KR101750857B1

KR101750857B1 - 코리네박테리아용 자동 유도성 합성 프로모터

Info

Publication number: KR101750857B1
Application number: KR1020150129586A
Authority: KR
Inventors: 정기준; 김민정; 임성순; 최재웅
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2015-09-14
Filing date: 2015-09-14
Publication date: 2017-06-29
Also published as: KR20170031961A

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 속 균주에 대하여, 자동 유도성을 가지는 신규 합성 프로모터 및 자동 유도성 합성 프로모터의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코리네박테리움의 세포성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 자동발현을 나타내는 합성 프로모터 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 자동 유도성 프로모터를 사용하면, 야생의 코리네박테리움 내에서 존재하는 자동 유도성 프로모터들과 비교하여, 현저히 높은 발현율과 발현 유도능을 나타내어, 코리네박테리움을 이용한 재조합 단백질의 생산수율을 향상시킬 수 있다.

Description

코리네박테리아용 자동 유도성 합성 프로모터{Auto-inducible Synthetic Promotor for Corynebacteria}

본 발명은 코리네박테리움 속 균주에 대하여, 자동 유도성을 가지는 신규 합성 프로모터 및 자동 유도성 합성 프로모터의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코리네 박테리움의 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 자동발현을 나타내는 합성 프로모터 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 포자를 생산하지 않고 병원성이 없는 GRAS한 그람 양성균으로, 현재 산업적으로 아미노산과 핵산 등의 생산에 많이 이용되는 미생물이다. 이 균주를 이용하여 더 많은 산물을 얻기 위해 다양한 세포 엔지니어링 기술이 개발되고 있으며, 그 중 코리네박테리움에 최적의 유전자 발현 프로모터를 개발하여, 유전자 발현 정도를 조절하는 기술이 중요한 요소 중 하나이다.

프로모터의 종류로는 대표적으로 항시성 프로모터(constitutive promoter)와 유도성 프로모터(inducible promoter)가 있다. 항시성 프로모터는 발현의 세기가 특정 조건에 의하여 유도되지 않고 일정하게 유지되는 프로모터로서, 표적 유전자의 항시적인 전사가 일어나는 프로모터이다. 반면, 유도성 프로모터는 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터로서, 표적 유전자의 단백질로의 발현 여부를 유도 인자(inducer)를 이용하여 조절할 수 있다. 이와 같은 유도성 프로모터는 항시성 프로모터에 비해 단백질 발현에 있어 여러 가지 장점을 가진다. 그 중 가장 중요한 장점은, 단백질의 발현을 원하는 시점에서 유도인자의 투입을 통하여 유도할 수 있기 때문에 세포의 대사공학적 부담을 덜어줄 수 있다는 것이다. 원하는 시점에서 단백질 발현을 유도함으로써, 초기 성장 속도를 빠르게 유지할 수 있다. 때문에 유도성 프로모터는 세포 성장을 저해할 수 있는 독성 화학물질 또는 단백질의 발현에 유리하게 작용할 수 있다.

그러나, 유도성 프로모터는 유도인자의 투입을 위해서 지속적인 세포 농도와 대사공학적 상태의 관측이 필요하여, 산업적 규모의 단백질 대량 생산 시스템에서 인력과 물자를 낭비하는 단계로 작용할 수 있기 때문에 단점으로 작용한다. 그리고 대부분의 유도인자는 독성을 띄거나 대량 생산 시스템에 사용하기에는 가격 효율이 지나치게 떨어진다는 단점이 있다.

특히 의료용 단백질 생산에 있어 유도 인자의 독성은 치명적인 영향을 끼칠 수 있기 때문에 유도 인자의 사용을 가급적 피하는 것이 유리하다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 자동 유도성 프로모터 (auto-inducible promoter)에 관한 많은 연구가 진행되어왔다.

자동 유도성 프로모터는 영양 상태, 용존 산소량, 산도, 그리고 세포 성장 단계 등 특정 환경에 의해 단백질 발현이 유도되는 프로모터를 일컫는다. 지금까지 여러 박테리아 균주들에 대하여 이와 같은 자동 유도성 프로모터에 관한 연구가 다수 진행되어 왔지만, 코리네박테리움 글루타미쿰에 관하여 진행된 바가 없기 때문에 산업적 재조합 단백질 생산에 있어 그 수요가 높다.

시그마인자 B(Sigma factor B, sigB)는 세포 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기(transition phase)에서 높은 활성을 보이는 전사인자로, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 기 존재하는 다수의 프로모터가 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 자동 발현 가능한 성질을 나타내도록 하는 인자이다. 그와 같은 자동 발현 가능 프로모터 중 cg3141 프로모터는 세포의 산화질소 해독작용에 관여하는 cg3141 단백질을 발현하는 프로모터로 알려져 있다. 하지만 기존의 cg3141 프로모터는 재조합 단백질 발현 강도가 약하기 때문에 산업적 단백질 생산 시스템으로의 응용을 위해 발현 강도와 발현 조절 등에 대한 개선이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 자동발현 유도기능을 가지면서도 높은 발현강도를 나타내는 프로모터를 개발하고자 예의 노력한 결과, cg3141 프로모터의 시그마인자 B의 결합부위를 변이시켜 개량한 신규 프로모터가 지수증식기(logarithmic phase)에서 정상기(stationary phase)로 넘어가는 과도기(transition phase)에 목적 단백질의 높은 발현강도를 가지면서 발현 조절 능력을 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 높은 목적 단백질의 발현강도를 가지면서 자동 발현 조절 능력을 가지는 신규 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 프로모터 라이브러리를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터 라이브러리와 리포터 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 균주 라이브러리를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 자동 유도성 프로모터의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주의 자동 유도성 프로모터를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로모터 염기서열에서, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로모터 염기서열에서, 201~210, 217~233 및 240~246 서열을 무작위 돌연변이시킨 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 프로모터 라이브러리를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 프로모터 라이브러리와 리포터 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 균주 라이브러리를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 균주 라이브러리를 배양하여, 세포 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 리포터 유전자의 발현이 증가하는 균주를 선별하는 단계; 및 (d) 상기 선별된 균주가 함유하는 자동 유도성 프로모터를 수득하는 단계를 포함하는 자동 유도성 프로모터의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 자동 유도성 프로모터를 사용하면, 야생의 코리네박테리움 내에서 존재하는 자동 유도성 프로모터들과 비교하여, 현저히 높은 발현율과 발현 유도능을 나타내어, 코리네박테리움을 이용한 재조합 단백질의 생산수율을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 합성 프로모터 라이브러리의 벡터 시스템을 나타낸 것이다.
도 2는 형광 활성 세포 분류기를 통한 합성 프로모터 라이브러리의 스크리닝 과정을 나타낸 것이다. 회색은 pCES208 벡터(negative control)이고, 하늘색은 기존 cg3141 프로모터로 발현한 sfGFP이다. (a)는 형광세기가 강한 상위 1% 세포들을 분리하는 양성분리(positive sorting)결과를 나타낸 것으로, 빨간색은 기존 ㄹ라랑라이브러리, 주황색은 1차 라이브러리, 연두색은 2차 라이브러리, 파란색은 3차 라이브러리, 자주색은 4차 라이브러리를 나타낸다. (b)는 형광세기가 하위 1% 세포들을 분리하는 음성분리(negative sorting)결과를 나타낸 것으로, 자주색은 4차 라이브러리이고, 초록색은 4차 라이브러리에서 형광세기가 약한 하위 1% 세포들을 분리하는 음성분리 (negative sorting)결과를 나타낸다.
도 3은 도 2에서 선택된 30개의 세포 중 유도성이 가장 높았던 3 종의 세포 (4-N5, N6, N18)에 대해서 배양시간별 세포 밀도와 sfGFP의 발현양(형광 세기)을 나타낸 것으로, a는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에서의 시간별 세포생장곡선과 발형양를 나타낸 것이고, ●는 pCES208 OD; ○는 pCES208 fluorescence; ▲는 4-N5 sfGFP OD; △는 4-N5 sfGFP fluorescence; ■는 4-N6 sfGFP OD; □는 4-N6 sfGFP fluorescence; ◆는 4-N18 sfGFP OD; ◇는 4-N18 sfGFP fluorescence를 나타낸다. b는 sfGFP를 가지고 있지 않은 pCES208 벡터(negative control)와 기존 cg3141 프로모터로 발현한 sfGFP와 선별된 3종의 promoter로 발현한 sfGFP를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것으로, 1번부터 6번까지의 레인은 트랜스퍼 후 5, 7, 9, 11, 13, 15시간의 배양시간을 나타낸다.
도 4는 4-N18 프로모터에 의하여 발현되는 glutathione S-transferase(GST) 의 발현양을 비교 분석한 것으로, a는 SDS-PAGE를 통한 합성 프로모터의 GST 발현량을 비교분석한 것이고, b는 웨스턴 블럿 실험을 통한 합성 프로모터에 의한 GST의 발현양을 비교 분석한 것이다 1번부터 7번까지의 레인은 트랜스퍼한 후 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17시간의 배양시간을 나타낸다. (c) 는 4-N18 프로모터와 GST를 가지고 있지 않은 pCES208 벡터만 가지고 있는 세포로부터 4-N18 프로모터와 GST를 가지고 있는 pCES208 벡터를 함유한 세포의 세포성장곡선 (optical density, OD)을 비교한 것이다. ●는 pCES208 OD; ▲는 4-N18 GST OD를 나타낸다.

본 발명에서는 코리네박테리움 글루타미콤 균주의 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에서 자동으로 발현되도록 조절하는 능력을 가지는 프로모터를 개량하여, 재조합 단백질의 발현강도와 자동 유도성을 높일 수 있는 프로모터를 개발하고자 하였으며, 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기(transition phase)에서 높은 활성을 보이는 시그마인자 B(Sigma factor B, sigB)가 결합하는 cg3141 프로모터를 개량한 합성 프로모터를 제작하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, 서열번호 1~3 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 코리네박테리움 속 균주의 자동 유도성 프로모터에 관한 것이다.

본 발명의 신규 합성 프로모터는 기존 cg3141 프로모터(서열번호 4)에서 300개의 염기서열 부분에서 SigB 결합부위 (-35: TTAAGG, -10: TGGGAT) 양 옆 플랭킹부위(flanking region)의 총 34개의 유전자 서열을 무작위적으로 디자인한 라이브러리에서 스크리닝 하였으며, 코리네박테리움 글루타미콤 균주의 성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에서 활성이 유도되는 프로모터이다.

본 발명의 일 양태에서는 발굴된 자동 유도성 프로모터가 과도기(9시간)부터 급속도로 GST를 생산하기 시작하여 안정기에 들어가고 난 후에도 지속적으로 GST를 생산하는 것을 확인하였으며, 세포 성장 속도가 GST를 만들지 않는 순수 pCES208 벡터만 가지고 있는 코리네박테리움과도 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다 (도 4c).

다른 관점에서, 본 발명은 상기 자동 유도성 프로모터를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미콤인 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 자동 유도성 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로모터 염기서열에서, 201~210, 217~233 및 240~246 서열을 무작위 돌연변이시킨 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 프로모터 라이브러리 및 상기 프로모터 라이브러리와 리포터 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 균주 라이브러리에 관한 것이다.

상기 서열번호 4의 염기서열을 가지는 프로모터 염기서열에, 201~210, 217~233 및 240~246 서열은, 전사시작점 전 프로모터 염기서열 중 시그마인자 B의 결합부위를 제외한 34개의 유전자 서열 (전사시작점 전 ??1부터 ??7까지, -14부터 ??30까지, -37부터 ??46까지)을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광단백질, 항생제 내성단백질 및 탄수화물 가수분해 효소로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "과도기"는 세포성장 단계 중 지수증식기(logarithmic phase)에서 정상기(stationary phase)로 넘어가기 전 단계의 중간과정인 과도기(transition phase)를 의미한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 균주 라이브러리를 배양하여, 세포성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 리포터 유전자의 발현이 증가하는 균주를 선별하는 단계; 및 (d) 상기 선별된 균주가 함유하는 자동 유도성 프로모터를 수득하는 단계를 포함하는 자동 유도성 프로모터의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는, cg3141 프로모터(서열번호 4)에서 300개의 염기서열 부분에서 SigB 결합부위 (-35: TTAAGG, -10: TGGGAT) 양 옆 플랭킹부위(flanking region)의 총 34개의 유전자 서열을 무작위적으로 디자인하고,sfGFP(super-folder green fluorescent protein) 유전자를 프로모터 활성의 리포터 유전자로 연결하여 합성프로모터 라이브러리 플라스미드를 제작하고, pCES208에 상기 프로모터 라이브러리를 삽입한 후, 대장균 균주 XL1-Blue (invitrogen, 미국)를 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 구축한 라이브러리에서 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 형질전환하여, 자동 유도성 프로모터 스크리닝용 코리네박테리움 균주 라이브러리를 제작하였다. 상기 코리네박테리움 균주 라이브러리를 배양하여, 세포성장 단계 중 지수증식기에서 정상기로 넘어가는 과도기에 높은 형광세기를 나타내는 균주를 선발하고, 상기 균주가 함유한 프로모터의 염기서열을 확인하고, 자동 유도성 프로모터로 선별하였다.

본 발명에서, “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 속 균주를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미콤 균주를 사용할 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에서 “발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 프로모터 라이브러리의 제작

코리네박테리움에서 단백질의 대량생산에 사용될 수 있는 자동 유도성 합성프로모터를 스크리닝하기 위한 라이브러리를 구축하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 기존 cg3141 프로모터(서열번호 4)에서 300개의 염기서열 부분에서 SigB 결합부위 (-35: TTAAGG, -10: TGGGAT) 양 옆 플랭킹부위(flanking region)의 총 34개의 유전자 서열을 무작위적으로 디자인하고,sfGFP(super-folder green fluorescent protein) 유전자를 프로모터 활성의 리포터 유전자로 연결하여 합성프로모터 라이브러리 플라스미드를 제작하였다.

합성프로모터 라이브러리의 벡터로는 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터인 pCES208 (J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)을 사용하였다.

먼저, 형질전환 효율이 높은 대장균 균주 XL1-Blue (invitrogen, 미국)를 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 구축한 라이브러리에서 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 형질전환하였다.

PCR을 이용하여, 프로모터와 sfGFP 단편을 수득하였으며, 사용한 프라이머의 Tm은 모두 55℃ 이상으로 제작하였다

300개의 염기 서열을 가진 cg3141 프로모터와 sfGFP를 pCES208 벡터에 연결하기 위해 먼저 정방향 프라이머(서열번호 5)와 역방향 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 코리네박테리움 염색체로부터 300개의 염기 서열을 가진 cg3141 프로모터를 PCR을 통해 제조하였다. 그리고 sfGFP는 정방향 프라이머(서열번호 7)와 역방향 프라이머(서열번호 8)를 사용하여 Addgene plasmid 40127 (Addgene, 미국)로부터 PCR을 통해 제조하였다. sfGFP에는 역방향 프라이머(서열번호 8)에 부착된 표지분자인 FLAG tag이 C-터미너스에 부착되었다. 그리고 그 두 유전자 단편을 cg3141프로모터의 정방향 프라이머 (서열번호 5)와 sfGFP의 역방향 프라이머(서열번호 8)로 PCR을 이용하여 연결하였다.

서열번호 5: attaatggtaccgactcggatgtttttatcgcctg

서열번호 6: cagtgaaaagttcttctcctttgctcatatggttttcgcctttccatgcttcatg

서열번호 7: attaatcatatgagcaaaggagaagaacttttcactg

서열번호 8:

attaatgcggccgcttattatttgtcatcgtcatctttataatctttgtagagctcatccatgccat

상기 PCR에서 얻어진 cg3141 프로모터와 sfGFP가 연결된 유전자를 벡터 pCES208에 연결하기 위해 pCES208를 제한효소 KpnI과 NotI으로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이 하고, pCES208Pcg3141sfGFP 플라스미드를 수득하였다.

합성 프로모터 라이브러리는 기존 cg3141 프로모터에서 300개의 염기서열 중 시그마 인자 B (SigB)의 결합부위인 -35 (TTAAGG) 앞 10개의 염기 서열, -35와 -10 (TGGGAT) 사이 17개의 염기서열, -10 뒤 7개의 염기서열을 무작위하게 변이시켜 제작하였다. 먼저 정방향 프라이머(서열번호 9)와 역방향 프라이머(서열번호 10)을 이용하여 100개의 염기서열을 가진 -35와 -10부분과 UTR을 포함한 유전자 단편을 제작하였고, 앞 200개의 염기서열 (도 1에서의 업스트림 부위)을 가진 유전자 단편을 제작하기 위해 cg3141 프로모터의 정방향 프라이머 (서열번호 5)와 역방향 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 코리네박테리움의 염색체에서 PCR을 사용하였다. 200개의 염기서열을 가진 앞쪽 업스트림 부위, 100개의 염기서열을 가진 뒤쪽 무작위변이된 부위 및 UTR을 연결하기 위해 cg3141 프로모터의 정방향 프라이머 (서열번호 5)와 라이브러리의 역방향 프라이머 (서열번호 10)을 사용하여 PCR을 하였다.

서열번호 9: atggtacccccgtttaaacatttttccaattagtgatNNNNNNNNNNttaagg

NNNNNNNNNNNNNNNNNtgggatNNNNNNNattagattaaatccgtagaaattagccc

서열번호 10:

attaatcatatggttttcgcctttccatgcttcatgggctaatttctacggatttaatctaat

서열번호 11: atcactaattggaaaaatgtttaaacggg

상기 PCR에서 얻어진 프로모터 라이브러리를 sfGFP를 가진 pCES208에 삽입하기 위하여, 상기 프로모터 라이브러리와 앞서 제작된 pCES208Pcg3141sfGFP 플라스미드를 KpnI과 NdeI 제한효소로 절단한 후 T4 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하였다.

상기 제조된 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032)에 형질전환하여, 합성 프로모터 라이브러리를 제작하였다.

실시예 2: 형광 활성 세포 분류기를 통한 자동 유도성 합성 프로모터 라이브러리 분리

실시예 1에서 제작된 프로모터 라이브러리를 BHI(Brain heart infusion) 배지(BD, 미국)에 접종하여 약 24시간 동안 30℃, 200 rpm에서 배양한 다음 초최소배지(20 g glucose, 2 g MgSO₄, 3 g K₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄, 2 g urea, 10 g (NH₄)₂SO₄, 2 g MgSO₄, 200μg biotin, 5mg thiamine, 10mg calciumpantothenate, 10 mg FeSO₄, 1 mg MnSO₄, 1 mg ZnSO₄, 200 μg CuSO₄ 및 10mg CaCl₂)에 1/100 부피 만큼 접종한 후, 동일 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 배양한 코리네박테리움을 6000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 수득한 후 PBS에 현탁하고, FACS(fluorescence activated cell sorter)를 사용하여 sfGFP의 발현에 의해 상위 1%의 높은 형광세기를 보이는 세포들을 분리하였다. 분리한 코리네박테리움을 신선한 BHI에 배양한 뒤 최소 배지로 옮기고 스크리닝을 4회까지 반복하였다(도 2a).

그 후, 세포성장 단계 중 정상기에 도달하기 이전에 이미 높은 형광 값을 나타내는 세포들을 배제하기 위하여, 지수 증식기에서 하위 1%의 낮은 형광 세기를 가지는 세포들을 negative sorting을 통해 분리하였다(도 2b). 최종적으로 분류된 코리네박테리움은 고체 RG 아가배지 (40 g BHI, 10 g glucose, 10 g beef extract, 30 g sorbitol 20 g agar)에서 배양하여, 콜로니를 수득하여 분석하였다 (도 3).

실시예 3: 최종적으로 발굴한 자동 유도성 합성 프로모터의 활성 분석

실시예 2에서 개별적인 콜로니 분석을 통해 선정된 세 개의 강하고 유도능(induciblity)이 좋은 자동 유도성 프로모터를 4-N5 (서열번호 1), 4-N6　（서열번호 2) 및 4-N18 (서열번호 3)라고 명명하고, 서열을 분석하였다(표 1).

분리된 자동유도성 프로모터 서열

명칭	염기서열	서열번호
4-N5	GACTCGGATGTTTTTATCGCCTGGAAATTGTTCGCCCATAATGTCTCATTCTAGAGGGTTTTTAATTGTTTTAAATCCGGGGATTCCCTGAACTGAATGGGGGTAGTGGGGGTAGGCCTGTATTAAATAGCGATAAAACGGCATTAAACCCGGTTGAATCCGTTTTTAATGCCCGTTTAAACATTTTTCCAATTAGTGATCATTAGGCGATTAAGGGTCAAGCGGTGGTAT	서열번호 1
4-N6	GACTCGGATGTTTTTATCGCCTGGAAATTGTTCGCCCATAATGTCTCATTCTAGAGGGTTTTTAATTGTTTTAAATCCGGGGATTCCCTGAACTGAATGGGGGTAGTGGGGGTAGGCCTGTATTAAATAGCGATAAAACGGCATTAAACCCGGTTGAATCCGTTTTTAATGCCCGTTTAAACATTTTTCCAATTAGTGATATTGCGCACATTAAGGCAACGGGCCTGGATCGTTGGGATTTAAGCTATTAGATTAAATCCGTAGAAATTAGCCCATGAAGCATGGAAAGGCGAAAAC	서열번호 2
4-N18	GACTCGGATGTTTTTATCGCCTGGAAATTGTTCGCCCATAATGTCTCATTCTAGAGGGTTTTTAATTGTTTTAAATCCGGGGATTCCCTGAACTGAATGGGGGTAGTGGGGGTAGGCCTGTATTAAATAGCGATAAAACGGCATTAAACCCGGTTGAATCCGTTTTTAATGCCCGTTTAAACATTTTTCCAATTAGTGATCAAATCAACATTAAGGATATGGACGTTGCCAGCTGGGATGGTTAGAATTAGATTAAATCCGTAGAAATTAGCCCATGAAGCATGGAAAGGCGAAAAC	서열번호 3
cg3141	GACTCGGATGTTTTTATCGCCTGGAAATTGTTCGCCCATAATGTCTCATTCTAGAGGGTTTTTAATTGTTTTAAATCCGGGGATTCCCTGAACTGAATGGGGGTAGTGGGGGTAGGCCTGTATTAAATAGCGATAAAACGGCATTAAACCCGGTTGAATCCGTTTTTAATGCCCGTTTAAACATTTTTCCAATTAGTGATTGCCATCATATTAAGGCCAAATTGCTTGGATCCTGGGATTTATTTAATTAGATTAAATCCGTAGAAATTAGCCCATGAAGCATGGAAAGGCGAAAACCCC	서열번호 4

pCES208 벡터로 형질전환된 코리네박테리움과, sfGFP가 연결된 기존 cg3141 프로모터를 가지는 재조합 벡터와 발굴한 3종의 자동 유도성 프로모터를 가지는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움을 각각 BHI에 접종하여 약 24시간 동안 30℃, 200rpm에서 배양한 다음, 최소배지로 1/100 부피만큼 접존하고, 동일 조건에서 배양하면서 시간별 세포 농도와 형광 세기를 비교 분석하였다.

시간별로 샘플링한 코리네박테리움을 6000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체만 수득한 다음 PBS에 현탁하고 형광분석기와 웨스턴 블럿으로 sfGFP의 발현양을 분석하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 유도기(lag phase)와 대수증식기인 배양 9시간째까지는 형광 세기가 일정하다가, 과도기(9시간째)부터 형광단백질 발현양이 급격히 증가하는 것을 확인하였다.

웨스턴 블럿을 위하여 PBS에 현탁하여 수득한 균체를 초음파로 용해시키고, 전세포 lysate로 웨스턴 블럿을 수행하였다. 웨스턴 블럿 실험에 사용된 항체는 anti-FLAG M2 항체에 Horseradish peroxide (HRP)가 연결된 항체 (Sigma-Aldrich, 미국)를 사용하였다. 웨스턴 블롯을 통해 도 3b에 나타난 결과와 같이, 발굴된 자동 유도성 프로모터가 기존 cg3141 프로모터와 비슷한 패턴을 가지면서 보다 강력한 세기를 가지는 것을 확인하였다.

실시예 4: 합성 프로모터를 통한 재조합 단백질 생산

발굴된 자동 유도성 합성 프로모터를 사용하여 재조합 단백질 생산이 가능한지를 확인하기 위하여, 실시예 3에서 발굴된 프로모터 중 가장 유도성이 좋은 4-N18 (서열번호 3)을 사용하여 glutathione S-transferase (GST)를 생산하였다. 4-N18 GST 생산을 위해 먼저 정방향 프라이머(서열번호 12)와 역방향 프라이머 (서열번호 13)로 PCR을 사용하여 GST 유전자 절편을 수득하였고, 수득된 유전자 절편과 4-N18 sfGFP 플라스미드를 제한효소 NdeI과 NotI으로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하였다.

서열번호 12: attaatcatatgtcccctatactaggttattgga

서열번호 13: attaatgcggccgcttattaatccgattttggaggatggtcg

시간별 세포 농도와 GST 생산량을 분석하기 위해 pCES208 벡터를 가진 코리네박테리움과 4-N18 GST를 BHI 배지에 접종하여 24시간동안 30℃, 200rpm에서 배양 후 1/100 부피만큼 최소배지로 옮겨서 동일 조건에서 배양하면서 시간별로 일정량 샘플링하고 세포농도를 측정하였다. 시간별 수득한 코리네박테리움을 6000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체만 습득한 뒤 PBS에 현탁하고 수득한 균체를 초음파로 용해시키고, 전세포 lysate로 웨스턴 블럿을 수행하였다. anti-GST-HRP conjugated antibody (GE Healthcare, 미국)를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 4a와 도 4b에 나타난 바와 같이, 발굴된 자동 유도성 프로모터가 과도기(9시간)부터 급속도로 GST를 생산하기 시작하여 안정기에 들어가고 난 후에도 지속적으로 GST를 생산하는 것을 확인하였다. 그리고, 세포 성장 속도가 GST를 만들지 않는 순수 pCES208 벡터만 가지고 있는 코리네박테리움과도 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다 (도 4c).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea advanced institutue of science and technology <120> Auto-inducible Synthetic Promotor for Corynebacteria <130> P15-B269 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-N5 promoter <400> 1 gactcggatg tttttatcgc ctggaaattg ttcgcccata atgtctcatt ctagagggtt 60 tttaattgtt ttaaatccgg ggattccctg aactgaatgg gggtagtggg ggtaggcctg 120 tattaaatag cgataaaacg gcattaaacc cggttgaatc cgtttttaat gcccgtttaa 180 acatttttcc aattagtgat cattaggcga ttaagggtca agcggtggta t 231 <210> 2 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-N6 promoter <400> 2 gactcggatg tttttatcgc ctggaaattg ttcgcccata atgtctcatt ctagagggtt 60 tttaattgtt ttaaatccgg ggattccctg aactgaatgg gggtagtggg ggtaggcctg 120 tattaaatag cgataaaacg gcattaaacc cggttgaatc cgtttttaat gcccgtttaa 180 acatttttcc aattagtgat attgcgcaca ttaaggcaac gggcctggat cgttgggatt 240 taagctatta gattaaatcc gtagaaatta gcccatgaag catggaaagg cgaaaac 297 <210> 3 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-N18 promoter <400> 3 gactcggatg tttttatcgc ctggaaattg ttcgcccata atgtctcatt ctagagggtt 60 tttaattgtt ttaaatccgg ggattccctg aactgaatgg gggtagtggg ggtaggcctg 120 tattaaatag cgataaaacg gcattaaacc cggttgaatc cgtttttaat gcccgtttaa 180 acatttttcc aattagtgat caaatcaaca ttaaggatat ggacgttgcc agctgggatg 240 gttagaatta gattaaatcc gtagaaatta gcccatgaag catggaaagg cgaaaac 297 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cg3141 promoter <400> 4 gactcggatg tttttatcgc ctggaaattg ttcgcccata atgtctcatt ctagagggtt 60 tttaattgtt ttaaatccgg ggattccctg aactgaatgg gggtagtggg ggtaggcctg 120 tattaaatag cgataaaacg gcattaaacc cggttgaatc cgtttttaat gcccgtttaa 180 acatttttcc aattagtgat tgccatcata ttaaggccaa attgcttgga tcctgggatt 240 tatttaatta gattaaatcc gtagaaatta gcccatgaag catggaaagg cgaaaacccc 300 300 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 attaatggta ccgactcgga tgtttttatc gcctg 35 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cagtgaaaag ttcttctcct ttgctcatat ggttttcgcc tttccatgct tcatg 55 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 attaatcata tgagcaaagg agaagaactt ttcactg 37 <210> 8 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 attaatgcgg ccgcttatta tttgtcatcg tcatctttat aatctttgta gagctcatcc 60 atgccat 67 <210> 9 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atggtacccc cgtttaaaca tttttccaat tagtgatnnn nnnnnnntta aggnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn tgggatnnnn nnnattagat taaatccgta gaaattagcc c 111 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 attaatcata tggttttcgc ctttccatgc ttcatgggct aatttctacg gatttaatct 60 aat 63 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atcactaatt ggaaaaatgt ttaaacggg 29 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 attaatcata tgtcccctat actaggttat tgga 34 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 attaatgcgg ccgcttatta atccgatttt ggaggatggt cg 42

Claims

서열번호 3의 염기서열로 표시되는 코리네박테리움 속 균주의 자동 유도성 프로모터.
제1항의 프로모터를 함유하는 재조합 벡터.
제2항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
다음 단계를 포함하는 목적단백질의 제조방법;
(a) 제1항의 프로모터와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 생성시키는 단계; 및
(b) 생성된 목적단백질을 회수하는 단계.
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