KR101744324B1

KR101744324B1 - 폐절임배추를 이용한 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법

Info

Publication number: KR101744324B1
Application number: KR1020130087974A
Authority: KR
Inventors: 박성희; 김태운; 이종희; 최학종; 박해웅; 김현주; 장자영; 강미란
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2017-06-27
Also published as: KR20150012448A

Abstract

본 발명은 김치제조공장 및 절임공장에서 발생하는 절임배추 폐기물을 이용한 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 배추 절임 공정에서 생산되는 폐절임배추를 이용하여 상업용 배지와 동등한 수준의 미생물 배양능을 가지면서도 저가로 제조가능한 식용 배지를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 저가형 식용 배지는 미생물 첨가제의 개발에 활용되어 김치 산업에 이바지할 수 있으며, 김치의 대량생산시 다량으로 배출되는 절임배추 폐기물 문제를 해결 할 수 있다.

Description

폐절임배추를 이용한 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법{Preparation of edible media for culturing bacteria using waste of salted cabbages}

본 발명은 김치제조공장 및 절임공장에서 발생하는 절임배추 폐기물을 이용한 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법에 관한 것이다.

최근 소비자의 절임 배추 수요가 급증함에 따라 가정에서 발생되는 배추의 폐기물은 감소하는 반면 김치제조공장 및 절임공장에서 버려지는 절임배추의 폐기물이 해마다 증가하고 있다. 단위 농협 및 농가 단위로 절임 배추가 대량 생산되고 있는 현실을 고려할 때 절임배추 폐기물을 회수하여 활용할 수 있는 여건이 충족되고 있다. 한편, 시대적인 요청으로 종균을 이용한 김치를 비롯한 발효식품들이 개발 유통되고 있기에 식용가능하면서 고가의 상업용 배지를 대체할 만한 식용 배지의 개발이 필요하다.

본 발명은 김치 제조 공장 및 절임 공장에서 발생하는 절임배추 폐기물을 이용하여 상업용 배지를 대체할 수 있는 미생물 배양용 식용 배지를 제공하고자 한다.

본 발명에서는 김치 등 발효식품에 활용이 가능한 식용 배지를 개발하기 위하여 김치공장, 농가 등에서 배출되는 절임배추 폐기물을 이용한 식용 배지를 개발하고, 이를 이용하여 배양한 균주를 다시 김치 등의 발효식품에 활용할 수 있도록 연구하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여 연구한 결과, 절임배추 폐기물 착즙액을 이용한 배지를 제조하여 식용 배지의 천연당원으로 활용하고 여기에 질소원 및 미량원소를 보충하게 되면 고가의 상업용 배지를 대체할 수 있으면서도 저가로 공급할 수 있는 식용 배지를 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 폐절임배추를 마쇄하고, 증숙한 후 착즙하고, 여과 및 멸균하는 것을 포함하는 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법은 도 1의 순서도에 의해 예시하여 설명할 수 있다.

마쇄는 그라인더를 이용하여 폐절임배추를 착즙에 적당한 크기로 줄여주는 공정으로서, 통상 사용되는 그라인더를 이용하여 당업자의 판단에 의해 적당한 시간 동안 폐절임배추를 마쇄할 수 있으며, 방법상 특별히 제한되지 않는다.

본 발명은 폐절임배추를 마쇄한 후 배추착즙액을 얻기 전에 증숙(pre-heating) 하는 것을 특징으로 한다. 하기 실시예에서 설명한 바와 같이, 증숙 하지 않고 착즙 후 멸균하여 얻은 배추착즙액에서 불용성 물질이 생성되는 것과는 달리 착즙 전의 증숙(pre-heating)는 침전물의 발생을 방지하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 불용성 물질의 생성을 방지하는 한편, 착즙 과정에서의 미생물 오염 등을 방지하기 위해 본 발명에서는 마쇄와 착즙 단계 사이에 증숙 단계를 거치도록 하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 증숙은 80 내지 90℃ 에서 5분 내지 15분 동안 수행될 수 있으나, 상기 증숙 단계의 조건이 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

마쇄 및 열처리 후의 착즙 단계는 통상적인 착즙 공정을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 거즈를 이용한 착즙을 수행하였다.

착즙 단계를 통해 얻어진 배추착즙액은 통상적인 여과 및 멸균 과정을 거쳐 남아 있는 고형물들을 제거하고 멸균하는 과정을 거치게 된다. 본 발명의 실시예에서는 규조토 여과를 실시하였으며, 멸균은 여타의 배지 제조방법에서 사용하고 있는 것과 마찬가지로 오토클레이브를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균하였다.

한편, 본 발명은 멸균 전 단계에서 활성탄을 첨가 후 재여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

절임배추는 가열시 특유의 이취가 발생하는데 이는 식용 배지로의 활용에 제한을 줄 수 있다. 하기 실시예를 통해 살펴볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 멸균 전 단계에서 활성탄의 첨가가 이러한 이취를 제거할 수 있음을 확인하였다. 활성탄 첨가 단계는 이에 제한되는 것은 아니나 배추 배지의 고형분 대비 3 내지 7%의 활성탄을 첨가하고 재여과함으로써 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 식용 배지에 질소원 및 미량원소를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 폐절임배추를 이용하여 제조된 식용 배지는 상업용 배지인 MRS 배지와 비교할 때 탄소원 함량이나 질소원 함량에 차이가 있다. 탄소원의 경우에는 구체적인 함량에 차이가 있긴 하나 탄소원 자체가 부족한 것은 아니기 때문에 폐절임배추의 당원 그 자체를 활용해도 무방하다. 따라서, 본 발명의 식용 배지의 제조에 있어 탄소원의 추가는 필수적이지 않다. 다만, 질소원과 미량원소의 경우 상업용 배지와 비교하여 부족한 것으로 나타났으며, 이에 본 발명에서는 보충이 필요한 질소원과 미량원소를 찾아내고 이들의 필요함량에 대해 연구하였다.

하기 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 질소원으로서는 펩톤을 첨가하는 것이 바람직하다. 펩톤은 배지의 부피를를 기준으로 3 내지 5%(w/v), 예컨대 4%(w/v)의 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.

하기 실시예에서는 또한 본 발명의 식용 배지가 상업용 배지와 동등한 수준의 유산균 증식율을 나타낼 수 있도록 해 주는 미량원소를 선발하였다.

그 결과, 미량원소로서 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 망간 설페이트(manganese sulfate) 및 소듐 숙시네이트(sodium succinate)를 첨가하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 이에 제한되는 것은 아니나, 마그네슘 설페이트는 배지의 부피를 기준으로 0.001 내지 0.02%(w/v), 예컨대 0.01%(w/v)의 농도로, 망간 설페이트는 0.001 내지 0.01%(w/v), 예컨대, 0.005%(w/v)의 농도로, 소듐 숙시네이트는 0.5 내지 2%(w/v), 예컨대, 1%(w/v) 의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 미생물 배양용 식용 배지를 제공한다.

본 발명에 따른 식용 배지를 이용하여 배양할 수 있는 유산균미생물의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서 미생물은 단독으로 또는 1종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 미생물은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus속, Bifidobacterium 속, Lactococcus속, Pediococcus 속, Bacillus속, 및 Saccharomyces 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 미생물은 Leuconostoc mesenteroides , Lactobacillus plantarum , Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus , Weissella cibaria, Pediococcus pentosaceus , Bacillus subtilies , Saccharomyces cerevisiae 등 일 수 있다.

본 발명에 따르면 배추 절임 공정에서 생산되는 폐절임배추를 이용하여 상업용 배지와 동등한 수준의 미생물 배양능을 가지면서도 저가로 제조가능한 식용 배지를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 저가형 식용 배지는 미생물 첨가제의 개발에 활용되어 김치 산업에 이바지할 수 있으며, 김치의 대량생산시 다량으로 배출되는 절임배추 폐기물 문제를 해결할 수 있다.

도 1은 절임배추 폐기물을 식용 배지로 생산하기 위한 제조과정을 모식도로 나타낸 것으로, 마쇄, 증숙(pre-heating), 착즙, 여과 및 멸균의 과정을 포함한다.
도 2는 폐절임배추 착즙액과 MRS 배지의 HPLC 분석을 이용한 당함량분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 폐절임배추 착즙액의 배지로서의 가능성을 알아보기 위하여 유산균 접종 후 MRS 배지와 균의 성장을 비교한 그래프이다.
도 4는 배추착즙액의 질소원, 탄소원 강화를 위하여 대표적인 질소원, 탄소원으로 효모엑기스와 글루코오스를 각각 고형분 대비1%를 첨가하여 유산균 성장 강화에 영향을 미치는지 여부를 확인한 그래프이다.
도 5는 8가지 질소원을 강화한 배추착즙액 배지와 MRS배지의 성장균수를 측정하여 비교한 그래프를 나타낸다.
도 6는 질소원 첨가에 따른 Leuconostoc mesenteroides의 생균수를 관찰하기 위하여 3가지 질소원 Beef, Peptone, Yeast를 농도별로 첨가한 결과를 그래프로 나타내었다.
도 7는 질소원 첨가에 따른 Lactobacillus plantarum의 생균수를 관찰하기 위하여 3가지 질소원 Beef, Peptone, Yeast를 농도별로 첨가한 결과를 그래프로 나타내었다.
도 8은 미량원소의 결핍이 유산균의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프로서 MRS broth와 동일한 수준의 미량원소를 첨가한 Ⅲ실험군과 특정 미량원소를 제거하고 실험한 실험군의 유산균 증식율 차이를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

[ 실시예 1] 절임배추 폐기물로부터 배추착즙액의 제조

김치공장으로부터 회수한 절임공정 중 발생하는 절임배추 폐기물을 그라인더로 마쇄 후, 4-5겹의 거즈를 이용하여 착즙한 뒤 멸균하면, 멸균 후 미끌한 불용성 물질의 생성이 나타난다.

본 발명에서는 멸균 전 증숙(pre-heating) 처리를 통해 불용성 물질의 침전을 미리 유도한 후 이를 여과 단계에서 제거함으로써, 증숙 단계가 별도로 존재하지 않아 열처리가 이루어지는 멸균 단계에서 침전물이 생기는 종래의 문제점을 해소하였다.

상기 제조 방법으로 제조된 배추배양액은 노란색의 맑은 액상 형태를 띠었으며, pH 6.0 ~ 6.2, 고형분 5 ~ 7 Brix%, NaCl 2 ~ 3%로 측정되었으며, 초기 폐절임배추 사용량 대비 최종배양액 수득률은 약 75%였다.

하지만 초기 착즙 과정 중 미생물 오염 등을 고려하여 상기 증숙 단계는 착즙과정의 전단계에서 실시하도록 수정하였다.

배추를 약 80 ~ 90℃의 온도에서 1차 증숙(pre-heating) 후 마쇄, 착즙, 멸균의 과정을 거쳐 폐절임배추 배양액을 제조하면 불투명한 노란색의 액상으로서 탁도는 있지만 기타 침전물이 생성되는 현상을 방지할 수 있었다.

이상의 진행 과정을 정리하여 도 1에 나타내었다.

[ 실시예 2] 가열에 의해 생성되는 배추 이취 제거

절임배추의 가열시 특유의 이취가 발생한다. 이취의 발생은 향후 식용 배지로의 활용에 제한을 주거나 배양액 활용에 문제를 야기할 수 있을 것으로 예상되기에 이취를 제거하고자 실험을 수행하였다.

폐절임배추의 가열에 의한 이취를 제거하고자 활성탄을 활용하여 탈취를 실시하였다. 활성탄(Fintech CP-2, Ajinimoto)을 배추 배지 고형분 대비 5%를 첨가 후 60℃에서 1시간동안 반응 후 규조토 여과를 실시하였다. 본 활성탄의 여과는 배추의 가열취를 제거하는데 성공적으로 진행되었으며, 활성탄 여과 후 배지의 색이 옅어지는 효과를 나타내었다. 따라서, 폐절임배추를 이용하여 제조한 식용 배지의 사용목적에 따라 옅은 배지의 색과 이취를 제거의 필요할 경우 활성탄 첨가 단계를 추가할 수 있다.

[ 실시예 3] 폐절임배추 착즙액과 MRS 배지의 당성분 비교 분석

폐절임배추를 유산균 성장 배지로 이용하기 위하여 기존 상업용 배지인 MRS배지와 당의 함량을 분석하여 배지 base로의 가능성과 배지 조성의 조합에 활용하고자 분석하였다.

폐절임배추는 그라인더로 갈아 85℃ 내외에서 10분간 가열한 후, 거즈로 착즙하고 규조토를 이용한 여과 후 상업적 배지의 살균 과정과 동일하게 121℃에서 15분간 살균하여 사용하였다. 동일한 살균 과정을 거친 폐절임배추 착즙액 배지와 MRS배지를 0.45 μm membrane filter로 여과한 다음 HPLC(JASCO, Japan)에 20 μL를 주입하였다. 이때 사용한 column은 Asahipak NH2P-50(Shodex) 였고, 용매는 아세토니트릴 : 물 = 75 : 15, flow rate는 1.0ml/min, detector는 시차굴절계(RI)를 이용하였다. 표준품으로 fructose, glucose, sucrose, mannitol, maltose를 사용하였다. 시험용액 및 표준용액을 각각 20 μL씩 주입하여 얻은 피크의 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 유리당 함량을 계산하였다.

폐절임배추 착즙액와 MRS 배지의 당함량을 분석한 결과를 [표 1]과 [도 2]에 나타내었다.

폐절임배추 배지와 MRS 배지의 당 함량 분석

(mg/ml)	프락토스	글루코스
MRS broth	2.1706	17.8365
폐절임배추 배지	5.4925	5.0514

표 1과 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 프락토스는 폐절임배추 착즙액이 MRS보다 2배 이상 높은 함량을 나타내었으며, 글루코스의 경우 MRS 배지가 월등이 높은 것으로 분석되었으나, 종합적으로 볼 때, 폐절임배추 착즙액이 배지 제조에 있어서 충분한 양의 당원을 함유하고 있음을 확인하였다.

[ 실시예 4] 폐절임배추 착즙액과 MRS 배지의 균체 성장 비교

폐절임배추 착즙액(이하 배추착즙액)과 MRS배지를 이용하여 김치 유산균 표준균주 2종에 대한 균체 성장을 비교함으로써 배추착즙액의 식용 배지로서의 가능성을 탐색하였다.

폐절임배추로 제조된 배추착즙액 100%와 MRS배지에서 김치 유산균 표준균주 2종(Leuconostoc mesenteroides 및 L. lactis)을 배양하여 김치 유산균 성장을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 유산균 개체 증식 수는 배추착즙액(10⁸CFU/ml)보다 약 10배 정도 MRS배지(10⁹CFU/ml)에서 더 많이 증식하는 결과를 보였다. 이러한 성장율의 차이를 줄기기 위해, 배추착즙액을 기본으로 당원이나 단백질원 등을 조절하여 MRS배지보다는 저렴하지만 성장률에 영향을 미치지 않는 저가용 배지를 제작하고자 하기 실험을 계속하였다.

[ 실시예 5] 폐절임배추 착즙액 성장 강화 성분의 조사

배추착즙액의 식용 배지로서의 가능성 탐색하고자 인위적으로 당원과 질소원을 조절하여 균주 성장에 미치는 영향을 조사하였다.

배추착즙액의 조성에 따른 성장율을 MRS배지의 유산균 성장률와 비교해보기 위하여 표준균주 3종(KCCM 35464, Lactobacillus brevis : KCCM 3505, Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides : KCCM 3769, Lactococcus lactis subsp. lactis)을 이용하여 접종량은 배양액 대비 2%(v/v)으로 하였으며, 30℃에서 24시간 배양하여 MRS agar plate를 이용하여 균수를 측정하였다.

또한, 배추착즙액의 질소원, 탄소원 강화를 위하여 대표적인 질소원, 탄소원으로 효모엑기스와 글루코오스를 각각 고형분 대비 1%를 첨가하여 유산균 성장 강화에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 첨가하였다. 배추착즙액에 각 1%의 효모액기스와 글루코오스의 첨가가 균주성장에 영향을 미치는지 조사한 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 유의적인 차이를 보이지 않았다. 첨가량을 배추배양액 고형분 대비 1%로 매우 소량을 첨가한 것이 성장에 영향을 미치지 못한 것으로 사료되었다. 따라서 추후에는 고형분 대비가 아닌, 배양액 대비 1∼2% w/v수준으로 첨가가 필요할 것으로 판단되었다. 결론적으로, 배추착즙액으로부터 제조된 배추배지가 상업적 유산균 배양액은 MRS broth와 비교하였을 때 충분히 활용 가능성을 확인할 수 있었으며, 추후 작업으로 표준균주가 아닌 실제 김치로부터 분리하여 동정된 대표적인 김치 균주를 활용하여 상세한 성분조성에 변화를 주어 실험을 진행하였다.

[ 실시예 6] 폐절임배추 착즙액 배지개발을 위한 탄소원 조사

배추착즙액으로부터 제조된 배추배지에 탄소원의 종류와 그 첨가량에 변화를 주어 상업적 유산균 배양배지인 MRS broth 수준으로 균체 생육 정도를 강화할 수 있는지 알아보고자 하였다. 배추 유리당의 구성이 글루코스와 프락토스로 이루어져 있다는 점과 첨가 원료의 단가 및 식품첨가물로서의 사용 빈도 등을 고려하여 탄소원으로서 글루코스와 프락토스를 선정하였다.

앞선 실험에서 배추배양액 고형분 대비 1% 글루코스의 첨가량이 미비한 것으로 판단되어 그 첨가량을 고형분 대비 2%까지 첨가하여 유산균 생육정도를 관찰하였으나, 첨가 수준 증가에 따른 유의적인 차이도 나타나지 않았다. 이에 본 실험에서는 글루코스 또는 프락토스의 첨가량을 전체 액상 부피대비 질량으로 하여(g/ml, w/v) 실험을 진행하였다.

김치에서 분리한 Leu . mesenteroides와 Lac . plantarim를 비교균주로 이용하였다. 상업용 배지인 MRS배지에 비해 배추착즙액에서 부족했던 당원 글루코스의 함량을 전체 액상 부피대비 질량으로 하여(g/ml, w/v) 각각 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%를 첨가하여 김치에서 분리한 두 균주의 성장률을 비교를 위하여 30℃에서 24시간 배양한 후, MRS agar plate를 이용하여 균수를 측정하였다.

글루코스나 프락토스의 함량이 2%(w/v)까지 증가된 실험군의 경우에도 탄소원 첨가에 따른 유산균 증식에 긍정적인 효과는 보이지 않았다(데이터 미도시). 따라서, 배추착즙액에 탄소원의 추가가 필수적인 것은 아닌 것으로 판단하였다.

[ 실시예 7] 폐절임배추 착즙액 배지개발을 위한 질소원 조사

배추착즙액으로부터 제조된 배추배지에 질소원의 종류와 그 첨가량에 변화를 주어 상업적 유산균 배양배지인 MRS broth 수준으로 균체 생육 정도를 강화할 수 있는지 알아보고자 하였다.

우선적으로 배추착즙액을 이용한 배지에 질소원으로서 무기원((NH₄)₂SO_4,NH₄Cl, (NH₄)1HPO₄ _,Urea)과 유기원(Peptone, Beef extract, Yeast extract, CSL(Corn Steep Liquor))을 첨가하여 균주 성장에 미치는 영향을 조사하였다.

김치에서 분리한 Leu . mesenteroides와 Lac . plantarum를 비교균주로 이용하였다. 식용으로 가능한 질소원을 무기원 4종((NH₄)₂SO₄ _,NH₄Cl, (NH₄)HPO₄ _,Urea)과 유기원(Peptone, Beef extract, Yeast extract, CSL(Corn Steep Liquor))을 질소원으로 이용하였다. 질소원은 선발한 8종을 각각 2%(w/v)의 농도로 배추착즙액에 첨가하여 김치에서 분리한 두 균주의 성장률을 비교를 위하여 30℃에서 24시간 배양한 후, MRS agar plate를 이용하여 균수를 측정하였다. 도 5는 8가지 질소원을 강화한 배추착즙액 배지와 MRS배지의 성장균수를 측정하여 비교한 그래프를 나타낸다.

Box-Benken experimental design을 이용한 첨가량 조절실험을 유산균증식배지인 MRS broth(Difco) 질소원 배합이 하나의 물질이 peptone 1%(w/v), beef extract 1%, yeast extract 0.5%(w/v)이 함유되어 있는 점을 착안하여 screening 단계에서 yeast extract, beef extract, peptone이 김치유산균 증식에 관여한 질소원의 중요인자로 선택되었으며, 상기 선택된 인자들이 김치유산균 증식에 미치는 개별적 영향뿐만 아니라 서로의 상관관계를 관찰하고 분석함으로써 이에 근거하여 각 인자들이 김치유산균 증식에 가장 좋은 영향을 미치는 수준을 선정하고자 하였다. 본 실험에서는 반응표면실험법으로서 Box-Behnken design을 사용하였으며, 첨가율 0%, 1%, 2%의 값을 “+”, “0”, “-”의 값으로 나누어 총 15개의 실험을 설계하여 수행하였다. 상업용 유산균 증식배지인 MRS broth(Difco)의 질소원 배합이 하나의 물질이 아닌 peptone 1%(w/v), beef extract 1%, yeast extract 0.5%(w/v)이 혼합되어 함유되어 있는 점을 착안하여 앞선 1차 질소원 테스트에서 선발된 3종의 질소원의 최적 배합비를 찾아보고자 하였다. 질소원에 대한 1차 screening단계에서 yeast extract, beef extract, peptone이 김치유산균 증식에 관여한 질소원의 중요인자로 선택되었으며, 상기 선택된 인자들이 김치유산균 증식에 미치는 개별적 영향뿐만 아니라 서로의 상관관계를 관찰하고 분석하므로서 이를 근거하여 각 인자들이 김치유산균 증식에 가장 좋은 영향을 미치는 수준을 선정하고자 하였다. Leu . mesenteroides 및 Lac . plantarum 모두 Maximum point가 최고 함량치가 아닌 중간지점에서 발생하는 saddle point의 형태로 나타났다. 이와 같은 결과로 미루어 보았을 때 Leu. mesenteroides는 Peptone 1.5%, Beef 1.5%, Yeast 1.5% 첨가시켰을 때 최대 OD값(600nm)이 0.72으로, Lac . plantarum는 Peptone 1.6%, Beef 1.5%, Yeast1.8% 첨가하였을 때 OD값(600nm)이 1.60으로 최대값을 예측할 수 있었다.

이에 Peptone, Yeast extract, Beef extract를 각각 0, 1, 2, 4, 8%(w/v)의 비율로 첨가하여 유산균 생육 정도를 관찰하는 확인 실험을 진행한 결과, 도 6 및 7에서 볼 수 있는 바와 같이 질소원의 종류에 따른 유의적인 차이는 발견되지 않았다.

단일 질소원 처리시 첨가량 수준에 따라 비례하며 증가하는 경향을 나타내었지만, 비용적인 측면을 고려하였을 때 무조건 높은 농도의 질소원을 넣어주는 것은 합리적이 아닌 것으로 판단되었다. 따라서, 앞선 질소원 3종의 최적조합에서 나온 결과(약 총 질소원 처리량 4.5%)와 질소원의 단가적인 측면을 고려하여 Pepton 4%(w/v)첨가를 최적 배합으로 결정하고, 추후 본 연구에서 개발된 배추배지를 활용하여 fermenter를 이용한 대량 배양을 할 경우 fed-batch에 의한 간헐적인 추가 질소원 첨가가 이루어 질 것으로 판단되기에 질소원 첨가수준을 최대량이 아닌 적정 수준에서 설정하는 것은 충분히 보완 될 수 있을 것으로 판단된다.

[ 실시예 8] 폐절임배추 착즙액 배지개발을 위한 미량성분 조사

배추착즙액으로부터 제조된 배추배지에 미량원소를 첨가하여 균주 성장에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.

김치에서 분리한 Leu . mesenteroides와 Lac . plantarum를 비교균주로 이용하였다. 식용으로 가능한 미량원소 중 소듐 숙시네이트(Sodium succinate), 암모늄 시트레이트(Ammonium citrate), 소듐 아세테이트(Sodium acetate), 마그네슘 설페이트(Magnesium sulfate (MgSO₄)), 망간 설페이트(Manganese sulfate (MnSO₄)), 디포타슘 포스페이트(Dipotassoim phosphate (K₂HPO₄))를 이용하였다.

본 발명에 따른 식용 배지에 첨가될 미량원소의 선발은 MRS broth에 포함되어 있는 질소원 수준으로 질소원을 동일하게 처리한 뒤(MRS broth의 질소원 함량 수준, Peptoen 1%, Beef extract 1%, Yeast 0.5%), 상기 표기 명시된 5종의 미량원소을 하나씩 제거함으로써, 유산균 증식에 영향을 주는 주요 인자를 알아보는 방식으로 수행하였다.

즉, 배추배지에 MRS broth와 동일한 수준의 미량원소를 첨가한 Ⅲ실험군과 다른 실험군을 상대적으로 비교하여 특정 물질 제거를 통한 김치유산균 증식에 가장 큰 영향을 주는 것과 그렇지 않은 것을 분류하고자 실험군을 설계하였다(도 8).

극 미량원소인 마그네슘 설페이트(0.01%, w/v)와 망간 설페이트(0.005%, w/v)은 1) 그 함량이 매우 미미하여 단가적인 측면에 큰 영향을 미치지 않았으며, 2) 미생물 증식에 따른 안정적인 균체내 효소 분비를 위해 Mn, Mg가 필수 요소인 것으로 알려져 있다. 또한, 3) Lac . plantarum의 경우 마그네슘 설페이트와 망간 설페이트의 제거가 균체 증식에 영향을 주는 것으로 나타났기 때문에 마그네슘 설페이트(0.01%, w/v)와 망간 설페이트 (0.005%, w/v)는 MRS broth 수준의 첨가량을 유지하기로 결정하였다.

또한, 일반 무기질원 보다는 소듐 아세테이트와 소듐 시트레이트 등의 유기산 물질이 김치 유산균 증식에 민감한 영향을 보이는 미량원소인 것으로 확인되었다.

이에, 배추배지에 펩톤 4%, 마그네슘 설페이트 0.01%, 망간 설페이트 0.005%를 기본베이스로 한 뒤에 상기 미량원소 1차 테스트에서 김치유산균 증식에 영향을 주는 것으로 판단된 미량원소 2종 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트와 함께 김치발효에 따른 유기산 변화가 가장 컸던 숙시네이트(유리 유기산 중 이용률이 가장 높음)를 소듐 숙시네이트의 형태로 첨가하였으며 동시에 그 첨가량에 따른 테스트를 실시하였다.

SAS통계 프로그램을 활용한 duncan’s multiple range test 결과, 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 소듐 숙시네이트 1% 첨가한 실험군에서 Leu . mesenteroides, Lac . plantarum 모두 가장 높은 수준으로 유산균 생육정도를 나타내었다. 따라서 Sodium succinate 1%를 3번째 미량원소로 결정하였다. 또한 미량성분들을 0.005 ~ 2%까지 교차 실험하였다.

배지 미량성분 첨가량에 따른 유산균의 성장에 미치는 영향

질소원		유산균 종류	미량성분 첨가량		미생물(cfu/ml)
펩톤4%	마그네슘 설페이트0.01%, 망간 설페이트 0.005%	Leuconostoc mesenteroides	아세테이트	0.25%	1.58 × 10⁹ ^bb
			아세테이트	0.50%	1.87 × 10⁹ ^ab
			아세테이트	1.00%	4.85 × 10^8a
			시트레이트	0.25%	2.01 × 10^9b
			시트레이트	0.50%	1.73 × 10^9b
			시트레이트	1.00%	1.48 ×10⁹ ^ab
			숙시네이트	0.25%	2.28 × 10^9b
			숙시네이트	0.50%	9.80 × 10^8a
			숙시네이트	1.00%	7.75 × 10^8a
		Lactobacillus plantarum	아세테이트	0.25%	1.01 × 10⁹ ^bc
			아세테이트	0.50%	2.25 × 10^8c
			아세테이트	1.00%	2.02 × 10⁹ ^ab
			시트레이트	0.25%	1.32 × 10⁹ ^abc
			시트레이트	0.50%	2.56 × 10^9a
			시트레이트	1.00%	1.61 × 10⁹ ^ab
			숙시네이트	0.25%	1.51 × 10⁹ ^ab
			숙시네이트	0.50%	1.12 × 10⁹ ^bc
			숙시네이트	1.00%	2.45 × 10^9a

종합컨대, 탄소원과 질소원, 미량성분을 이용하여 배지조성에 관한 실험을 진행한 결과, 펩톤 4%, 마그네슘 설페이트 0.01%, 마그네슘 설페이트 0.005%, 소듐 숙시네이트 1%를 첨가하여 제조한 배추착즙액의 배지 조성이 상업적 유산균 배지인 MRS와 유사한 유산균 성장률을 갖는 것으로 확인되었다.

Claims

폐절임배추를 마쇄하고, 증숙한 후 착즙하고, 여과 및 멸균하는 것을 포함하는 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 증숙은 80 내지 90℃에서 5분 내지 15분 동안 수행되는 것인 미생물 배양용 식용 배지의 생산방법.
제1항에 있어서,
상기 멸균 단계 전에 활성탄을 첨가 후 재여과하는 단계를 추가로 포함하는 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 멸균 단계 전에 질소원 및 미량원소를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제4항에 있어서,
상기 질소원은 펩톤인 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제4항에 있어서,
상기 미량원소는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 망간 설페이트(manganese sulfate) 및 소듐 숙시네이트(sodium succinate)인 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 , Pediococcus 속 Bacillus 속, 및 Saccharomyces 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 미생물 배양용 식용 배지의 생산 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 미생물 배양용 식용 배지.