KR101309360B1

KR101309360B1 - 개질 ｃｎｔ가 흡착된 인산칼슘 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체, 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101309360B1
Application number: KR1020110070631A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 신원상; 이해형
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-09-17
Also published as: KR20130009478A

Abstract

본 발명은 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자; 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 탄소나노튜브, 인산칼슘 및 생분해성 고분자를 이용하여 기계적인 인장 강도가 증가하고, 세포의 증식 및 조골세포의 분화 정도가 증가한 나노복합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 나노복합체의 제조방법을 제공한다.

Description

개질 ＣＮＴ가 흡착된 인산칼슘 나노입자 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체, 및 이의 제조방법 {Nanocomposites comprising with calcium phosphate adsorbed modified carbon nanotubes and degradable polymer and method of preparing thereof}

본 발명은 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자; 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

의학물질로 인간의 단단한 조직을 대체 및 재생하는 것은 안과 및 치과분야에 있어서 널리 사용되는 치료기술이다. 뼈와 치아의 결함은 주로 바이오세라믹 미립자 또는 분해가능한 고분자로 처리하여 치료된다. 게다가, 뼈조직이 상해 또는 외상에 의해서 골절되거나 제거되면 뼈 정착액이 물리적 생물학적 기능을 회복하기 위해서 사용된다. 대부분에 있어서, 뼈 정착액은 티타늄 합금과 스테인리스 철로 구성되어 있다. 그러나 금속은 본질적으로 흡수성이 없고 따라서 임플란트 부위에 문제가 생기면 이차적인 작용이 요구된다.

최근에는 PLA와 같은 생분해성 고분자가 뼈 대체제로서 도입되었다. PLA는 FDA 승인 물질로서 일반적으로 뼈를 포함한 넓은 조직부위에 사용가능하다. 그리고 쉽게 열적 성형 고분자 제조과정을 거쳐서 복합체-형상 임플란트로 제조될 수 있다. 그러나 기계적 강도의 측면에서 생분해성 고분자(PLA)를 이용하는 것은 여전히 문제가 있고 고분자 물질의 성질을 향상시키기 위해서 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 인산삼칼슘(tricalcium phosphate), 칼슘카보네이트(calcium carbonate) 및 생활성 유리 알갱이와 같은 생활성 세라믹 물질을 결합하여 사용하는 것이 제안되어 왔다. 이러한 생활성 세라믹 물질의 첨가는 고분자 산 생성물과 관련된 감소된 pH를 중성화 시킬 수 있고 물질 분해를 감소시키고 기계적 성질을 강화시킬 수 있다. 또한 복합체의 in vitro 실험에 의한 세포에서의 작용은 세포 증식 및 조골세포 분화에 있어서 증가된 활성을 보여준다.

생체내에서 혈관이나 연골과 같이 기계적인 충격을 흡수하면서 기능을 발휘하는 조직 장기가 존재하고 이러한 조직 장기를 대체할 생체재료로서 탄성력 및 복원력을 가지는 합성고분자의 연구가 시작되었다. 고탄성 생분해성 고분자로서는 PLA와 poly(carprolactane)(PCL)의 블록 공중합체인 poly(lactide-caprolactone)(PLCL)을 들 수 있다. 이러한 생분해성 고분자를 임플란트로서 사용할 경우 금속 임플란트의 매우 강한 기계적 특성 때문에 변형이 불가능하다는 단점을 극복할 수 있다. 그러나 그 강도가 약하다는 문제점이 있었다. 따라서 변형이 용이하면서도 고강도를 갖는 소재의 개발에 관한 연구가 진행되었다.

이에 본 발명자는, 상기 생분해성 고분자의 사용시 강도가 약하다는 문제점 및 생체 적합성문제점을 해결하기 위하여 연구하던 중, 탄소나노튜브 및 인산칼슘을 함께 사용할 경우, 인장강도가 증가할 뿐만 아니라 세포에서의 세포 증식 및 분화에 있어서 활성이 증가한다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은, 탄소나노튜브, 인산칼슘 및 생분해성 고분자를 이용하여 기계적인 인장 강도가 증가하고, 세포의 증식 및 조골세포의 분화 정도가 증가한 나노복합체를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 나노복합체의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자; 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체를 제공한다.

[화학식 1]

[CNT-((CH₂)_aO)_bH]⁺[Y]^-

(상기 화학식 1에서, [Y]^-는 음이온을 나타내고,

2≤a≤6의 정수이고,

1≤b≤50의 정수이다)

본 발명에서 사용되는 용어 “CNT”는 탄소나노튜브를 의미하는 것으로, 하나의 탄소원자가 3개의 다른 탄소원자와 sp² 결합을 이루고, 육각형 벌집무늬 구조를 갖고 있으며, 직경이 수 나노미터에서 수십 마이크로미터인 물질을 의미한다. CNT를 생분해성 고분자에 첨가하여 CNT의 우수한 기계적 특성을 이용하여 생분해서 고분자의 인장 강도를 향상 시켰다. 또한 CNT를 그대로 사용하는 경우에는 응집현상이 크고 표면의 소수성이 커서 고분자 매트릭스에 균일하게 분산하기 어렵고, CNT와 고분자 상이의 계면 상호작용이 약해 고분자/CNT 복합체의 응용이 제한적인바 이를 개질하여 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 “개질 CNT”는 순수 CNT를 알킬화하여 알킬화된 탄소나노튜브가 양전하로 하전된 것에 음이온이 결합된 것이다. 구체적으로는 상기 화학식 1의 개질 CNT는 순수한 CNT에

(c 는 1≤c≤5의 정수)를 첨가하여 반응시켜서 다수의 -((CH₂)_aO)_bH)기가 CNT 몸체에 공유 결합 방식으로 결합되게 하고 그 후 CNT 몸체는 비편재화된 양전하로 하전되어 상대음이온[Y]^-과 이온 결합방식으로 결합되어 제조된다.

본 발명에 사용할 수 있는 탄소나노튜브는 단일벽 탄소나노튜브, 이중벽 탄소나노튜브 또는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다중벽 탄소나노튜브를 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 인산칼슘은 비금속 무기재료로서 Ca, P, O 와 H로 구성된 화합물을 지칭하며 원소의 조합비에 따라서 다양한 인산칼슘염이 존재한다. 인산칼슘은 경조직의 미네랄 성분이 화학적으로 유사하기 때문에 일부 인산칼슘이 염증반응이나 섬유상 조직의 발생 없이 경조직과 직접 결합하는 생체 친화성이 우수한 생체재료이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 인산칼슘은, 하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 생분해성 고분자란 생체 내 또는 자연 환경하에서 스스로 분해되는 고분자를 총칭하며 특히 의료용의 목적으로 생체내에서 분해되는 생분해성 고분자를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 생분해성 고분자는 폴리(글리콜산), 폴리락트산, 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산), 폴리(L-락타이드-코-D, L-락타이드), 폴리(히드록시부티레이트), 폴리(히드록시 발러레이트), 폴리(발레로락톤), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나가 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 화학시 1에서 [Y]^-는 음이온을 의미하는 것으로. 일례로 N₃ ^-, Br^-, Cl^-, F^-, I^-, SbF₆ ^-, 플러렌 음이온, CHB₁₁H₁₂ ^-, HS^-, OCN^-, SCN^-, CN^-, PF₆ ^-, NTf₂ ^-, OTf^-, BF₄ ^-, CO₃ ² ^-, HCO₃ ^-, OH^-, NO³ ^-, NO² ^-, PO₄ ³ ^-, HPO₄ ² ^-, H₂PO⁴ ^-, SO₄ ² ^-, HSO⁴ ^-. R-COO^-, R-SO₄ ^- (여기서, R은 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 아미노기를 포함하는 하나 이상의 작용기로 치환되거나 비치환된 알킬기 또는 아릴기를 나타냄), C₂O₄ ² ^-, HC₂O⁴ ^-, 또는 RNA로부터 유도된 음이온, DNA로부터 유도된 음이온, 단백질로부터 유도된 음이온 및 양이온교환수지로부터 유도된 음이온으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 의미한다. 바람직하게는, Cl^-또는 SbF₆ ^-를 의미한다.

상기 나노복합체에서, 상기 개질 CNT의 함량은 상기 나노복합체에 대하여 0.01 중량% 내지 0.5 중량%인 것이 바람직하다.

또한 상기 나노복합체에서, 상기 개질 CNT의 함량은 상기 인산칼슘 나노입자에 대하여 0.10 중량% 내지 1 중량%인 것이 바람직하다.

또한 상기 나노복합체에서, 상기 인산칼슘의 함량은 상기 생분해성 고분자에 대해서 10 중량% 내지 50 중량%인 것이 바람직하다. 특히, 인장강도를 높이기 위하여 30 중량%인 것이 바람직하다.

상기 중량 비율에서 CNT의 함량은 많을수록 강도 향상 측면에서 좋을 수 있으나, 너무 많으면 (1% 이상) 인산칼슘 입자에 균일하게 흡착되지 못할 수 있어 향후 나노복합체 형성 후 오히려 강도가 저하될 수 있으며, 너무 적을 경우 (0.1% 미만) 효과가 미미할 수 있다. 또한 인산칼슘의 함량은 고분자 대비 많을수록 생체활성 증진측면에서 좋으나, 너무 많을 경우 (50% 이상) 인산칼슘 입자의 분산이 쉽지 않아 강도의 저하가 일어나게 된다.

상기에 따른 나노복합체는, 개질된 탄소나노튜브가 흡착된 인산칼슘 나노입자가 생분해성 고분자에 균일하게 분산되어 있는 형태를 가지고 있으며, 기존의 생분해성 고분자만을 사용한 경우, 생분해성 고분자에 인산칼슘만이 함유된 경우에 비해서 인장강도가 향상하며 세포에서의 세포 증식 및 분화에 있어서 활성이 증가한다. 상기 복합체의 형상은 섬유, 필름, 펠릿 및 3차원의 형상을 갖는 벌크로부터 선택된 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 개질 CNT에 용매를 첨가한 후 교반 또는 초음파 처리하여 개질 CNT 용액을 준비하는 단계(단계 1); 상기 개질 CNT 용액과 인산칼슘 나노입자를 혼합하여 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 제조하는 단계(단계 2); 상기 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 생분해성 고분자와 혼합하는 단계(단계 3); 및 상기 혼합물로부터 용매를 제거하는 단계(단계 4)를 포함하는 나노복합체의 제조방법을 제공한다.

[화학식 1]

[CNT-((CH₂)_aO)_bH]⁺[Y]^-

(상기 화학식 1에서, [Y]^-는 음이온을 나타내고,

2≤a≤6의 정수이고,

1≤b≤50의 정수이다)

상기 단계 1에서 사용되는 용매로는 CNT를 분산시킬 수 있는 용매이면 제한되지 않으며, 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 트리플루오로에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,4-다이옥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸메타아크릴레이트, 에틸렌글리콜, 디메틸포름아마이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 특히, 테트라하이드로퓨란이 바람직하다. 용매는 개질 CNT 1 ㎖에 대하여 1 내지 100 ㎖로 사용한다. 만약 용매의 함량이 상기 범위 미만이면 분산 과정에서 개질 CNT끼리 응집을 이뤄 분산이 방해되는 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 이후 제거과정에서 긴 시간이 소요되어 비경제적이다.

또한, 상기 탄소나노튜브는 단일벽 CNT, 이중벽 CNT 또는 다중벽 CNT를 사용할 수 있다.

상기 단계 2는, 개질 CNT 용액과 인산칼슘 나노입자를 혼합하여 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 제조하는 단계로서 개질 CNT 용액에 인산칼슘 나노입자를 첨가하여 교반하여서 도 2와 같이 칼슘인산에 개질 CNT가 가지모양으로 흡착되게 된다.

상기 단계 3은, 상기 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 생분해성 고분자와 혼합하는 단계로서 상기 개질 CNT 용액 1 ㎖에 대하여 상기 생분해성 고분자 10 mg 내지 500 mg를 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 단계 4는 , 건조 조건은 사용한 용매에 따라 달라질 수 있으며, 상분리가 발생하지 않도록 빠른 시간 내에 수행되는 것이 바람직하다. 특히 상기 혼합물로부터 용매를 제거하는 단계로서 25℃ 내지 50℃에서 10분 내지 2일 동안 건조를 통해 수행하는 것이 바람직하다.

이 때 건조방법은 특별히 제한하지 않으며, 이 분야에서 공지된 바의 건조방법이 가능하다. 대표적으로, 상온상압건조, 열풍건조, 감압건조, 동결건조, 분무건조, 회전식 증발건조 등이 가능하다. 건조 조건은 사용한 용매에 따라 달라질 수 있으며, 상분리가 발생하지 않도록 빠른 시간 내에 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자; 및 생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체는, 기존의 생분해성 고분자만을 사용하는 경우 또는 생분해성 고분자-인산칼슘 나노입자 복합체를 사용한 경우에 비해서 기계적인 인장 강도가 증가하고, 세포의 증식 및 조골세포의 분화 정도가 증가하는바, 생체재료로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 나노복합체를 제조하는 단계를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일실시예에 따른 나노복합체의 고분해능 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은, PLA 및 PLA 나노복합체의 고분해능 SEM 이미지를 나타낸 것으로, (a)는 PLA, (b)는 PLA-CP, (c)는 PLA-CPNT1, 및 (d)는 PLA-CPNT2를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일실시예에 따른 나노복합체의 화학적 스펙트럼을 나타낸 것으로, (a)는 FTIR, (b)는 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일실시예에 따른 나노복합체에서의 세포 증식 효과를 나타낸 것으로, (a)는 3일, 7일, 14일 후의 세포 증식 정도를 그래프로 나타낸 것이고, (b)는 7일 후의 조골세포의 성장 형태를 나타낸 것이다.
도 6은, 7일 및 14일 후의 세포활성 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은, qRT-PCR에 의해서 측정되는 7일 후의 PLA 및 이의 나노입자 복합체의 유전자 발현 프로파일을 나타낸 것으로, 콜라겐 타입 Ⅰ(Col Ⅰ), OPN, Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcine (OCN)에 대한 표적 유전자 발현을 나타낸 것이다.
도 8은, 콜라겐 타입Ⅰ 및 ALP, GAPDH를 포함하는 뼈-관련 단백질 발현의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸 것으로, GAPDH가 대조군으로 사용된 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 내지 2: 고분자- CNT -인산칼슘 나노복합체의 제조

1-1. 개질된 탄소 나노튜브 ( mCNT _S )의　합성

화학 증기 증착에 의해서 합성된 본래의 다중벽 탄소 나노튜브(pCNT_S)(일진나노텍)를 3시간 동안 음이온 교환하고 30분 동안 이온화 개질 과정을 수행하였다. 이에 따라서 양전하를 띠는 탄소나노튜브유도체[CNT]⁺[X]^-[X = SbF₆또는 Cl](여기에서는 mCNT(X)로 기술)를 제조하였다. 요약하자면 아르곤(Ar) 가스에서 디클로로메탄을 넣어주고 pCNT_S의 현탁액과 [bmin][Sb₂F₁₁](bmin=1-butyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids)이 혼합되었다. 현택액상에, 테트라하이드로퓨란(THF)을 더하고 15분 동안 초음파처리 하였다. 수용액으로 담금질(quenching) 한 후에 테프론 막을 통해서 걸러진 CNT-SbF₆가 생산되었고 이것을 아세톤과 디클로로메탄으로 세척하였다. 진공상태에서 건조한 후에 CNT-SbF₆와 NaCl을 에탄올/물 혼합물에 첨가하였다. Cl-교환 CNT_S를 얻기위해서 혼합물을 3시간 동안 25℃에서 초음파처리하였다. 결과물인 입자를 테플론 막으로 거른 후 물, 아세톤, 및 디클로로메테인으로 세척하였다. 그리고 진공상태에서 이온적으로 개질된 CNT를 얻기 위해서 건조하였다. 이러한 방식에 의해서 생성된 생성물을 "mCNT"라고 한다. mCNT의 요소는 FLASH EA 1112 (Thermo Elemental)로 분석되었고 90.8% 의 탄소, 0.33%의 수소, 및 0.1% 질소가 있다는 것이 밝혀졌다. 이것을 개질되지 않은 pCNT_S와 비교하면 개질되지 않은 pCNT_S는 93.8%의 탄소, 0.14%의 수소, 및 0.1%의 질소가 있다는 것이 밝혀졌다. MALDI TOF MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectroscop, Voyager-DE STR)를 사용하여 34.97 (100%) 및 36.97 (32%) 동위원소의 비율 m/e 피크가 나타났으므로 mCNT에서 Cl이 존재한다는 것이 밝혀졌다.

CP(Ca₃(PO₄)₂, B-형태) 생체 세라믹 상, 인산삼칼슘 입자는 Merck사에서 구매하였으며 900℃에서 1시간 동안 소결한 후에 사용하였다. Poly(L-lactic acid)(PLLA, Resomer　L206S)는 Boehringer lngelheim에서 구매하였다. 유기 용매를 포함하는 모든 다른 화합물들은 상업적으로 구매하였고 정제하지 않고 사용하였다.

1-2. mCNT - CP 나노입자 및 PLA 나노입자 복합체의 제조

3분 동안 초음파 진동하에 THF 용매(100 mL)에 mCNT(50 mg)을 녹여서 동종의 다중벽 CNT 용액을 준비하였다. CP 입자 10그램을 그 후 천천히 mCNT/THF 용액 20 및 50 ml에 첨가하였다. 그 동안 CNT 분자는 CP 나노입자에 흡착되었고 남은 깨끗한 THF 용매에 침전되었다. 이 과정은 mCNT-CP, 즉 동종의 개질된 탄소 나노튜브가 흡착된 인산칼슘 나노입자로 정의되었다. CP에 대해서 mCNT의 양은 0.1 및 0.25 중량%이었다. 여기에서는 0.1 중량% 및 0.25 중량% mCNT-CP 나노입자를 CPNT1 및 CPNT2로 각각 기재하였다. mCNT-CP 나노입자를 용매로부터 분리하였고 아세톤으로 여러 번 세척하였고 주위조건에서 건조하였다.

또한 PLA 10g을 50 ml 클로로포름 용매에 녹였다. 그 후에, CPNT1 및 CPNT2 10g을 준비된 PLA/클로로포름 용액에 50℃에서 교반하면서 혼합하였다. 에탄올에서 용매를 빠르게 추출한 후에 0.05 및 0.125 중량% (나노입자 복합체에 대해서)의 mCNT를 포함하는 PLA-CP-mCNT 삼원소 나노입자 복합체는 두 상의 응집작용 없이 얻었다. 여기에서 PLA-CPNT1 및 PLA-CPNT2로 기재되어 있는 최종 나노입자 복합체는 디스크 타입 표본(두께×열판은 1×10 mm² 이고 3×5 mm² 이다)을 형성하기 위해서 180℃ 열판에서 제조되었다. 비교를 위해서, mCNT_S 없는 PLA-CP 복합체는 탄소나노튜브가 흡착된 CP 나노 입자 대신에 CP 나노입자를 사용함으로써 제조되었다. 이러한 복합체는 여기에서 PLA-CP로 기재되었다. 샘플을 생산하기 위해서 사용되는 물질의 양은 표 1에 기재하였다.

샘플의 제조를 위해 사용한 물질의 양 과 샘플의 이름
샘플의 이름	CP (+ mCNT )/PLA( wt / wt )	mCNT /CNT( wt / wt )
PLA	0	0
PLA - CP	1	0
PLA - CPNT1	1	0.0025
PLA - CPNT2	1	0.0010

실험예 1: 성질 분석에서의 측정방법

표본의 형태는 주사전자현미경에 의해서 측정하였다(SEM, 히타치, 일본). 고분해능 SEM이미지는 JEM2100F (JEOL, 도쿄, 일본)을 사용하여 얻었다. 나노 복합체 샘플의 라만 스펙트럼은 Nd-YAG-레이저를 사용하여(1064 nm 자극 파장) 얻었다. 모든 샘플은 건조된 상태에서 분석하였다. PerkinElmer 스펙트럼 GX 스펙트로미터 (MA)를 사용하여 FT-IR이 측정되었다. 샘플과 단일형태소로 이루어진 KBr은 실리카-겔 건조제를 사용하여 건조기에서 보존하였다. FT-IR 스펙트로미터는 투과 모드와 스펙트럼(파동수 범위 500-4000cm^-1)에서 측정되었다. 순수 단일형태 KBr 디스크는 배경 샘플로 사용되고 모든 데이터는 배경 스펙트럼 상태에서 얻어졌다. 열무게분석범(TGA)은 Seiko Exstar 6000 (TG/DTA6100; Seico, 일본)을 사용하여 공기 중에서 온도 범위 20 내지 800℃에서 10℃/mim 가열 속도로 측정하였다. 두 개의 열 판(Carver 3851-0)이 장착되어 있는 열-프레스 및 몰드(두께 × 지름 = 3 × 5 mm² 및 1 × 10 mm²)는 표본 디스크를 제조하기 위해서 준비하였다. 샘플의 인장 강도 성질은 Instron 3344를 상온에서 사용함으로써 간접인장강도(DTS)테스트에 의해서 측정하였다. 표본(크기 3 × 5 mm²)을 속도 5mm/min로 적재하고 DTS 값을 측정하였다. 전체 4개의 표본은 각각의 조건에서 측정되었다(n = 4).

실험예 2: 세포성장에 있어서 in vitro 분석에서의 측정방법

Murine-유도 pre-골아세포 세포 line(Murin-derived pre-osteoblast cell line)(MC3T3-E1)를 나노입자 복합체, PLA-CP, PLA-CPNT1, 및 PLA-CPNT2에 대한 세포반응을 측정하기 위해서 사용하였다. 샘플 디스크는 각각의 24-well plate의 well에 놓았다. 그 후 70%의 에탄올로 살균하였다. 세포는 그 후 샘플마다 4 × 10⁴세포밀도로 시드하였다. 표준 세포 분석 조건 (37℃ 온도, 공기중 5% CO₂ 및 95% 습도)에서 10% fetal vovin serum (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충되는 α-minimal essential medium (α-MEM)을 포함하는 표준세포 조건에서 14일까지 배양하였다. 샘플의 세포 단일형태는 세포를 부착한 후에 금 코팅 및 헥사케틸디실라잔(hexamethyldisilazan)으로 처리하고 에탄올처리의 순차적인 순서에 의해서 탈수반응을 하고 SEM에 의해서 이미지를 측정하였다. MTS 방법을 사용하여 미토콘드리아 활성의 생존가능 세포를 측정함으로써 세포 생존도를 측정하였다. CellTiter 96 Aqueous One 용액(Promega)은 세포 배양을 위해서 첨가하였다. 그 후 490nm의 흡광도에서 색상 정량분석에 의해서 측정하였다. 세 개의 복제된 샘플은 각각의 조건에서 측정하였다(n=3).

실험예 3: 골 세포 분화 연구 방법

Alkaline phosphatase(ALP) 활성을 나노 복합체에 대한 반응으로 조골세포로의 세포 분화를 평가하기 위해서 측정하였다. 특히, 조골세포로 세포분화를 유도하기 위해서 10 mM ß-글리세롤 포스페이트 및 50 ㎍/ml 아스코르빅 산을 포함하는 골형성 요소를 표준 배양 환경 (10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 α-MEM)에 추가하였다. 7 에서 14일 동안 샘플에서 배양된 세포를 ALP결정을 위해서 사용하였다. 적어도 세 개의 표본을 분석을 위한 충분한 단백질 양을 확보하기 위해서 수집하였다. 세포 펠렛을 모았고, 0.1% 트리톤 X-100으로 처리하였고 연속 냉각화 및 해빙화에 의해서 분열하였다. 그 다음으로, 전체 단백질 함량을 상업적 DC 단백질 분석 키트(BioRad)를 사용하여 분석하였다. 효소화 반응을 위해서, 제조자의 지시(Sigma)에 따라서 각각의 샘플에 기질로서 p-나이트로페닐 포스페이트를 포함하는 ALP 반응 환경에 첨가하였다. 효소 생성물의 레벨, p-나이트로페놀은 405nm 흡광도에서 변화에 기반하여 측정하였다. ALP 활성 레벨은 단백질 표준 커브로부터 제외하였다. 이것은 bovine serum albumin (Sigma)를 사용하여 얻어졌다. 세 개의 복제 샘플이 각각의 조건에서 측정하였다(n=3).

나노 복합체의 성장에 있어서 세포 유전자 표현 프로파일은 polymerase 사슬 반응(qRT-PCR) 양적 실제 시간에 의해서 측정하였다. 세포 종자화 7일 후에 Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, South Korea)를 사용하여 각각의 샘플로부터 전체 RNA를 추출하였다. 그 다음, 전체 RNA의 2 ㎍이 반대 전사 효소 반응을 수행하기 위해서 사용하였다. 얻어진 DNA는 PCR을 위해서 주형으로 사용하였다. 오스테오폰틴(OPN), 골 시아로프로테인(BSP), 콜라겐 타입 Ⅰ(Col Ⅰ), 그리고 오스테오칼신 (OCN)을 포함하는 조골세포 분화 마커에 의해서 측정되었다. 배열 및 역배열 프라이머는 GeneBank에서 입수가능한 cDNA 배열을 사용하기 위해서 디자인되었다. 그리고 ß- actin은 RNA 발현을 정상화하기 위해서 housekeeping gene으로 사용하였다. 실제-시간 PCR은 스펙트로플루오로메트릭 열적 순환기 (Rotor-Gene 3000, Corbett Research, Korea)에서 SYBR Green PCR kit(Quantace, GCbiotech, Netherlands)를 사용하여 측정하였다. 실제-시간 PCR을 수행한 후에, GAPDH와 관련된 다양한 유전자의 효과를 측정하기 위해서 Ct value를 사용하였다. 이것을 내부 조절제( △Ct = Ct gene - Ct ß-actin )로 사용하였다. 각각의 샘플에서 mRNA는 다른 것과 비교한 경우의 △△Ct(△Ct gene - △Ct control)측정 값에 의해서 계산되었다. 각각의 측정방법은 세 번 수행하였다(n=3). 유전자의 프라이머 시퀀스는 표2에 표현하였다.

실제시간 PCR 을 위한 프라이머 시퀀스
	주형	역주형
Col I	5'- tgttcgtggttctcagggtag -3'	5'- ttgtcgtagcagggttctttc -3'
BSP	5'- ataggcaacgagtacaacac -3'	5'- gtatccagatgcaaagacag -3'
OCN	5'- tgaggaccctctctctgctc -3'	5'- gggctccaagtccattgtt -3'
OPN	5'- atctgatgagtccttcactg -3'	5'- gggatactgttcatcagaaa -3'
ß- actin	5'- gctacgagctgcctgacgg -3'	5'- gaggccaggatggagcc -3'

콜라겐 타입 1의 발현 및 PLA, PLA-CP, PLA-CPNT1 중의 하나에서 21 동안 배양된 세포에 있어서 골 ALP는 웨스턴 블랏 분석방법에 의해서 단백질 레벨을 측정하였다. 간략하게, 배양된 세포의 추출은 세포 lysis RIPA 완충용액으로 준비하였다. 단백질 샘플을 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리-아크릴아마이드 젤에서 분해하였다. 0.1% Tween-20 함유 Tris-완충 saline에서 2.5% bovine serum albumin으로 제한한 나이트로셀룰로오스 막에 트랜스블롯하였다. 막은 일차 항원(항-마우스 콜라겐 항원; 1:100, 항-마우스 골 ALP 항원; 1:100)으로 블롯(blotting)하기 위해서 비닐 백에 넣었다. 모든 항원은 lowa 대학의 Development studies Hybridoma Bank에서 구매하였다. 블롯은 horseradish peroxidase-conjugated된 이차 이뮤노글로블린G 와 면역반응 밴드로 배양되고 강화된 chemiluminescent ECL 감지제(Pierce, Rockford)를 사용해서 측정하였다.

실험예 4: 통계학적 분석

기계적 그리고 세포 테스트를 통해서 얻어진 자료는 평균 및 표준 편차에 의해서 나타난다. 데이터의 통계학적 분석은 one-way analysis of variance (ANOVA) 의 방법에 의해서 수행하였다. Bonferroni correction 및 주요 레벨은 p < 0.05 또는 p < 0.01 이다.

결과 및 검토

1. 하이브리드 나노파우더 및 PLA 나노복합체

다중벽 탄소나노튜브(MWNT_S)는 초기 조건에서 매우 소수성이다. 따라서 대부분의 실험 용매에서 분산되기 어렵다. 결과적으로, 고분자로 된 조성물을 함유하는 CNT_S의 사용은 제한적이었다. 이러한 결점을 극복하기 위해서 실시예에 기술한 방법에 의한 화학적 개질 방법에 의해서 새로운 형태의 CNT_S를 합성하였다. 도 1에는 mCNT_S-CP 흡착된 입자를 생산하기 위한 제조과정이 나타나 있다. 그리고 더 나아가서 PLA 나노 복합체의 제조과정이 나타나 있다. 초기의 CNT_S(pCNT_S)는 개질된 CNT_S(mCNT(X))로 전환된다. 여기에서 X는 SbF₆ 또는 Cl을 나타내는 음이온이다. CNT_S 옆면을양전하를 유지하도록개질하기 위해서는, 초기에는 활성화된 THF Lewis-acidic 이온화 용액[bmin][Sb₂F₁₁]([bmim]=1-부틸-3-메틸이미다졸리움)을 사용하고, 이것은 강한 전하를 띠는 물질을 형성하기 위해서 열역학적으로 안정한 THF 용매 고리를 형성한다. 그 다음으로, 활성화된 THF에서 CNT_S는 SbF₆ 중심-음이온의 존재시에 협력관계로서 양전하의 표면을 제공하기 위해서 알킬화되었다. 이것은 구체적인 사용을 위해서 다른 이온으로 교환이 가능하다. 용매의 범위에 따라서 용해도를 조절할 수 있다.

표면의 이온화 개질로 인해서 새로운 m-CNT_S는 간단하게 클로로포름, 디클로로메탄, 및 THF 유기용매에 녹는다. 이것은 PLA 와 같은 생체고분자의 용해를 위해서 사용되는 일반적인 유기용매이다. 따라서 생체고분자-CNT_S 나노 복합체의 섬유화를 촉진한다. 본 연구에서는 CP가 복합된 나노입자를 제조하기 위해서 THF에서 매우 균일한 Cl-교환 CNT_S(mCNT[Cl])를 사용하였다. THF에 용해한 CNT_S는 CNT_S의 응집 작용 없이 안정하였다. 그리고 침전물이 가라앉았고 이러한 안정화는 몇 달 동안 지속되는 것이 관찰되었다. CP-CNT_S복합 나노입자는 CP나노입자를 균일화된 mCNT/THF 용액에 넣어서 휘저음 하면서 간단하게 제조되었다. 이러한 제조 과정 동안, 잘 분산된 초미립자 탄소 나노튜브 분자가 CP 나노입자의 표면에 흡착을 유도하였다. mCNT 0.1 및 0.25 중량%의 두 개의 다른 농도를 포함하는 결과적으로 복합된 나노입자, 그들의 색에 기반한 순수한 CP 입자로부터 분명하게 구별이 되는 나노입자, 여기서는 CPNT1 및 CPNT2로 각각 정의된다. 따라서, CPNT_S를 포함하는 PLA 나노 복합체의 제조는 PLA-클로로포름 용액에서 CPNT_S나노입자를 도입하기 쉽게 하기 위해서 수행되었다. 에탄올에서 용매를 추출한 후에 고체화된 나노입자는 디스크에 주조되었다.

비록 CPNT 복합 나노입자의 색의 변화는 mCNT_S의 존재를 대표하지만, mCNT_S는 mCNT의 농도가 상당히 낮기 때문에 (0.1 및 0.25 중량%) 빠르게 알아차리기 어려웠다. SEM 이미지의 높은 분해능에서 그 존재를 더 쉽게 알 수 있고 mCNT_S의 복합된 정도, 도 2에 나타내었다(mCNT_S를 화살표로 나타냄). mCNT 분자는 CP나노입자와 잘 혼합되었다(수백의 나노미터).

복합된 CPNT 나노입자는 나노복합체를 제조하기 위해서 PLA 고분자와 혼합되었다. 내부 형태구조를 밝히기 위한 표본의 나노복합체의 마이크로-나노-구조는 도 3에 나타나 있다. 비록 마이크로 구조의 입자 단계가 PLA-CP에서 관찰되더라도 CP-첨가된 복합체의 SEM cross-sectioned 형태 [PLA-CP 도 3(b)]은 순수한 PLA [도 3(a)]와 상당히 유사하였다. 그러나 CPNT-첨가된 복합체의 형태 [PLA-CPNT1 및 PLA-CPNT2, 도 3(c,d)]는 앞에서 언급된 복합체와 상당히 다르다. 이것은 섬유의 나노구조를 보이며 CNT의 존재에 기여한다. 도 3의 이미지에 기반하여, CPNT 나노입자덩어리가 보이지 않으며 나노입자는 PLA 상에서 균일하게 분산되는 것 같아 보인다.

2. 나노입자의 제조

생성된 나노입자의 구조적 성질은 FT-IR 및 라만 스펙트럼에 의해서 측정된다. PLA-CPNT2 나노복합체의 FT-IR 스펙트럼은 도 4(a)에 대표적인 예로서 나타난다. 1750-1735 범위 및 1300-1100 cm^-1 강한 C=O 및 C-O 스트레칭 밴드는 각각 PLA의 에스터 그룹과의 반응이 관측되었다. 게다가, 포스페이트의 P=O 및 P-O 그룹은 1300-1240 cm^- ¹에서 매우 강한 밴드를 가지고 1088-725 cm^-1의 범위에서 몇몇의 밴드를 가진다. 라만 스펙트로스코피가 또한 도입되었고 도 4(b)에 나타내었다. ca. 1290 (D 밴드) 및 1600 (G 밴드)의 피크의 성질이 분명하게 PLA-CPNT2 나노복합체에서 mCNT_S가 존재함을 증명한다.

단단한 세포 임플란트 물질로서 표 3에 요약되어 있듯이 새로이 발견된 PLA-CPNT 나노복합체의 적합성을 측정하는 데 있어서 기계적 성질은 가장 중요한 성질 중의 하나이다. 따라서, 물질의 DTS는 실온에서 측정되고 표 3에 요약되었다. 순수한 PLA의 관점에서, CP의 첨가(10, 20, 30, 40 및 50 중량%)는 인장강도를 상당히 증가시켰다. CPNT 복합 나노입자를 CP (10, 30, 50 중량%) 대신에 PLA를 첨가하였을 때, 강도는 훨씬 더 증가하였다. 강도는 유지되거나 향상되었다. 특히, CPNT2의 경우에는 나노입자의 첨가 양의 증가로 인해서 인장강도의 값이 계속적으로 증가하였다. 그리고 CPNT2 50%에서 가장 높은 인장 강도 값이 얻어졌다.

PLA 와 이의 나노복합체의 기계적 인장 강도
	mCNT 함량(CP에 대한%)	CP 함량 (PLA에 대한 %)	인장강도, 평균(std), MPa	%증가 (w.r.t. PLA)
PLA	0	0	6.0(0.9)	-
PLA-CP	0	10	11.9(2.5)*	198
	0	20	12.5(2.4)*	208
	0	30	9.5(0.5)*	158
	0	40	11.3(2.4)*	188
	0	50	10.3(3.0)**	172
PLA-CPNT1(low mCNT)	0.0010	10	10.9(2.2)*	182
	0.0010	30	14.0(0.4)++**	233
	0.0010	50	11.7(0.7)**	195
PLA-CPNT2(high mCNT)	0.0025	10	10.4(0.4)*	173
	0.0025	30	14.3(1.1)++**	238
	0.0025	50	15.9(0.9)+**	265
*ANOVA에 의한 통계적 분석은 p<0.05 및 p<0.01 에서 PLA에 대한 그리고 +p,0.05 및 ++p<0.01에서 PLA-CP에 대한 나노복합체의 상당한 차이를 보여주었다.

이러한 결과에 의해서, 50%까지 증가된 CP를 함유하는 개질된 CNT를 흡착하는 나노입자는 PLA 고분자의 강도를 증가시키기 위해서 효과적으로 PLA 매트릭스 안에서 분산되었다. 게다가, CNT 흡착된 CP 나노입자는 재강화 효과가 감소되지 않았다. 반면에, CP 나노입자에 CNT 분자의 첨가는 나노복합체의 강도를 강화시켰다 그리고 이러한 효과는 초기의 CP 나노입자를 통해서 잘-균등화된 CNT_S에 의해서 촉진되는 것으로 여겨진다. 그리고 PLA 매트릭스 안에서 이것들이 더 잘 분산된 형태를 갖는다.

3. In vitro 세포 성장과 조골세포 분화

본원발명의 나노복합체의 in vitro 생물학적 현상은 세포 증식 및 조골세포 분화를 통해서 판단된다. MC3T3-E1 세포는 PLA에서 배양되고 CP 또는 CPNT_S 나노복합체와 세포 성장 레벨은 MTS 방법에 의해서 측정된다. 이것은 도 5(a)에 나타내었다. 최초의 세포 증식은 3일 안에 이루어졌고 나노 복합체에 대해서 PLA에 비해서 상당히 높은 수준이었다. 그리고 특히 PLA-CPNT1의 성장에 대해서 PLA-CP에 비해서 상당히 높은 수준이었다. 7일 내지 14일 동안의 배양에 의해서 PLA-CPNT1에 서 세포성장은 다른 그룹과 비교하였을 때 여전히 높게 나타났다. 7일째에는 PLA-CPNT2에 대해서 약간 감소하였다. 도 5(b)에 기재된 바와 같이 7일째의 샘플은 세포 형태가 성장하였다. 그리고 대부분 완벽하게 근원적인 물질을 커버하였고, 뛰어난 세포 생활력을 보였다. 이러한 결과에 기반하여 PLA에 CP-기반의 나노입자를 추가하는 것은 세포 생존력에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 그리고 나노복합체에서의 CNT의 존재는 어떠한 세포독성 효과도 보이지 않았다. 그러나, CNT_S (0.05%)적은 농도 대신 세포 재생 능력을 자극하였다.

나노복합체에 있어서 세포의 조골세포 분화는 14일까지(도 6) 배양하는 동안 ALP활성에 기반하여 측정되었다. ALP 단계는 전체 단백질 양을 평균화하여 측정되었다. 결과는 시간-의존적 ALP 향상을 보여주었다. 게다가, ALP활성은 CP 또는 CPNT 나노입자의 PLA로의 첨가로 인해서 양쪽 배양 시간에서 상당히 증가하였다. ALP에서의 증가는 CPNT1이 첨가되었을 때가 최고였다.

콜라겐 타입 Ⅰ(Col Ⅰ)을 포함하는 골 세포와 관련된 유전자 표현은, OPN, BSP, 및 OCN은 qRT-PCR을 사용하여, 도 7에서 보여주듯이 증폭되었다. Col Ⅰ 및 OPN 은 대부분의 나노복합체에 있어서 많이 자극되지 않는다. BSP 및 OCN은 상당히 나노복합체에 있어서 상당히 높게 평가되었다. 특히 PCL-CPNT1의 측면에서. BSP 및 OCN은 골 세포 분화와 미네랄화의 마지막 단계를 포함하는 구체적 유전자이다. PLA-CPNT1 나노복합체에 대한 그들의 상당한 up-regulation은 조골세포 발달을 겪는 세포를 유도하는 잠재적인 기질을 제공한다. 콜라겐의 단백질 표현은 type Ⅰ 및 ALP는 웨스턴 블랏 분석방식에 의해서 도 8에서 보여지듯이 측정되었다. 세포는 PLA 또는 PLA-CP 또는 PLA-CPNT1 중의 하나로 21일 동안 배양되었다. 그리고 세포적 구조는 샘플 그룹에 기반하여 콜라겐 type Ⅰ의 경우에 유사하게 관찰되었다.

단백질의 변화 및 유전자 표현 레벨은 생고분자 PLA 내에 있는 포함되는 물질로서 CP-CNTS 혼합 나노입자의 긍정적인 역할 증명한다. 단단한 세포 임플란트 장치에서 CNT-첨가 나노복합체의 사용, 골 고정에 있어서. 오직 적은 농도의 CNTS(0.05%)는 굉장히 조골세포의 확대 및 분화를 향상시킨다. PLA에 첨가한 CNT_S는 기질에서의 나노구조를 변화해야 한다. 고 분해능 전자 현미경에 의해서 밝혀졌듯이, CNT는 PLA 매트릭스와 관련된 분자는 최초 세포 부착 및 가능한 한 성장 및 분화. 분자 메커니즘이 완전히 밝혀지지 않음에도 나노구조 물질의 역할 특히, CNT_S와 관련된, 조골세포의 성장 및 흡착력 향상에 있어서 최근에 여러 논문에 기재되어 있다. CNT_S에 대한 기질의 전기 전도성은 또 다른 가능한 세포 기능을 바꿀 수 있는 파라미터이다. 세포의 막 포텐셜 및 단백질 흡착력은 매우 높게 조절된다. 이러한 행동에 대한 비록 정확한 메커니즘이 더 나은 조사를 위해서 필요하다. 계속되는 연구는 이러한 새로운 타입의 나노복합체의 적용을 촉진하는데 있어서 in vivo 세포 반응을 포함한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자; 및
생분해성 고분자를 포함하는 나노복합체:
[화학식 1]
[CNT-((CH₂)_aO)_bH]⁺[Y]^-
(상기 화학식 1에서, [Y]^-는 음이온을 나타내고,
2≤a≤6의 정수이고,
1≤b≤50의 정수이다)
제1항에 있어서, 상기 CNT는 단일벽 CNT, 이중벽 CNT 또는 다중벽 CNT인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 인산칼슘은 하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 [Y]^-는 N₃ ^-, Br^-, Cl^-, F^-, I^-, SbF₆ ^-, 플러렌 음이온, CHB₁₁H₁₂ ^-, HS^-, OCN^-, SCN^-, CN^-, PF₆ ^-, NTf₂ ^-, OTf^-, BF₄ ^-, CO₃ ² ^-, HCO₃ ^-, OH^-, NO³ ^-, NO² ^-, PO₄ ³ ^-, HPO₄ ² ^-, H₂PO⁴ ^-, SO₄ ² ^-, HSO^4-. R-COO^-, R-SO₄ ^- (여기서, R은 각각 독립적으로 하이드록시기 또는 아미노기를 포함하는 하나 이상의 작용기로 치환되거나 비치환된 알킬기 또는 아릴기를 나타냄), C₂O₄ ² ^-, HC₂O⁴ ^-, 또는 RNA로부터 유도된 음이온, DNA로부터 유도된 음이온, 단백질로부터 유도된 음이온 및 양이온교환수지로부터 유도된 음이온으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 개질 CNT의 함량은 상기 나노복합체에 대하여 0.05 중량% 내지 0.125 중량%인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 개질 CNT의 함량은 상기 인산칼슘 나노입자에 대하여 0.10 중량% 내지 0.25 중량%인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제1항에 있어서, 상기 인산칼슘의 함량은 상기 생분해성 고분자에 대해서 10 중량% 내지 50 중량%인 것을 특징으로 하는 복합체.
제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(글리콜산), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산), 폴리(L-락타이드-코-D, L-락타이드), 폴리(히드록시부티레이트), 폴리(히드록시 발러레이트), 폴리(발레로락톤), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 나노복합체.
하기 화학식 1의 개질 CNT에 용매를 첨가한 후 교반 또는 초음파 처리하여 개질 CNT 용액을 준비하는 단계;
상기 개질 CNT 용액과 인산칼슘 나노입자를 혼합하여 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 제조하는 단계;
상기 개질 CNT가 흡착된 인산칼슘 나노입자 용액을 생분해성 고분자와 혼합하는 단계; 및
상기 혼합물로부터 용매를 제거하는 단계
를 포함하는 나노복합체의 제조방법:
[화학식 1]
[CNT-((CH₂)_aO)_bH]⁺[Y]^-
(상기 화학식 1에서, [Y]^-는 음이온을 나타내고,
2≤a≤6의 정수이고,
1≤b≤50의 정수이다)
제9항에 있어서, 상기 CNT는 단일벽 CNT, 이중벽 CNT 또는 다중벽 CNT인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(글리콜산), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산-코-글리콜산), 폴리(L-락타이드-코-D, L-락타이드), 폴리(히드록시부티레이트), 폴리(히드록시 발러레이트), 폴리(발레로락톤), 폴리(카프로락톤), 폴리디옥사논, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 트리플루오로에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 클로로포름, 1,4-다이옥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸메타아크릴레이트, 에틸렌글리콜, 디메틸포름아마이드, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 개질 CNT 용액 1 ㎖에 대하여 상기 생분해성 고분자 10 내지 500 mg를 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 용매를 제거하는 단계는 25℃ 내지 50℃에서 10분 내지 2일 동안 건조를 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.