CN112057671B - 一种多功能型仿生ha颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多功能型仿生ha颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法和应用。该方法包括：具有仿生结构羟基磷灰石微纳米颗粒的制备；姜黄素纳米前药的制备；将羟基磷灰石粉体与姜黄素纳米前药加入水中，混合均匀，然后孵育吸附，离心，冷冻干燥，灭菌，得到复合微纳米颗粒。本发明制备得到的复合微纳米颗粒具有高载药量和选择靶向功能，生物相容性良好，对生物机体无明显毒副作用；载药物量高时复合颗粒可以有效抑制骨肿瘤的生长，载微量药物时复合颗粒的微纳多级结构可以高效地促骨组织的再生修复。

Description

一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料的技术领域，具体涉及一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨肿瘤，它容易向肺部转移。目前完全根治性切除是临床上治疗骨肉瘤的首选方法。然而，绝大多数的病例在手术中难以被完整切除。因此，术后化疗对于杀死残余癌细胞至关重要。高剂量的传统药物治疗虽然取得了良好的临床效果，但化疗易引发严重的后遗症。此外，为了缓解患者的肢体活动受限程度，手术产生的骨组织缺损也需要进行必要的修复或重建。因此，开发既能高效地促进骨再生修复，又能靶向作用局部残余的骨肉瘤细胞的多功能生物材料对于解决骨肿瘤的临床治疗难题具有重要意义。
姜黄素是从天然植物姜黄中提取的多酚类成分，对多种癌细胞具有显著的抑制效果，并可逆转细胞耐药性，增强化疗敏感性。此外，姜黄素对健康的成骨细胞毒性很低，却可选择性杀死骨肉瘤细胞。因此，姜黄素具有很大的潜力发展成为一种新的骨肿瘤治疗药物。
天然骨组织具有从纳米尺度到宏观层次的多级复杂构造，这赋予其强大的力学性能和生物功能。因此，开发具有微/纳米多级构造的新型生物材料，模拟天然骨组织的组成、结构和性能，具有重要的临床应用前景。HA具有良好的生物相容性、骨传导性和骨诱导性，并被广泛用作药物和基因的载体。此外，三维中空结构材料因独特的结构和超高的比表面积使其在药物递送中具有突出的性能。因此，通过仿生合成技术，可获得具有多级微/纳结构、高比表面积和优异生物相容性的中空HA颗粒。这类HA微纳米颗粒可同时提供骨修复性能和实现对抗癌药物的装载，用于多功能骨肿瘤治疗材料的开发。
文献(Lee,W.-H.,C.-Y.Loo,and R.Rohanizadeh,Functionalizing the surfaceof hydroxyapatite drug carrier with carboxylic acid groups to modulate theloading and release of curcumin nanoparticles.Materials Science&EngineeringC-Materials for Biological Applications,2019.99:p.929-939.)虽通过对HA颗粒表面的化学修饰一定程度上提高了对姜黄素纳米药物的装载能力并取得一定的抑癌效果，但是其载药率只有约2-3％。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法。
本发明针对现有骨肿瘤治疗材料设计性能上存在的缺点和不足之处，提供了一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料及其制备方法。
该复合微纳米颗粒由具有仿生结构的HA颗粒、姜黄素纳米前药共混后，离心弃上清液，冷冻干燥，制备得到的复合材料。仿生HA颗粒具有高比表面积和多级结构，其微纳结构具有较高的成骨活性和骨诱导性；复合微纳米颗粒具有高载药量和选择靶向功能，生物相容性良好，对生物机体无明显毒副作用；载药物量高时复合颗粒可以有效抑制骨肿瘤的生长，载微量药物时复合颗粒的微纳多级结构可以高效地促骨组织再生修复。
本发明的目的还在于提供所述的一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的制备方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)仿生HA微纳米颗粒的制备：将磷酸氢二铵加入水中，混合均匀，得到磷酸氢二铵溶液；然后将所述磷酸氢二铵溶液的pH值调节为5.6-6.2，得到溶液a；将硝酸钙加入所述溶液a，搅拌均匀，得到溶液b；将柠檬酸钠加入溶液b中，搅拌均匀，升温进行加热处理，离心取沉淀，离心洗涤，冷冻干燥，得到羟基磷灰石粉体(HA微纳米颗粒)；
(2)姜黄素前药的制备：将聚乙二醇单甲醚(mPEG)、丁二酸酐及对甲基苯磺酸混合，然后在氮气气氛下进行加热反应，得到加热反应的产物；将所述加热反应的产物溶解于二氯甲烷中，混合均匀，过滤取滤液，将滤液与第一沉淀剂混合进行第一次重结晶处理，过滤取沉淀，冷冻干燥，得到修饰有SA的mPEG产物(mPEG-SA)；将修饰有SA的mPEG产物(mPEG-SA)、姜黄素、N,N'-二环己基碳酰亚胺、4-二甲氨基吡啶及三乙胺加入超干溶剂中，混合均匀，在氮气气氛下进行反应，过滤取滤液，然后把滤液与第二沉淀剂混合进行第二次重结晶处理，过滤取沉淀，冷冻干燥，得到接枝有mPEG-SA的姜黄素前药(mCur)；
(3)复合微纳米颗粒的制备：将所述羟基磷灰石粉体与所述接枝有mPEG-SA的姜黄素前药(mCur)加入去离子水中，超声分散均匀，得到混合液，然后于摇床中孵育吸附，离心取上清液，冷冻干燥，辐射灭菌，得到所述多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料。
优选地，步骤(1)中，将所述磷酸氢二铵溶液的pH值调节为6.0。
进一步地，步骤(1)所述磷酸氢二铵溶液的浓度为1-45mM；所述硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为1-90：1mmol/L；所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为5-8：1；所述加热处理的温度为120-200℃，加热处理的时间为1-24h。
优选地，步骤(1)所述磷酸氢二铵溶液的浓度为1-36mM；所述硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为1-60mmol/L；所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为6-7：1。
优选地，步骤(1)所述加热处理的温度为150-200℃，加热处理的时间为2-6h。
进一步地，步骤(2)所述聚乙二醇单甲醚的分子量为350-2000；所述聚乙二醇单甲醚与丁二酸酐的质量比为2:1-20:1；步骤(2)所述丁二酸酐与对甲基苯磺酸的质量比为2:1-5:1；所述加热反应的温度为60-120℃，加热反应的时间为1-24h。
优选地，所述步骤(2)所述聚乙二醇单甲醚的分子量为550；所述聚乙二醇单甲醚与丁二酸酐的质量比为8：1.6；丁二酸酐与对甲基苯磺酸的质量比为1.6：0.56。
优选地，步骤(2)所述加热反应的温度为80℃；所述加热反应的时间为3h。
进一步地，步骤(2)所述聚乙二醇单甲醚与二氯甲烷的质量体积比为0.25-0.5：1g/mL；所述第一沉淀剂为无水乙醚或无水丙酮；所述第一沉淀剂与二氯甲烷的体积比为5:1-10:1；所述第一次重结晶处理的温度为-20～30℃。
优选地，步骤(2)所述聚乙二醇单甲醚与二氯甲烷的质量体积比为8g：30mL；所述第一沉淀剂为无水乙醚；所述第一沉淀剂与二氯甲烷的体积比为160：30；所述重结晶处理的温度为-5℃。
进一步地，步骤(2)所述修饰有SA的mPEG产物与姜黄素的质量比为2:1-16:1；所述修饰有SA的mPEG产物与N,N'-二环己基碳酰亚胺的质量比为1.2:1-8:1；所述姜黄素与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:1-5:1；所述姜黄素与三乙胺的质量体积比为1-5：1g/mL。所述4-二甲氨基吡啶为催化剂。
进一步地，步骤(2)所述超干溶剂为超干级有机溶剂；所述超干溶剂为超干二氯甲烷；所述三乙胺与超干溶剂的体积比为1:400-1:600；所述在氮气气氛下进行反应的时间为4h-96h；所述第二沉淀剂为无水乙醚；所述第二沉淀剂与超干溶剂的体积比为5:1-10:1；所述第二次重结晶处理的温度为-20～30℃。
优选地，步骤(2)所述修饰有SA的mPEG产物与姜黄素的质量比为2.7:0.54；所述修饰有SA的mPEG产物与N,N'-二环己基碳酰亚胺的质量比为2.7:1.4；所述姜黄素与4-二甲氨基吡啶的质量比为0.54：0.1；所述三乙胺与超干溶剂的体积比为1:500；所述在氮气气氛下进行反应的时间为24h；所述重结晶处理的温度为-14℃。
进一步地，在步骤(3)所述混合液中，羟基磷灰石粉体的浓度为0.1-200mg/mL。
进一步地，步骤(3)所述羟基磷灰石粉体与姜黄素前药的质量比为1:0.01-1:5；孵育吸附的时间为1-72h。
优选地，步骤(3)所述述HA颗粒的浓度为0.5-100mg/mL；所述HA颗粒与姜黄素前药的质量比为1:0.1-1:4；所述吸附时间为4-24h。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料。
本发明提供的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料在制备骨肿瘤治疗药物中的应用。
本发明中使用的分级结构的HA颗粒载体具有更优的促成骨效果，使得整合纳米药物后的复合材料兼具抑癌和促骨修复性能。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
(1)本发明制备得到的复合微纳米颗粒具有较高的载药量，其独特的分级结构可以选择性地靶向癌细胞，并显著增强了姜黄素纳米前药对骨肉瘤细胞的抗癌效应；
(2)本发明制备得到的复合微纳米颗粒对生物机体无明显毒副作用，并能促进骨肉瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤组织的血管化，从而有效地抑制骨肿瘤的生长。此外，复合颗粒还可以抑制骨肉瘤细胞对肺的侵袭转移；
(3)在肿瘤术后骨组织缺损部位填充携带少量姜黄素前药的复合微纳米颗粒，通过姜黄素对局部组织的抗炎效应和分级结构HA颗粒的高成骨活性，可以高效地促进骨组织的再生修复。
附图说明
图1为实施例2、实施例3及实施例4制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的SEM图。
图2a为实施例4中步骤(1)制得的HA颗粒的强度-粒径分布图；图2b为实施例4制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的强度-粒径分布图。
图3为实施例4制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的激光共聚焦观察图。
图4为细胞摄取实施例4中制得的多功能型微纳米复合材料图。
图5为实施例4制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的抗癌活性评价图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
姜黄素纳米前药的制备，包括如下步骤：
(1)分子量为550的mPEG修饰SA：分别称取8g的mPEG550、1.6g的丁二酸酐、0.56g的对甲基苯磺酸于烧瓶中，氮气环境保护，在80℃条件下反应3h。将反应完的产物溶解于30ml二氯甲烷，过滤取滤液，然后用160mL无水乙醚于-5℃下反复重结晶，冷冻干燥，得到修饰有SA的mPEG产物(mPEG550-SA)；
(2)mPEG550-SA修饰姜黄素：称取步骤(1)所述修饰有SA的mPEG产物(mPEG350-SA)2.7g、姜黄素药物(0.54g)、N,N'-二环己基碳二亚胺(1.4g)、4-二甲氨基吡啶(0.1g)、三乙胺(0.1mL)溶于超干的二氯甲烷溶液(50ml)，氮气保护环境下12h，将反应完的溶液过滤，去除沉淀物，然后将滤液与250mL无水乙醚混合于-14℃下反复重结晶，冷冻干燥，得到接枝有mPEG550-SA的姜黄素前药。
实施例2
复合微纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
(1)分级结构的羟基磷灰石粉体的制备：配置4mM的磷酸氢二铵，pH调到6得到溶液a。将硝酸钙加入溶液a，硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为6.6：1mmol/L，搅拌均匀，得到溶液b。然后将1mmol柠檬酸钠加入溶液b剧烈搅拌，搅拌均匀，将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在180℃下反应3h。所得沉淀物离心，冷冻干燥，制备得到HA颗粒。该HA颗粒具有较高的中空结构，比表面积高达64.8m2/g。
(2)HA颗粒负载姜黄素前药复合微纳米颗粒的制备：称取20mgHA颗粒和20mg实施例1制得的接枝有mPEG550-SA的姜黄素前药分别溶于20mL去离子水中，超声分散，于摇床中孵育24h，离心弃上清液，冷冻干燥，辐照灭菌备用，得到复合微纳米颗粒(所述多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料)。
实施例3
复合微纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
(1)仿生HA微纳米颗粒的制备：配置6.0mM的磷酸氢二铵，pH调到6得到溶液a。将硝酸钙加入溶液a，硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为10：1mmol/L，搅拌均匀，得到溶液b。然后将1.5mmol柠檬酸钠加入溶液b剧烈搅拌，搅拌均匀，将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在180℃下反应3h。所得沉淀物离心，冷冻干燥，制备得到HA颗粒。该HA颗粒具有较高的中空结构，比表面积高达74.8m2/g。
(2)HA颗粒负载姜黄素前药复合微纳米颗粒的制备：称取20mgHA颗粒和20mg实施例1制得的接枝有mPEG550-SA的姜黄素前药分别溶于20mL去离子水中，超声分散，于摇床中孵育24h，离心弃上清液，冷冻干燥，辐照灭菌备用，得到复合微纳米颗粒(所述多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料)。
实施例4
复合微纳米颗粒的制备，包括如下步骤：
(1)分级结构的羟基磷灰石粉体的制备：配置24mM的磷酸氢二铵，pH调到6得到溶液a。将硝酸钙加入溶液a，硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为40：1mmol/L，搅拌均匀，得到溶液b。然后将6mmol柠檬酸钠加入溶液b剧烈搅拌，搅拌均匀，将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，在180℃下反应3h。所得沉淀物离心，冷冻干燥，制备得到HA颗粒。该HA颗粒具有较高的中空结构，比表面积高达106.7m2/g。
(2)HA颗粒负载姜黄素前药复合微纳米颗粒的制备：称取20mgHA颗粒和20mg实施例1制得的接枝有mPEG550-SA的姜黄素前药分别溶于20mL去离子水中，超声分散，于摇床中孵育24h，离心弃上清液，冷冻干燥，辐照灭菌备用，得到复合微纳米颗粒(所述多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料)。
实施例5
采用场发射扫描电镜观察实施例2-4中复合微纳米颗粒的形貌特征。图1中A1、A2及A3分别为实施例2-4中制备的复合微纳米颗粒的SEM图；结果如图1所示，药物分子能在不同的HA分级孔结构上自组装，其颗粒粒径有明显差异。A1号复合材料上组装的纳米颗粒粒径加大，A3号复合材料上组装的纳米颗粒粒径较小且密集，这表明两亲性药物分子在不同孔结构上的组装具有空间-尺度自适应性。此外，HA颗粒的空腔结构与外界会发生溶液交换，药物分子可以随水分子渗入空腔，并在腔体多级结构上发生自组装，这导致A3号复合材料有较高的载药率。
实施例6
利用激光多普勒电泳仪测定实施例4中A3号复合微纳米颗粒的粒径。将待测试样超声处理3～5min，获得分散状态良好的样品溶液，用于纳米粒度检测。HA颗粒的粒度分布呈单峰状态，平均粒度为2949nm，如图2a所示。复合微纳米颗粒的粒度分布呈双峰状态(图2b)，分别为纳米药物的峰位和复合颗粒的峰位，其对应的分布比例为15.5％和84.5％。纳米药物峰位的平均粒度为236nm，可能归因于纳米颗粒的团聚效应。
实施例7
利用激光共聚焦显微镜(CLSM)对实施例4中复合微纳米颗粒荧光成像，以确定药物被复合到HA颗粒。将试样超声处理3-5min，加入共聚焦皿，待颗粒沉积稳定后用CLSM观察材料荧光。结果如图3所示，图3的A部分是复合微纳米颗粒的荧光观察图，图3的B部分是单个颗粒的荧光成像，这表明药物分子与HA颗粒成功复合。
实施例8
利用CLSM观察实施例4中复合微纳米颗粒的细胞摄取。将143B细胞以1.5×105/孔的密度接种于共聚焦培养皿，贴壁24h后，用含复合微纳米颗粒的DMEM更新培养基。孵育后用PBS漂洗，加入不含药物的新鲜培养基。培养2h后，细胞样品用PBS漂洗，CLSM观察细胞荧光。结果如图4所示，复合颗粒与细胞共培养后143B细胞质发绿色荧光。进一步研究表明，复合微纳米颗粒可以被细胞摄取后进入溶酶体，在细胞内酸性微环境下快速降解，从而促进药物的释放。
实施例9
采用MTT实验评价实施例4中复合微纳米颗粒的抗癌活性。将143B细胞以5×103/孔的密度均匀地接种于96孔培养板中，与含10％FBS的DMEM在37℃、5％CO2培养箱中孵育。细胞贴壁24h后，培养基用含不同浓度复合微纳米颗粒的营养液更新。共培养48h后，用MTT评价复合颗粒的抗癌活性。结果如图5所示，复合微纳米颗粒可以显著抑制143B细胞的增殖活性；进一步的实验表明，分级结构的HA微纳米颗粒可以选择性地增强纳米药物对肿瘤细胞的抑制效应。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)仿生HA颗粒的制备：将磷酸氢二铵加入水中，混合均匀，得到磷酸氢二铵溶液；然后将所述磷酸氢二铵溶液的pH值调节为5.6-6.2，得到溶液a；将硝酸钙加入所述溶液a，搅拌均匀，得到溶液b；将柠檬酸钠加入溶液b中，搅拌均匀，升温进行加热处理，离心取沉淀，离心洗涤，冷冻干燥，得到羟基磷灰石粉体；所述磷酸氢二铵溶液的浓度为1-45mM；所述硝酸钙与溶液a的摩尔体积比为1-90：1mmol/L；所述硝酸钙与柠檬酸钠的摩尔比为5-8：1；所述加热处理的温度为120-200℃，加热处理的时间为1-24h；
(2)姜黄素前药的制备：将聚乙二醇单甲醚、丁二酸酐及对甲基苯磺酸混合，然后在氮气气氛下进行加热反应，得到加热反应的产物；将所述加热反应的产物溶解于二氯甲烷中，混合均匀，过滤取滤液，将滤液与第一沉淀剂混合进行第一次重结晶处理，过滤取沉淀，冷冻干燥，得到修饰有SA的mPEG产物；将修饰有SA的mPEG产物、姜黄素、N,N'-二环己基碳酰亚胺、4-二甲氨基吡啶及三乙胺加入超干溶剂中，混合均匀，在氮气气氛下进行反应，过滤取滤液，然后把滤液与第二沉淀剂混合进行第二次重结晶处理，过滤取沉淀，冷冻干燥，得到接枝有mPEG-SA的姜黄素前药；所述聚乙二醇单甲醚的分子量为350-2000；所述聚乙二醇单甲醚与丁二酸酐的质量比为2:1-20:1；步骤(2)所述丁二酸酐与对甲基苯磺酸的质量比为2:1-5:1；所述加热反应的温度为60-120℃，加热反应的时间为1-24h；
(3)将步骤(1)所述羟基磷灰石粉体与步骤(2)所述接枝有mPEG-SA的姜黄素前药加入水中，超声分散均匀，得到混合液，然后于摇床中孵育吸附，离心取上清液，冷冻干燥，辐射灭菌，得到所述多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料；所述HA颗粒具有分级结构，可以选择性地靶向癌细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述聚乙二醇单甲醚与二氯甲烷的质量体积比为0.25-0.5：1g/mL；所述第一沉淀剂为无水乙醚或无水丙酮；所述第一沉淀剂与二氯甲烷的体积比为5:1-10:1；所述第一次重结晶处理的温度为-20～30℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述修饰有SA的mPEG产物与姜黄素的质量比为2:1-16:1；所述修饰有SA的mPEG产物与N,N'-二环己基碳酰亚胺的质量比为1.2:1-8:1；所述姜黄素与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:1-5:1；所述姜黄素与三乙胺的质量体积比为1-5：1g/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述超干溶剂为超干级有机溶剂；所述超干溶剂为超干二氯甲烷；所述三乙胺与超干溶剂的体积比为1:400-1:600；所述在氮气气氛下进行反应的时间为4h-96h；所述第二沉淀剂为无水乙醚；所述第二沉淀剂与超干溶剂的体积比为5:1-10:1；所述第二次重结晶处理的温度为-20～30℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)所述混合液中，羟基磷灰石粉体的浓度为0.1-200mg/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述羟基磷灰石粉体与接枝有mPEG-SA的姜黄素前药的质量比为1:0.01-1:5；孵育吸附的时间为1-72h。
7.一种由权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料。
8.权利要求7所述的多功能型仿生HA颗粒负载姜黄素前药微纳米复合材料在制备骨肿瘤治疗药物、骨组织修复药物及抗菌材料中的应用。
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