KR101774348B1 - 세포 성장촉진 및 피부보습 개선기능을 가진 덕구온천수와 올리고키토산을 함유한 화장품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 덕구 온천수 및 올리고키토산을 포함하는 화장료 조성물 및 이를포함하는 화장품에 관한 것이다.

Description

세포 성장촉진 및 피부보습 개선기능을 가진 덕구온천수와 올리고키토산을 함유한 화장품 조성물 {Cosmetic composition for enhancing the growth of the seed and refreshing skin comprising Duk-gu hot spring water and oilgochitosan}

본 발명은 덕구 온천수 및 올리고키토산을 포함하는 화장료 조성물 및 이를포함하는 화장품에 관한 것이다.

온천수는 지하수가 지열에 의해 평균 기온 이상으로 더워져서 지표로 용출된 것으로, 보통 수온이 25℃ 이상이고 일정한 광물성분, 수증기, 가스 등을 포함하고 있다. 온천학상으로 넓은 뜻의 온천은, 물리적·화학적으로 보통의 물과는 성질이 다른 천연의 특수한 물이 지중에서 지표로 나오는 물을 의미한다. 이에 대하여, 지하수의 수온보다 낮은 것은 냉천이라고 하고, 수온과는 관계없이 무기물질 또는 가스성분을 다량으로 함유하고 있는 것을 광천이라 한다. 온천의 한계 온도는 지역에 따라 다르다. 우리나라는 25℃를 기준으로 25℃ 이하는 냉천, 25-34℃ 는 미온천, 34-42℃ 는 온천, 42℃ 이상은 고온천으로 구분한다. 온천의 분류는 학자나 국가에 따라 다르나, 일반적으로 온도, 온천의 용출 형태, 액성 이온 농도, 광물질의 용해도, 또는 온천의 개발 상태 등에 따라서 나눈다.

덕구 온천은 우리나라에 대표적 보양 온천으로　경상북도 울진군 북면 덕구리 용봉산(999m) 기슭에 잡고 있으며 국내 유일의 자연용출 온천수로, 1일 용출량은 약 2,000톤이며, 수온은 41도, 수질은 중탄산나트륨이 주성분이고, 불소칼륨·칼슘·철·탄산 등의 성분이 많이 함유되어 약 알카리성이다. 덕구 온천수로 당뇨병, 신경통, 만성소화불량에 좋다고 알려져 있으나, 이러한 온천수를 이용한 바이오 제품의 개발이 활발히 이루어지지 못하고 있는 실정이다.

한편, 키토산은 항균 작용, 창상 피복 작용, 약물 서방 작용, 콜레스테롤 저하 작용 등 다양한 기능을 가지고 있기 때문에 의료용 재료나 기능성 식품 재료로 이용되고 있다.

국내특허등록 제0135716호(1998.01.16)

본 발명에서는 경상북도 지역의 덕구 온천수에 대한 세포 성장촉진 및 피부 보습 개선 효능을 확인하여, 덕구 온천수를 유효성분으로 함유한 화장료 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.

나아가, 본 발명에서는 올리고키토산의 분자크기별 기능성을 확인하였으며, 세포성장촉진 및 피부보습개선 효능이 우수한 덕구 온천수와 보습성 및 친화력이 우수한 올리고키토산을 배합한 화장료 조성물이 피부 기능 개선을 위해 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 경상북도 지역의 덕구 온천수를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 경상북도 지역의 덕구 온천수 및 올리고키토산을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 것이다.

본 발명은 덕구 온천수가 세포 성장촉진, 피부보습 개선 및 피부 장벽 강화 효능이 우수하므로 화장품의 소재로서 유용함을 확인하였다. 이에, 본 발명은 덕구 온천수를 포함하는 화장료 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 홍게껍질 유래 올리고키토산을 덕구 온천수에 배합한 화장료 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 세포 성장촉진 및 피부보습개선 효능이 확인된 덕구 온천수와, 보습성 및 친화력이 우수하며 양이온성의 고분자이 홍게껍질 유래 올리고 키토산을 배합함으로써, 이온성을 띠지 않은 고분자보다 점성이 뛰어나고 유화안정, 분산안정 및 결합성 등이 우수하고, 자극없이 안전하게 사용가능하여, 화장품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 화장료 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.

일 예로, 본 발명은 경상북도 지역의 덕구 온천수를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 피부 보습 또는 피부 장벽 강화 용도로 사용될 수 있으며, 피부에 자극없이 안전하게 사용이 가능하다.

다른 예로, 본 발명은 경상북도 지역의 덕구 온천수 및 올리고키토산을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 피부 보습, 항산화, 주름개선 또는 피부 장벽 강화 용도로 사용될 수 있으며, 피부에 자극없이 안전하게 사용이 가능하다.

다른 예로, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다. 상기 화장품은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형을 가진 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 온천수란 지하로부터 용출되는 섭씨 25℃ 이상의 온수로 그 성분이 인체에 유해하지 않은 미네랄 배합물을 의미하며, 바람직하게는 경상북도 지역의 덕구 온천수로서, 나트륨, 불소, 칼륨, 칼슘, 철, 탄산 등이 고함유된 약 알칼리성의 온천수일 수 있다.

일 구체예로, 본 발명의 온천수는 경상북도 울진군 북면 덕구온천로 응봉산 지역의 덕구 온천수일 수 있다.

다른 구체예로, 본 발명의 온천수는 칼륨 0.40 내지 0.60 mg/L, 나트륨 40.0 내지 43 mg/L, 칼슘 3.00 내지 3.50 mg/L, 마그네슘 0.01 내지 0.05 mg/L, 산화규소 30.00 내지 35.00 mg/L, 리튬 0.05 내지 0.10 mg/L, 스트론튬 0.01 내지 0.05 mg/L, 철 0.01 내지 0.05 mg/L, 망간 0.01 내지 0.05 mg/L, 구리 0.01 내지 0.05 mg/L, 납 0.01 내지 0.05 mg/L, 아연 0.01 내지 0.05 mg/L, 불소 8.0 내지 12.0 mg/L, 염소이온 4.00 내지 5.00 mg/L 및 황산이온 5.00 내지 6.00 mg/L 를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 온천수는 그 자체로 사용되거나 가공되어 사용될 수 있는데, 예를 들어 증발, 농축 및 건조에 의해 수득된 농축물 또는 고형분으로 사용할 수 있다. 또는 상기 온천수를 자연건조로 증발시키거나, 인공적으로 탈염 및 건조(또는 증발)시켜 얻은 농축액을 사용할 수 있다. 증발, 농축 및 건조 방법에 특별한 한정은 없으나, 예를 들면 지하 온천수를 1차, 2차 및 3차 증발기로 증발시키고 여과한 후 농축 건조하여 얻을 수 있다.

구체적인 일실시예로, 본 발명의 따른 상기 온천수의 농축물은, 우선 원수를 채수한 후, 필터링하는 여과 단계를 거칠 수 있다. 여과 과정을 거쳐 수득한 수득물은 탈염 단계 및 건조 과정을 수행할 수 있으며, 탈염은 이에 제한되는 것은 아니나 전기투석기를 이용할 수 있다. 이후, 자연건조나 인공건조기를 이용한 건조단계를 거쳐 탈염 파우더를 제조 할 수 있다. 마지막 단계에서는 탈염 파우더를 분쇄하여 포장할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 온천수의 농축물의 제조는 원수를 채수한 후 건조과정을 통해 먼저 농축과정을 수행할 수 있고, 이후 여과 단계를 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 온천수를 그 자체로 사용할 경우 조성물 총 부피를 기준으로 50%(v/v)~100%(v/v)의 양으로 사용할 수 있으며, 농축물로 사용할 경우에는 조성물 총 부피를 기준으로 농축물을 0.5~50%(v/v)의 양으로 함유하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

키토산은 키틴을 탈아세틸화시킨 물질로서, 여러 생리활성 및 물리화학적 특성을 지니고 있지만 키토산을 녹일 수 있는 용매는 몇 가지 용매를 제외하고는 극히 제한되어 있다. 본 발명에서는 키토산을 가수분해시킨 저분자량의 올리고키토산을 덕구 온천수에 배합할 수 있으며, 이러한 올리고키토산은 보통 화장료에 많이 사용되는 키토산에 비해 저분자이므로, 헤어나 피부에 흡수율을 증가시켜서 우수한 컨디셔닝 효과를 제공 할 수 있다. 올리고키토산은 수득하는 방법에는 특별한 제한이 없으나, 예를 들어 키토산을 화학적 방법 또는 효소적 방법에 의하여 가수분해하여 수득할 수 있다. 또는, 홍게껍질에서 추출한 올리고키토산을 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 올리고키토산의 분자량은 1kDa 내지 3.5kDa일 수 있다.

본원의 화장료 조성물은 투여 경로에 따라서, 피부 외용, 경피 또는 피하 투여, 헤어 투여가 가능하며, 바람직하게는 피부 외용 또는 경피, 모발, 보다 바람직하게는 피부, 모발에의 외용 투여가 가능한 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부, 두피 또는 모발에 경피적으로 적용될 수 있고, 기초 화장품, 메이크업 화장품, 바디 제품(바디 클렌져, 바디로션 등), 면도용 제품, 모발 제품(샴푸, 린스, 헤어 에센스 등) 등의 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나, 그 형태에 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션(고체 타입, 액체 타입 또는 스프레이 타입 등), 파우더, 메이크업 제거제(클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등) 및 세정제(클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등) 등의 제형을 가질 수 있다.

상기 화장료 조성물은 유효성분 이외에, 통상의 제품화 또는 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 항료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 효소, 식물 또는 미네랄오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 및 왁스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 약리학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 벤질알코올, 이소프로판올, 부탄디올, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌카보네이트, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 등 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.　 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 경피 투여시의 경피 투과를 강화하기 위한 다양한 물질을 포함할 수 있다.　예를 들어, 라우로켑람 유도체 및 올레인산, 모노올레이트 유도체의 에스테르 유도체, 아다팔렌, 트리티노인, 레틴알데하이드, 타자로틴, 살리실산, 아질라익산, 글라이콜산, 에톡시다이글라이콜, 트윈80, 레시틴 올가노겔 등을 포함할 수 있다.　또한, 본 발명의 화장료 조성물은 부가적인 기능을 부여하기 위해, 본 발명의 미백 또는 주름 개선 효과를 해치지 않는 범위 내에서 공계면활성제, 계면활성제, 비듬 방지제, 각질 연화제, 혈행 촉진제, 세포 활성제, 청량제, 보습제, 항산화제, pH 조절제, 정제수 등의 보조 성분들을 첨가할 수 있으며, 적용되는 형태에 따라서 적절한 향료, 색소, 방부제, 부형제 등의 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습, 항산화, 주름개선 또는 피부 장벽 강화 기능이 우수할 뿐만 아니라, 대게 홍게 부산물 및 경상북도 울진의 천연 자원으로 하루 2000톤 정도 유출되는 덕구온천수를 활용할 수 있으므로, 부산물 처리 비용 저감, 환경오염 저감 및 새로운 산업수요 창출 측면에서 중요한 기여를 할 수 있다.

도 1은 키토산 시료 중의 폴리페놀 함량을 측정한 결과를 나타낸다. GAE (Gallic Acid Equivalents)는 폴리페놀 함량을 나타내는 측정단위이다.
도 2는 키토산의 DPPH 소거 활성능(%)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 키토산의 Elastase activity(%)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수, 일반수 및 정제수를 각각 분주한 페트리디쉬에서 상추씨의 발아율(%)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수, 일반수 및 정제수를 각각 분주한 페트리디쉬에서 발아한 상추씨의 뿌리길이(cm)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수, 일반수 및 대조군의 세포독성을 평가하기 위하여 세포 생존율(%)을 확인한 결과를 나타낸 것이다
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수의 시간과 온도에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수 및 일반정제수의 4주 동안 피부수분 변화(A.U.)를 그래프로 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수의 4주 동안 피부보습개선율(%)을 나타내는 것이다.
도 10 본 발명의 일실시예에 따른 덕구온천수(시험제품)의 2주 동안 경피수분손실량의 개선율(%)을 나타내는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 덕 구온천수의 준비

본원의 일실시예에서 사용한 덕구 온천수는 경상북도 울진군 북면 덕구 온천로 924번지 응봉산(999m)에서 흘러나오는 43℃ 약알칼리온천이다. 경상북도 울진군에서 대한온천학회에 의뢰하여 덕구온천수의 성분을 분석 결과를 표 1에 기재하였다. 단위는 mg/L 이다.

성분	2002년	2008년	2012년
칼륨(K)	0.56	0.57	0.47
나트륨(Na)	40.9	40.4	42.3
칼슘(Ca)	3.17	3.37	3.1
마그네슘(Mg)	0.01	0.02	0.02
산화규소(SiO2)	33.79	34.1	32.7
리튬(Li)	0.08	0.08	0.08
스트론튬(Sr)	0.03	0.03	0.03
철(Fe)	0.02	0.02	0.02
망간(Mn)	0.01	0.01	0.01
구리(Cu)	0.01	0.02	0.03
납(Pb)	0.01	0.03	0.05
아연(Zn)	0.01	0.04	0.03
알루미늄(Al)	0.02	0.03	0.05
불소(F)	10.3	10.6	9.8
염소이온(Cl-)	4.4	4.93	4.9
황산이온(SO4 2-)	5.2	5.79	5.82
총고형물(TS)	65	141	160

실시예 2. 키토산에 따른 최적의 조건 확립

2-1. 폴리페놀분석

키토산을 분석하기 위하여, 분자량 크기에 따라 3종의 올리고키토산(1kDa, 3.5kDa, 10kDa) 과 CM 키토산(carboxymethylated chitosan)을 이용하여 분석하였다. 각각 10mg/ml로 녹여 사용하였다. 폴리페놀 분석을 위하여 올리고키토산과 CM 키토산 0.5 ml에 섞은 용액에 Folin-Ciocalteu 시약 0.5 ml, 7.5 % Na₂CO₃ 1 ml 넣어준 후 증류수로 최종 10 ml을 맞추었다. 배양기(60)에서 20분간 발색 시킨 후 765 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고 미리 gallic acid (GAE)을 사용하여 구한 검량 곡선으로부터 시료 중의 폴리페놀 함량을 계산하였다. 그 결과, 폴리페놀 분석 경우 올리고키토산 분자량에 따라서 3.5kD > 1 kD > 5 kD > CM-키토산 순으로 폴리페놀 함량이 높게 나타났다 (도 1).

2-2 DPPH 소거 활성능

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 측정은 Yinrong와 Yeap Foo의 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다. 올리고키토산과 CM 키토산 0.2 ml에 DPPH (16 mg / 100 ml EtOH) 용액 1 ml 를 섞은 후 10분간 상온에서 반응 시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가 하지 않은 대조군과 비교하여 유리 래디칼 소거 활성을 백분율(%)로 나타내었다. 계산식은 아래와 같다.

A₀ ： 대조군 흡광도

A₁ ： 실험군 흡광도

항산화 효능은 올리고키토산 분자량에 따라서 1 kD > 3.5 kD > 5 kD > CM-키토산 순으로 효능이 나타났다. (도 2).

2-3. 엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 분석

엘라스타아제(Elastase) 저해 활성 측정을 위하여, 분자 크기별 올리고키토산과 CM 키토산(10mg/ml) 및 알부틴(10mg/ml)을 각각 20ul 시험관에 취하고, 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase (10㎍/mL)용액 50㎕을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃ -p-nitroanilide (0.5mg/mL)을 100㎕첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

올기고키토산 분자 크기별 엘라스타아제 저해능을 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 올리고키토산 분자량에 따라서 1 kD > 3.5 kD > CM-키토산 > 5 kD 순으로 저해능이 확인되었다. 이 결과를 바탕으로 올리고키토산이 저분자일수록 항산화 효능이나 주름 개선 효능이 높으로 것으로 나타났다.

실시예 3. 덕구온천수의 성장 활성 확인

덕구온천수, 일반수로서 수돗물, 및 정제수로서 2차 증류수를 이용하여 발아성장률을 비교하는 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 페트리디쉬(90 X 15mn)에 여과지 (adadvant filter paper #2)를 깔고 정제수, 일반수 또는 덕구온천수 5ml를 각각 분주하고, 페트리디쉬에 상추씨 8개 정렬 후 배양실에서 배양하였다. 배양실 조건은 25℃, 명/암(L:D) 주기 12H:12H, 및 습도 60%로 맞추어 배양하였다. 각각 발아시킬 용매에 세척한 후 사용하였다. 양성 발아기준은 3일 후 뿌리길이가 0.5cm이상 자란 것으로 간주하였다. 5일 후 뿌리 길이를 측정하여 덕구온천수와 일반수, 정제수와 비교하였다. 모든 실험을 3반복하여 3회 이상 실시하여 3회이상 반복하였다.

상추씨의 발아율 확인 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 덕구온천수가 분주된 페트리디쉬에서는 86.4%, 일반수가 분주된 페트리디쉬에서는 80%, 그리고 정제수가 분주된 페트리디쉬에서는 76.7%의 발아율을 나타냈다. 또한, 뿌리 길이 측정 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 덕구온천수에서 5.58cm, 일반수에서 4.94cm, 그리고 정제수에서 4.1cm로 측정되었다. 따라서, 덕구온천수 > 일반수 > 정제수 순으로 상추씨 성장활성을 보였다. 특히, 덕구온천수와 정제수를 비교하여 볼 때, 덕구온천수가 발아율은 9.7% 더 높고, 뿌리길이는 1.48cm 더 길어, 더 높은 생장율을 보였다. 화장품 조성물 제조시 수용성 용매로 정제수를 일반적으로 사용하는 보편화 되어 있는데, 본 실험 결과에 의하여, 덕구온천수가 정제수 대체 용매물로 사용할 수 있음이 확인되었다.

실시예 4. 덕구온천수의 안정성 평가

4-1 세포 독성평가

B16-F10 멜라닌 세포(제조사 ATCC LOT. 60508145)를 이용하여 덕구온천수의 안정성을 평가하였다. 96 well plate에 cell suspension(5000cells/well) 100㎕씩 분주하여, 24시간동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 pre-incubation 시켜 cell을 well plate에 부착시켰다. blank well은 cell을 포함하지 않은 배지 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 제조사 ATCC)만 100㎕ 분주하였다.

일반수와 덕구온천수를 각 well에 10㎕씩 처리하고, 음성 대조군(negative control)으로는 배지 10㎕만 처리하고, 양성 대조군으로 100% Ethanol을 10㎕ 처리 한 후, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 인큐베이션 시켰다. 각 well에 CCK-8 solution 10㎕씩　첨가한 후 1시간 동안 인큐베이션 하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. blank 는 세포가 없는 상태에서 시료를 넣고 측정한 것이다.

survival rate(%) = (A_sample-A_b)/(A_c-A_b) × 100

A_sample : sample 흡광도

A_b : blank 흡광도

A_c : 음성 대조군 흡광도(cell있는 상태에서 증류수 넣고 측정한 값)

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 덕구온천수 처리시 세포생존율이 90% 이상 나타나, 안정성이 확인되었다. 이에 반하여, 양성 대조군(100% Ethanol) 은 세포 생존율이 20%이하로 나타나 세포독성이 확인되었다.

4-2 시간과 온도 변화에 따른 덕구온천수의 pH 변화 및 안정성 테스트

덕구온천수에 대하여 시간 및 온도에 따라 pH 변화를 살펴 보았다. 기간은 3개월정도 5-6일에 한번씩 측정을 하였고, 온도는 4℃ 및 25℃로 하였다. 4℃는 냉장보관, 25℃는 배양기를 통해서 일정한 온도를 유지하면서 pH 변화도, 변취 및 부유물 발생 등을 관찰하였다.

그 결과, 도 7 에서 보는 바와 같이, 덕구온천수의 pH는 평균 4℃에는 8.58±0.14로 나타났고, 25℃에는 8.49±0.13로 나타났으며, 시간에 따른 pH 변화는 나타나지 않았다.

실시예 5. 덕구온천수를 이용한 임상시험

5-1. 덕구온천수의 피부보습 개선에 대한 임상시험

덕구온천수 원수를 A 제품(시험제품), 일반정제수를 B 제품(대조제품)으로 하여 피부보습효능을 평가하였다. 각 군의 피험자의 기본정보는 아래 표 2 및 3에 정리하였다.

A 제품 (시험제품:덕구온천수)의 피험자의 기본정보

전체피험자수(A 제품 시험제품)	21 명
성별	남: 0 명	여: 21 명
평균연령	43.8 세

B 제품 (대조제품:정제수)의 피험자의 기본정보

전체피험자수(B 제품 대조제품)	21 명
성별	남: 0 명	여: 21 명
평균연령	45.2 세

피험자 선정 및 제외 기준에 따라 연구에 적합한 피험자를 선정하고, 피험자의 피부상태를 확인한 후, 기기평가(Corneometer)를 시행하였다. 시험 부위는 피험자의 안면(눈가) 부위로 하였다. 피험자들의 측정 조건을 동일하게 하고자 시험 부위를 깨끗하고 마른 상태를 유지 하였으며, 최소 30분간 항온 항습(22±2℃, R.H. 40~60%)이 유지되는 곳에서 피부 안정을 취한 후 진행하였다.

보습 측정은 Corneometer(CM825, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany)를 이용하여 안면 부위를 측정하였으며, 3개의 값을 이용해 평균값을 구하였다. 측정은 제품 사용 전(0주, 0w), 제품 사용 2주 후(2w), 제품 사용 4주 후(4w)에 실시하였다. Corneometer는 피부에 접촉하는 probe를 통해 전달되는 전류의 정전부하용량(capacitance)계측으로 이루어진다. 수분의 함량과 정전부하용량은 서로 비례하는 성질이 있어 수분(보습량)이 높을수록 측정수치가 높아지며, 측정계수는 arbitrary unit(A.U.) 이다.

통계분석은 두 군간의 비교를 위해 독립 검정(independent t-test)법으로 분석하였다. 모든 통계 결과는 생물학적 통계분석에서 가장 많이 사용하는 유의차 5%(p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있다고 간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를 사용하였다. Corneometer를 이용한 피부 보습 측정 결과는 표 4 및 표 5에 정리하였다.

A 제품 (시험제품:덕구온천수)의 피부 보습 측정 결과

피험자 No. (단위:A.U.)	0w	2w	4w
1	55.6	56.3	57.3
2	72.6	73.0	74.0
3	80.0	83.1	83.3
4	81.3	81.3	85.2
5	69.9	75.5	76.4
6	82.1	79.6	81.6
7	72.9	74.4	77.5
8	68.9	72.5	71.2
9	63.6	65.9	68.8
10	65.1	67.4	68.3
11	84.0	83.4	83.9
12	94.2	94.2	96.2
13	75.2	75.1	75.0
14	65.2	68.6	69.3
15	73.0	73.7	72.7
16	81.0	80.7	83.0
17	73.2	80.1	77.5
18	83.1	83.2	83.1
19	86.8	86.6	86.5
20	92.7	92.3	92.5
21	88.3	82.3	84.9
평 균	76.60	77.58	78.49
표준편차	10.06	8.90	9.00

B 제품 (대조제품 : 정제수)의 피부 보습 측정 결과

피험자 No. (단위:A.U)	0w	2w	4w
1	69.7	69.1	69.7
2	81.7	81.5	82.4
3	77.3	77.3	77.1
4	72.9	73.6	72.3
5	78.2	78.3	78.5
6	75.0	75.1	75.4
7	90.1	91.5	89.7
8	71.8	79.3	78.3
9	75.3	74.9	76.1
10	76.7	76.7	79.2
11	66.6	69.6	68.3
12	86.1	85.7	85.1
13	63.3	67.5	64.0
14	61.3	61.6	62.2
15	82.9	84.5	84.2
16	73.3	70.4	73.0
17	81.6	81.2	81.7
18	86.2	85.8	82.4
19	92.4	85.5	91.3
20	68.3	68.1	68.5
21	75.3	78.2	76.6
평 균	76.48	76.92	76.95
표준편차	8.33	7.50	7.76

5-1-1. 피부 보습 변화량( A.U .)

Corneometer로 측정한 피부 보습 변화량(A.U.)을 도 8에 그래프로 나타내었다.

피부 보습 변화량 = 사용 후에 측정한 피부 보습 측정 결과 -사용 전의 피부 보습

피부 보습 측정 결과, A 제품(시험제품: 덕구온천수)은 사용 전(0주) 76.60A.U., 제품 사용 2주 후 77.58A.U. 및 제품 사용 4주 후 78.49A.U로 나타났으며, B 제품(대조제품 : 정제수)은 사용 전 (0주) 76.48A.U.에서 제품 사용 2주 후 76.92A.U. 및 제품 사용 4주 후 76.95A.U.로 나타났다.

따라서, 제품 사용 후 A 제품 (시험제품: 덕구온천수)에서 피부 보습에 변화가 있음을 확인할 수 있었으며, A 제품은 사용 후 4주 후 B 제품(대조제품 : 정제수)과 비교하여 통계적으로 유의한 수준의 피부 보습 개선 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(p<0.05).

5-1-2. 피부 보습 개선율( % )

시험제품에 대한 피부 보습 개선율(%)은 피부 보습 변화량을 각각 구하여 사용 전에 대한 피부 보습 개선율(%)을 산출하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.

피부 보습 개선율(%)=(피부 보습 변화량 / 결과사용 전의 피부 보습 측정 결과) × 100

그 결과, A 제품(시험제품: 덕구온천수)제품은 제품 사용 전(0주)과 비교하여, 제품 사용 2주 후 1.55%, 및 제품 사용 4주 후 2.71%의 보습 개선율을 확인하였다.

결론적으로 시험제품 사용 전후에 따라 피부 보습에 변화가 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 "덕구온천수"은 "정제수"에 비하여 통계적으로 유의한 수준의 피부 보습 개선 효과가 있는 것으로 확인되었다(p<0.05).

5-2. 피부자극테스트

피험자의 기본정보는 덕구온천수의 피부보습개선에 대한 인체 적용시험 병행하여 실시하였으므로, 표 2 및 표 3와 동일하다.

배포된 시험 제품을 사용방법에 따라 2주 및 4주 동안 사용한 피험자를 대상으로 피부자극 평가와 기기평가(Corneometer)를 병행하여 효과를 평가하였다. 그리고 제품 사용 4주 후에 각각 피험자를 대상으로 시험 제품에 대하여 일반적인 평가(사용감), 효능성(피부 보습 개선 효과 등)평가 및 호감도에 대한 평가를 설문 조사하였다. 시험 제품에 대해 이상반응인 홍반(Erythema), 부종(Edema), 인설(Scaling), 가려움(Itching), 자통(Stinging), 작열감(Burning), 뻣뻣함 (Tightness), 따끔거림(Prickling)이나 다른 이상반응이 발생하는지의 존재 여부를 면밀히 관찰하고 피부 이상반응이 나타날 시 심한 정도에 따라 등급을 표시하고 이에 대한 검사 소견을 작성하였다. 방문하는 날이 아니더라도 시험에 더 이상 참가 할 수 없게 되는 경우는 본인의 서명이 첨부된 "시험참가 포기동의서" 를 쓰도록 하였다. 이상 반응 여부 및 등급 분류표(Adverse grading)는 다음과 같다.

0:none(이상반응 없음), 1:mild, 2:severe, 3:very severe(심각한 이상반응)

Erythema	Edema	Scaling	Itching	Stinging	Burning	Tightness	Prickling
홍반	부종	인설	가려움	자통	작열감	뻣뻣함	따끔거림

또한, 실험결과 시험제품 사용 후 연구자에 의한 육안 평가에서 피부 이상 반응은 관찰되지 않았다.

피험자의 피부자극평가에 대한 결과

	홍반	부종	인설	가려움	자통	작열감	뻣뻣함	따끔거림
2주 후	0	0	0	0	0	0	0	0
4주 후	0	0	0	0	0	0	0	0

5-3. 피부장력강화 실험

피험자는 만 30세에서 45세의 성인 여성 20명을 대상으로 2주간 시험을 수행하였으며 중도 탈락자는 없었으므로 총 참여 피험자는 20명이다. 피험자들의 측정 조건을 동일하게 하고자 시험 부위는 깨끗하고 마른 상태를 유지하며 최소 30분간 항온항습(22±2℃, R.H. 40~60%)이 유지되는 곳에서 피부 안정을 취한 후 진행하였다.

제품 사용 전, 시험부위 세정 후 30분간 피부 안정을 취한 다음 시험부위의 사진 촬영 및 경피수분손실량(TEWL) 측정 후 SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 1%를 함침한 Chamber를 시험부위에 24시간 동안 부착하였다. 매 방문 시 마다 Digital Camera(CANON EOS 7D, JAPAN)로 시험부위인 상완부를 촬영하였다.

시험부위에 부착된 Chamber를 제거한 후 시험부위의 상태를 확인하였다. 각질층의 제거가 제대로 되었으면, 사진 촬영 및 Tewameter를 이용하여 시험부위 경피수분손실량(TEWL)을 측정하고, 각질층의 제거가 부족하다고 판정이 되면 추가적으로 새로운 Chamber를 부착하며 추후에 시험부위를 재확인 후 경피수분손실량(TEWL)을 측정하였다. 측정을 끝낸 피험자들에게 시험제품의 사용법에 대해 설명하고 시험제품을 분배하면서 하루에 2회씩 사용하도록 당부하였다.

제품 사용 1주, 7일 ±1 후에는, 시험 제품을 사용방법에 따라 사용한 피험자를 대상으로 피부자극 평가 후, 사진 촬영 및 경피수분손실량(TEWL) 측정을 하여 피부장벽강화 효과를 평가하였다.

제품 사용 2주, 14일 ±1 후에는, 시험 제품을 사용방법에 따라 사용한 피험자를 대상으로 피부자극 평가 후, 사진 촬영 및 경피수분손실량(TEWL) 측정을 하여 피부장벽강화 효과를 평가하였다.

그 결과, 경피수분손실량(TEWL) 개선율은 제품 사용 1주 후에 제품 사용 부위에서 91.72%, 미사용 부위 96.79%로, 제품 사용 2주 후에 제품 사용 부위에서 90.37%, 미사용 부위 94.92%로 나타났다(도 10). 제품 사용 부위와 미사용 부위의 개선율을 비교한 결과, 제품 사용 부위에서 제품 사용 2주 후에 통계적으로 유의한 수준의 장벽강화 효과를 나타내었다(p<0.05). 이상의 결과로 덕구온천수는 피부장벽강화에 도움을 주는 것으로 확인되었다(p<0.05).

실시예 6. 화장품 제조 조성물

6-1. 덕구온천수 함유 샴푸 조성물

한글성분명	함량%	기능	INIC
온천수	22.76	보습	Onsen-Sui
프로방스장미꽃수	5	보습	Rosa Centifolia Flower Water
키토올리고산	0.05	피막형성제 모발강화	Chitosan
폴리쿼터	0.5	점증제	Polyquaternium-10
알란토인	0.1	보습, 재생	Allantoin
EDTA-2NA	0.03	산도조절	Disodium EDTA
데실글루코사이드	20	계면활성제	Decyl Glucoside
라우릴글루코사이드	19	계면활성제	Lauryl Glucoside
소듐코코실글루타메이트	3	계면활성제	Sodium Cocoyl Glutamate
디소듐라우레스설포석시네이트	15	계면활성제	Disodium Laureth Sulosuccinate
코카미도프로필베타인	6	계면활성제	Mitaine CA
글리코디스테라이트	1	점증제	Glycol Distearate
Micopol CME	5	점도증가	Cocamide MEA
디메치콘	2	실리콘오일	Dimethicone
구연산	0.1	산도조절	Citric Acid
소듐시트레이트	0.1	산도조절	Sodium Citrate
1,2-헥산디올	0.06	용제 방부제	Hexanediol
사향장미잎오일	0.05	향, 보습	Rosa Moschata Oil
케라스젠	0.06	피부 컨디셔닝	Canavalita gladiata
알로에베라잎추출물	0.06	보습	Aloe Barbadensis Leaf Extract
마치현 추출물	0.06	피부보습제	Portulaca Oleracea Extract
하이드롤라이즈드콜라겐	0.06	피부컨디셔닝제	Hydrolyzed Collagen

6-2. 덕구온천수 함유 미스트 조성물

한글성분명	함량%	FOUNCTION	INIC
온천수	to 100	보습	Onsen-Sui
프로방스장미꽃수	30	보습	Rosa Centifolia Flower Water
소듐하이알루로네이트	3	피부컨니셔닝제	Sodium hyaluronate
1,2-헥산디올	2	용제 방부제	Hexanediol
하이드롤라이즈드콜라겐	0.5	피부컨디셔닝제	Hydrolyzed Collagen
마치현추출물	0.5	피부보습제	Portulaca Oleracea Extract
로즈에센스향료	0.5		Rose perfume
키토올리고당	0.5	피막형성제 모발강화	Chitosan

6-3. 덕구온천수 함유 비누 조성물

성분명	함량%	FOUNCTION	INIC
NO TEA 비누베이스	87.9	비누베이스
온천수	10	보습	Onsen-Sui
소듐하이알루로네이트	1	보습	Sodium hyaluronate
로즈힙오일	1	보습
로즈 에센스향료	0.1		Rose perfume
키토올리고당	0.02	항균 피부강화	Chitosan

Claims (9)

1. 경상북도 울진군 북면 덕구온천로 응봉산 지역의 덕구 온천수 및 홍게 껍질 유래의 올리고키토산을 포함하는 항산화 또는 주름 개선용 화장료 조성물로서,
   상기 덕구 온천수는 칼륨 0.40 내지 0.60 mg/L, 나트륨 40.0 내지 43 mg/L, 칼슘 3.00 내지 3.50 mg/L, 마그네슘 0.01 내지 0.05 mg/L, 산화규소 30.00 내지 35.00 mg/L, 리튬 0.05 내지 0.10 mg/L, 스트론튬 0.01 내지 0.05 mg/L, 철 0.01 내지 0.05 mg/L, 망간 0.01 내지 0.05 mg/L, 구리 0.01 내지 0.05 mg/L, 납 0.01 내지 0.05 mg/L, 아연 0.01 내지 0.05 mg/L, 불소 8.0 내지 12.0 mg/L, 염소이온 4.00 내지 5.00 mg/L 및 황산이온 5.00 내지 6.00 mg/L 를 포함하고,
   상기 홍게 껍질 유래의 올리고키토산은 1kDa 내지 3.5kDa의 분자량을 갖는 것인, 항산화 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 온천수는 증발 및 농축한 농축물이고, 상기 농축물을 조성물 총 부피를 기준으로 0.5 내지 50%(v/v)로 함유하는 것인 화장료 조성물.
8. 제1항 또는 제7항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 화장품.
9. 제8항에 있어서, 상기 화장품은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형을 가지는 것인, 화장품.

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