KR101723870B1 - Tmc-256c1을 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Tmc-256c1을 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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고원민
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Abstract

본 발명은 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 빛 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양진균 Aspergillus sp. SF-6354에서 분리된 항신경염증 효과를 갖는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 TMC-256C1을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 염증반응과 관련하여, BV2 및 HT22 세포에서 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하고, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현을 억제하며, TNF-α, IL-6(C), 및 IL-12(D)의 mRNA 생성을 억제할 뿐만 아니라, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성을 억제하며, HO-1 발현을 증가시키고, HO-1 발현에 따른 p38 MAPK 및 PI3K/AKT 경로를 활성화시키며, ROS 생성 억제 효과가 있으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TMC-256C1을 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical Composition for Preventing and Treating Inflammatory Diseases Comprising TMC-256C1}
본 발명은 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 빛 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양진균 Aspergillus sp. SF-6354에서 분리된 항염증 효과를 갖는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
헴 옥시게나제(HO)-1은 열충격, 중금속, 및 산화제를 포함하는 자극에 의해 유도되는 스트레스-반응 효소이다. HO-1는 일산화탄소, 빌리베르딘, 및 자유이온을 생산하여 Heme 그룹의 분해를 촉진시킨다(Llesuy et al., Biochim. Biophys. Acta., 1223:9-14, 1994; Ryter et al., Mol. Cell. Biochem., 234-235:249-263, 2002). Heme 및 이 분해산물은 산화적 손상, 세포 손상, 및 염증을 포함하는 생물학적 반응을 조절하는 중요한 역할을 한다. 항산화 효과때문에, HO-1은 염증 질환의 치료를 위한 새로운 대상으로 인식되고 있다(Lee et al., J. Biol. Chem., 278:19325-19330, 2003; Gueler et al., J. Pathol., 170:1192-1199, 2007). HO-1의 항염증 작용은 활성화된 대식세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, and MIP-1β와 같은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성을 억제하는 것을 통하여 매개되는 것으로 알려져있다. 또한, HO-1 및 이것의 부산물은 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)와 같은 전염증성 효소의 발현을 억제하고, NO 및 PGE2의 생성 감소로 이어진다(Oh et al., Free. Radic. Biol. Med., 41:106-119, 2006; Wiesel et al., J. Biol. Chem., 275:24840-24846, 2000).
HO-1의 발현은 핵 전사 인자 적혈구-2 관련 인자 2(Nrf2)로 조절되고, 이는 HO-1를 포함하는 해독/항산화 phase II 효소의 핵심 조절자이다. Nrf2은 phase II 효소의 프로모터 부분에 나타나는 항산화 반응 요소와 같은 특정 DNA와 결합하고, 전사를 증가시킨다(Surh, Nat. Rev. Cancer., 3:768-778, 2003). 최근, 커큐민, 레스베라트롤, 및 플라보노이드와 같은 천연물은 HO-1의 유도를 통해 산화적 스트레스-유발 신경세포 손상을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Yang et al., Brain. Res., 1282:133-141, 2009; Fukui et al., Free. Radic. Biol. Med., 49:800-813, 2010; Cho et al., Food. Chem. Toxicol., 50:1940-1945, 2012).
산화적 스트레스 및 신경염증은 중추신경계(central nervous system; CNS) 질환과 관련이 있다(Mosley et al., Clin. Neurosci. Res., 6:261-281, 2006). 산화적 스트레스 또는 활성산소(reactive oxygen species; ROS)의 불균형은 신경 손상을 유발할 수 있고, 따라서 신경세포의 사멸 및 기능저하 결과인 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)와 같은 신경 퇴행성 질병의 진전에 기여할 수 있다(Smith et al., Biochim. Biophys., 1502:139-144, 2000).
CNS에서 주요 신경전달물질인 글루타메이트(Glutamate)는 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 헌팅턴병과 같은 신경 퇴행성 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Xu et al., J. Neurochem., 103:2004-2014, 2007). 이온성 글루타메이트 수용체 결여된 불멸화 마우스 해마 세포주인 HT22 세포주에서 비-수용체 매개 산화 경로를 통해 글루타메이트에 의해 유도된 세포 독성에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다(Maher et al., J. Neurosci., 16:6394-6401, 1996). 신경염증은 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 루게릭병과 같은 신경 퇴행성 질병에서 뇌(brain)의 신경세포 손상에 근본적인 중요한 메커니즘이다(Glezer et al., Neuroscience., 147:867-883, 2007; Qin et al., Glia., 55:55453-55562, 2007). 미세아교세포는 뇌에 존재하는 대식세포로, 중추신경계에서 면역 방어에 중요한 역할을 수행한다. 미세아교세포는 자극을 하면 산화질소(NO), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)와 같은 염증성 매개체를 생산한다(Cannella et al., Ann .Neurol., 37:424-435, 1995; Peress et al., J. Neuroimmunol., 71:115-123, 1996). BV2 미세아교세포주는 뇌의 대식세포를 나타내는 것으로 간주되고, 주로 신경염증의 모델로 사용될 수 있다(Park et al., J. Pharmacol., 164:1008-1025, 2011; Chow et al., Int. Immunopharmacol., 12:657-665, 2012; Gao et al., PLoS One. 8, e72046, 2013;).
해양 유래 균류는 다양한 구조 및 생리활성을 갖는 대사산물의 유망한 자원으로 간주되었으며, 해양 균류에서 일부 대사산물은 새로운 종류의 약물 개발에 영감을 주었다(Fenical et al., Nat. Chem. Biol., 2:666-673, 2006; Bugni et al., Nat. Prod. Rep., 21:143-163, 2004; Gerwick et al., Chem. Biol., 19:85-98, 2012).
이에, 본 발명자들은 해양 미생물로부터 생리활성 이차대사산물을 분리하고 그 효과를 검증하고자 예의 노력한 결과, 나프토피라논 유도체(Sakurai et al., J. Antibiot(Tokyo), 55:685-692, 2002)인 TMC-256C1을 해양 유래 Aspergillus sp. SF-6354에서 분리한 후 그 구조를 밝혔으며, 마우스 해마 TH22 및 BV2 미세아교세포를 사용하여 이차대사산물의 세포 보호 및 항신경염증 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016008500318-pat00001
본 발명은 또한, (i) 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1, 또는 (ii) 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 포함하는 해양진균 Aspergillus sp. SF-6354의 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 TMC-256C1을 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 염증반응과 관련하여, BV2 및 HT22 세포에서 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하고, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현을 억제하며, TNF-α, IL-6(C), 및 IL-12(D)의 mRNA 생성을 억제할 뿐만 아니라, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성을 억제하며, HO-1 발현을 증가시키고, HO-1 발현에 따른 p38 MAPK 및 PI3K/AKT 경로를 활성화시키며, ROS 생성 억제 효과가 있으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 세포 생존력에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 글루타메이트로 유도된 산화적 신경독성(A) 및 활성 산소 종의 생성(B)에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 NO(A) 및 PGE2(B)의 생성에 대한 TMC-256C1의 효과 및 LPS로 자극된 BV2 세포에서 iNOS 및 COX-2(C)의 단백질 발현 정도에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 LPS로 자극한 BV2 세포에서 TNF-α(A), IL-1β(B), IL-6(C), 및 IL-12(D)의 mRNA 발현 정도에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 LPS로 유도된 NF-κB 활성에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 HT22 세포(A, C) 및 BV2 세포(B, D)에서 HO-1 발현에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 HT22 세포에서 글루타메이트로 유도된 산화적 신경독성(A) 및 활성 산소 종의 생성(B)에 대한 주석 프로토포르피린(SnPP)의 효과와, LPS로 자극된 BV2 세포에서 TMC-256C1전처리로 산화질소(C), PGE2(D), IL-6(E), 및 TNF-α(F) 생성을 억제하는 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 HT22 세포(A) 및 BV2 세포(B)에서 핵 전좌 인자-E2-관련 인자 2(Nrf2)에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 HT22 세포(A) 및 BV2 세포(B)에서 ERK, JNK, 및 p38 MAPK 발현에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 HT22 세포(A) 및 BV2 세포(B)에서 HO-1 발현에 TMC-256C1에 의해 유도된 p38 활성화 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 HT22 세포(A, B) 및 BV2 세포(C, D)에서 PI3K/AKT cascade를 통해 HO-1의 발현에 대한 TMC-256C1의 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체적인 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 개별 구성에 관한 세부 사항은 후술하는 관련 기재의 구체적 취지에 의하여 적절히 이해될 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 Aspergillus sp. SF-6354의 추출물로부터 TMC-256C1을 분리하여, BV2 및 HT22 세포에서 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성 억제, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제, TNF-α, IL-6(C), 및 IL-12(D)의 mRNA 생성 억제, IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성 억제, HO-1 발현 증가, HO-1 발현에 따른 p38 MAPK 및 PI3K/AKT 경로 활성화, ROS 생성 억제 효과를 확인하였으며, 세포 독성이 없으므로 염증 질환의 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112016008500318-pat00002
본 발명의 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1은 남극 로스해에서 분리한 Aspergillus sp. SF-6354에서 분리된 항염즘 활성, 특히 항신경염증 활성을 갖는 화합물이고, 분자량이 273.0763이며, 분자식이 C15H13O5인 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 염증 질환 예방 또는 치료하는데 유용하며, 본 발명에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 퇴행성 신경염증에 특히 효과적이며, 상기 퇴행성 신경염증은 알츠하미어병, 파킨슨병, HIV-관련 치매(HAD), 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트 야콥병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것이 바람직하다.
1) 산화질소(NO) 및 프로스타글라딘 E2(PGE2)의 생성 억제;
2) 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제;
3) 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6), 및 인터루킨 12(IL-12)의 mRNA 생성 억제;
4) IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 수준 감소;
5) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제;
6) HO-1(heme oxygenase 1)의 발현 증가; 및
7) p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 PI3K/AKT(phosphotidyl inositol 3-kinase/protein kinase B) 경로 활성화.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다. 화합물을 함유하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화합물을 함유하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제제화될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 하지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 유효성분을 기준으로 0.1 mg/kg(체중) 내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중) 내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 (i) 하기 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1, 또는 (ii) 하기 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 포함하는 해양진균 Aspergillus sp. SF-6354 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품을 제공하는데 있다.
[화학식 1]
Figure 112016008500318-pat00003
본 발명에 따른 식품에 의해 증상이 개선될 수 있는 염증 질환은 전술한 바와 같다. 본 발명에 따른 식품은 염증 질환 중에서도 특히 퇴행성 신경염증을 치료하는데 효과적이다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 건강기능 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 TMC-256C1을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 TMC-256C1을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 건강 기능식품 또한, 식품조성물로서 기능성 식품, 영양보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 다양한 형태를 포함하는 것이며, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태, 예컨대, 앞서 언급한 TMC-256C1을 차, 쥬스, 드링크의 형태로 제조하거나, 과립화, 캡슐화, 분말화하거나, 이러한 화합물 또는 추출물을 음료, 과실 및 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류, 면류, 조미료 등 각종 식품에 첨가하여 제조함으로써 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.
본원에서 "염증"이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로서, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성 염증은 수일이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관여한다. 만성 염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.
본원에서 "산화질소"는 세포 내 염증반응 유발시 산화질소 합성효소에 의해 생성량이 증가하므로, 염증반응의 지표가 되는 물질이다. 신경계에서 산화질소는 신경세포에 존재하는 신경계 산화질소 합성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 상기 합성된 산화질소는 뇌세포에서 cGMP의 생성을 증가시키고, 이로 인하여 외부로부터 인지한 정보를 오랫동안 저장하는 기능을 수행한다. 산화질소(NO)는 자유 라디칼로 생리학적, 병리학적 과정에 관련된 것으로 알려져 있다. NO는 산화질소 합성효소에 의해 엘-아르기닌(L-Arginine) 산화에 의해 합성된다(Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
본원에서 "COX-2"는 염증반응과 관련된 단백질인 프로스타그란딘을 생성하는데 관여하는 효소로서, 세포 내 COX-2 발현 수준의 증가는 염증반응이 진행되고 있음을 나타내는 지표가 될 수 있다.
본원에서 "프로스타그란딘 E2(PGE2)"는 프로스타그란딘 엔도페록시드 합성효소라고 불리는 COX-2에 의해 염증 부위에서 생성되는 다른 염증 매개체이다. PGE2는 많은 심장혈관 질환, 관절염, 염증성 장 질환 및 만성 위궤양을 포함하는 만성 염증성 질환과 관련되어 있다(St-Onge et al., Biochim . Biophys . Acta., 1771:1235-1245, 2007; Turini et al., Annu . Rev. Med ., 53:35-57, 2002; Rocca et al., Int. Immunopharmacol ., 2:603-630, 2002; Singh et al., Pharmacology, 72:77-84, 2004).
[ 실시예 ]
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.
분석 장치
ESIMS data는 flight micro 액상 크로마토그래피-MS/MS 장치의 4중극 시간을 이용하여 획득하였다(Waters, Manchester, UK). NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 분광 광도계(JEOL, Peabody, MA, USA)로 DMSO-d6에 기록하였으며, 화학이동은 상응하는 잔류용매의 신호(δH/δC=2.49/39.5)를 기준하였다. HPLC(YOUNGLIN-YL9100, Younglin, Anyang, Korea) 분리는 5 mL/min의 유량으로, Synergi™ 4u Polar-RP 80A, AXIA™ 충진 컬럼(21.2×150 mm, 5 νm particle size; Phenomenex, Macclesfield, UK)을 이용하여 수행하였다. HPLC에 사용되는 용매는 모두 분석 등급이다.
시약
둘베코수정이글배지(DMEM), 소태아혈청(FBS), 및 기타 조직배양 시약은 Gibco BRL Co.로부터 구입하였다(Grand Island, NY, USA). HO 활성화 억제제인 주석 프로토포르피린 IX(SnPP IX)은 Porphyrin Products로부터 입수하였다(Logan, UT, USA). 다른 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich Co.로부터 구입하였다(St. Louis, MO, USA). 생쥐(mouse)/염소(goat)/토끼(rabbit) 항-HO-1, Nrf2, COX-2, iNOS, β-Actin, IκB-α, p-IκB-α, p50, p65, 및 PCNA를 포함하는 일차항체 및 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였으며(Heidelberg, Germany),p-AKT 및 AKT 항체는 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다(Cell Signaling, Danvers, MA, USA).
웨스턴 블롯 분석
BV2 세포는 채취하고 15분 동안 16,000 rpm으로 원심분리하여 펠렛화하였다. 상기 세포는 PBS로 세척한 다음, 단백질 분해효소 저해제 혼합물(0.1 mM PMSF, 5 mg/mL 아프로티닌, 5 mg/mL 펩스타틴 A, 및 1 mg/mL 키모스타틴)을 함유하는 20 mM Tris-HCl 버퍼용액(pH 7.4)으로 용해시켰다. 단백질 농도는 Lowry 단백질 분석 kit(P5626; Sigma-Aldrich)로 측정하였다. 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 7.5% 및 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분해시킨 다음, Hybond™ ECL(enhanced chemiluminescence) 나이트로셀룰로스 멤브레인(Bio-Red, Hercules, CA, USA)으로 전기영동에 의해 옮겨왔다. 5%(w/v) 무지방 우유로 상기 멤브레인의 오염을 방지하고, 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 및 홀스래디쉬 과산화효소가 결합된 이차 항체를 순차적으로 배양하고 ECL을 검출(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)하였다. 밴드 신호의 강도는 농도계의 ImageJ software(National Institutes of Health, Bethesda, MD)을 이용하여 정량화하였다.
통계 처리
모든 실험은 적어도 3회 반복해서 수행하였으며, 실험결과는 평균±표준편차(S.D.)로 표시하였다. 3개 이상의 그룹을 비교하기 위하여 일원변량분석(one-way analysis of the variance)을 사용한 다음, Tukey's 다중 비교 시험하였다. 통계 분석은 GraphPad Prism software로 수행하였다(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
실시예 1: TMC-256C1 의 분리 및 구조결정
해양 균류 Aspergillus sp. SF-6354의 배양 배지의 유기 추출물에서 생리활성 화합물을 확인하기 위하여, 플래시 컬럼 크로마토그래피 및 HPLC를 포함하는 여러 정제 방법을 사용하였으며, 나프토피라논 형태의 진균 대사산물, TMC-256C1을 분리하였다(도 1).
Aspergillus sp. SF-6354는 2013년 2월에 남극 로스해(N 78O28.728' E 163O22.694')의 수심 375 m에서 수집한 정체불명의 스펀지에서 분리하였다. 상기 균류는 리보솜 RNA(rRNA) 염기서열 분석에 기초하여 확인되었다. SF-6354(GenBank accession number KT185660)의 28S rRNA 유전자를 사용하여 GenBank 검색을 한 결과, Aspergillus niger(KC119204), Aspergillus heteromorphus(KM434330), 및 Aspergillus japonicus(KC128815)와 가장 가까운 것으로 나타났으며, 각각 99.42%, 98.83%, 및 96.85%의 유사성을 나타내었다. 따라서, 해양유래 진균 균주는 SF-6354는 Aspergillus sp.으로 분류되었다. Aspergillus sp. SF-6354는 한국생물자원센터에 균주를 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12951BP).
진균 균주는 감자한천배지[0.4% (w/v) potato starch, 2% (w/v) dextrose, 3% (w/v) NaCl, 및 1.5% (w/v) agar] 20 mL를 각각 포함하는 100 페트리 접시(90 mm)에서 배양하였다. 플레이트는 개별적으로 진균 균주의 종자 배양물 2 ㎖을 접종하고, 25℃에서 14일 동안 배양하였다. 에틸아세테이트(150 mL)와 한천배지의 추출은 유기상을 제공하고, 진공 농축하여 563.5 mg의 추출물을 수득하였다.
에틸아세테이트 추출물은 C18 플래시 컬럼 크로마토그래피(3.5×17 cm)로 수행하였으며, 20%, 40%, 60%, 80%, 및 100%(v/v)의 메탄올수용액(각 250 mL)으로 단계적으로 용출시켰다. 80% 메탄올로 용출한 분획물(151.2 mg)은 C18 기능화 컬럼 크로마토그래피로 분리한 다음, 75%(v/v) 메탄올 수용액으로 용출하여 7개의 소분획물을 수득하였다. 소분획물 4는 semi-prep. RP 고압 액상 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였으며, 60분 동안 0.1%(v/v)의 포름산을 포함하는 60% 내지 63%(v/v)의 메탄올수용액으로 구배를 주어 용출하였으며 TMC-256C1[2.3 mg, t R=31.6 min, yield=0.41%(w/w)]을 수득하였다.
분리된 화합물의 구조는 문헌에 보고된 데이터와 비교함과 동시에 NMR 및 MS 결과 분석에 의하여 확인하였다(Sakurai et al., J. Antibiot(Tokyo), 55:685-692, 2002).
TMC-256C1: 옅은 노랑(pale yellow), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 12.88 (1H, s, 5-OH), 10.52 (1H, brs, 8-OH), 6.77 (1H, s, H-6), 6.61 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-7), 6.47 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-9), 6.45 (1H, s) 3.93 (3H, s, 10- OCH 3 ), 2.47 (3H, s, 2-CH3); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:182.1 (C-4), 167.5 (C-2), 160.1 (C-8), 159.0 (C-10), 155.5 (C-11), 155.4 (C-5), 140.7 (C-13), 109.7 (C-3), 107.4 (C-12), 104.2 (C-6), 103.0 (C-14), 101.1 (C-7), 97.4 (C-9), 55.9 (10-OCH3), 19.9 (2-CH3); HRESIMS: m/z 273.0764 [M + H]+(C15H13O5, 273.0763).
실시예 2: TMC - 256C1의 세포독성 확인
본 실시예에서는 TMC-256C1의 세포독성을 평가하기 위하여, HT22 세포(도 1A) 및 BV2 세포(도 1B)의 생존력에 미치는 영향을 평가하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, HT22 세포(A) 및 BV2 세포(B)를 표시된 농도(5, 10, 20, 40 μM)의 TMC-256C1으로 12시간 동안 배양하였다. BV2 및 HT22 세포는 10%(v/v) 열-비활성화 FBS, 페니실린 G(100 units/mL), 스트렙토마이신(100 ㎍/mL), 및 L-글루타민(2 mM)로 보충한 DMEM 배지(Diameter 100 nm)에서 각각 5×106 cells/dish 및 5×105 cells/mL로 유지시키고, 5% CO2를 함유하는 대기하에 37℃에서 배양하였다. 세포 생존력의 측정을 위하여, 세포(2×104 cells/well in 96-well plates)를 최종농도 0.5 mg/mL에서 4시간 동안 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT)로 배양하였으며, 포르마잔 형성은 산성 2-프로판올에 용해시켰다. 광학 밀도는 microplate reader로 590 nm에서 측정하였다(Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 대조군(비처리) 세포에서 형성된 포르마잔의 광학 밀도는 100%의 생존율을 나타내었다.
그 결과, 5 μM 내지 40 μM의 TMC-256C1는 HT22 및 BV2 세포에서 세포독성을 나타내지 않았다. 따라서, 모든 실시예에서 세포 실험은 TMC-256C1의 농도가 5 μM 내지 40 μM 인 범위 내에서 실시하였다.
실시예 3: TMC-256C1 이 글루타메이트로 유도된 세포독성 및 활성 산소 종의 생성에 미치는 영향
비세포독성 농도에서(5-40 μM), TMC-256C1으로 사전-배양(3 시간)한 후, 12시간 동안 글루타메이트(5 mM)로 HT22 세포를 처리함으로써 글루타메이트로 유도된 세포독성(도 2A) 및 ROS(reactive oxygen species) 생성(도 2B)에 대하여, TMC-256C1이 세포보호 효과 및 ROS 소거 능력에 영향을 미치는지 조사하였다.
활성 산소 종(ROS)의 측정을 위하여, HT22 세포(2.5×104 cells/well in 24-well plates)를 TMC-256C1 또는 SnPP(HO 억제제)의 존재 또는 부재하에 5 mM 글루타메이트로 처리한 다음, 12시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 다음, 세포는 어두운 곳에서 30분 동안 항크스 평형 염류 용액에서 10 μM의 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트와 염색하였다. 상기 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 37℃에서 10분 동안 PBS에 1% (v/v) Triton™ X-100으로 추출하였다. 형광은 490 nm의 여기(excitation) 파장 및 525 nm의 방사(emission) 파장으로 기록되었다(SpectraMax Gemini XS; Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
세포에 글루타메이트의 적용은 ROS 생성을 증가시켰지만, TMC-256C1으로 전처리한 것은 이러한 유도를 효과적으로 억제하였다(도 2B). Trolox®는 잘 알려진 항산화제로 양성 대조군으로 사용되었으며, 40 μM 농도에서 현저한 세포보호 효과 및 ROS 소거 능력을 보였다.
실시예 4: TMC - 256C1이 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향
TMC-256C1의 항염증 효과를 확인하기 위하여, BV2 세포에서 LPS로 유도된 NO 및 PGE2 생성에 미치는 영향뿐만 아니라 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였다(도 3).
배지에서 산화질소(NO) 생성의 지표인 NO 농도는 Griess 반응으로 측정하였다. 각 상청액(100 μL)은 Griess 시약(Solution A: 222488; Solution B: S438081, Sigma-Aldrich)과 동등한 부피로 혼합하고, 525 nm에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) plate reader을 사용하여 혼합물의 흡광도를 측정하였다.
각 샘플에 나타나는 PGE2의 수준은 시판중인 R&D Systems의 키트를 이용하여 측정하였으며(Minneapolis, MN), 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. BV2 세포는 24-well plates에 비세포독성 농도(5, 10, 20, 40 μM)의 TMC-256C1로 3시간 동안 사전 배양(전처리)시킨 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다. 세포 배양 상청액은 처리 후 즉시 회수하고, 13,000×g에서 2시간 회전시켜 입자상물질을 제거하였다. 배지는 96-well plate에 PGE2을 위한 특정 친화성-정제 다중클론성 항체로 미리 코팅하여 첨가하였다. PGE2을 위한 특정 효소결합 다중클론성 항체를 웰에 첨가하고, 20시간 동안 반응하도록 방치한 다음, 언바운드 항체 효소 시약을 제거하기 위하여 마지막으로 세척하였다. 기질용액이 첨가되고, 450 nm에서 측정된 발색의 강도는 존재하는 PGE2의 양에 비례한다.
실험 결과, TMC-256C1으로 3시간 동안 전처리한 세포는 iNOS-유래 NO의 농도(도 3A) 및 iNOS 발현(도 3C)이 감소되는 것으로 나타났다. 또한, 동일한 조건하에 TMC-256C1은 COX-2 발현을 억제하고(도 3C), COX-2-유래 PGE2 생성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 3B).
결과적으로, 본 발명의 TMC-256C1는 iNOS 및 COX-2 단백질 발현의 억제를 통해 LPS로 인한 염증성 매개체(즉, NO 및 PGE2)의 생성을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 5: TMC-256C1 이 전염증성 사이토카인에 미치는 영향
LPS로 자극된 BV2 세포에 대한 TMC-256C1의 항염증 효과를 평가하기 위하여, TNF-α, IL-1β, IL-6, 및 IL-12와 같은 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 비세포독성 농도(5-40 μM)에서 TMC-256C1의 존재 및 부재하에서 평가하였다.
양적 역전사 중합효소 연쇄 반응
Total RNA는 제조업체의 지시에 따라 Trizol®(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 세포로부터 분리하였으며, 260 nm에서 분광광도계를 이용하여 정량화하였다. Total RNA(1 μg)은 High Capacity RNA-to-cDNA kit을 이용하여 역전사하였다(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). cDNA는 StepOnePlus™ Real-Time PCR system(Applied Biosystems)을 사용한 SYBR® Premix Ex Taq™ kit(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 이용하여 증폭하였다. 간략하게, 각각의 반응 부피 20 μL는 SYBR® Green PCR Master Mix 10 μL, 각각의 프라이머 0.8 μM, 및 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 물을 포함한다. 프라이머 시퀀스는 PrimerQuest® software (Integrated DNA Technologies, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 설계되었다. 프라이머 시퀀스는 다음과 같다: TNF-α에 대한 forward 및 reverse primers는 5'-CCA GAC CCT CAC ACT CAC AA-3'(서열번호 1) 및 5'-ACA AGG TAC AAC CCA TCG GC-3'(서열번호 2)이고, IL-1β에 대한 forward 및 reverse primers는 5'-AAT TGG TCA TAG CCC GCA CT-3'(서열번호 3) 및 5'-AAG CAA TGT GCT GGT GCT TC-3'(서열번호 4)이며, IL-6에 대한 forward 및 reverse primers는 5'-TCA CAA GTC GGA GGC TT-3'(서열번호 5) 및 5'-TGC AAG TGC ATC ATC GTT GT-3'(서열번호 6), 및 IL-12에 대한 forward 및 reverse primers는 5'-AAG TGA CAT GTG GAA TGG CGT-3'(서열번호 7) 및 5'-CAG TTC AAT GGG CAG GGT CT-3'(서열번호 8)이다. cDNA의 PCR 증폭을 위한 최적의 조건은 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 데이터는 StepOne™ software(Applied Biosystems)을 사용하여 분석하였으며, 항존유전자(GAPDH)를 위한 선형 증폭 역치(Ct) 값에서 사이클 횟수 및 표적 유전자를 기록하였다. 상대 유전자 발현(표적 유전자 발현은 항존유전자의 발현을 표준으로 한다)은 비교 Ct 방법(2-˚△△Ct)을 이용하여 계산하였다.
BV2 세포는 TMC-256C1의 표시된 농도로 3시간 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, LPS 처리는 LPS 처리하지 않은 그룹과 비교하여 배양 배지에서 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도의 현저한 증가를 유발하였다. 하지만, 세포를 TMC-256C1으로 3시간 동안 전처리한 것은 용량에 의존적으로 TNF-α, IL-6, 및 IL-12의 mRNA 발현 정도가 현저하게 감소하였지만, IL-1β의 mRNA 발현에 대한 억제 효과는 거의 없었다.
따라서, 본 발명의 TMC-256C1은 전사 수준에서 LPS로 자극된 BV2 세포에서 전염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 6: TMC-256C1 이 NF - κB 활성에 미치는 영향
NF-κB는 LPS로 활성화된 포유류 전사 인자로, 전염증성 효소 및 사이토카인의 발현을 조절한다(Baeuerle, Cell, 95:729-731, 1998). NF-κB 경로의 활성화 동안, IκB-α의 저하, 세포질에서 NF-κB와 연관된 억제제, 및 NF-κB의 핵 전좌는 중요한 것이다(Jacobs et al., Cell, 95:749-758, 1998). 따라서, TMC-256C1의 근본적인 신경염증 효과에 대한 메커니즘은 규명하기 위하여, 웨스턴 블론 분석으로 TMC-256C1이 인산화 및 IκB-α의 저하에 미치는 영향을 조사하였다.
BV2 세포를 10, 20, 및 40 μM 농도의 화합물 1로 3시간 동안 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 30분 동안 자극하였다. 핵 추출물에서 NF-κB의 DNA-바인딩 활성은 제조업체의 지시에 따라 TransAM® kit(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
BV2 세포는 새로 추가된 단백질 분해효소 저해제 cocktail I(EMD Biosciences, San Diego, CA, USA) 및 1 mM 페닐메틸설포닐플로라이드(PMSF)을 함유하는 M-PER™ Mammalian 단백질 추출 버퍼용액(1:20, w/v)(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)에서 균질화하였다. 세포의 세포기질 분획은 4℃에서 5분 동안 16,000×g 원심분리에 의해 제조하였다. 핵 및 세포질의 세포 추출물은 각각 NE-PER® 핵 및 세포질의 추출 시약으로 각각 제조하였다(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).
도 5A는 전체 단백질을 제조하고, 웨스턴 블롯 분석은 IκB-α 및 p-IκB-α에 특정 항체를 이용하여 수행하였고, 도 5B의 세포질 및 핵 추출물은 NF-κB p65 및 p50에 대한 웨스턴 블롯에 사용하기 위해 제조하였으며, anti-p65 및 anti-p50 단일클론항체를 사용하였다. 도 5C는 시판중인 NF-κB ELISA(Active Motif) 키트를 핵 추출물 실험 및 NF-κB 바인딩 정도를 측정하는데 사용하였다. 밴드 감도는 농도계 및 β-actin와 PCNA 효준화로 정량화하였으며, 값은 각 밴드 하단에 기재하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, IκB-α은 세포를 LPS로 30분 동안 처리한 후 인산화되고 저하되었지만, IκB-α의 인산화 및 저하는 3시간 동안 TMC-256C1(10-40 μM)와 세포의 전처리로 현저하게 억제되었다. 이러한 관찰은 TMC-256C1이 IκB의 인산화 및 저하 방지를 통해 NF-κB(p65 및 p50)의 LPS로 유도된 핵 전좌를 억제하는 것을 알 수 있다. 이에 따라, BV2 미세아교세포에서 핵 NF-κB p65 및 p50의 정도는 세포를 LPS로 30분 동안 처리한 후 증가한 반면, LPS로 자극된 세포에 TMC-256C1(10-40 μM)로 전처리한 것은 용량에 의존적으로 감소하였다. 또한, LPS 전처리(30분)는 BV2 세포의 핵 추출물에서 NF-κB의 DNA 바인딩 활성 증가시켰지만; TMC-256C1은 LPS로 자극된 세포에서 용량에 의존적으로 NF-κB의 DNA 바인딩 활성을 억제하였다(도 5C).
종합하면, 상기 결과들은 LPS로 자극된 세포에서 TMC-256C1의 항염증 효과는 NF-κB 경로와 관련이 있음을 증명하였다.
실시예 7: TMC - 256C1이 HO-1 발현에 미치는 영향
HO-1의 유도와 TMC-256C1의 신경보호 및 항염증 효과의 연관성을 알아보기 위하여, TMC-256C1이 HT22 및 BV2 세포에서 HO-1 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 비세포독성 농도(10, 20, 및 40 μM)에서 12시간 동안 TMC-256C1으로 전처리한 것은 HT22 및 BV2 세포에서 HO-1 발현(도 6A 및 6B)을 용량에 의존적으로 증가시켰다. HO-1 유도인자 CoPP(Abraham et al., Pharmacol. Rev., 79-127, 2008)는 양성 대조군으로 사용하였다. TMC-256C1에 의해 HO-1의 유도는 40 μM에서 정점에 도달하였다. 40 μM 농도로, HT22 및 BV2 세포에서 HO-1 발현은 6 h에 처음 감지되었으며, 약 18h에 최대로 증가한 다음, 24h 후에 점차 감소하였다(도 6C 및 6D).
실시예 8: 글루타메이트로 유도된 산화적 신경독성 및 TMC - 256C1에 의한 전염증성 매개체 억제에 HO-1 발현에 미치는 영향
HT22 세포에서 TMC-256C1의 신경보호 효과 및 BV2 세포에서 TMC-256C1의 항염증 효과가 HO-1 발현 유도를 통해 영향을 받는지 여부를 확인하기 위하여, TMC-256C1-처리된 세포에서 SnPP, HO-1의 억제제의 효과를 조사하였다. 활성 산소 종(ROS)의 측정은 실시예 3에 기재된 내용을 참고로 한다.
도 7A의 HT22 세포는 SnPP(50 μM)의 존재 또는 부재하에 TMC-256C1으로 전처리한 다음, 글루타메이트(5 mM)로 12시간 동안 배양하였으며, 도 7B는 SnPP(50 μM)의 존재 또는 부재하에 12시간 동안 5 mM 글루타메이트에 노출된 HT22 세포는 활성 산소 종의 생성을 증가시켰다. 도 7C 내지 7F의 BV2 세포는 SnPP(50 μM)의 존재 또는 부재하에 TMC-256C1(40 μM)로 전처리한 다음, LPS(1 μg/mL)로 24시간 동안 자극하였다.
HT22 세포는 SnPP의 존재 또는 부재하에 12시간 동안 40 μM의 TMC-256C1으로 처리하였으며, SnPP는 TMC-256C1에 의해 매개되는 세포보호 효과를 현저하게 뒤바꾸는 것으로 나타냈다(도 7A). 또한, TMC-256C1으로 HO-1 발현의 유도는 글루타메이트로 유도된 ROS의 생성을 억제하기 위해 필요한 것으로 나타났다(도 7B). 마찬가지로, TMC-256C1에 의한 HO-1 발현과 항신경염증 효과의 잠재적인 연관성은 SnPP를 이용하여 조사하였다. 도 7C 내지 7F에 나타난 바와 같이, LPS로 자극된 세포에서 TMC-256C1으로 전처리한 것은 NO, PGE2, TNF-α, 및 IL-6 생성을 억제하였다. 하지만, TMC-256C1및 SnPP로 전처리한 것은 LPS로 자극된 세포에서 상기 인자들의 생성에 대하여 TMC-256C1의 억제 효과와는 부분적으로 상반된 것으로 나타났다.
실시예 9: TMC-256C1 이 Nrf2의 핵의 전좌에 미치는 영향
활성화된 Nrf2의 핵의 전좌는 HO-1의 전사에 중요한 상위 인자이다(Paine et al., Biochem. Pharmacol., 80:1895-1903, 2010). 따라서, 본 실시예에서는 HT22 및 BV2 세포를 TMC-256C1으로 처리하는 것이 세포핵으로 Nrf2의 핵의 전좌를 유발하는지 조사하였다. 세포는 0.5, 1, 및 1.5시간 동안 40 μM 농도의 TMC-256C1으로 배양하였으며, Nrf2 단백질의 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, TMC-256C1으로 처리된 세포의 핵의 분획물에서 Nrf2의 단백질 수준은 TMC-256C1으로 처리하지 않은 세포와 비교하여 점차 증가하였으며, 반면에 세포질의 분획물에서는 점차 감소하였다.
실시예 10: TMC-256C1으로 HO-1 발현의 유도에 MAPK 경로의 연관성
MAPK는 산화적 스트레스 및 기타 다양한 스트레스 요인에 반응하여 활성화된다. MAPK 경로의 활성화는 HO-1의 유도와 관련이 있다고 알려져 있다(Kietzmann et al., J. Biol. Chem., 278:17927-17936, 2003). 따라서, TMC-256C1에 의한 HO-1 발현 유도에 관여하는 신호 전달 경로를 확인하기 위해, TMC-256C1이 3개의 MAPK 경로에 미치는 영향을 분석하였다. 이러한 경로의 활성화는 활성화-특정 항체로 분석하였으며 이는 ERK, JNK, 및 p38의 활성화 및 인산화된 형태를 선택적으로 확인하였다. 각 세포는 표시된 시간(15, 30, 45, 및 60분) 동안 40 μM의 TMC-256C1으로 처리하였다. 세포 추출물은 인산화 ERK1/2(p-ERK), 인산화 JNK(p-JNK), 또는 인산화 p38(p-p38)에 대한 특정 항체로 웨스턴 블론으로 분석하였다.
40 μM 농도에서, TMC-256C1는 HT22 및 BV2 세포 각각에서 p38의 인산화를 증가시켜 p38 경로를 활성화하였다. p38의 인산화는 세포를 TMC-256C1으로 처리하고 15분 후에 관찰되었으며, 60분 동안 지속되었다(도 9). 반면, JNK 및 ERK의 인산화는 관찰되지 않았다.
또한, BV2 및 HT22 세포에서 TMC-256C1에 대한 HO-1 발현의 유도를 조절하는 p38 키나아제의 역할을 확인하기 위하여, HO-1의 발현 수준에 대한 p38(SB203580), JNK(SP600125), 및 ERK(PD98059)의 특정 억제제의 효과를 웨스턴 블롯 분석으로 조사하였다(도 10). 각 세포는 특정 억제제 PD98059(40 μM), SP600125(25 μM), 및 SB203580(20 μM)로 1시간 동안 전처리한 다음, 12시간 동안 TMC-256C1(40 μM)로 처리하였다. 그 결과, TMC-256C1으로 유도된 HO-1 발현은 p38 억제제로 발현이 억제된 반면, JNK 및 ERK 억제제는 HO-1 단백질 수준에 대해 영향이 거의 없는 것으로 나타났다. p38 억제제는 본 발명의 실험 조건에서 세포독성 효과를 발휘하지 않았다.
따라서, p38 경로의 활성화는 TMC-256C1에 의한 HO-1 발현 유도와 관련되어 있음을 알 수 있다.
실시예 11: TMC-256C1으로 HO-1 발현의 유도에 PI3K / AKT 경로의 연관성
PI3K/AKT 경로는 식물의 대사산물에 의한 HO-1 발현의 유도에 관여하는 것을 보여주는 많은 연구가 보고되었다(Martin et al., J. Biol. Chem., 279:8919-8929, 2004; Zhang et al., J. Agric. Food. Chem., 60:8171-8182, 2012; Chen et al., Free. Radic. Biol. Med., 52:1054-1066, 2012). 따라서, 추가 분석은 PI3K/AKT의 경로의 활성화와 TMC-256C1에 의한 HO-1 유도의 연관성에 대해 수행하였다.
도 11B 및 11D는 각각의 세포를 1시간 동안 10 μM의 LY294002 또는 LY294002 없이 전처리한 다음, 18시간 동안 40 μM의 TMC-256C1의 존재 또는 부재하에 배양하였다. 또한, 도 11A 및 11C는 각각의 세포를 표시된 시간(15, 30, 45, 60분) 동안 TMC-256C1(40 μM)로 처리하였다. 그 결과, 세포와 LY294002(PI3K 억제제)의 전처리는 TMC-256C1에 의한 HO-1 발현의 유도를 약화시켰다(도 11B 및 11D). 또한, 세포를 40 μM의 TMC-256C1으로 처리한 경우, 세포 내에서 Akt의 인산화 수준은 15분에서 60분까지 점차 증가하였다(도 11A 및 11C).
따라서, TMC-256C1으로 유도된 HO-1의 발현은 PI3K/AKT 경로를 통해 HT22 및 BV2 세포에서 영향이 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12951BP 20151125
<110> Korea Polar Research Institute <120> Pharmaceutical Composition for Preventing and Treating Inflammatory Diseases Comprising TMC-256C1 <130> P15-B320 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagaccctc acactcacaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acaaggtaca acccatcggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aattggtcat agcccgcact 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aagcaatgtg ctggtgcttc 20 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcacaagtcg gaggctt 17 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgcaagtgca tcatcgttgt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aagtgacatg tggaatggcg t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cagttcaatg ggcagggtct 20

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112016126275790-pat00004
    .
  2. 제1항에 있어서, TMC-256C1는 해양진균 Aspergillus sp. SF-6354에서 분리되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 염증 질환은 퇴행성 신경질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV-연관 치매(HAD), 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트 야콥병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    1) 산화질소(NO) 및 프로스타글라딘 E2(PGE2)의 생성 억제;
    2) 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제;
    3) 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6), 및 인터루킨 12(IL-12)의 mRNA 생성 억제;
    4) IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 수준 감소;
    5) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제;
    6) HO-1(heme oxygenase 1)의 발현 증가; 및
    7) p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 PI3K/AKT(phosphotidyl inositol 3-kinase/protein kinase B) 경로 활성화.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 TMC-256C1을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 개선용 식품:
    [화학식 1]
    Figure 112016126275790-pat00005
    .
  7. 제6항에 있어서, 상기 염증 질환은 퇴행성 신경질환인 것을 특징으로 하는 염증 질환 개선용 식품.
  8. 제7항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV-연관 치매(HAD), 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트 야콥병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증 질환 개선용 식품.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2010, vol. 20, pp. 3848~3850
Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, 2010, vol. 20, pp. 3848~3850 *
The Journal of Antibiotics, 2002, vol. 55, no. 8, pp. 685~692 *

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