KR101771077B1 - 우엉-시금치 복합발효추출물을 포함하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분쇄된 우엉과 시금치를 효소처리하고, 효소처리된 우엉-시금치 복합물을 발효시킨 후 추출하여 얻어진 우엉-시금치 복합발효추출물을 유효성분으로 포함하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물은 대량 생산되는 채소인 우엉과 시금치를 주성분으로 하여 제조된 천연 건강식품으로서 조혈기능을 개선하고 및 빈혈을 예방하는 효과를 가진다.

Description

우엉-시금치 복합발효추출물을 포함하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물{Composition for improving hematogenous functions and preventing anemia comprising extracts of fermented Arctium lappa L.and Spinacia oleracea}
본 발명은 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우엉-시금치 복합발효추출물을 유효성분으로 포함하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물에 관한 것이다.
우엉(Arctium lappa L.)은 국화과에 속하는 2년초 식물로 특유의 향을 가진 알칼리성 채소이다. 우엉은 안동을 비롯한 경북 지역에서 많이 재배되는 식물로, 2013년도의 경우 국내 우엉 총생산량 3,083톤 중 경북에서 생산된 우엉 생산량은 2,457톤으로 80%를 차지하고 있다.
우엉은 다량의 식이섬유소, 당뇨에 좋은 이눌린, 항산화 성분 및 생리활성물질{악틴(arctiin), 악티제닌(arctigenin), 시나린(cynarin) 등의 폴리페놀화합물}이 풍부하여 이미 오래 전부터 식재료 또는 약재로 활용되어 오고 있다.
한의학에서 우엉은 맛이 쓰고 성질은 차며, 폐와 위를 이롭게 하는 한약재로 사용하고 있고(중약대사전), 우엉의 뿌리는 중풍과 종기에 효과가 있고 씨앗은 우방자 또는 악실이라고 하여 해독, 이뇨제로 사용되고 있으며(동의보감), 우엉을 술에 담가 복용하면 풍을 제거하고 악성 종기를 치료하는데 효과가 있는 것으로 알려져 있다(본초급유). 또한 우엉은 여성호르몬 분비를 조절해 노화방지, 변비해소, 근력향상, 콜레스테롤 분해, 혈액순환, 생리통 등에 효과가 있고, 각종 피부병, 치매, 암, 뇌졸중, 동맥경화 예방 등에 도움을 준다고 알려져 있다.
시금치(Spinacia oleracea)는 명아주과에 속하는 1년생 작물로서 원산지는 중앙아시아이고 재배지는 북부 온대지방이다. 국내에서는 경북포항을 중심으로 한 남해지역에서 재배되고 있다.
시금치는 비타민과 철분, 엽산이 풍부하며 항산화, 면역 증강 및 항암 활성이 보고되어 있으며, 빛에 대한 안정성이 뛰어나 천연색소로서의 가치도 인정받고 있다.
1. 대한민국 특허공개 제10-2013-0024025호 2. 대한민국 특허공개 제10-2014-0009880호 3. 대한민국 특허공개 제10-2015-0051597호
본 발명은 대량 생산되는 채소인 우엉과 시금치를 주성분으로 하여 조혈기능 개선 및 빈혈의 예방 효과, 특히 가임기 여성을 위한 조혈기능 개선 및 빈혈 예방효과를 가진 천연 건강식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분쇄된 우엉과 시금치를 효소처리하고, 효소처리된 우엉-시금치 복합물을 발효시킨 후 추출하여 얻어진 우엉-시금치 복합발효추출물을 유효성분으로 포함하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서, 상기 효소처리는 펙틴 분해효소와 섬유소 분해효소에 의해 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 조성물에서, 상기 발효는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 불가리쿠스 및 웨이셀라 시바리아 중 선택된 1종 이상의 유산균을 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 조성물에서, 상기 우엉-시금치 복합발효추출물은,
우엉과 시금치를 혼합하여 분쇄하는 단계; 분쇄된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합하고, 반응물 1ℓ당 펙틴 분해효소 0.05~0.15g과 섬유소 분해효소 0.025~0.10g을 혼합한 후 45~60℃, pH 4.5~6.0에서 50~100rpm 속도로 교반하면서 18~30시간 동안 반응시키는 효소처리단계; 상기 효소처리된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합하고, 유산균 종균을 0.5~2%(v/v) 첨가하고, 탄소원을 5~10g/ℓ, 질소원을 1.5~2.5g/ℓ 및 효모추출물을 1.0~2.0g/ℓ 농도로 첨가한 후, 35~40℃, pH 5.0~6.0에서 36~60시간 동안 호기배양하는 발효단계; 및 상기 발효액을 100~140℃에서 10~20분 동안 살균처리하고 50~60℃에서 18~30시간 동안 교반하면서 추출한 후 여과하여 추출액을 수집하는 추출단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.
상기 조성물에서, 상기 방법은 상기 추출액을 건조시켜 수분 5% 미만의 분말로 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에서, 상기 우엉과 시금치는 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 복합발효를 통해 우엉과 시금치의 유효성분과 활성을 강화시킨 우엉-시금치 복합발효추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물은 대량 생산되는 채소인 우엉과 시금치를 효소처리하고 발효시켜 제조한 천연 건강식품으로서, 조혈기능을 개선하고 빈혈, 특히 철결핍성 빈혈(Iron Deficiency Anemia)을 예방하는 효과가 우수하며, 대량 생산되는 채소를 이용함으로써 경제성 또한 있다.
도 1은 조혈장해를 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 조혈장해 개선효과를 확인하기 위하여 말초혈액의 백혈구 수치를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 조혈장해를 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 말초혈액 내 림프구의 수치 및 면역관련 사이토카인(IL-2와 IFN-γ)의 증강효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 조혈장해를 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 경구투여가 실험동물의 간 및 신장에 미치는 영향을 평가하기 위하여 실험동물의 혈청에서 간기능검사(AST/ALT) 및 신장기능검사(BUN/Creatine)를 한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험동물의 대퇴골 천자 골수를 도말한 슬라이드 표본을 제조하는 과정과, 제조된 슬라이드 표본에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 경구투여에 따른 조혈전구세포 증가의 분포도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 항빈혈효과를 확인하기 위한 동물실험에서 10주 실험기간 동안의 실험동물의 체중변화 및 식이효율을 측정 및 산출하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 철결핍성 빈혈을 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 철결핍성 빈혈의 개선 효과를 확인하기 위하여 말초혈액의 CBC항목(RBC, Hbg, HCT, PLT)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 철결핍성 빈혈을 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 철결핍성 빈혈의 개선 효과를 확인하기 위하여 실험동물의 혈청 중 철분 함량과 총 철결합능 및 적혈구 지수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 철결핍성 빈혈을 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 철결핍성 빈혈의 개선 효과를 확인하기 위하여 실험동물의 말초혈액을 슬라이드에 도말 및 염색하여 적혈구 형태 및 혈색소의 농도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 철결핍성 빈혈을 일으킨 동물모델에서 우엉-시금치 복합발효추출물의 실험동물의 간 및 신장에 미치는 영향을 평가하기 위하여 실험동물의 혈청에서 간기능검사(AST/ALT) 및 신장기능검사(BUN/Creatine)를 한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물은, 분쇄된 우엉과 시금치를 효소처리하고 효소처리된 우엉-시금치 복합물을 발효시킨 후 추출하여 얻어진다.
이하 우엉-시금치 복합발효추출물의 제조방법을 상세하게 설명한다.
1. 우엉과 시금치의 분쇄단계
우엉과 시금치를 혼합하여 분쇄한다. 우엉과 시금치는 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하며, 1~2㎜ 크기로 분쇄하는 것이 바람직하다.
2. 우엉-시금치 복합물의 효소처리단계
분쇄된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합한다. 정제수는 우엉-시금치 복합물 중량의 3~5배 중량을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 혼합된 반응물 1ℓ당 펙틴 분해효소(Pectinase) 0.05~0.15g과 섬유소 분해효소(Cellulase) 0.025~0.10g을 혼합한다. 펙틴 분해효소와 섬유소 분해효소는 식품용도로 상용화되어 판매되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
반응액의 온도는 45~60℃로 유지하고, pH는 4.5~6.0 범위로 조절하며, 50~100rpm 속도로 약하게 교반하면서 18~30시간 동안 반응시킨다.
3. 효소처리된 우엉-시금치 복합물의 발효단계
효소처리가 완료된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합한다. 정제수는 효소처리된 우엉-시금치 복합물 중량의 2~3배 중량을 사용하는 것이 바람직하다.
발효를 위하여 유산균 종균을 0.5~2%(v/v) 첨가하고, 탄소원을 5~10g/ℓ, 질소원을 1.5~2.5g/ℓ 및 효모추출물을 1.0~2.0g/ℓ 농도로 첨가한 후, 35~40℃, pH 5.0~6.0의 조건에서 36~60시간 동안 호기배양한다.
유산균 종균으로는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantanum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 및 웨이셀라 시바리아(Weissella cibaria) 중 선택된 1종 이상의 종균을 사용하는 것이 바람직하다.
탄소원으로는 포도당을 사용하는 것이 바람직하고, 질소원으로는 소이펩톤을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 pH는 사과산을 0.1~0.2g/ℓ 농도로 첨가하여 조절하는 것이 바람직하다.
4. 발효된 우엉-시금치 복합물의 추출단계
발효가 완료된 후 발효액을 100~140℃에서 10~20분 동안 살균처리하고 50~60℃에서 18~30시간 동안 교반하면서 추출한다. 추출 후 여과하여 고형분(균체 및 불순물)을 제거하고 추출액을 수집한다. 여과는 필터프레스, 원심분리기 등을 사용하여 여과하는 것이 바람직하다.
5. 우엉-시금치 복합발효추출물의 분말화단계
상기 추출액을 건조시킨 후 분쇄하여 수분 5% 미만의 분말로 제조할 수 있다. 상기 건조는 50~70℃에서 감압농축하고, 80~100℃에서 40~80분 동안 살균처리한 후 70~90℃에서 열풍건조시키는 것이 바람직하다.
[ 실시예 ]
이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
우엉-시금치 복합발효추출물의 제조
우엉(경북 안동)과 시금치(경북 포항) 원재료를 1:1의 중량비로 혼합하여 분쇄기(Meat chopper, 한국후지공업)에 투입하고 1~2㎜의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 우엉-시금치 복합물 50㎏과 정제수 150ℓ를 효소처리 반응기에 투입하고 펙틴 분해효소 15g과 섬유소 분해효소 8g을 혼합하였다. 초산 또는 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.0으로 조절하고 반응액의 온도를 55℃로 유지하며 75rpm 속도로 약하게 교반하면서 24시간 동안 반응시켰다.
효소처리가 끝난 우엉-시금치 복합물을 그대로 발효조에 투입하고, 투입량의 3배 중량의 정제수를 투입하였다. 포도당을 5g/ℓ, 소이펩톤을 2.5g/ℓ, 효모추출물을 1.5g/ℓ의 농도로 첨가하고, 사과산을 0.13g/ℓ의 농도로 첨가하여 pH를 5.8로 조절하였다. 웨이셀라 시바리아 종균을 1% (v/v) 접종하여 37℃에서 48시간 동안 호기환경에서 정치배양하여 발효시켰다.
발효가 완료된 후 발효액을 120℃에서 15분 동안 살균처리한 후 50~60℃에서 24시간 동안 교반하면서 추출한 후 여과기를 통하여 고형분(균체 및 불순물)을 제거하고 추출액을 수집하였다.
수집된 추출액은 60℃에서 감압농축하고 90℃에서 1시간 동안 살균처리하고 80℃에서 열풍건조한 후 분쇄하여 수분 5% 미만의 분말로 제조하였다.
< 실시예 2>
소재의 식품성분 분석 및 특성
원재료인 우엉과 시금치 각각을 상기 실시예에 기재된 방법과 동일하게 효소처리, 발효 및 추출하고, 이들에 대하여 원물, 효소처리 후 추출물 및 발효 후 추출물에 함유되어 있는 철분과 엽산의 함량을 식품공전의 분석방법에 따라 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
철분(㎎/100g) 엽산(㎎/100g)
우엉 원물 0.677 0.031
효소처리 후 2.651 0.145
발효 후 2.951 0.146
시금치 원물 2.588 0.515
효소처리 후 27.340 0.804
발효 후 31.224 0.812
상기 표 1의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 우엉과 시금치는 원물에 비하여 효소처리 후 추출물의 철분 및 엽산 함량이 크게 증가하였고, 발효 후 추출물의 철분 및 엽산 함량은 효소처리 후 추출물에 비하여 높았다.
[ 실험예 ]
< 실험예 1>
조혈기능 개선효과 실험
시료의 준비
추출물시료는 상기 실시예 1에서 제조된 시료를 사용하였다.
실험동물의 구입 및 순화사육
실험에 사용한 5주령의 SD 래트(Sprague-Dawley Rat)는 중앙실험동물에서 구입하여 사용하였다. 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55~60%로 유지되고 명암 순환이 12시간 단위로 조절되는 환경의 사육실에서 1주일 동안 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, Korea)와 물을 자유로이 공급하면서 순화사육하였다.
조혈장해 유발 및 추출물의 투여
동물모델에서 추출물의 조혈장해 억제활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험동물에 조혈장해를 유발하였다.
실험동물에 조혈장해를 일으키기 위한 조혈장해 유도제로는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide, 이하 "CP"라 함)(Sigma에서 구입)를 사용하였다. CP는 알킬화제로서 항암제 및 면역억제제로 사용되는 약제이며, 흔한 부작용으로 골수억제가 보고되어 있어 조혈장해 유도제로 사용하였다.
상기 실험동물을 하기 표 2와 같이 5그룹(각 그룹마다 20마리씩)으로 나누고, 실험 1일째 무처리대조군 1을 제외한 각 래트에 150㎎/㎏BW의 CP를 복강투여하여 조혈기능 장해를 유발하였다.
그 후 18일 동안 실험군 1-1은 100㎎/㎏BW의 추출물과 생리식염수, 실험군 1-2는 200㎎/㎏BW의 추출물과 생리식염수를 경구투여하고, 비교군 1은 헤모힘(Hemo-him, 한국콜마)을 4㎎/㎏BW 농도로 경구투여하였다. 헤모힘은 한국원자력연구원에서 연구개발한 "면역기능향상" 개별인정형 건강기능식품이다.
그룹명 처리내용
무처리대조군 1 무처리
대조군 1 CP 처리
실험군 1-1 CP 처리 + 100㎎/㎏BW 추출물 경구투여
실험군 2-2 CP 처리 + 200㎎/㎏BW 추출물 경구투여
비교군 1 CP 처리 + 4㎎/㎏BW 헤모힘 경구투여
1. 백혈구 검사
실험기간 동안 각 군별 4마리씩을 5번에 걸쳐 졸레틸(45㎎/㎏)과 럼푼(10 ㎎/㎏) 혼합제를 이용하여 마취시킨 후 치사시켰다. 일자별로 희생된 래트의 말초혈액 전혈을 EDTA가 들어있는 시험관에 수집하고 실온에서 30분 정도 잘 혼합한 후 자동혈구분석기로 분석하였다. 분석항목은 일반혈액검사(completer blood cell count, CBC)와 말초혈액 도말검사의 일종인 백혈구(WBC) 감별 계산(WBC differential count)이었다. 측정된 백혈구(WBC) 수치를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과에서, 우엉-시금치 복합발효추출물이 CP에 의한 조혈장해유도로 인하여 감소된 백혈구의 수치를 농도의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있다.
2. 림프구 및 사이토카인 검사
조혈장해를 일으킨 동물모델에서의 말초혈액 내 림프구(LY)의 수치를 측정하고, 면역관련 사이토카인인 IL-2와 IFN-γ를 ELISA 키트(ELISA kit, R&D system)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에서, 우엉-시금치 복합발효추출물이 조혈장해를 일으킨 동물모델에서 말초혈액 내 림프구의 수치 및 면역관련 사이토카인인 IL-2와 IFN-γ를 농도의존적으로 증가시킴을 알 수 있다.
3. 간기능 및 신기능검사
CP 및 우엉-시금치 복합발효추출물의 경구투여가 실험동물의 간 및 신장에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 채취된 혈액에서 분리한 혈청으로 간기능검사인 AST(aspartate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase), 및 신장기능검사인 UN(blood urea nitrogen)와 크레아틴(Creatinine)을 자동생화학분석기 BS-220 (Mindray, New York, NY, USA)로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 결과에서, CP의 투여 및 18일 동안 본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물의 해당 농도별 경구투여는 간기능 및 신장기능의 변화에 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 확인되었다.
4. 골수도말검사
실험동물의 대퇴골 부분을 분리하여 가운데 부분을 절단한 후 신선한 골수조직 일정량을 슬라이드(slide) 위에 접촉(touch)시키고, 또 다른 슬라이드로 밀착시킨 후 수평으로 당겨내어 균일한 도말층을 형성시켜 골수도말 슬라이드 표본을 제조하였다(Touch print법). 제작된 슬라이드 표본을 건조시킨 후 메탄올(methanol)로 고정하고 라이트염색(wright stain)을 실시하여 현미경으로 관찰하여 조혈모세포 및, 과립백혈구, 적혈구, 단핵구 등의 조혈전구세포의 분포 비율을 각 군별로 비교하여 조혈기능을 평가하였다. 그 과정과 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 결과에서 알 수 있듯이, 골수에서 생성되는 과립백혈구, 적혈구, 단핵구 등의 조혈전구세포는 조혈장해 유도에 의해 감소되었다가 본 발명의 추출물의 경구투여에 의해 다시 증가되는 것으로 확인되었다.
< 실험예 2>
항빈혈효과 실험
시료의 준비
추출물시료는 상기 실시예 1에서 제조된 시료를 사용하였다. 원물시료는 우엉과 시금치의 건조분말을 1:1의 중량비로 혼합하여 사용하였다.
실험동물의 구입 및 순화사육
실험에 사용한 5주령의 SD 래트(Sprague-Dawley Rat)는 중앙실험동물에서 구입하여 사용하였다. 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55~60%로 유지되고 명암 순환이 12시간 단위로 조절되는 환경의 사육실에서 1주일 동안 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, Korea)와 물을 자유로이 공급하면서 실험실에 적응시켰다.
철결핍성 빈혈 유발 및 추출물의 투여
실험동물은 각각 12마리씩의 무처리대조군 2(NC군)와 대조군 2(PC군), 8마리씩의 비교군 2-1(AL+SO군), 비교군 2-2(AL+SO군), 실험군 2-1{FE(AL+SO)군}, 실험군 2-2{FE(AL+SO)군}, 비교군 2-3(HMQ군) 및 비교군 2-4(HMQ군)으로 나누었다.
무처리대조군 2를 제외한 실험동물에 무철분식이(Modified AIN-93G diet with no added iron)(#D03072501, Research Diets, America)를 6주 동안 공급하여 철분 결핍성 빈혈을 유도하였다. 실험에 사용된 무철분식이(#D03072501)의 조성을 하기 표 3에 나타내었다. 단위는 (g/㎏ 식이)이다.
#D03072501
g% kcal%
단백질 20.3 20.3
탄수화물 63.9 63.9
지방 7.0 15.8
총계
kcal/g 4.00
첨가된 ppm Fe
성분 gm kcal (계산)
카제인(Casein) 200 800 1.7
L-시스틴(L-Cystine) 3 12 0
콘스타치(Corn Starch) 397,486 1589.9 0.40
말토덱스트린(Maltodextrin) 10 132 528 0.11
슈크로오즈(Sucrose) 100 400 0.08
셀룰로오즈(Cellulose), BW200 0 0 0
아비셀(Avicel), PH101 50 0 0.015
대두유(Soybean Oil) 70 630 0
t-부틸하이드로퀴논(t-Butylhydroquinone) 0.014 0 0.00014
미네랄 믹스(Mineral Mix) S10022G 0 0 0
미네랄 믹스 S18706(철 무첨가) 35 0 0.56
구연산철(Ferric citrate) 0 0 0
비타민 믹스(Vitamin Mix) 10 40 0.009
타르타르산수소콜린(Choline Bitartrate) 2.5 0 0.0005
적색염료(Red dye), FD&C#40 0.05 0 0.0065
청색염료(Blue dye), FD&C#1 0 0 0
총계 1000.050 4000 2.9
6주 동안의 무철분식이에 따른 철결핍성 빈혈의 유도여부를 확인하기 위하여, 무처리대조군 2와 대조군 2의 실험동물을 각각 4마리씩 희생시켜 빈혈혈액지표를 확인하였다. 확인 후 다시 무철분식이를 공급하면서 비교군 2-1은 원물 100㎎/㎏BW, 비교군 2-2는 원물 200㎎/㎏BW, 실험군 2-1은 추출물 100㎎/㎏BW, 실험군 2-2는 추출물 200㎎/㎏BW을 4주 동안 1일 1회 경구투여하였다. 무처리대조군 2와 대조군 2는 생리식염수를 동일한 방법으로 경구투여하였고, 비교예 2-3과 2-4는 일반의약품(OTC) 철분보충제인 헤모큐 플러스 캡슐(Hemo-Q Plus Cap., HMQ)(대웅제약, Korea)을 4㎎/㎏BW와 14㎎/㎏BW 농도로 각각 경구투여하였다. 각 실험그룹의 처리내용을 하기 표 4에 나타내었다.
그룹명 처리내용 동물수 시험약물투여용량(㎎/㎏)/㎖
무처리대조군 2(NC) - 12 PBS 1㎖
대조군 2(PC) - 12 PBS 1㎖
비교군 2-1(AL+SO) 100㎎/㎏BW 원물 8 원물시료 1㎖
비교군 2-2(AL+SO) 200㎎/㎏BW 원물 8 원물시료 1㎖
실험군 2-1{FE(AL+SO)} 100㎎/㎏BW 추출물 8 본발명시료 1㎖
실험군 2-2{FE(AL+SO)} 200㎎/㎏BW 추출물 8 본발명시료 1㎖
비교군 2-3(HMQ) 4㎎/㎏BW 헤모큐플러스 8 HMQ시료 1㎖
비교군 2-4(HMQ) 14㎎/㎏BW 헤모큐플러스 8 HMQ시료 1㎖
이때, AL은 우엉(Arctium lappa L.), SO는 (Spinacia oleracea), AL+SO는 우엉과 시금치의 건조분말, FE(AL+SO)는 우엉-시금치 복합발효추출물, HMQ는 헤모큐플러스 캡슐을 나타낸다.
1. 체중변화 및 식이효율의 측정
모든 실험동물의 식이는 자유섭취방법으로 일정량을 공급하고, 실험기간 동안 매주 일정시간에 사료 잔량을 측정하여 주간 식이 섭취량을 계산하였으며, 체중은 1주일에 1회 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 실험시작일부터 희생일까지를 총 실험기간으로 하여 실험기간 동안의 체중 증가량을 실험기간 동안의 식이 섭취량으로 나누어 산출하였다.
동물실험 10주 동안의 실험동물의 체중변화 및 식이효율을 측정 및 산출한 결과를 도 5에 나타내었다.
실험기간 10주 동안의 체중변화와 식이 섭취량 및 식이효율의 변화는 정상사료 식이군과 무철분사료 식이군 간, 또는 4주 동안의 원물, 추출물 및 헤모큐플러스 투여군 간 유의한 차이가 나타나지 않았다.
2. 혈액검사
무철분식이와 함께 시험약물을 경구투여한 2주 후 및 4주 후 2회에 걸쳐 군당 임의로 선택된 4마리씩의 동물을 졸레틸(45㎎/㎏)과 럼푼(10㎎/㎏) 혼합제를 이용하여 마취한 후 래트의 복대정맥에서 혈액을 채취하였다.
전혈은 EDTA가 들어있는 시험관에 수집하여, 실온에서 30분 정도 잘 혼합한 후 빈혈 측정지표를 자동 혈구분석기(automatic blood cell counter, Sysmex NE 8000, Toa Medical Electronics Co., Japan)를 사용하여 측정하였다. 혈액을 이용하여 측정한 빈혈 측정지표는 다음과 같다:
(1) 일반 혈액 검사(complete blood cell count, CBC) : ① 혈색소 농도(hemoglobin; HGB), ② 적혈구 용적률(hematocrit; HCT), ③ 적혈구(red blood cell, RBC), ④ 백혈구(white blood cell, WBC), ⑤ 혈소판 수(platelet; PLT)
(2) 적혈구 지수(red blood cell indices) : ① 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), ② 평균 적혈구혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), ③ 평균 적혈구혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), ④ 적혈구 크기 분포(red cell distribution width, RDW)
(3) 혈중 철분 함량 및 총 철결합능 : ① 혈중 철분(iron) 함량, ② 철결합능(Total iron binding capacity, TIBC).
나머지 혈액은 플레인 튜브(plain tube)에 넣고 3,000rpm에서 5분간 원심분리하여 혈청을 분리하여 헤모글로빈(hemoglobin) 합성에 필요한 혈중 철분(iron) 함량 및 철결합능(Total iron binding capacity, TIBC)을 자동생화학분석기 BS-220(Mindray, New York, NY, USA)으로 측정하였다.
실험동물의 말초혈액에서 CBC항목(RBC, HGB, HCT, PLT)을 측정한 결과를 도 6에 나타내고, 실험동물의 혈청 중 철분함량과 총 철결합능(TIBC) 및 적혈구지수(MCV, MCH, MCHC, RDW, MPV)를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
각 군간의 혈액학적 분석 결과에서는, 정상사료를 섭취한 무처리대조군 2에 비하여 무철분사료를 섭취한 대조군 2가 혈액학적 빈혈 측정지표인 적혈구수, 혈색소 농도, 적혈구 용적, 헤모글로빈합성에 필요한 혈청 중 철분 함량 등이 유의성 있게 낮아졌으며, 4주 동안의 본 발명의 추출물의 경구투여에 의해 유의적인 개선효과를 농도의존적으로 나타내었다. 총 철결합능은 철결핍성 빈혈이 유도된 실험시작시 유의적으로 높아졌고 본 발명의 추출물을 투여한 4주째에 다시 낮아졌으나 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
3. 말초혈액도말표본 검사
전혈을 소량 채취하여 슬라이드 유리 위에 도말건조한 후 라이트염색(Wright's stain)을 시행하여 말초혈액도말표본(peripheral blood smear)을 제조하고, 적혈구 크기와 형태 및 혈색소 농도를 현미경(×1000)으로 비교 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 결과에서 알 수 있듯이, 무철분사료의 급여에 의하여 적혈구의 크기가 감소하고 적혈구의 형태가 비정상적이며 혈색소 농도가 낮아졌던 실험동물에 본 발명의 추출물을 투여함으로써 적혈구 크기가 증가하고 적혈구의 형태가 정상적으로 변하며 혈색소 농도가 농도의존적으로 증가하였다.
4. 간기능 및 신기능검사
시험약물의 투여로 인한 간기능 및 신기능의 변화를 확인하기 위한 AST(aspartate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase), BUN(blood urea nitrogen)와 크레아틴(Creatinine)을 자동생화학분석기 BS-220 (Mindray, New York, NY, USA)로 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 10주 동안의 철결핍성 빈혈 유도 및 4주 동안의 본 발명의 우엉-시금치 복합 발효물의 해당 농도별 경구투여에 의하여 실험동물의 간기능 및 신장기능에서 변화는 관찰되지 않았다.
본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물은, 조혈기능을 개선하고 빈혈, 특히 철결핍성 빈혈(Iron Deficiency Anemia)을 예방하는 효과가 우수한 조성물로서, 조혈기능 개선 및 빈혈 예방을 위한 약품이나 건강식품 용도로 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 우엉-시금치 복합발효추출물은 대량 생산되는 채소인 우엉과 시금치를 이용한 경제성 있는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물로서, 종래의 조혈기능 개선 및 빈혈 예방 제품을 대체하여 널리 활용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 분쇄된 우엉과 시금치를 효소처리하고, 효소처리된 우엉-시금치 복합물을 발효시킨 후 추출하여 얻어진 우엉-시금치 복합발효추출물을 유효성분으로 포함하며,
    상기 우엉-시금치 복합발효추출물은,
    우엉과 시금치를 혼합하여 분쇄하는 단계;
    분쇄된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합하고, 반응물 1ℓ당 펙틴 분해효소 0.05~0.15g과 섬유소 분해효소 0.025~0.10g을 혼합한 후 45~60℃, pH 4.5~6.0에서 50~100rpm 속도로 교반하면서 18~30시간 동안 반응시키는 효소처리단계;
    상기 효소처리된 우엉-시금치 복합물에 정제수를 혼합하고, 유산균 종균을 0.5~2%(v/v) 첨가하고, 탄소원을 5~10g/ℓ, 질소원을 1.5~2.5g/ℓ 및 효모추출물을 1.0~2.0g/ℓ 농도로 첨가한 후, 35~40℃, pH 5.0~6.0에서 36~60시간 동안 호기배양하는 발효단계; 및
    상기 발효액을 100~140℃에서 10~20분 동안 살균처리하고 50~60℃에서 18~30시간 동안 교반하면서 추출한 후 여과하여 추출액을 수집하는 추출단계를 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 효소처리는 펙틴 분해효소와 섬유소 분해효소에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 발효는 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 불가리쿠스 및 웨이셀라 시바리아 중 선택된 1종 이상의 유산균을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 추출액을 건조시켜 수분 5% 미만의 분말로 제조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 우엉과 시금치는 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선 및 빈혈 예방용 조성물.
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