KR101712464B1

KR101712464B1 - 감염성 질환 치료제 대사효소 관련 유전자 snp 지노타이핑 시약, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법

Info

Publication number: KR101712464B1
Application number: KR1020150178162A
Authority: KR
Inventors: 김정미; 정호상; 서두원; 오명열; 이윤수; 이민경; 김시은
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2017-03-06

Abstract

본 발명은 감염성 질환 치료제와 관련된 유전자의 SNP를 지노타이핑 할 수있는 프로브가 포함된 시약과, 상기 시약을 포함하는 유전자형 분석 키트 및 이를 이용한 분석 방법에 대한 것이다.

Description

감염성 질환 치료제 대사효소 관련 유전자 SNP 지노타이핑 시약, 이를 포함하는 키트 및 유전자형 분석방법 {Reagent for SNP-genotyping of a gene related with infectious diseases drug-metabolizing enzyme, the kit comprising the same, and the method for the SNP-genotyping}

본 발명은 성인과 소아의 Pneumocystis carinii 폐렴, 이질, 요로감염, 결핵균을 통한 감염 등의 감염성 질환의 치료제로 사용되는 Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole에 대해서 상기 치료 약물을 환자에게 투여하기 전에 약물 부작용이 발생하는지 확인하기 위한 SNP 시약 및 분석 방법으로, 보다 상세하게는 감염성 질환 치료제와 관련된 유전자의 SNP를 지노타이핑 할 수 있는 프로브가 포함된 시약과, 이를 포함하는 유전자형 분석 키트 및 이를 이용한 유전자형 분석 방법에 대한 것이다.

인간의 유전체 염기서열 전체가 모두 해독된 후, 질병과의 연관성을 밝히기 위하여, 개인별 및 인종별 다양성을 기반으로 나타나는 단일 염기쌍의 차이에 대한 SNP(Single nucleotide polymorphism)연구가 활발히 진행되고 있다. 인간 유전자의 99.9%는 일치하나, 0.1~0.5%의 SNP 및 CNV(copy number variation)등의 차이로 인해 체질, 외모, 질병 등 개인별 및 인종별 유전적 특성이 나타나며, 사람마다 동일한 약을 사용해도 약의 효능과 약효, 반응 등이 다르게 나타나는 것도 SNP, CNV 등의 차이로 알려져 있다.

이러한 개인차이가 있는 SNP를 확인하기 위해서 본 발명에서는 qPCR(quantitative realtime pcr)을 사용하고자 한다. qPCR은 이미 잘 알려져 있는 PCR 기법을 개량한 것으로, PCR은 핵산의 효소 증폭을 의미하고 있으며, 극히 적은 양의 시료를 대량으로 증폭할 수 있다는 점과, 그 과정이 간단하기 때문에 생명공학의 연구에 기본적으로 사용되어져 왔으나, 증폭된 산물의 정량화가 불가능하다는 한계를 가지고 있다. 따라서, 이 문제를 해결하기 위해 증폭되는 핵산물질에 형광을 붙이고 이 형광을 지속적으로 검출하는 방식으로 이루어진 qPCR을 도입하였으며, 상기 qPCR을 사용함으로써, 초기 핵산의 양을 추정할 수 있게 되었고, 이러한 qPCR 기술을 이용하여 병원균의 검출, 유전자 발현의 분석, SNP분석, 염색체 이상등을 분석하고 있다.

한편, 상기 감염성 질환 중의 하나인 폐렴은, 세균이나 바이러스, 곰팡이 등의 미생물로 인한 감염으로 발생하는 폐의 염증으로, 기침, 염증 물질의 배출에 의한 가래, 숨 쉬는 기능의 장애에 의한 호흡곤란 등 폐의 정상적인 기능에 생기는 폐 증상과, 구역, 구토, 설사 등의 소화기 증상 및 두통, 피로감, 근육통, 관절통 등의 신체 전반에 걸친 전신질환이 발생한다.

상기 이질은 시겔라 균에 감염된 상태를 의미하며, 대장과 소장을 침범하는 급성 감염성 질환으로 제 1군 법정 전염병으로, 환자 또는 보균자가 배출한 대변을 통해 구강으로 감염되며, 매우 적은 양의 세균으로도 감염되며, 발열, 구역, 복통, 그리고 잔변감을 동반하는 소량의 점성, 혈성 및 설사등이 발생한다.

상기 요로감염은 방광이나 신장에 세균이 들어가 소변 속에서 번식하게 된 것으로, 주로, 방광염, 신우신염 등의 질환을 발생하며, 고열, 구역감, 구토 및 요통 등이 이 발생한다.

상기 질환을 치료하기 위해 사용 되어지는 약물 중 trimethoprim 및 sulfamethoxazole은 sulfonamides계 항생제로 엽산 합성 억제제로 감염성 질환의 일차 선택약제제로 사용되어지며, 상기 trimethoprim은 Dihydrofolate reductase의 억제제로 쓰이고, 상기 sulfamethoxazole은 세균의 핵산대사에 필요한 엽산의 합성을 저해하는 정균성(bacteriostatic) 항생제이며, 상기 trimethoprim 및 sulfamethxazole의 병합투여하면 항균 작용이 상승되는 효과가 있으며, isoniazid은 결핵에 처방되는 1차 치료제로 사용된다.

그러나, 상기 Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole을 감염 치료제로 사용하였을경우, 약물 부작용으로 오심, 구토, 설사, 복통, 두드러기, 가려움증, 발열, 발진, 근육통, 독성표피괴사(toxic epidermal necrolysis, TEN), 스티븐스 증후군(Stevens Johnson Syndrome, SJS), 골수억제, 전해질 불균형, 결정뇨 등이 발생할 우려가 있는데, 상기 Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole은 NAT2의 유전자가 변형없이 존재할 경우에는 부작용이 생길 가능성이 낮지만, NAT2의 유전자의 변형이 발생하였을 경우에는 제대로된 화학 작용이 발생하지 않아 부작용이 발생할 확률이 높아지며, 부작용의 증상이 심각해지면 사망에 이를 수 있는 가능성이 있으므로, Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole을 투여하기 전에 개인별 SNP를 확인하여 유전자형을 파악하고 환자의 개인에 맞는 약물과 약물 투여양을 정확하게 정확히 확인할 필요가 있다.

이에 본 발명은 종래 감염성 질환 치료제 사용에 있어서 개인별 SNP에 따른 감염성 질환 치료제 부작용을 처방전에 알 수 없어 올바른 감염성 질환 치료제의 선정 및 투여량을 정할 수 없었던 문제점을 해결하기 위한 것으로서, Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole 감염성 치료제와 관련된 유전자 NAT2의 SNP 지노타이핑을 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 SNP 진단 분석용 시약을 제공하고, 상기 시약을 포함하는 키트 및 그 유전자형의 분석방법을 제공한다.

선행기술문헌

-특허문헌

특허문헌 1 KR2012-0133385 A (감염성 질환 병원체 및 이들의 약물 민감성을 진단하는 방법)

특허문헌 2 KR1038519 B1 (인체 감염성질환 병원체 감별진단 및 이의 항생제 내성 유무 판별방법, 멀티플렉스 키트 그리고 이를 포함하는 칩)

본 발명의 목적은 종래 감염성 질환 치료제 사용에 있어서 개인별 SNP에 따른 감염성 질환 치료제 부작용을 처방전에 확인할 수 없어 올바른 감염성 질환 치료제의 선정을 할 수 없었던 문제점을 보안 하기 위하여 상기 감염성 질환 치료제와 관련된 유전자인 NAT2의 SNP 지노타이핑을 정확하고 신속하게 진단할 수 있는 SNP 진단 분석용 시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 감염성 질환 치료제 관련 SNP를 높은 특이도 및 민감도로 정확하게 검색할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 qPCR 프라이머, NCI를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프로브, 상기 qPCR 프라이머, 상기 NCI 및 표지수단을 포함하는 조성물을 제공하여 상기 감염성 질환 치료제와 관련 되는 SNP의 유전자형을 분석 할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 NCI(Non Competitive Inhibitor)를 이용하여 상기 감염성 질환과 관련되는 SNP의 ancestral allele을 브로킹 하여 variant allele 유전자형을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 프로브, 상기 qPCR 프라이머, 상기 NCI 및 표지수단을 이용하여 상기 감염성 질환 치료제와 관련되는 SNP의 유전자형을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 특정 약물에 반응하는 감염성 질환 유전자 관련 SNP를 분석하는 기술에 관한 것으로, 상기 분석에 사용되는 프로브, 프라이머, NCI 및 표지수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 감염성 질환 관련 유전자와 SNP의 지노타이핑 시약을 포함하는 키트를 활용하여 특정 유전자들의 유전자형을 분석함으로써, 유전자형에 따른 질병 감수성, 약물 반응성 등을 용이하게 분석하는 방법을 제공한다.

상기 키트는 서열번호 21 내지 30의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브, 서열번호 1 내지 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 서열번호 31 내지 40의 염기서열을 갖는 NCI 및 상기 프라이머를 통해 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단을 포함한다.

상기 프라이머는 서열번호 1 내지 20의 염기서열을 갖는 NAT2 유전자 증폭용 프라이머 인것이 바람직하다.

상기 프라이머는 서열번호 1 내지 20의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 각 유전자에 특이적인 부위와 상보적 결합을 할 수 있다.

상기 DNA를 검출하기 위한 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표지수단이다.

상기 프로브의 농도는 본발명의 민감도와 관련되는 것으로서, 1pmol 이상이면 충분하다.

상기 키트는 약물 투여 전에 SNP 지노타이핑을 확인 할 수 있는 시약을 이용하는 것으로서, 환자에 적합한 감염성 질환 치료제의 투여 여부를 결정하는데 이용 될 수 있다.

또한, 본 발명은 (a)서열번호 1 내지 20에서 선택되는 프라이머를 이용하여 검체의 타겟 유전자를 단일(Single) qPCR 방법에 의해 증폭하는 단계; (b)Taq Man 올리고뉴클레오티드 프로브를 가수분해 시키는 단계; (c) 상기 Taq Man 올리고뉴클레오티드 프로브의 표지를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 SNP 유전자형의 분석방법을 제공한다.

상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군 으로 부터 선택되는 표지수단이다.

더욱, 상세하게는 상기 타겟 유전자에 결합되는 타겟 프로브는 서열번호 21 내지 30의 염기서열을 가지는 Taq Man 프로브이며, 3' 말단에 MGB 또는 BHQ가 결합되는 것이 바람직하다.

본 발명의 SNP 유전자형 분석방법은 10개 유형의 variant SNP 유전자를 삽입한 플라스미드벡터들을 양성 대조군 클론으로 이용하여 분석하는 단계 및 서열번호 31 내지 40의 염기서열을 가지는 NCI 올리고뉴클레오티드를 이용하여 SNP의 ancestral allele을 브로킹 하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 검체 획득 방법은 혈액 또는 Buccal swab (볼점막 세포)에서 선택되는 방법을 적용할 수 있다.

본 발명의 상기 SNP 유전자 분석 방법을 더욱더 자세히 설명하면 상기 분석방법은 다음과 같이 9단계를 포함하여 구성된다.

1. 표준 및 대조군 검체의 준비

본 발명자들은 국내 및 미국 등 다른 국가의 보고서를 참조하여 새로운 키트에 포함되어야 할 감염성 질환 치료제 관련 유전자의 SNP유형을 결정하였다. 그 결과, 상기관련 유전자는 NAT2로 밝혀졌으며, 이에 따라 본 발명자들은 상기 각 유전자에 해당되는 유전자형 총 10종의 SNP에 대해 이를 모두 분석할 수있는 qPCR 키트를 발명하였다. 이를 위하여 각 유전자의 SNP에 해당하는 표준 및 대조군의 검체는 Mini Gene을 합성하여 준비하였다.

2. DNA 분리

상기 단계 1에서 얻은 각종 검체로부터 적정 방법을 수립하여 DNA를 분리하였다.

3. 단일(Single) qPCR

상기 NAT2 유전자의 총 10개 SNP allele의 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)을 고안하고, 적정 qPCR 조건을 수립하였고, 상기 qPCR은 단일(Single PCR)로 수행하였으며, 각 유전자에 해당되는 프라이머의 농도 비율을 달리하여 각각의 조건을 수립하였다.

4. 클론 확보

상기 각 SNP를 포함하는 DNA 절편이 포함된 클론을 합성하였다. 상기 클론은 본 발명의 SNP 지노타이핑 키트의 반응 조건 수립시 표준 및 대조군의 검체로 사용하였다.

5. 프로브 디자인

한국인의 SNP 유전자형 분석에서 나타난 시퀀스 데이터베이스와 외국 관련 데이터베이스에 따라 감염성 질환 치료제에 관련된 10가지의 모든 유형의 variant SNP 프로브와 qPCR 과정에서 가수분해 반응으로 파악할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 디자인하였다.

6. NCI(Non competitive Inhibitor) 디자인

한국인의 SNP 유전자형 분석에서 나타난 시퀀스 데이터베이스와 외국 관련 데이터베이스에 따라 감염성 질환에 관련된 10가지의 모든 유형의 ancestral SNP NCI와 qPCR 과정에 variant SNP 프로브의 반응을 방해하지 않고 ancetral template에만 결합하는 올리고뉴클레오티드 NCI를 디자인하였다.

7. 96 well plate의 그리드 제작

상기 단계 5에서 디자인된 프로브를 분석하기 용이하도록 순서를 선정하기 위하여 96 well plate에 그리드를 고안하였다.

8. qPCR 장비에서 반응 및 분석 조건 수립

상기 단계 5와 단계 6에서 얻은 SNP 각 유형별 클론을 하나, 혹은 두 개를 조합한 것과 다양한 농도로 조성된 표준 검체를 주형으로 하여 SNP 유전자를 단일 PCR로 증폭하고 가수분해 반응을 수행한 후 realtime PCR 장비로 분석하여 적정조건을 수립하였다.

9. qPCR 키트를 이용한 임상 검체 분석

상기 단계 3에서 PCR을 수행한 후 시퀀싱 반응으로 SNP의 유무와 그 유형이 확인된 바 있는 임상 검체의 DNA를 대상으로 다시 단일 qPCR을 수행한 후 realtime PCR 장비로 분석하였다. 이로써, 본 발명의 SNP유전자형 분석 키트의 민감도와 특이도, 재현성을 분석하였으며, SNP의 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 키트의 최적조건을 다시 수립하였다.

또한, 본 발명의 프로브, 프라이머, 표지수단을 구비한 키트는 혈액 또는 Buccal swab (볼점막 세포)등의 검체로부터 DNA를 추출하는 시약인 commercial 제품(Manual 방식 또는 자동화방식)으로 추출된 DNA를 사용하며, 1)NAT2 1종 유전자의 qPCR 증폭관련 시약, 2) SNP 유전자 증폭시에 양성 대조군으로 사용할 플라스미드 DNA 클론, 3) SNP 유전자형 검사용 올리고뉴클레오티드 프로브 및 NCI를 포함하고, 상기 키트를 이용한 qPCR 반응에 필요한 반응액을 모두 포함하는 올인원('ALL IN ONE')으로 제공된다.

본 발명에 의하면 감염성 질환 치료제인 Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole의 작용과 관련된 유전자의 SNP를 모두 파악할 수 있고, SNP 유전자형의 진단 민감도와 특이도가 100%에 가깝도록 높이며, 신속하게 검사할 수 있고, Trimethoprim, isoniazid, sulfamethoxazole의 부작용을 예측하는 데에 매우 유용하며, 특히 본 발명의 SNP 유전자형 분석용 시약과 이를 이용한 키트에 의하면, 혈액 또는 Buccal swab(볼점막 세포) 등의 검체에서 감염성 질환 치료제와 관련된 유전자의 SNP 유무와 그 유전자형을 신속 정확하게 자동 분석하는데 매우 유용하다.

또한, 감염성 질환 치료제와 관련된 다수의 유전자를 검사할 수 있기에 한가지 유전자의 SNP를 분석하기 위해 사용되던 기존의 시퀀싱 방식을 대체 할 수 있고, 검사 비용과 인력 및 시간을 절감시키는 효과가 있으며, 감염성 질환 치료제 관련 정확한 유전자형을 분석하여 맞춤식 감염성 질환 치료제 선별에 적용코자 할 때도 유용하다.

따라서, 본 발명은 감염성 질환 치료제의 부작용을 미리 예측함으로써 고가의 감염성 질환치료제 사용을 감소시킬 수 있고, 국민 건강과 복지의 증진에 크게 기여하여, 경제적으로도 지대한 기여를 할 수 있어 의료 산업상 매우 유용한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 감염성 질환 치료제와 관련된 NAT2 유전자의 SNP 지노타이핑 키트의 well plate 그리드를 나타내는 모식도이다.
도 2은 본 발명의 NAT2 282C>T qPCR 결과이다.
도 3는 본 발명의 NAT2 803A>G qPCR 결과이다.
도 4는 본 발명의 NAT2 6131027G>A qPCR 결과이다.
도 5은 본 발명의 NAT2 481C>T qPCR 결과이다.
도 6은 본 발명의 NAT2 590G>A qPCR 결과이다.
도 7은 본 발명의 NAT2 857G>A qPCR 결과이다.
도 8는 본 발명의 NAT2 191G>A qPCR 결과이다.
도 9은 본 발명의 NAT2 341T>C qPCR 결과이다.
도 10은 본 발명의 NAT2 9246C>G qPCR 결과이다.
도 11는 본 발명의 NAT2 9796T>A qPCR 결과이다.

본 발명은 약물 투여 전에 환자의 혈액 또는 Buccal swab (볼점막 세포)에서 검체를 획득하여 감염성 질환 치료제와 관련된 유전자의 SNP 유무와 그 유전자형을 신속 정확하게 자동 분석하고, 맞춤식 감염성 질환 치료제 선별에 적용코자 할 때도 유용한 SNP 지노타이핑 시약, 이를 포함하는 키트 및 SNP 유전자형 분석 방법에 대한 것이다.

이하, 다음에서 설명되는 실시예는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공하는 것이다.

실시예 1 : 대조군 검체의 준비 및 DNA 추출

본 발명에서는 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagne, 69506)를 이용하여 DNA를 추출하였으나 본 기술을 수행하기 위해 commercial 제품을 사용하여 DNA를 추출하였고, 본 키트를 사용한 DNA 추출방법은 다음과 같다.

① Blood Cell 또는 볼점막 세포를 centrifuge tube에 모아 300 Xg에서 5분 동안 원심분리 하고, 200 ㎕의 PBS로 잘 풀어준다.

② Proteinas K를 20 ㎕ 첨가한다.

③ Buffer AL 200 ㎕를 첨가하고, vortexing한 다음 56℃에서 10분 동안 반응시킨다. Ethanol (96-100%) 200 ㎕를 첨가하고, vortexing하여 섞어준다.

④ 상기의 혼합물을 2 ml collection tube에 꽂은 DNeasy Mini spin column에 옮긴 후, 1분 동안 8,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).

⑤ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, Buffer AW1 500 ㎕를 첨가하여 1분 동안 8,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).

⑥ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, Buffer AW2 500 ㎕를 첨가하여 3분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).

⑦ DNeasy Mini spin column을 새로운 2 ml collection tube에 옮긴 후, 1분 동안 14,000 rpm으로 원심분리 한다 (collection tube에 걸러진 용액은 제거한다).

⑧ DNeasy Mini spin column을 깨끗한 1.5 ml 또는 2 ml microcentrifuge tube에 옮긴 후, Buffer AE 200 ㎕를 DNase membrane에 직접 떨어뜨린다. Room temperature에서 3분 동안 반응시킨 후, 8,000 rpm으로 원심분리 한다.

이렇게 추출된 DNA의 판정기준은 다음과 같다.

DNA나 RNA의 경우 260nm 파장에서 최고의 흡광도를 보이며, 자외선 흡수 복사량은 DNA양에 비례하여 260nm 파장에서 흡광도 값이 1.0이면 ds-DNA는 50 ug/ml의 농도를 나타낸다. 따라서 순수한 DNA의 가정하에서 260nm 파장에서 흡광도 값이 2.0이면 ds-DNA는 100 ug/ml의 농도를 나타낸다. 유사 파장에서 간섭이 가능 한 물질로는 단백질, phenol 등이 있는데 이들은 280nm 파장에서 최고의 흡광도를 보인다. 이와 같이 간섭물질이 있을 경우에 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)로 다른 물질과의 오염 여부를 확인할 수 있다. 간섭물질이 없는 순수한 DNA의 경우는 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)이 1.8이상의 값을 보이며 이 값이 2.0이라면 이는 100% 순수한 DNA (또는 RNA)라고 정의 내릴 수 있다. 만약, 단백질이나 phenol 등에 오염된 경우에는 260nm 파장과 280nm 파장의 흡광도 비율 (A260/A280)이 1.8이하의 값을 보인다. 이러한 경우에는 시료의 정량이 정확하지 않을 수도 있다. 파장에서 흡광도가 1인 경우에 ds-DNA는 50 ㎍/ml, ss-DNA는 33 ㎍/㎕, RNA는 40 ㎍/ml, oligomer는 25 ∼ 35 ㎍/ml의 농도를 나타낸다.

또한, 추출된 DNA의 purity는 A260/A280 ratio 는 1.8 ~ 2.1, A260/A230 ratio는 1.5 ~ 2 이상 범위 내에 측정되어야 한다.

실시예 2 : 표준 및 대조군 검체의 준비

유전자형 검사와 상기 유전자형 분석에 표준물질이될 관련 유전자 10종의 ancestral SNP와 10종이 variant SNP가 포함된 플라스미드 DNA 클론을 합성하여 준비하였다.

실시예 3 : 단일(Single) qPCR

감염성 질환 치료제 관련 NAT2 유전자 10종의 SNP를 검사하기 위해서 관련 유전자를 증폭시켰다.

이들 PCR 증폭을 위하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 먼저 선택 및 고안하였다. 먼저 감염성 질환 치료제 관련 유전자 별로 variation viewer(dbSNP에서의 data)와 1000 Genomes Browser (1000 Genome Project에서의 data) 에서의 SNP 데이터를 확인하였다. (http://www.sequenceontology.org). dbSNP에는 HapMap, 1000 Genome Project 데이터를 모두 포함하고 있지만, '인종별 차이를 나타내는 인종별 allele frequency'는 포함하고 있지 않는다. 하지만 1000 Genomes Browser 에서의 데이터는 SNP 에 대한 정보가 적은 대신, '인종별 차이를 나타내는 인종별 allele frequency' (AF: overall allele frequency, ASN AF: Asian allele frequency, AMR AF: American allele frequency, AFR AF: African allele frequency, EUR AF: Europan allele frequency)를 포함하고 있기 때문에 감염성 질환 치료제 관련 유전자의 프라이머를 선정하기 위해 존재한다고 보고된 유전자 SNP allele 별로 1000 Genomes Browser와 variation viewer를 확인하여 각 유전자의 allele의 SNP를 모두 비교 분석하였다.

본 발명에서 발명된 프라이머는 개인에 따라 특정 위치에 있을 수 있는 SNP 때문에 PCR 증폭이 일어나지 못하는 경우의 수를 최대한 낮출 수 있도록 디자인되었다.

본 발명이 프라이머는 다음과 같이 각각의 SNP를 포함하는 NAT2 유전자를 검출하는 프라이머(서열번호 1 내지 20)로 구성되어 있으며, NAT2 유전자의 PCR은 각각 82, 143, 120, 109, 135, 141, 113, 114, 130, 93bp 길이의 산물을 각각 증폭 한다. 각 유전자별 PCR 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 나타냈다.

하기 표에서 R는 A+G (Purines), Y는 C+T (Pyrimidine), K는 G+T (Keto), B는 C+G+T를 나타낸다.

PCR용 프라이머

No.	Gene Name	Primer Name	Sequence (5'->3')	Length (bp)	Amplicon (bp)	rs number
1	NAT2_282C>T	1041983F	CCACAATCGGTTTTCAGACCA	21	82	RS1041983
2	NAT2_282C>T	1041983R	KGAACCATGCCAGTGCTGTATT	22	82	RS1041983
3	NAT2-803A>G	1208F	GTGGGCTTCATCCTCACCTAT	21	143	RS1208
4	NAT2-803A>G	1208R	BTGGGCAYRAGATTTCTCC	19	143	RS1208
5	NAT2-6131027G>A	1495741F	GGGATGACAACGGGAACGT	19	120	RS1495741
6	NAT2-6131027G>A	1495741R	CRGCCCTRAAGCTACTGTGAA	21	120	RS1495741
7	NAT2-481C>T	1799929F	GCCTTGCATTTTCTGCTTGAC	21	109	RS1799929
8	NAT2-481C>T	1799929R	TGGCAGGAGATGAGAATTAAGAA	23	109	RS1799929
9	NAT2-590G>A	1799930F	GCCAAAGAAGAAACACCAAAAAAT	24	135	RS1799930
10	NAT2-590G>A	1799930R	TGCAAGGAACAAAATGATGTG	21	135	RS1799930
11	NAT2-857G>A	1799931F	ACTGAGGAAGAGGTTGAAGAAGTG	24	141	RS1799931
12	NAT2-857G>A	1799931R	GTTGGGTGATACATAYACAAGGG	23	141	RS1799931
13	NAT2-191G>A	1801279F	ATGGAGTTGGGCTTAGAGGCTA	22	113	RS1801279
14	NAT2-191G>A	1801279R	GAAAACCGATTGTGGTCAGAGC	22	113	RS1801279
15	NAT2-341T>C	1801280F	ATACAGCACTGGCATGGTTCA	21	114	RS1801280
16	NAT2-341T>C	1801280R	ATTAATTCTAGAGGCTGCCACATC	24	114	RS1801280
17	NAT2-9246C>G	4271002F	AAAGCAGAAACAAAGCCATATGA	23	130	RS7271002
18	NAT2-9246C>G	4271002R	CTGCCTCTTTTCATCTCTCATCCT	24	130	RS7271002
19	NAT2-9796T>A	4646244F	ACAGGCCAAAAGAAAGCCTTCC	22	90	RS4646244
20	NAT2-9796T>A	4646244R	TTGCCTTTAGCACCTACTGTTCCA	24	90	RS4646244

실시예 4 : 키트의 프로브 고안

감염성 질환 치료제 관련 유전자의 SNP allele 별로 variation viewer(dbSNP에서의 data)와 1000 Genomes Browser (1000 Genome Project에서의 data) 에서의 SNP 데이터를 확인하였다. (http://www.sequenceontology.org). dbSNP에는 HapMap, 1000 Genome Project 데이터를 모두 포함하고 있지만, '인종별 차이를 나타내는 인종별 allele frequency'는 포함하고 있지 않는다. 하지만 1000 Genomes Browser 에서의 데이터는 SNP에 대한 정보가 적은 대신, '인종별 차이를 나타내는 인종별 allele frequency (AF: overall allele frequency, ASN AF: Asian allele frequency, AMR AF: American allele frequency, AFR AF: African allele frequency, EUR AF: Europan allele frequency)를 포함하고 있기 때문에 감염성 질환 치료제 관련 유전자의 프라이머를 선정하기 위해 존재한다고 보고된 유전자 SNP allele 별로 1000 Genomes Browser와 variation viewer를 확인하여 각 유전자의 allele의 SNP를 모두 비교 분석하였다.

이는 올리고뉴클레오티드 프로브를 고안하기 위해, 감염성 질환 치료제 관련 유전자의 염기서열에 대한 방대한 데이터베이스(SNPs3D)를 분석한 후, 각 인종에 따른 SNP 유전형의 빈도 수와 유전형에 따른 각각의 유전자에 존재하는 변형(intra cariant)염기서열도 분석하였다. 이에 따라 감염성 질환 치료제 관련 유전자의 SNP 유형을 선정하고 이의 유전자형의 검색을 위한 올리고프로브를 고안 하였다.(표2)

본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 디자인은 본 발명의 목적에 따라 10개 유전자의 다양한 SNP와 특이적으로 결합할 수 있는 유전자형 특이적 프로브(genotype specific probe)로서 올리고뉴클레오티드를 설계하였고, 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 PyroMark Assay Design 이나 Primer3을 활용하여 유전자형 특이적 프로브를 디자인하였다.

이때, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 20±2 및 18±2bp의 올리고뉴클레오티드로 설정하여 10종의 유형 특이적 프로브를 1차 설계하였고, 상기 감염성 질환 관련 유전자형 진단 시약과 키트는 상기 DNA 프로브가 1개의 NAT2 유전자 총 10종의 NAT2 유전자를 검색표적으로 한다.

상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 하기 표2에 정리하였다.

하기 표에서 R는 A+G (Purines), Y는 C+T (Pyrimidine), K는 G+T (Keto)을 나타낸다.

올리고뉴클레오티드 프로브

No.	Gene Name	Probe Name	Sequence (5'->3')	rs number
21	NAT2_282T	rs1041983tP	FAM-AGGGTATTTTTATATCCC-MGB	rs1041983
22	NAT2_803G	rs1208gP	FAM-GAAGTGCTGGAAAAT-MGB	rs1208
23	NAT2_6131027A	rs1495741aP	FAM-GGATGATTTTCATAATAATATGG-MGB	rs1495741
24	NAT2_481T	rs1799929tP	FAM-GAATCTGGTACTTGGACCA-MGB	rs1799929
25	NAT2_590A	rs1799930aP	FAM-GCTTGAACCTCAAACRA-MGB	rs1799930
26	NAT2_857A	rs1799931aP	FAM-CCAAACCTGGTGATGAA-MGB	rs1799931
27	NAT2_191A	rs1801279aP	FAM-CATTGTAAGAAGAAACCAGG-MGB	rs1801279
28	NAT2_341C	rs1801280cP	FAM-GGTGACCACTGAYRG-MGB	RS1801280
29	NAT2_-9246C	rs4271002cP	FAM-TGTGGTATAAGTGTGACATG-MGB	rs4271002
30	NAT2_-9796A	rs4646244aP	FAM-CATGCTGCCACATGATC-MGB	rs4646244

또한 NCI 올리고뉴클레오티드 길이는 19±7 bp의 올리고뉴클레오티드로 설정하여 10종의 유형 특이적 NCI를 1차 설계하였고, 상기 감염성 질환 관련 유전자형 진단 관련 시약과 키트는 상기 DNA SNP가 1개의 NAT 유전자를 검색표적으로 한다. NCI(non competitive inhibitor)의 명칭과 서열번호 및 유형은 하기 표 3에 정리하였다. NCI는 보통의 올리고와 달리 3’말단의 -OH 기를 제거하여 Taq Polymerase에 의해 합성이 될 수 없도록 하여 PCR 증폭이 일어나지 않도록 변형시킨 올리고뉴클레오티드로 주로 올리고 합성단계에서 3'-phosphate 기, thiol 기 또는 amine 기 등을 결합시켜서 3’-OH를 제거한다. 이렇게 제작된 NCI는 검출하고자 하는 variant SNP에는 결합하지 않고 ancestral SNP 부위에만 결합함으로 프라이머에 의해 PCR amplicon이 증폭되더라도 본 발명의 타켓 프로브는 NAT 유전자의 variant SNP 부분에만 반응하여 시그널을 나타낸다.

NCI 서열정보

No.	Gene Name	NCI Name	Sequence (5'->3')	mer	rs number
31	NAT2_282C	5-1B	ATTTTTACATCCCTCC	16	rs1041983
32	NAT2_803A	5-2B	AGTGCTGAAAAATATATT	22	rs1208
33	NAT2_6131027G	5-3B	CATAATAATGTGGGCATTC	19	rs1495741
34	NAT2_481C	5-4B	TCTGGTACCTGGACCA	16	rs1799929
35	NAT2_590G	5-5B	TGAACCTCGAACAATTG	17	rs1799930
36	NAT2_857G	5-6B	TGGTGATGGATCCCTT	16	rs1799931
37	NAT2_191G	5-7B	GAAACCGGGGTGG	13	rs1801279
38	NAT2_341T	5-8B	TGACCATTGACGG	13	RS1801280
39	NAT2_-9246G	5-9B	GGTATAAGTGTCACATGTATC	21	rs4271002
40	NAT2_-9796T	5-10B	ACATGAACTCGGGACTC	17	rs4646244

실시예 5 : 96 well plate의 그리드 제작

상기 실시예 4에서 디자인된 프로브에 따라 그리드(Grid)를 고안하였다. 96 well plate의 그리드 제작 과정은 구체적으로 다음과 같다.

감염성 질환 치료제 관련 유전자의 SNP 유전자형 분석을 위한 각 well의 프로브 그리드는 A1, B1, C1, D1, E1, F1, G1 그리고 H1 well은 NAT2 282C>T; A2, B2, C2, D2, E2, F2, G2 그리고 H2 well은 NAT2 803A>G; A3, B3, C3, D3, E3, F3, G3 그리고 H3 well은 NAT2 6131027G>A; A4, B4, C4, D4, E4, F4, G4 그리고 H4 well은 NAT2 481C>T; A5, B5, C5, D5, E5, F5, G5 그리고 H5 well은 NAT2 590G>A; A6, B6, C6, D6, E6, F6, G6 그리고 H6 well은 NAT2 857G>A; A7, B7, C7, D7, E7, F7, G7 그리고 H7 well은 NAT2 191G>A; A8, B8, C8, D8, E8, F8, G8 그리고 H8 well은 NAT2 341T>C; A9, B9, C9, D9, E9, F9, G9 그리고 H9 well은 NAT2 9246C>G; A10, B10, C10, D10, E10, F10, G10 그리고 H10 well은 NAT2 9796T>A 유전자의 올리고 프로브가 각각 FAM과 HEX(또는 VIC)로 라벨된 것을 위치하도록 하였다.

본 발명에서는 하나의 96 well plate에서 감염성 질환 치료제 유전자형에 따른 검색된 유전자형이 고위험형인지, 중정도 위험형인지 아니면 저위험형인지를 바로 쉽게 알 수 있게 그룹화하여 그리드(grid)를 작성하였다. 그 순서는 도 1과 같다.

실시예 6 : 96 well plate에서 qPCR 반응 및 분석 조건 수립

상기 실시예 3에서 수립된 감염성 질환 관련 유전자의 각 유형별 클론을 주형으로 하여 감염성 질환 치료제 관련 유전자를 qPCR로 증폭한 후, 상기 실시예 5에 따라 제작된 96 well plate의 그리드와 같이 순서대로 분석하여 적정 조건을 수립하였다.

감염성 질환 치료제 관련 유전자의 유전자형을 확인하기 위한 qPCR의 조성과 조건은 하기 표 4과 같이 수행하였다.

단, 프로브 조합 중 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 Variant allele의 경우에는 표지수단으로 FAM 형광을 사용하며, 상기 올리고뉴클레오티드 3' 말단의 표지수단으로 MGB 또는 BHQ1을 사용하였다.

상기 표지수단의 표지물질은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로 부터 하나 이상 선택되어 진다.

실시예 7: SNP 지노타이핑 키트를 이용하여 임상 검체에서 분석

상기 실시예 3에서 PCR 후 시퀀싱 반응으로 SNP의 유형이 확인된 바 있는 임상 검체의 DNA를 대상으로 상기 실시예 3에서 기술된 방법대로 다시 qPCR을 수행하여 분석하였다. 이로써, 본 SNP 지노타이핑 키트의 민감도와 특이도 및 재현성을 분석하였으며, SNP 유전자형의 진단을 위한 본 발명의 SNP 지노타이핑 키트의 최적조건을 다시 점검 하였다. 그 결과를 도2 내지 도 11에 나타내었다.　

<110> KOREA(National institute of food and drug safety evaluation) <120> Reagent for SNP-genotyping of a gene related with infectious diseases drug-metabolizing enzyme, the kit comprising the same, and the method for the SNP-genotyping <130> 15-FR-018 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1041983F <400> 1 ccacaatcgg ttttcagacc a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1041983R <400> 2 kgaaccatgc cagtgctgta tt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1208F <400> 3 gtgggcttca tcctcaccta t 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1208R <400> 4 btgggcayra gatttctcc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1495741F <400> 5 gggatgacaa cgggaacgt 19 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1495741R <400> 6 crgccctraa gctactgtga a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799929F <400> 7 gccttgcatt ttctgcttga c 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799929R <400> 8 tggcaggaga tgagaattaa gaa 23 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799930F <400> 9 gccaaagaag aaacaccaaa aaat 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799930R <400> 10 tgcaaggaac aaaatgatgt g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799931F <400> 11 actgaggaag aggttgaaga agtg 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1799931R <400> 12 gttgggtgat acatayacaa ggg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1801279F <400> 13 atggagttgg gcttagaggc ta 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1801279R <400> 14 gaaaaccgat tgtggtcaga gc 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1801280F <400> 15 atacagcact ggcatggttc a 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1801280R <400> 16 attaattcta gaggctgcca catc 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4271002F <400> 17 aaagcagaaa caaagccata tga 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4271002R <400> 18 ctgcctcttt tcatctctca tcct 24 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4646244F <400> 19 acaggccaaa agaaagcctt cc 22 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4646244R <400> 20 ttgcctttag cacctactgt tcca 24 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1041983tP <400> 21 agggtatttt tatatccc 18 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1208gP <400> 22 gaagtgctgg aaaat 15 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1495741aP <400> 23 ggatgatttt cataataata tgg 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799929tP <400> 24 gaatctggta cttggacca 19 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799930aP <400> 25 gcttgaacct caaacra 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1799931aP <400> 26 ccaaacctgg tgatgaa 17 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1801279aP <400> 27 cattgtaaga agaaaccagg 20 <210> 28 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs1801280cP <400> 28 ggtgaccact gayrg 15 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4271002cP <400> 29 tgtggtataa gtgtgacatg 20 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rs4646244aP <400> 30 catgctgcca catgatc 17 <210> 31 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-1B <400> 31 atttttacat ccctcc 16 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-2B <400> 32 agtgctgaaa aatatatt 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-3B <400> 33 cataataatg tgggcattc 19 <210> 34 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-4B <400> 34 tctggtacct ggacca 16 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-5B <400> 35 tgaacctcga acaattg 17 <210> 36 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-6B <400> 36 tggtgatgga tccctt 16 <210> 37 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-7B <400> 37 gaaaccgggg tgg 13 <210> 38 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-8B <400> 38 tgaccattga cgg 13 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-9B <400> 39 ggtataagtg tcacatgtat c 21 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5-10B <400> 40 acatgaactc gggactc 17

Claims

서열번호 21 내지 30의 각각의 염기서열로 각각 표시되는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 세트, 서열번호 1 내지 20의 각각의 염기서열로 각각 표시되는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머에 의해 증폭된 DNA를 검출하기 위한 표지수단 및 서열번호 31 내지 40의 각각의 염기서열로 각각 표시되는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 NCI (non competitive inhibitor) 올리고뉴클레오티드 세트로 이루어지는 감염성 질환 치료제 트리메소프림(Trimethoprim)과 관련되는 유전자 NAT2의 SNP 지노타이핑용 조성물
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제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 구성하는 각각의 올리고뉴클레오티드 프로브의 농도는 1pmol 이상인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑용 조성물
제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 20의 각각의 염기서열로 각각 표시되는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 20의 각각의 염기서열로 표시되는 NAT2 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑용 조성물
제 1항에 있어서, 상기 표지수단은 CY3, CY5, CY5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665m Calfluor Orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, HEX, VIC, BHQ, BHQ1, MGB, ZEN 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지수단인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑용 조성물
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제 1항에 있어서, 상기 서열번호 31 내지 40의 각각의 염기서열로 각각 표시되는 NCI 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 포스페이트(phospate)기, 티올(thiol)기 또는 아민(amine)기 중에서 선택된 어느 하나의 작용기인 것을 특징으로 하는 SNP 지노타이핑용 조성물
제 8항에 따른 조성물을 포함하는 SNP 지노타이핑용 분석키트
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