KR101756428B1 - 인산칼슘을 이용한 pH 변화에 따른 선택적 일산화질소 방출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일산화질소의 방출을 제어하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인산칼슘을 이용하여 pH 변화에 따라 일산화질소를 선택적으로 방출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일산화질소를 선택으로 방출하는 방법은 원하는 부분까지 안정적으로 일산화질소를 전달할 수 있으며, pH의 변화에 의해 일산화질소의 방출을 유도함으로써 일산화질소의 손실을 막음과 동시에 치료 효과를 높일 수 있는 장점을 가지고 있다.

Description

인산칼슘을 이용한 pH 변화에 따른 선택적 일산화질소 방출 방법 {Emission control method of pH-responsive nitric oxide using calcium phosphate}
본 발명은 일산화질소의 방출을 제어하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인산칼슘을 이용하여 pH 변화에 따라 일산화질소를 선택적으로 방출하는 방법에 관한 것이다.
일산화질소는 반응성이 큰 라디칼 분자로 세포 내에 일산화질소 생성 효소에 의해 합성되는 기체이며 생체 내 생리 활성 물질로서 중요한 기능을 가지고 있다. 특히, 신경전달 시스템, 심혈관계 및 면역시스템 등 다양한 생리현상 및 질병에 관련이 있는 것으로 알려지고 있다.
예를 들면, 일산화질소는 농도와 방출 시간에 비례하여 상반되는 치료 효과를 나타낸다. 고농도의 일산화질소가 단시간 방출이 되면 항암효과 및 항박테리아 효과가 나타나며 적은 양의 일산화질소가 장시간 방출되면 상처 치료, 세포 성장, 혈관 생성 등과 관련이 있다고 알려져 있다. 하지만 일산화질소는 가스 형태로 존재하므로 효과적인 전달에 많은 제약이 있다.
대표적으로 일산화질소를 방출하는 작용기인 디아제늄디올레이트 (diazeniumdiolate)는 노노에이트(NONOate)로도 불리는데, 그 일반식은 RR'N-N(O)=NOR"으로 나타낼 수 있다. 디아제늄디올레이트는 고체 형태로 안정 하게 보관할 수 있으며, 물에 대한 용해도가 높고, 생체 온도와 pH 조건에서 분해될 뿐만 아니라, pH에 따라 다양한 방출 형태를 가진다. 디아제늄디올레이트는 쉽게 일산화질소를 생성하고 상대적으로 다량의 일산화질소 방출을 할 수 있지만, 물과 접촉과 동시에 방출되는 문제점을 가지고 있다.
이를 극복하기 위해 외부 자극에 의한 일산화질소 방출 기술이 개발되고 있지만 외부 자극과 생체 적합성 물질을 응용한 사례는 매우 드물다. 본 출원인은 생체적합성 물질인 인산칼슘을 도입하여 외부와의 접촉을 막고 pH 변화에 의해서 일산화질소의 방출을 유도하는 새로운 시스템을 도입하고자 하였다. 또한 전달과정에서 발생하는 일산화질소의 손실을 최소화 하고, 보다 안정적으로 일산화질소를 전달하는 시스템을 개발하고자 한다.
한국 동록특허공보 제 10-1351130호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 과량의 일산화질소를 원하는 부분까지 안정적으로 전달할 수 있는 일산화질소 방출 입자를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 일산화질소 방출 입자는 물과 접촉하는 동시에 일산화질소를 방출하는 디아제늄디올레이트 작용기의 문제점을 해결하기 위하여, 제한적인 pH 조건에서만 일산화질소의 방출을 유도하여 치료 효과를 높일 수 있는 선택적인 일산화질소 방출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이차아민기를 포함하는 실란커플링제 및 인산칼슘을 포함하는 것을 특징으로 하는 일산화질소 방출 입자에 관한 것이다.
본 발명은 a) 이차아민기를 포함하는 실란커플링제가 함유된 용액내에서 인산칼슘을 형성하는 단계; 및 b) 일산화질소 가스를 투입하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성하는 단계;를 포함하는 일산화질소 방출 입자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 제조된 일산화질소 방출 입자에 pH 5.0 내지 7.4로 조절하여 일산화질소가 방출되는 것을 특징으로 하는 선택적 일산화질소 방출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일산화질소 방출 입자를 도입한 일산화질소의 선택적인 방출 방법은 원하는 부분까지 안정적으로 일산화질소를 전달할 수 있으며, pH의 변화에 의해 일산화질소의 방출을 유도함으로써 일산화질소의 손실을 막음과 동시에 치료 효과를 높일 수 있는 장점을 가지고 있다.
또한 본 발명의 일산화질소 방출 입자는 다른 약물을 추가적으로 첨가할 수 있으며, 듀얼 딜리버리를 통해 약물의 치료 효과와 더불어 일산화질소의 치료 효과를 볼 수 있을 것이라 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 제조하는 과정을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 Transmission Electron Microscopy로 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 Powder XRD를 통해 측정한 결정구조 분석 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 자외-가시광 분광기(UV-vis spectroscopy)로 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 적외선 분광기(FT-IR)로 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 제타 전위 측정기 (Zeta potential)로 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 칼슘이온 검출 방법을 통해 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 pH 7.4에서 AEATS의 일산화질소 검출기를 통해 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 pH의 변화에 의한 CaP-NO의 일산화질소 검출기를 통해 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 pH 7.4와 5.0의 반복적인 변화에 의한 CaP-NO의 일산화질소 검출기를 통해 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 일산화질소 방출 입자를 생체 적합성 능력 (MTT assay)을 측정한 결과이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명은 이차아민기를 포함하는 실란커플링제 및 인산칼슘을 포함하는 일산화질소 방출 입자에 관한 것이며, 이를 이용하여 일산화질소를 선택적 방출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 “선택적 방출”이란 생체 내 특정 조건에서 일산화질소를 방출 할 수 있는 것을 뜻하며 즉, 인공 체내 삽입물이나 의료 장치 등으로 체내에 삽입된 방출 입자가 특정 조건에서 일산화질소를 방출하는 것을 일컫는다. 이러한 일산화질소 방출 입자는 예측할 수 없이 간헐적으로 방출되거나 폭발적인 방출 형태로 방출되지 않는다는 의미를 내포한다.
이하, 본 발명의 일산화질소 방출 입자를 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 일산화질소 방출 입자는 일산화질소를 방출할 수 있는 작용기를 내재하고 있으며, 상기 작용기는“디아제늄디올레이트(diazeniumdiolate)”일 수 있다.
상기 디아제늄디올레이트 작용기는 하기 반응식 1에 나타낸 것처럼 이차아민에 일산화질소를 반응시켜 얻을 수 있다. 또한 상기 디아제늄디올레이트 작용기는 RR’N-N(O)=NOR”의 일반식으로 나타낼 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112015113857713-pat00001
상기 디아제늄디올레이트 작용기는 작용기당 2분자의 일산화질소를 방출하므로 방출 입자에 포함시켰을 때 상대적으로 높은 농도의 일산화질소를 발생할 수 있다. 그러나 물과 접촉하는 동시에 일산화질소의 방출이 일어나므로 효율적인 일산화질소 전달을 위해 외부 자극을 통해 일산화질소의 방출을 제어하는 게이트키퍼 시스템이 필요하다. 따라서 본 발명은 생체 내 특정 조건에 노출되었을 때, 디아제늄디올레이트 작용기가 반응하여 일산화질소를 방출할 수 있다.
상기 반응식 1의 디아제늄디올레이트는 R1과 R2에 해당하는 작용기를 조절함으로써 일산화질소 방출 특성을 조절할 수 있다. 또한, 디아제늄디올레이트는 전자 밀도가 집중되어 있는 산소 원자를 가지고 있으므로, 디아제늄디올레이트의 산소 원자에 다른 약리 활성 물질을 연결한 결합체(conjugate) 형태로 일산화질소 외의 다른 활성 물질을 포함 할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서는 이차아민기를 포함하는 실란커플링제를 사용할 수 있다. 이러한 실란커플링제는 이차아민기가 일산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성할 수 있다.
본 발명의 실란커플링제는 한 분자내에 적어도 두 종류의 반응성이 다른 관능기를 갖고 있는 구조로써, 구조내의 알콕시실릴(Si-OR) 관능기는, 가수분해되면 실라놀기가 되어 무기물과 결합하며, 유기물과 무기물을 서로 연결시키는 역할을 할 수 있다.
상기 실란커플링제는 하기 화학식 1로 표현될 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015113857713-pat00002
(상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 (C1~C12)알킬렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 (C1~C4)알킬기이고, n은 1~3이다.)
본 발명에서는 더욱 바람직하게, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(AEATS)를 사용하여 본 발명의 목적하는 효과를 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시 형태에서 일산화질소 방출 입자에 디아제늄디올레이트 작용기를 얼마나 도입하여야 하는지는 특별히 제한은 없으나, 이차아민 작용기 중 디아제늄디올레이트로 변환되는 비율은 50% 이상 정도이며, 이 비율에 구애받는 것은 아니다. 통상적인 경우 가능한 디아제늄디올레이트의 변환율을 높게 하는 것이 바람직한 때가 많지만 궁극적으로는 이 분야의 평균적 기술자가 원하는 최종적인 일산화질소 방출 특성에 따라 반응 조건을 적당하게 조절함으로써 디아제늄디올레이트 작용기의 함유량을 조절할 수 있다.
본 발명에서는 일산화질소의 방출을 제어하는 게이트키퍼 시스템으로 인산칼슘을 사용하여 pH변화에 의한 일산화질소 방출을 제어할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 인산칼슘은 pH가 낮아지면 인산칼슘이 분해되므로 일산화질소가 선택적으로 방출될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인산칼슘은 칼슘의 인산염을 지칭하는 말로써, 바람직하게는 수산화아파타이트를 사용할 수 있다.
상기 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)는 생체 무기화합물로 인체 뼈와 가장 유사한 구조를 가지고 있어 고분자와 결합하여 경조직 대체 물질로 우수한 골 재생능력, 생체활성, 생체적합성 및 생분해성의 특징을 자지고 있어 조직공학에 주로 활용될 수 있다. 본 발명에서는 pH가 낮아지면 분해되는 특성을 이용하여 효과적인 일산화질소의 방출을 제어하는 게이트키퍼 시스템으로 사용될 수 있다.
본 발명은 a) 이차아민기를 포함하는 실란커플링제가 함유된 용액내에서 인산칼슘을 형성하는 단계; 및
b) 일산화질소 가스를 투입하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성하는 단계;
를 포함하는 일산화질소 방출 입자의 제조방법을 제공 할 수 있다.
상기 실란커플링제는 하기 화학식 1의 실란커플링제를 혼합할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015113857713-pat00003
(상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 (C1~C12)알킬렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 (C1~C4)알킬기이고, n은 1~3이다.)
상기 a)단계에서 인산칼슘의 형성은 수용성의 인산염과 칼슘염을 액상 매질을 이용하여 제조하는 습식법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 인산염은 특별히 제한되지 않으나, 인산(H3PO4), 제1인산나트륨(NaH2PO4), 제2인산나트륨(Na2HPO4), 제1인산칼륨(KH2PO4), 제2인산칼륨(K2HPO4), 제1인산암모늄(NH4H2PO4), 제2인산암모늄((NH4)2HPO4) 등을 사용할 수 있다. 또한 칼슘염은 질산칼슘(Ca(NO3)2), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 아세트산칼슘(Ca(CH3COO)2) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 혼합은 액상 매질을 더 포함하는 것이 바람직하다. 액상 매질은 물, 알코올 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있으며, 물은 정제수 또는 증류수를 사용하는 것이 바람직하다. 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 1가 알코올을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 a)단계에서 첨가 순서는 제한되는 것은 아니나, 부산물을 방지하기 위해서 바람직하게는 상기 실란커플링제를 인산염 용액에 용해시킨 후, 질산염 용액을 첨가하여 혼합할 수 있다.
본 발명에서 형성되는 인산칼슘은 바람직하게는 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)일 수 있다.
본 발명의 수산화아파타이트는 반응시, pH에 민감하여 pH 12 부근에서 침전물이 생성되지만 반응이 진행할수록 pH가 감소되어 반응종반부에서는 7 내지 11 영역에서 침전물이 생성될 수 있다. 수산화아파타이트 침전물은 pH가 7 이하의 낮은 영역에서의 그들의 결정구조내에 충분한 칼슘을 확보하지 못하게 되어 칼슘이 결핍된 수산화아파타이트, 즉 구조가 붕괴된 수산화아파타이트가 생성될 수 있다.
본 발명에서는 상기 a)단계에서 pH를 7 내지 11 로 조절하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 혼합된 용액은 약 50 내지 90℃에서 반응시킬 수 있다. 반응 시간은 생성되는 인산칼슘 화합물의 종류와 관련되어 있으므로 이를 고려하여 적절히 선택되어야 한다. 반응 시간은 침전량과 입자의 크기에 영향을 미치기 때문에 30 내지 90분이 바람직하다. 반응이 끝나면 용액을 여과하여 침전물을 분리하고, 분리한 침전물은 세척한 후 건조하여 분말을 제조할 수 있다.
상기 a)단계에서 제조된 분말에 일산화질소 가스를 투입하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성하는 단계는 다음과 같다.
상기 디아제늄디올레이트 작용기는 하기 반응식 1에 나타낸 것처럼 이차아민에 일산화질소 가스를 반응시켜 얻을 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112015113857713-pat00004
본 발명에서는 일산화질소 가스의 투입 전에 아르곤 가스를 이용하여 배기하는 단계를 수행할 수 있는데, 배기는 10 psi 내지 30 psi의 압력으로 1번 내지 3번 수행할 수 있다.
다음으로, 배기를 마친 반응기에 일산화질소 가스의 투입은 40 psi 내지 200 psi의 압력 하에 수행할 수 있고, 바람직하게는 80 psi 내지 150 psi의 압력 하에 수행할 수 있다. 상기 일산화질소 투입 후 1일 내지 5일간 반응시킴으로써 디아제늄디올레이트 작용기를 포함하는 일산화질소 방출 입자를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 상기 제조된 일산화질소 방출 입자에 pH 5.0 내지 7.4로 조절 하여 일산화질소가 방출되는 것을 특징으로 하는 선택적 일산화질소 방출 방법을 제공 할 수 있다.
또한, 본 발명의 일산화질소 방출 입자는 내부 또는 표면에 약리 효과 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 이를 통해 일산화질소 효과와 더불어 추가적인 약리 효과를 목적으로 사용할 수 있다.
상기 약리 효과 물질을 포함하는 방법은 일산화질소 방출 입자와 화학 결합으로 연결된 결합체(conjugate) 형태로 고정될 수도 있고, 화학 결합 없이 단순 분산되어 있을 수도 있다. 예를 들면, 약리 효과 물질이 디아제늄디올레이트 작용기의 산소 원자에 공유 결합되어 고정될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서는 디아제늄디올레이트의 음전하에 양전하를 띠는 약리 효과 물질 또는 그 유도체를 전기적으로 결합할 수 있다.
상기 약리 효과 물질은 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 혈전 형성이나 혈액 응고를 방지하는 물질, 항산화제, 소염제, 상처 치유 촉진 물질, 항암제, 항박테리아제 등을 포함할 수 있으며, 약물의 치료 효과와 더불어 일산화질소의 치료 효과를 볼 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 일산화질소 방출입자의 제조
1. 인산칼슘과 실란커플링제의 반응(CaP-AEATS)
22㎍ AEATS(N-(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane)를 0.1M의 (NH4)2HPO4 10ml용액에 용해시킨 후, 0.1M의 Ca(NO3)2·4H2O 20ml를 드롭방식(dropwise)으로 첨가하였다.(Ca:AEATS = 10:1) 암모니아수를 첨가하여 pH 9로 조절하였으며, 60℃에서 1시간 동안 반응하였다.
원심분리기(centrifugation, 3000 rpm, 15 min)에서 분리한 후, 탈이온수(deionized water)로 3번 세척하였다. 48시간동안 동결건조(freeze-drying)하여 CaP-AEATS를 수득하였다.
2. 디아제늄디올레이트 작용기 치환(CaP-NO)
상기 수득한 CaP-AEATS 10mg을 0.5M NaOMe/MeOH 3ml에 용해시킨 후 고압반응기에 넣는다. 상기 반응기는 20psi의 Ar 가스로 두 번 배기(purging)시킨 후, 80 psi의 NO가스로 3일간 반응시켰다. 상기 일산화질소를 방출할 수 있는 디아제늄디올레이트기를 가진 CaP-NO는 원심분리기(centrifugation, 4000 rpm, 10 min)에서 분리한 후, 남아있는 용매를 진공건조하여 제거하였다.
[비교예 1] pure CaP의 제조
0.1M의 (NH4)2HPO4 10ml 용액을 준비한 후, 0.1M의 Ca(NO3)2·4H2O 20ml를 드롭방식(dropwise)으로 첨가하였다. 암모니아수를 첨가하여 pH 9로 조절하였으며, 60℃에서 1시간 동안 반응하였다.
원심분리기(centrifugation, 3000 rpm, 15 min)에서 분리한 후, 탈이온수(deionized water)로 3번 세척하였다. 48시간동안 동결건조(freeze-drying)하여 CaP-AEATS를 수득하였다.
[특성 평가]
일산화질소 검출 장비를 통해 pH의 변화에 따른 일산화질소 방출 거동을 확인하였다. 일산화질소의 존재 및 인산칼슘의 생분해적 특성은 투과전자현미경, X-선 회절분석, 자외선-가시광선 분광기, 적외선 분광기, 칼슘이온의 검출 등을 통해 확인하였다.
또한 생체 적합성 여부를 확인하기 위해 자궁경부암 조직에서 얻어낸 Hela cell과 섬유아세포(NIH-3T3)을 이용하여 물질의 독성 여부를 확인하였다.
1. 투과전자현미경 분석
도 2는 TEM(Transmission Electron Microscopy, JEOL JEM-1011 Japan)을 이용하여 생분해성을 확인한 결과이다.
pH 7.4와 pH 5에서 CaP-NO의 입자 크기의 변화를 관찰한 결과 pH 7.4에서는 약 200nm의 입자를 유지하는 것이 관찰되었으나 pH 5에서는 수산화아파타이트의 생분해 특성으로 인해 입자사이즈가 현저하게 줄어드는 것이 확인되었다.
2. X-선 회절 분석(Powder XRD)
도 3은 Powder XRD(using Cu Kα 1 radiation (λ = 1.54 A) from Rigaku SmartLab at 40 kV and 30 mA.)를 통해 관찰한 결과이다.
Pure한 CaP와 비교하여, CaP-AEATS, CaP-NO의 결정구조의 변화를 관찰한 결과 AEATS와 NO가 들어갔음에도 수산화아파타이트의 결정구조는 변하지 않는 것이 확인되었다.
3. 자외-가시광 분광기(UV-Vis spectroscopy), 적외선 분광기(FT-IR) 분석
도 4와 도 5는 자외-가시광 분광기, 적외선 분광기를 통해 관찰한 결과, 일산화질소로 인해 특정 peak형성 확인을 하여 일산화질소의 방출을 확인할 수 있었다. 적외선 분광기를 통해 1300~1700 cm-1 영역에서 일산화질소의 고유 시그널이 관찰되었다. 자외-가시광 분광기를 통해 250nm 영역에서 일산화질소 고유 피크가 나타났음을 확인하였다.
4. 제타 전위 (Zeta potential) 분석
도 6은 제타 전위 분석기를 통해 전위를 각각 측정해 본 결과 자외-가시광 분광기, 적외선 분광기를 통해 관찰한 결과, AEATS 도입 후 약한 음전하를 띄고 일산화질소 도입 후 다시 강한 음전하를 나타내는 것을 통해 일산화질소의 존재 여부를 확인하였다.
5. pH에 따른 칼슘이온 검출(Aresenazo assay)
도 7은 Arsenazo Ⅲ complexion method)[Micaylova Ⅴ. Et al., Anal. Chim. Acta, 53(194), 1971]에 의한 칼슘이온 검출 결과이다. 약산성일 때 수산화아파타이트의 생분해성을 칼슘 이온의 검출을 통해 확인한 결과 pH 7.4에서는 검출되지 않았으나 pH 5에서 49.3%의 칼슘이온이 검출되는 것을 확인하였다.
6. pH에 따른 일산화질소 방출 (Sievers NOA)
도 8, 9, 10은 합성한 CaP-NO 의 pH 변화에 따른 일산화질소 방출거동을 확인하기 위해 일산화질소 검출기 (Sievers NOA, GE analytical instruments, USA)를 이용하였다. 도 8은 DPBS(40ml pH 7.4)에 1mg의 AEATS를 넣어 관찰한 결과 다량의 일산화질소의 방출이 일어나는 것을 확인하였고 도 9는 pH에 변화에 따른 CaP-NO의 일산화질소 방출을 확인한 것으로 DPBS (40ml, pH 7.0, 6.0, 5.0)에 1mg의 CaP-NO를 넣고 관찰한 결과 pH가 낮아짐에 따라 수산화아파타이트의 분해가 빠르게 일어나는 것을 확인하였다. 도 10은 pH 7.4에서 CaP-NO의 일산화질소 방출이 일어나지 않았으나 HCl을 이용하여 pH 5로 낮추니 일산화질소의 방출이 일어났다. 다시 pH를 7.4로 높이니 방출이 일어나지 않았으며 pH의 변화를 반복적으로 수행하여 pH 5일 때, 일산화질소의 방출이 일어나는 것을 확인하였다.
7. Hela Cell과 NIH 3T3 cell을 이용한 세포 독성 테스트 (MTT assay)
MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아 있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
Control(only cell), Pure CaP, AEATS-CaP, CaP-NO를 각각 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1mg/ml로 준비하여 Hela cell과 NIH3T3 (8000개) cell이 seeding 된 plate에 넣어 24시간 인큐베이터에서 보관 후 세포 독성을 확인한 결과 Control 샘플 대비 95%이상의 세포 생존 능력을 나타냈으며, 이는 CaP-NO가 독성을 유발하지 않음을 나타낸다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 이차아민기를 포함하는 실란커플링제 및 인산칼슘을 포함하는 입자로서, 상기 입자는 상기 실란커플링제와 인산칼슘의 반응을 통해 제조되며, 상기 실란커플링제는 하기 화학식 1로 표현되는 것을 특징으로 하는 일산화질소 방출 입자.
    [화학식 1]
    Figure 112017009982673-pat00017

    (상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 (C1~C12)알킬렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 (C1~C4)알킬기이고, n은 1~3이다.)
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 실란커플링제는 이차아민기가 일산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성하는 것인 일산화질소 방출 입자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 인산칼슘은 수산화아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)인 일산화질소 방출 입자.
  5. a) 이차아민기를 포함하는 실란커플링제가 함유된 용액내에서 인산칼슘을 형성하여, 상기 실란커플링제와 인산칼슘을 반응시키는 단계; 및
    b) 일산화질소 가스를 투입하여 디아제늄디올레이트 작용기를 형성하는 단계;
    를 포함하며, 상기 실란커플링제는 하기 화학식 1로 표현되는 일산화질소 방출 입자의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112017009982673-pat00018

    (상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 (C1~C12)알킬렌기이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 (C1~C4)알킬기이고, n은 1~3이다.)
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 a)단계에서 인산칼슘은 인산(H3PO4), 제1인산나트륨(NaH2PO4), 제2인산나트륨(Na2HPO4), 제1인산칼륨(KH2PO4), 제2인산칼륨(K2HPO4), 제1인산암모늄(NH4H2PO4) 및 제2인산암모늄((NH4)2HPO4)에서 선택되는 어느 하나인 인산염과 질산칼슘(Ca(NO3)2), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 수산화칼슘(Ca(OH)2) 및 아세트산칼슘(Ca(CH3COO)2)에서 선택되는 어느 하나인 칼슘염을 혼합하여 형성하는 것인 일산화질소 방출 입자의 제조 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 a)단계에서 pH를 7 내지 11로 조절하는 것인 일산화질소 방출 입자의 제조방법.
  8. 제 1항, 3항 및 4항에서 선택되는 어느 한 항의 일산화질소 방출 입자에 pH 5.0 내지 7.4로 조절하여 일산화질소가 방출되는 것을 특징으로 하는 선택적 일산화질소 방출 방법.
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