KR101750364B1 - 생리활성 펩타이드 복합체 - Google Patents

생리활성 펩타이드 복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR101750364B1
KR101750364B1 KR1020147032181A KR20147032181A KR101750364B1 KR 101750364 B1 KR101750364 B1 KR 101750364B1 KR 1020147032181 A KR1020147032181 A KR 1020147032181A KR 20147032181 A KR20147032181 A KR 20147032181A KR 101750364 B1 KR101750364 B1 KR 101750364B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
peptide
val
peptides
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020147032181A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150002842A (ko
Inventor
올레그 이바노비치 키셀레프
펠리크스 이바노비치 에르쇼프
Original Assignee
오브쉬체스트보 에스 오그라니체노이 오트벳스트베노스트유 "알로페론"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49624148&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101750364(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 오브쉬체스트보 에스 오그라니체노이 오트벳스트베노스트유 "알로페론" filed Critical 오브쉬체스트보 에스 오그라니체노이 오트벳스트베노스트유 "알로페론"
Publication of KR20150002842A publication Critical patent/KR20150002842A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101750364B1 publication Critical patent/KR101750364B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 면역조절 및 항 바이러스 활성을 갖는 단백질 및 생리활성 펩타이드 복합체에 관한 것이다. 제시된 펩타이드 복합체는 3차원 구조를 가지며 다음의 구조식으로 나타낸다:
Figure 112014110513730-pct00003

여기서, X1은 존재하지 않거나 또는 적어도 1 개의 아미노산을 갖고;
R1 및 R2는 전이 금속 이온과 상호작용을 할 수 있는 His 또는 Cys인 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 사슬로서, R1은 최대 5 개의 아미노산 잔기를 갖거나 또는 존재하지 않으며, R2는 최대 3 개의 아미노산 잔기를 갖거나 또는 존재하지 않는다.
히스티딘 풍부 펩타이드, 특히 Zn 이온을 갖는 알로페론 계열의 펩타이드 복합체는 목표하는 작용 기전을 갖는 약물을 생성할 수 있고, 약물의 표적 구조에 대한 이해에 따라 이들 제제를 설계할 수 있게 한다.

Description

생리활성 펩타이드 복합체{BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDE COMPLEXES}
본 발명은 면역 조절 및 항바이러스 활성을 갖는 단백질 및 생리활성 펩타이드에 관한 것이다.
항바이러스제로서 의료용으로 사용되는 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질계 화합물이 알려져 있다. I형 인터페론 유도물질(I interferon inducer, IFI) 중에서, 고분자 화합물[F. I. Yershov, O. I. Koselev. Interferons and their inducers from the molecule to the drug -, .: Publ. House. Geotar - Media, 2005 - P. 356], [Berg K., Bolt G., Andersen H., Owen TC. Zink potentiates the antiviral action of human IFN-alpha tenfold. J.Interferon Cytokine Res, 2001, Jul; 21(7):471-4] 및 저분자 유도물질이 알려져 있다. 후자는 국내 약물 시클로페론(cycloferon) 및 미국 약물 이미퀴모드(imiquimod)가 주로 주목된다. 이들 약물은 각각 아크리딘(acridone) 및 벤즈이미다졸(benzimidazole) 유도체를 말한다. 이미퀴모드 및 유사한 유도체에 대해, 톨 유사 수용체(toll like receptor)가 알려져 있으며, 이는 이러한 군의 약물과 상호작용을 하여 다양한 세포 내에서 IFN- 합성을 유도한다[F.I. Yershov., O.I. Kiselev. Interferons and their inducers (from the molecule to the drug) .: Publ. House. Geotar - Media, 2005.- P. 356].
저분자 펩타이드의 생체활성은 널리 알려져 있다. 우선, 이는 항균 활성을 갖는 동물 및 식물 기원 펩타이드를 말한다[Boman H. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Anu. Rev. of Immunol., 1995, Vol.13, p.61-92]. 그러나, 직접적인 항바이러스 및 항종양 활성을 갖는 다양한 펩타이드가 개시되어 있다[Akiyama N., Hijikata M., Kobayashi A., Yamori T., Tsuruo T., Natori S. Anti-tumor effect of N--alanyl-5-S-glutathionyl dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD) a novel anti-bacterial substance from an insect.Anticancer Research, 2000, Vol. 20, p. 357-362].
양서류와 곤충류의 펩타이드는 여기에서 특별한 위치를 차지한다[Bulet P., Hetru C., Diamarcq J., Hoffmann D. Antimicrobial peptides in insects: structure and function. Devel. Comp. Immunol., 1999, Vol.23, p.329-344, Chinchar V.G., Wang J., Murti G., Carey C., Rolling-Smith L. Inactivation of frog virus 3 and channel catfish virus by esculentin-2P and ranatuerin-2P, two antimicrobial peptides isolated from frog skin. Virology, 2001, Vol.288, p.351-357].
면역 조절 펩타이드 - 알로페론(alloferon)이 알려져 있다(러시아 연방(RF) 특허 제 2172322호). 바이러스 감염의 치료는 알로페론의 주요 응용 영역이다. 알로페론은 화학 구조 및 작용 기전과 관련해서 본 발명의 가장 가까운 유사체이다.
특허 제 2172322호의 발명자들은 일차 알로페론 구조의 변형을 고려하기만 하였고 히스티딘 잔기 분포에 대해서는 핵심 가치를 두지 않는다는 것을 주목해야 한다.
또한 알로페론은 매우 "약한" 인터페론 유도물질로 지칭되어야 하며, 이는 이들의 활성을 시클로페론과 비교할 때 분명하다.
동시에, 알로페론 구조는 규칙적인 히스티딘 잔기의 배열과 반복적인 글리신 잔기를 가지고 있는 점이 두드러진다. 알로페론 구조의 개선은 3차 구조 성분을 부여함으로써, 예를 들면, 금속 이온을 도입함으로써 가능하다.
아연(Zn), 구리(Cu), 철(Fe), 망간(Mn)이 사용될 수 있는 금속 이온을 포함하는, 바이러스 박멸 및 항바이러스 활성을 갖는 헤민-펩타이드(hemin-peptide) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 또한 알려져 있다(러시아 연방 특허 제 2296131호). 그러나, 이 화합물은 펩타이드의 다른 부류의 펩타이드를 말하며 면역 조절제는 아니다.
3차 구조로 구조화된 성분 및 제 1 유형의 인터페론 유도물질의 활성을 갖고 Zn++ 이온을 함유하는 펩타이드 복합체는 문헌에 개시되어 있지 않다.
다음과 같은 이유에서 Zn++ 이온을 갖는 히스티딘 함유 펩타이드의 변형이 필요하다:
1. 생리활성의 짧은 펩타이드는 불가피하게 이의 생리활성, 다른 거대분자와 상호작용 및 대사 안정성을 감소시키는 2차 구조의 해체된 유형을 갖는다.
2. 펩타이드의 생물학적 및 약리학적 활성은 크게 세포로의 수송 효율성에 의존한다. 펩타이드 구조를 치밀하게 함으로써 세포막을 통한 전좌(translocation)의 효율성 그리고 이에 따라 약리학적 활성을 증가시킨다[Leng Q., Mixson J. Modified branched peptides with histidine-rich tail enhance in vitro gene transfection. Nucl. Acids. Res., 2005, Vol. 33, e40 ].
3. Zn++ 이온을 갖는 히스티딘 함유 펩타이드 복합체의 형성은 펩타이드의 특성의 근본적인 변화를 유발함으로써, 바이러스 및 세포의 전사활성 인자의 도메인과 동일하게 만든다.
본 발명의 목적은 3차원 구조로 구조화된 펩타이드 복합체를 제공하는 것이다. 설계된 복합체는 다른 분자들과의 높은 결합 능력을 갖고, I형 인터페론 유도를 포함하는 약리학적 작용의 폭넓은 효능을 보이며, 다양한 수준의 세포 기능에 작용을 함으로써 이를 근거로 한 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 새로운 약물을 제조할 수 있게 한다.
히스티딘 잔기가 풍부한 공지된 펩타이드, 알려진 기능을 갖는 단백질 도메인의 Zn-손가락(Zn-finger)을 원형으로 사용하는 알로페론 및 이들의 유사체를 근거로 새로운 계열의 생리활성 펩타이드가 개발되었다. 알로페론은 6 내지 35 개의 아미노산 잔기 길이의 펩타이드 기질로서 사용된다. 이렇게 설계된 펩타이드는 Zn++ 이온을 갖는 복합체를 형성하여, 올리고머와 응집체(aggregate)를 생성하며, 구조적 및 생물학적 특성에 대해 이들은 면역 조절제의 요건을 충족시킨다.
제시된 펩타이드 복합체는 3차원 구조를 가지며 다음의 구조식으로 나타낸다:
Figure 112014110513730-pct00001
여기서, X1은 존재하지 않거나 또는 적어도 1 개의 아미노산을 갖고; R1 및 R2는 아미노산 잔기를 포함하고 전이 금속 이온과 상호작용을 할 수 있는 펩타이드 사슬로서, R1은 최대 5 개의 아미노산 잔기를 갖거나 또는 존재하지 않으며, R2는 최대 3 개의 아미노산 잔기를 갖거나 또는 존재하지 않는다.
금속 이온과 결합하는 히스티딘이 풍부한 천연 펩타이드의 능력은 많은 연구에서 입증되었다[Hua Zhao H., and Waite J. H. Proteins in Load-Bearing Junctions: The Histidine-Rich Metal-Binding Protein of Mussel Byssus, Biochemistry. 2006, 45(47): 14223-14231].
본 발명의 특징은 다음의 도면에 도시된 데이터를 가지고 설명된다:
도 1은 알로페론 계열의 펩타이드의 공통 서열 분석을 나타낸다.
도 2는 A1 폴리펩타이드의 컴퓨터 모델을 나타낸다.
도 3은 Zn++ 이온을 갖는 A1 복합체의 구조에 대한 이론상 가능한 변형을 나타낸다.
도 4는 광산란법(light-scattering method)에 의한, Zn++과 결합하는 알로페론 A1의 동역학을 나타낸다.
도 5는 Ni++로 평형시킨 HiTrap 흡착제와의 펩타이드 A1의 결합력에 대한 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 I형 인터페론의 유도를 나타낸다.
도 7은 쥐의 치명적인 인플루엔자 감염에서 연구된 약물의 보호 효과를 나타낸다.
본 발명의 개발시 표 2에 나타낸 알로페론 1 (서열 번호 1) 펩타이드가 기본 구조로 사용되었다. 알로페론 1을 고체상(solid-phase) 합성법에 의해 합성하였고 제시된 펩타이드의 생리활성을 연구하기 위해 사용하였다. 본 연구는 이 펩타이드가 전이 금속으로 복합체를 형성하는 능력을 갖고 있고, 인터페론 유도물질이며, 항바이러스 활성을 갖고 있는 것을 입증하였으며, 이 연구의 결과는 하기 실시예에 나타나 있다.
단백질과 펩타이드의 구조 및 특성에 대한 데이터베이스의 컴퓨터 분석은 이 화합물이 새로운 계열의 생리활성 펩타이드라는 것을 확인하였다. 도입된 금속 이온을 갖는 히스티딘과 글리신 풍부 폴리펩타이드는 면역 조절 및 항바이러스 활성을 가지며, 아연 이온은 이들의 생리활성을 가능하게 한다. 제시된 서열의 펩타이드의 합성은 페닐 아세트아미드 메틸(PAM) 고분자의 Boc/Bzl 합성법을 이용하는 고체상 펩타이드 합성으로 수행하였다. Coupler-250 및 Applied Biosystems 430A 펩타이드 합성기를 이용하여 펩타이드를 분리하였다.
터트-부톡시카르보닐아미노기는 트리플루오로아세트산을 사용하여 제거된 -아미노기의 일시적인 보호를 위하여 사용되었다. 삼작용성(trifunctional) 아미노산의 측쇄를 보호하기 위해 다음과 같은 벤질 및 아실 유형의 보호기를 사용하였다: 히스티딘을 위한 디니트로페닐, 아르기닌을 위한 메시틸렌설포닐, 리신을 위한 2-클로로벤질옥시카르보닐, 트립토판을 위한 포르밀, 티로신을 위한 2,6-디클로로벤질, 트레오닌과 세린을 위한 O-벤질 에테르. 메티오닌을 설폭시 유도체 형태로 응축 단계에 도입하였다.
일시적인 보호기의 제거는 비희석 트리플루오로아세트산을 이용하여 수행되었으며, N,N'-디이소프로필에틸아민을 응축 단계에서 반응 혼합물에 직접 첨가하여 중화하였다.
0.2 mmol의 고분자에 대해 아실아미노산의 전체 함량을 기준으로 펩티딜-고분자 사슬을 연장하는 동안 하나의 아미노산 잔기의 첨가를 위한 프로그램이 표에 나타나 있다. 카르복실기 성분의 사전 활성화를 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole)과 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide)를 사용하여 30 분내로 수행하였다. 이러한 합성 조건 하에서 펩타이드 절편의 서열에 해당하는 필요한 수의 아미노산 잔기를 첨가한 후 모든 경우에서 만족스러운 펩티딜-고분자의 증가에 도달하였다.
측쇄 보호기의 제거 및 수지(resin)에서의 펩타이드의 분리를, 주로 m-크레솔인 스캐빈저 (scavenger)의 존재 하에 무수 불화수소의 작용으로 수행하였다. 이러한 처리를 하는 동안, 모든 측쇄 보호기를 제거하였고, 펩타이드를 고분자 매트릭스로부터 분리하였으며, 방출 시간은 한 시간에서 한 시간 반까지 다양했다.
메티오닌 함유 펩타이드 합성시 부반응(특히, 펩타이드 사슬 연장시 터트-부틸 라디칼과의 황 알킬화 반응 및 이의 부분적인 산화 반응)을 방지하기 위해, 메티오닌 잔기를 설폭시드 유도체의 형태로 펩티딜 고분자-서열에 부드럽게 첨가하였으며, 이는 펩타이드 방출의 마지막 단계에서 메티오닌으로 환원된다. 이 환원 반응은 요오드화 암모늄 또는 완전히 방출된 펩타이드의 작용에 의해, 또는 펩타이드가 여전히 수지에 존재하는 단계에서 만족스러운 결과가 발생한다.
하나의 아미노산 잔기의 첨가를 위한 프로그램
No. 단계 시약 반복
횟수		 시간
(분)		 시약의 양(mL)
1 Boc-보호기의 제거(방출) 트리플루오로아세트산 1 2 5
2 재방출 트리플루오로아세트산 1 2 5
3 세척 디메틸포름아미드 3 1 10
4 응축 적절한 아미노산 유도체의 1.0 mmol의 옥시벤조트리아졸 에테르
+
디이소프로필에틸아민
(디메틸포름아미드 내의 0.7 mmol)		 1 20 5
5 세척 디메틸포름아미드 3 1 10
6 세척 이염화 메틸렌 3 1 10
7 닌하이드린 테스트*
* 응축은 닌하이드린 테스트(ninhydrin test)가 긍정적인 경우 반복되었다.
합성된 모든 펩타이드 약물을 Dynamax 60 칼럼(Gibson, France)에서 조제용 역상 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하였으며, 트립타민의 존재 하에 메탄설폰산을 이용한 가수분해 이후 가수분해물인 펩타이드의 아미노산 분석(아미노산 분석기, Alpha Plus, LKB, Sweden)으로 확인하였다.
다음의 실시예는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 가능성을 입증한다.
실시예 1: 알로페론 계열의 펩타이드의 구조 및 공통 서열 분석
알로페론 계열의 펩타이드의 공통 서열 분석을 위해 BioEdit v.7.09 Ibis Biosciences(US) 소프트웨어를 사용하였다. 알로페론 아미노산 서열 상동성을 표 2에 나타냈다.
알로페론 서열 상동성
펩타이드 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
서열번호 1
알로페론 1		 His Gly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly
서열번호 2
알로페론 10		 Cys Val Val Thr Gly His Gly Ser His Gly Val Phe Val
서열번호 3
알로페론 11		 Ile Ser Gly His Gly Gln His Gly Val Pro
서열번호 4
알로페론 12		 Cys Gly His Gly Asn His Gly Val His
서열번호 5
알로페론 13		 Ile Val Ala Arg Ile His Gly Gln Asn His Gly Leu
서열번호 6
알로페론 14		 His Gly Ser Asp Gly His Gly Val Gln His Gly
서열번호 7
알로페론 15		 Phe Gly His Gly His Gly Val
서열번호 8
알로페론 16		 His Gly Asn His Gly Val Leu Ala
서열번호 9
알로페론 17		 HIs Gly Asp Ser Gly His Gly Gln His Gly Val Asp
서열번호 10
알로페론 18		 His Gly His Gly Val Pro Leu
서열번호 11
알로페론 19		 Ser Gly His Gly Ala Val His Gly Val Met
서열번호 12
알로페론 2		 Gly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly
서열번호 13
알로페론 20		 Tyr Ala Met Ser Gly His Gly His Gly Val Phe Ile
서열번호 14
알로페론 3		 Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His
서열번호 15
알로페론 4		 Ser Gly His Gly Gln His Gly Val
서열번호 16
알로페론 5		 Pro Ser Leu Thr Gly His Gly Phe His Gly Val Tyr Asp
서열번호 17
알로페론 6		 Phe Ile Val Ser Ala His Gly Asp His Gly Val
서열번호 18
알로페론 7		 Thr His Gly Gln His Gly Val
서열번호 19
알로페론 8		 His Gly His Gly Val His Gly
서열번호 20
알로페론 9		 Leu Ala Ser Leu His Gly Gln His Gly Val
서열번호 21
혈구응집소
377-388		 HIs Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val
공통
서열		 His Gly His Gly
구조식
 X1 His Gly X2 R Gly X3
러시아 연방 특허 제 2172322호는 공동 서열의 제시 없이 알로페론 서열을 예시하였으며, 이는 펩타이드의 핵심부를 정확하게 추정할 수 없고 실질적인 변형을 무의미한 변형과 구분할 수 없게 한다.
분석의 결과, 알로페론 계열은 공동 서열을 갖는 다음의 3 개의 계열로 나눌 수 있다:
SGHGQ-HGV, VSGHGQ-HGV, SGHGQ-HGV, 이는 알로페론 계열의 펩타이드 서열의 주어진 컴퓨터 추정(도 1)으로 입증된다.
실시예 2: 펩타이드 A1의 컴퓨터 모델링(3차 구조 분석)
짧은 펩타이드의 구조를 이해하기 위해, 펩타이드 구조 전체를 그리고 이의 각각의 영역을 확인할 수 있게 하는 컴퓨터 모델링을 이용할 수 있다. 특히, Zn++ 이온으로 복합체를 형성하는 펩타이드의 가능성을 확인할 필요가 있다. 이를 위해, 다음과 같은 구조를 갖는 A1 펩타이드의 컴퓨터 모델링을 수행하였다: His-Val-Ser-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly (1). Zn++ 이온으로 A1의 단순한 복합체를 형성하는 것은 Zn++ 이온과의 히스티딘 잔기의 이중 결합으로 안정화된 펩타이드 루프(loop)의 형성을 입증할 수 있다.
A1 펩타이드 컴퓨터 모델링(도 2)은 짧은 펩타이드가 느슨한 루프를 형성하는 것을 나타내었으며, 이 루프 내에서 Zn++ 이온은 반응시 접근할 수 있는 히스티딘 잔기와 반응할 수 있다. 이 경우, 일반적인 폴리펩타이드 구조는 1, 6 및 9번 위치에서 적어도 세 개의 히스티딘 잔기로 Zn++ 이온 복합체를 형성할 수 있는 가능성에 적합하다.
단순화 모델(도 3) Zn-1은 글리신 잔기의 상당 부분이 분자의 N-말단 부위에 위치하는 것을 보여준다. 이는 베타 층 유형의 이차 구조에 해당한다. C-말단 부위는 Zn++ 이온과의 반응시 접근할 수 있는 히스티딘의 이미다졸 링의 내부로 노출된 알파 사슬 구조(alpha-helical structure)를 갖는다.
도면은 Zn++의 예를 도시한다. Zn++은 거의 모든 위치에 배치될 수 있다.
A: 루프 형태로 구조화된 분자내 복합체 Zn-1.
B: 이량체 형태로 구조화된 분자내 복합체 Zn-1. [a] 또는[b] 영역에서 또는 선형 폴리펩타이드의 중앙에서의 Zn++ 이온의 분자내 주입으로 인해, 6 및 9번 위치에서 Zn++와 히스티딘 잔기와의 반응과 함께 새로운 A1 분자를 첨가함으로써 응집이 수행될 수 있다.
A1 구조를 분석하면, 히스티딘 잔기의 높은 함량과 규칙적인 배열을 주목하게 된다. 도 2는 A1 폴리펩타이드가 거의 완벽한 안장 형상의 구조(saddle-like structure)를 형성하는 것을 보여준다. 이러한 확인에서, 히스티딘 잔기 1, 6 및 9는 Zn++ 이온과의 반응에서 가장 접근하기 쉽다.
이 경우, Zn++에 비해 과잉의 펩타이드를 이용한 복합체 형성은 분자내 응집체의 형성을 유발할 수 있다는 중요한 결론을 내릴 수 있다(도 2B). 이러한 구조적 전이는 근본적으로 펩타이드의 특성을 변화시킴으로써 이들의 구조를 생리활성에 필요한 치밀한 구조를 형성하게 하며, 이는 수많은 연구에서 입증되었다[Rydengard V., Nordahl E. A., Schmidtchen A. Zinc potentiates the antibacterial effects of histidine-rich peptides against Enterococcus faecalis. FEBS Lett., 2006, Vol. 273, p. 2399-2406].
실시예 3: 알로페론 및 이의 가장 가까운 유사체는 Zn ++ -결합 펩타이드이다.
알로페론 1(A1)및 이의 유사체와 결합하는 Zn++ 이온을 [Shi Y., Beger R.D., Berg J.M. Metal binding properties of single amino acid deletion mutants of zinc finger peptides: studies using cobalt(II) as a spetroscopic prob. Biophys.J., 1993, Vol.64, p.749-753]에 개시된 방법에 의해 연구하였다. A1 펩타이드와 결합하는 Zn++ 이온을 400 nm 및 여기광 398 nm에서 IL 형광계(ISS, Campaign)를 이용한 광산란법으로 확인하였다.
도 4는 A1 펩타이드와 반응하는 Zn++ 이온을 그래프로 나타낸다.
분석 조건은 Shi Y. 등(1993)을 참조하라.
A: (오픈 서클) A1과 Zn(N03)2의 반응. 펩타이드에 대한 Zn++ 이온의 몰 초과량은 1:10이었다. 실선: 펩타이드 Zn+ 이온의 포화. 완전 포화시 대부분의 펩타이드가 응집체로 변했다. EDTA를 응집체에 첨가하였다. EDTA의 첨가 이후, 복합체는 신속하게 분해되었고 펩타이드(알로페론)는 수용성 상으로 변했다.
도 4는 Zn++ (Zn(NO3)2이 1 펩타이드와 반응함으로써, 광산란의 급격한 증가를 유발하였고, 이후 최대 56-60 nm 지름의 다분산 나노입자 형태의 펩타이드 응집체 및 거친 응집체 현탁액의 형성을 유발하였음을 나타낸다. EDTA 킬레이트 시약을 첨가하면, 응집체와 A1 펩타이드 복합체는 분해된다.
따라서, A1 펩타이드는 Zn++ 이온과 반응하여 첫 번째 단계에서 수용성 복합체를 형성할 수 있다.
실시예 4: Zn ++ 과 반응한 펩타이드는 니켈 흡착제와의 높은 친화성을 보인다.
HiTrap 컬럼에서의 크로마토그래피는 A1이 올리고히스티딘으로서 작용을 하고 제시된 흡착제와 매우 높은 친화성을 가지며, 이미다졸 용액으로 완전히 용출된다는 것을 보여준다. 용출은 농도 구배의 인산염 완충액(0.5 M 이미다졸로)으로 수행하였다(도 5).
실시예 5: I형 인터페론 유도
I형 인터페론 유도를 이전에 공개된 방법에 의해 확인하였다[F.I. Yershov., O.I. Kiselev. Interferons and their inducers (from the molecule to the drug) .: Publ. House. Geotar - Media,2005- P. 356, Chernysh et al. 2002]. 도 6은 I형 인터페론을 유도하는 약물의 능력을 테스트한 결과를 나타낸다. 주어진 데이터로부터 Zn-A1이 최대의 인터페론 유도 활성을 갖는 것을 알 수 있다. Zn-A2 펩타이드는 다소 낮았다. 변형되지 않은 A1 펩타이드는 매우 높은 수준의 인터페론 유도 능력을 보여주었지만, Zn++ 이온과 결합한 유도체에 비해 상당히 낮았고 시클로페론의 활성과 일치했다.
실시예 6은 이러한 데이터가 쥐에서 치명적인 인플루엔자 바이러스 감염의 경우에서 약물의 보호 효과와 일치하는 것을 나타낸다.
실시예 6: 인플루엔자 바이러스 A로 유도된 흰쥐의 치명적인 인플루엔자 폐렴의 실험 모델에서의 항바이러스 활성
펩타이드 복합체의 항바이러스 활성을 테스트하기 위해 Rappolovo 사육장에서 얻은 체중 10 내지 12 g의 암수 흰쥐의 치명적인 인플루엔자 감염 모델을 사용하였다. 높은 병원성을 나타내는 실험실 조건에서 흰쥐에 적합한 /Aichi/2/68 (3N2) 인플루엔자 균주를 사용하여, 바이러스 투여량에 따라 5 내지 10 일 이내에 폐렴 감염과 치명적인 결과를 유도하였다.
감염시키기 전에 6 시간 및 12 시간에 한번씩 펩타이드 및 이의 유도체를 동물 체중의 1 내지 2 g/kg의 양으로 복강내 투여하였다. 동일한 양의 NSS 또는 인산염 완충액을 대조 동물군의 위약으로 사용하였다.
바이러스를 미리 동물에 적정하여 쥐에 대한 치사 농도를 결정하였다. 실험을 위해, 동물을 0.2 및 5 LD50의 투여량으로 약한 에테르 마취와 함께 바이러스를 비강내 투여하였다. 각각의 군은 10 마리의 쥐로 구성되었다. 동물을 15일 동안, 즉, 실험 인플루엔자로 100%의 동물 사망이 관찰되는 기간 동안 관찰하였다. 동물의 체중과 사망을 대조군 및 실험군에서 매일 기록하였다. 기록된 사망 데이터를 근거로, 각각의 군에서의 사망률(각각의 군에서 감염된 동물의 총수 대비 15일 동안 사망한 동물의 수의 비), 보호 지수를 계산하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 결과의 분석은 쥐에 대해 병원성인 인플루엔자 A 바이러스에 대한 연구된 약물 A1의 효과가 참조 약물(바이러스 1 LD50의 투여량의 80-87%)의 보호 효과의 효율과 비교할 만한 것을 알 수 있다. Zn-1 복합체의 높은 보호 효과는, A1을 이용한 Zn++ 복합체의 형성이 A1형 펩타이드의 활성을 매우 증가시키는 것을 입증한다. 이와 같은 경우에서 사용된 테스트 방법은 보호 효과가 주로 인터페론의 유도로 인한 것임을 나타낸다. 예방 대책으로 사용될 때 약물을 최대의 활성을 보였다.
도 7은 쥐에서 치명적인 인플루엔자 감염의 경우 연구된 약물의 보호 효과를 나타낸다.
상기한 바를 근거로, 설계된 펩타이드는 청구된 모든 특성을 갖는다고 말할 수 있다.
히스티딘 풍부 펩타이드 복합체, 주로 Zn++ 이온을 갖는 알로페론 계열의 펩타이드는 직접적인 작용 기전을 갖는 약물을 생성할 수 있게 하고, 펩타이드의 특성과 조성 및 약물의 표적 구조에 대한 이해에 따라 이들 약물을 설계할 수 있게 한다.
<110> OBSHCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOSTYU "ALLOFERON" <120> BIOACTIVE PEPTIDE COMPLEXES <130> p-1401 <150> 2013/176563 <151> 2013-11-28 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Alloferon <400> 1 His Gly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Alloferon <400> 2 Gly Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Alloferon <400> 3 Val Ser Gly His Gly Gln His Gly Val His 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Alloferon <400> 4 Ser Gly His Gly Gln His Gly Val 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Alloferon <400> 5 Pro Ser Leu Thr Gly His Gly Phe His Gly Val Tyr Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Alloferon <400> 6 Phe Ile Val Ser Ala His Gly Asp His Gly Val 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Alloferon <400> 7 Thr His Gly Gln His Gly Val 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Alloferon <400> 8 His Gly His Gly Val His Gly 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Alloferon <400> 9 Leu Ala Ser Leu His Gly Gln His Gly Val 1 5 10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Alloferon <400> 10 Cys Val Val Thr Gly His Gly Ser His Gly Val Phe Val 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Alloferon <400> 11 Ile Ser Gly His Gly Gln His Gly Val Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Alloferon <400> 12 Cys Gly His Gly Asn His Gly Val His 1 5 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Alloferon <400> 13 Ile Val Ala Arg Ile His Gly Gln Asn His Gly Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Alloferon <400> 14 His Gly Ser Asp Gly His Gly Val Gln His Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Alloferon <400> 15 Phe Gly His Gly His Gly Val 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Alloferon <400> 16 His Gly Asn His Gly Val Leu Ala 1 5 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Alloferon <400> 17 His Gly Asp Ser Gly His Gly Gln His Gly Val Asp 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Alloferon <400> 18 His Gly His Gly Val Pro Leu 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Alloferon <400> 19 Ser Gly His Gly Ala Val His Gly Val Met 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Alloferon <400> 20 Tyr Ala Met Ser Gly His Gly His Gly Val Phe Ile 1 5 10

Claims (3)

  1. 펩타이드 복합체에 있어서, 펩타이드는 3차원 구조로 구조화되고 다음의 일반 구조식에 의해 특징지어지는 펩타이드 복합체:
    Figure 112016110963674-pct00002

    여기서, X1은 Gln이고; R1 및 R2는 히스-(His-) 또는 시스-(Cys-) 아미노산 잔기를 포함하고 전이 금속 이온과 상호작용을 할 수 있는 펩타이드 사슬로서, R1은 His-Gly-Val-Ser-Gly- 또는 Gly-Val-Ser-Gly-이고, R2는 -Val-His-Gly이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인터페론 합성 유도물질의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 항바이러스 활성 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드 복합체.

KR1020147032181A 2012-05-21 2012-05-21 생리활성 펩타이드 복합체 KR101750364B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2012/000405 WO2013176563A1 (ru) 2012-05-21 2012-05-21 Биологически активные пептидные комплексы

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150002842A KR20150002842A (ko) 2015-01-07
KR101750364B1 true KR101750364B1 (ko) 2017-06-23

Family

ID=49624148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147032181A KR101750364B1 (ko) 2012-05-21 2012-05-21 생리활성 펩타이드 복합체

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9499585B2 (ko)
EP (1) EP2853535B1 (ko)
JP (1) JP5990324B2 (ko)
KR (1) KR101750364B1 (ko)
CN (1) CN104507958B (ko)
EA (1) EA029540B1 (ko)
UA (1) UA109760C2 (ko)
WO (1) WO2013176563A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2667128C2 (ru) * 2016-12-29 2018-09-14 Герман Петрович Беккер Композиция для приготовления противоопухолевого средства и способ приготовления противоопухолевого средства на ее основе
RU2673807C2 (ru) * 2017-05-05 2018-11-30 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма "ВЕРТА" Средство, обладающее биоцидным действием
KR102257913B1 (ko) 2018-07-17 2021-05-28 주식회사 에이티파머 알로페론을 포함하는 폐섬유증 치료용 조성물
RU2742565C1 (ru) * 2019-12-29 2021-02-08 Герман Петрович Беккер Фармацевтическая композиция, содержащая биологически активные комплексы аллоферона с цинком, и способ ее получения
CN116249543A (zh) * 2020-06-29 2023-06-09 上海威莫思生物科技有限公司 抗病毒和细胞因子风暴治疗方法
WO2023229443A1 (ko) * 2022-05-27 2023-11-30 주식회사 진큐어 신규 펩타이드 및 그의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011034931A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 Reactive Surface, Ltd. Anti-fouling paints and coatings

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2172322C1 (ru) * 1999-12-27 2001-08-20 Энтофарм Ко., Лтд. Аллофероны-иммуномодулирующие пептиды
RU2296131C2 (ru) 2004-11-26 2007-03-27 ООО "Фарминтерпрайсез" Геминпептид, его фармацевтически приемлемые соли и применение в качестве противовирусного и вирулецидного агента
MX2011003117A (es) * 2008-09-19 2011-04-21 Nektar Therapeutics Conjugados polimericos de peptidos terapeuticos.
RU2008147686A (ru) * 2008-12-03 2010-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Аллоферон" (RU) Биологически активные пептидные комплексы

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110070376A1 (en) 2002-09-09 2011-03-24 Reactive Surfaces, Ltd. Anti-fouling Paints & Coatings
WO2011034931A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 Reactive Surface, Ltd. Anti-fouling paints and coatings

Also Published As

Publication number Publication date
EA029540B1 (ru) 2018-04-30
EP2853535A4 (en) 2016-01-27
US20150299257A1 (en) 2015-10-22
JP5990324B2 (ja) 2016-09-14
UA109760C2 (uk) 2015-09-25
CN104507958A (zh) 2015-04-08
KR20150002842A (ko) 2015-01-07
EP2853535B1 (en) 2019-12-25
WO2013176563A1 (ru) 2013-11-28
US10125170B2 (en) 2018-11-13
US9499585B2 (en) 2016-11-22
EP2853535A1 (en) 2015-04-01
US20170058000A1 (en) 2017-03-02
EA201401148A1 (ru) 2015-01-30
CN104507958B (zh) 2017-07-14
JP2015519342A (ja) 2015-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101750364B1 (ko) 생리활성 펩타이드 복합체
AU2016283984B2 (en) Glucagon and GLP-1 co-agonist compounds
CA2648936C (en) Glp-1 compounds
KR20140039157A (ko) 항미생물성 융합 화합물 및 그의 용도
JP2015534568A (ja) Ｉｒｆ５に結合する細胞透過性ペプチド
JPH08511167A (ja) ケモカインの生物学的活性の強化法
EP3020724A1 (en) Cell-penetrating peptide and conjugate comprising same
EP3587443A1 (en) Use of erythropoietin-derived peptide through effect on cell damage prevention thereof
RU2470031C2 (ru) Биологически активные пептидные комплексы
EP3323825A1 (en) Polypeptide compound and preparation method and use thereof
WO2018062217A1 (ja) エボラウイルスワクチン
JP2020501513A (ja) 治療用多標的コンストラクトおよびその使用
EP3392263A1 (en) Polypeptide compound, preparation method therefor and use thereof
CN101838307B (zh) 一种k2多肽合成产物及其应用
CN101838305A (zh) 一种t2多肽合成产物及其应用
WO2019085926A1 (zh) 多黏菌素类似物及其制备方法
KR101025352B1 (ko) 생리활성 복합체
AU2012203915B9 (en) GLP-1 compounds
CN110078792B (zh) 一种靶向pd1/pdl1相互作用的抗肿瘤活性多肽imb-p6及其应用
Porta et al. Myotoxin a, crotamine and defensin homologs in reptile venoms
Jaggi et al. Anticancer activity of a peptide combination in gastrointestinal cancers targeting multiple neuropeptide receptors
Naydenova et al. Synthesis and biological activity of small peptides as NOP and opioid receptors’ ligands: View on current developments
CN113336824A (zh) 一种多肽在作为pd-1/pd-l1蛋白-蛋白相互作用(ppi)调节剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant