KR101710412B1

KR101710412B1 - Ycg063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101710412B1
Application number: KR1020150130312A
Authority: KR
Inventors: 최일환; 박세광
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2017-02-27

Abstract

본 발명은 YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 그람-음성균의 리포폴리사카라이드(LPS)에 노출된 망막색소상피세포에서는 안구내염과 같은 염증성 안구질환의 원인이되는 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현이 증가되지만, YCG063을 유효성분으로 함유하는 조성물을 LPS가 노출된 망막색소상피세포에 처리한 결과, LPS에 의해 분비가 유도되는 염증성 매개체의 발현이 억제되는 것을 확인됨에 따라, 본 발명의 YCG063을 유효성분으로 함유하는 조성물은 세균 감염에 따른 염증성 안구질환 치료용 약학조성물로 제공될 수 있다.

Description

YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory ocular diseases comprising YCG063}

본 발명은 YCG063을 유효성분으로 함유하여 세균 감염에 의한 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

안구 내 염증인 안구내염(Endophthalmitis)은 흔하지 않지만 부분적이거나 심각한 실명의 잠재적인 원인이 될 수 있다. 이러한 안구내염은 안구 내 수술의 합병증에 의해 발생되거나 비수술적 외상 또는 전신성 감염이 원인이 될 수 있다.

세균성 안구내염은 안구 내 구멍의 감염에 의한 것으로, 일반적으로 눈 속으로 미생물체가 침입하여 발생되며, 이러한 세균 감염 동안 주로 망막에 존재하는 시각세포의 손상을 피할 수 없다.

세균성 병원균 중 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ; PA)은 그람-음성 감균(gram-negative rod)으로 주로 병원성 감염의 원인이며, 각막염(keratitis) 및 안구내염(Endophthalmitis)과 같은 안구 감염을 발생시키는데, 그람-음성 세균의 바깥막 구성 성분인 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide; LPS)는 면역세포의 활성을 유도하여 염증성 매개체들을 분비시킨다.

또한, 그람-음성 세균과 같은 감염물질에 의해 눈이 자극될 때, 망막색소상피(retinal pigment epithelium; RPE) 세포는 염증성 매개체를 분비되는데, RPE는 신경외배엽으로부터 발생되는 색소성 세포의 단분자층으로 망막과 맥락막 사이에 존재하며, 망막에 영양을 공급하는 혈관을 포함하고 있다.

RPE의 주요 기능은 광수용체 부분의 식세포작용, 빛의 자극을 시각으로 변환하는 기능 및 노화관련 황반변성 및 당뇨망막병증과 같은 망막 질환과 병리학적으로 관련되며, 안구 면역 체계에 있어서 가장 중요한 역할을 한다.

염증은 병원체, 손상된 세포 또는 자극물에 대한 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응으로, 해로운 자극을 제거하고 치유과정을 개시하여 유기체를 보호하는 반응이나, 조직의 점진적인 파괴는 유기체의 생존을 위태롭게도 만든다. 이러한 염증을 유도하는 염증성 매개체들은 감염 부위에서 세포 침윤을 조절하는 중요한 역할을 하며, 증가된 세포 침윤은 심각한 망막 손상을 초래한다.

글루코코르티코이드는 이러한 염증을 비롯한 다양한 염증성 상태에 가장 효과적인 임상 치료제 중 하나이나, 스테로이성 약물로 환자의 전반적인 건강을 위협하는 부작용있으며, 다른 화합물보다 안압을 증가시키는 경향이 있어 백내장을 진행시킬 수 있다.

따라서, 세균 감염에 의한 염증성 망막 손상을 보다 안전하고 효과적으로 예방하거나 치료하기 위한 개선된 제약 화합물 또는 조성물에 대한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2004-0007494호(2004.01.24 공개)

본 발명은 세균 감염에 의한 염증성 안구질환을 예방하거나 치료하기 위해, YCG063을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 염증성 안구질환은 세균 감염에 의한 염증성 안구질환일 수 있으며, 상기 세균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ; PA), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 그람-음성균 군에서 선택될 수 있다.

상기 염증성 안구질환은 결막염, 안구내염, 각막염, 각결막염, 포도막염, 안검염, 공막염 및 홍채염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 YCG063은 TLR2(toll-like receptors 2)에 의해 유도되는 AKT 및 NF-κB 활성을 조절하여 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에 따르면, 그람-음성균의 리포폴리사카라이드(LPS)에 노출된 망막색소상피세포에서는 안구내염과 같은 염증성 안구질환의 원인이되는 염증성 매개체 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현이 증가되지만, LPS에 노출된 망막색소상피세포에 YCG063을 유효성분으로 함유하는 조성물을 처리한 결과, LPS에 의해 분비가 유도되는 염증성 매개체의 발현이 억제되는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 YCG063을 유효성분으로 함유하는 조성물은 세균 감염에 따른 염증성 안구질환 치료용 약학조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 화합물 YCG063의 화학 구조이다.
도 2는 ARPE-19 세포 생존능을 확인한 결과로, 도 2A는 ARPE-19 세포에서 0.5, 1, 5, 10, 20 및 30 μg/mL PA-LPS를 24시간 동안 처리하고 세포생존도를 확인한 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 결과이며, 도 2B는 세포에 0, 5, 10 및 50 μM YCG063를 24시간 동안 처리하고 세포생존도를 확인한 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 결과로, 대조군 세포를 이용하여 세포생존도를 백분율로 나타낸 결과이다(**p<0.01).
도 3은 PA-LPS 자극된 ARPE-19 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현에 있어 YCG063의 영향을 확인한 결과로, 5, 10 및 50 μM YCG063을 2시간 동안 처리한 후 24시간 동안 LPS 자극시킨 ARPE-19 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현 수준을 ELISA로 확인한 결과이다 **p < 0.01, compared with LPS-stimulated values.
도 4는 PA-LPS 자극된 ARPE-19 세포의 TLR 발현을 확인한 결과로, 10 μg/mL PA-LPS로 자극되거나 PA-LPS로 자극되지 않은 ARPE-19 세포에 TLR2 및 TLR4 특이적 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행한 결과이다.
도 5는 PA-LPS로 유도되는 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현에 있어서 TLR2의 영향을 확인한 결과로, ARPE-19 세포에 TLR4 차단 항체를 1시간 동안 처리한 후, 10 μg/mL PA-LPS로 24시간 동안 자극시키고 배양 배지에 분비된 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1를 ELISA로 확인한 결과이다.
도 6은 PA-LPS로 유도되는 ERK-1/2, p38 MAP 키나아제 및 AKT의 인산화를 확인한 결과로, ARPE-19 세포에 0, 10 및 50 μM YCG063를 2시간 동안 처리하고 10 μg/mL PA-LPS로 30분간 세포를 자극시킨 후 세포 추출물을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 ERK-1/2, p38 및 AKT의 인산화 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 10 또는 50 μM YCG063을 2시간 동안 ARPE-19세포에 처리한 후 LPS로 1시간 동안 자극시키고 ARPE-19 세포의 핵 내로 NF-κB의 이동 및 결합에 있어 YCG063의 효과를 확인한 결과로, 도 7A는 핵 추출물에서 NF-κB P65의 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 도 7B는 핵 단백질 추출물에서 NF-κB의 DNA 결합 활성을 확인한 EMSA(electrophoretic mobility shift assay) 분석결과이며, 도 7C는 LY294002 30M을 2시간 동안 처리한 후 PA-LPS로 30분간 자극시킨 ARPE-19 세포의 핵 추출물에서 NF-κB를 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 8은 PA-LPS로 자극된 ARPE-19 세포 내 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현에 있어서 NF-B 억제제의 영향을 확인한 결과로, 1 및 5 μM BAY 11-7082 및 파테놀리드(parthenolide)를 2시간 동안 사전처리하고 LPS로 24시간 동안 자극시킨 ARPE-19세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 단백질 수준을 확인한 ELISA 분석 결과이다 **p < 0.01, compared with LPS-stimulated values.
도 9는 PA-LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인의 생성에 관련된 활성산소종(ROS) 의존성 매커니즘을 확인한 결과로, 도 9A는 5시간 동안 10 μg/mL PA-LPS로 세포를 자극시키고 형광 플레이트 리더기를 이용하여 세포내 ROS 수준을 확인한 결과이며, 도 9B는 10 μg/mL PA-LPS로 24시간 동안 세포를 자극시키고 유세포 분석을 수행하여 미토콘드리아 ROS를 확인한 결과이다.

본 발명은 YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 염증성 안구질환은 세균 감염에 의한 염증성 안구질환일 수 있으며, 상기 세균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ; PA), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 그람-음성균 군에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 그람-음성균인 녹농균(PA)의 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide; LPS)에 의해 유도되는 염증성 안구질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 YCG063은 TLR2(toll-like receptors 2)에 의해 유도되는 AKT 및 NF-κB 활성을 조절하여 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제하여 세균 감염에 의한 염증성 안구질환을 예방하거나 치료할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 3과 같이 PA-LPS로 자극된 ARPE-19 세포에서 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1, 및 ICAM-1의 수준이 상당히 증가된 것이 확인되었으나, YCG063가 처리된 경우 LPS에 의해 유도되는 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현을 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 YCG063의 염증성 매개체 발현 억제와 관련된 신호 기작을 확인한 도 6과 같이 PA-LPS로 자극시킨 ARPE-19 세포에서 AKT 및 ERK의 인산화가 증가되었으나, YCG063은 PA-LPS에 의해 유도되는 AKT의 인산화를 억제시켰다. 또한, 도 7A와 같이 핵 내 LPS에 의해 유도되는 NF-κB p65의 발현이 YCG063에 의해 현저하게 억제되었다.

상기 결과들로부터 YCG063은 PA-LPS로 자극된 ARPE-19 세포에서 TLR2(toll-like receptors 2)에 의해 유도되는 AKT 및 NF-κB 활성을 조절하여 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제하는 것이 확인됨에 따라, 상기 YCG063은 PA-LPS에 의한 염증성 매개체 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제하여 세균 감염에 의한 염증성 안구질환을 예방하거나 치료할 수 있다.

상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, YCG063을 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 YCG063의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참고예 1> 실험 물질

Reagents. P. aeruginosa LPS를 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, YCG063를 Millipore (Billerica, MA)에서 구입하였으며, LY294002를 Calbiochem (La Jolla, CA)에서 구입하였다. p65, toll-like receptor (TLR) 2 (clone T2.5) 및 TLR4 (clone HTA125)에 대한 항체를 eBioscience (San Diego, CA)에서 구입하였고, 인산화(p)-ERK 1/2 및 p-p38 항체를 Cell Signaling (Beverly, MA)에서 AKT, p-AKT, ERK 및 p38에 대한 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.

2′,7′-디클로로플루오레세인 디아세테이트(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate; DCFDA)를 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. MitoSOX 및 MitoPY1은 Tocris Bioseience (Bristol, UK)에서 구입하였으며, BAY 11-7082 및 파테놀리드(parthenolide)를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.

니트로셀룰로스 막 및 강화 화학 발광체(enhanced chemiluminescence; ECL) 키트를 Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)에서 구입하였다.

피코에리트린(Phycoerythrin; PE)이 결합된 항-사람 TLR2 (clone TL2.1) 및 TLR4 (clone HTA125) 단일클론 항체 또는 동위원소 대조군을 BD Biosciences (San Jose, CA)에서 얻었다.

< 실험예 1> 세포배양

American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 얻은 인간 망막색소상피세포인 ARPE-19 세포를 10% 태아소혈청과 페니실린 100 IU/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml 혼합물(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)이 포함된 DMEM/F12 배지를 이용하여 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다.

그 후, ARPE-19 세포에 트립신처리하고 10 cm 접시에 분주하여 부착될 때까지 하룻밤 동안 배양하였다.

< 실험예 2> 웨스턴 블롯팅

PBS로 ARPE-19 세포를 3번 세척하고 용해버퍼(Mammalian Cell-PE LB, G-Biosciences, St. Louis, MO)로 세포를 용해시켰다.

동량의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 미니겔에 분리시키고 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 적절한 1차 항체로 인큐베이션한 후, 실온에서 호래디쉬 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체로 1시간 동안 인큐베이트하였다.

그 후, 트리스-버퍼 살린 트윈-20(TBST)으로 3번 반복 세척하고 면역활성 밴드를 ECL detection system (Pierce)으로 시각화하였다.

< 실험예 3> 유세포분석 (Flow cytometric analysis)

PE가 결합된 항-사람 TLR2 mAb(clone TL2.1) 및 PE가 결합된 항-사람 TLR4 mAb (clone HTA125)로 세포를 염색하고 FACSort 및 Cell QuestPro software (BD science, San Jose, CA)로 확인하였다.

< 실시예 1> YCG063의 세포독성 확인

YCG063(DMSO, 5, 10 및 50 μM)가 처리된 ARPE-19 세포의 생존능을 CCK-8 분석을 이용하여 확인하였다.

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)을 이용하여 제조사(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)의 설명서대로 ARPE-19 세포의 생존능을 확인하였다.

먼저, 96 웰 배양 플레이트에 한 웰 당 1×10⁴세포로 3번 반복 분주하고 하룻밤 동안 부착시킨 후, 5, 10 또는 50 μM YCG063가 포함된 DMEM/F12 배지 100 μl로 교체하여 24시간 동안 배양하였다.

그 후, CCK-8 시약 10 μl를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 추가배양한 후 microplate reader(Model EL800, BIO-TEK, Winooski, VT)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.

그 결과, 도 2B와 같이 YCG063를 50 μM까지 ARPE-19 세포에 처리하여도 유의한 세포독성이 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 이후 실험에서는 YCG063의 농도를 5에서 50 μM의 농도범위에서 선택하여 수행하였다.

< 실시예 2> PA- LPS에 의해 유도된 염증성 매개체 발현에 대한 YCG063의 효과 확인

도 3을 참고하면, ARPE-19 세포가 PA-LPS로 자극된 이후, IL-6, IL-8, MCP-1, 및 ICAM-1의 수준이 상당히 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이에 따라, ARPE-19 세포에서 IL-6, IL-8, MCP-1, 및 ICAM-1의 단백질 발현에 대한 YCG063의 영향을 확인하기 위해, 5, 10 및 50 μM YCG063을 ARPE-19 세포에 사전 처리하고 LPS 10 μg/mL로 세포를 자극시켰다.

그 결과, 도 3과 같이 YCG063가 처리된 세포에서는 LPS에 의해 유도되는 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 단백질의 생산이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 YCG063은 LPS에 의해 유도되는 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다.

< 실시예 3> LPS 자극된 ARPE -19 세포에서 톨 유사 수용체(toll-like receptors)의 발현 확인

톨 유사 수용체(toll-like receptors; TLR) 패밀리는 선천성면역반응과 관련있으며, 전염성 미생물에 발현된 특이적인 병원체관련 분자패턴(pathogen-associated molecular patterns; PAMP)을 인식하여 세포 내 연쇄적인 신호반응을 발생시켜 DNA 결합 단백질의 활성을 유도함으로써 염증성 유전자의 전사를 촉진시킨다. 그러므로, TLR은 침입한 병원체에 대한 방어 기작의 시작으로 염증, 면역 세포의 조절, 생존 및 증식에 매우 중요한 역할을 한다.

따라서, 본 발명자들은 PA-LPS로 자극된 염증 반응 신호와 톨 유사 수용체(toll-like receptors)의 관련성을 확인하였다.

먼저, ARPE-19 세포에 LPS 10 μg/mL를 12시간 동안 처리하고, 상기 세포를 PE가 결합된 TLR2 및 TLR4로 염색한 후 유세포 분석을 통하여 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 4B와 같이 자극되지 않은 세포에서는 TLR2가 발현되지 않은 반면, LPS로 자극된 세포에서는 단백질 발현이 증가되었다. 반면, LPS로 자극되는 동안 TLR4의 발현 증가는 확인되지 않았다.

상기 결과를 확인하기 위해, TLR2 차단 항체가 PA-LPS로 자극된 염증을 억제하는지 세포 배양 배지 내 사이토카인 수준을 ELISA 분석을 통하여 확인하였다.

LPS 자극 전 다양한 농도의 YCG063을 세포에 2시간 동안 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 배지 상층액을 수집하고 염증매개체 수준을 확인하였다.

BioLegend (San Diego, CA)에서 구입한 ELISA 키트를 사용하여 IL-6, IL-8 및 MCP-1 수준을 확인하였으며, R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입한 ELISA 키트로 ICAM-1 수준을 확인하였다.

흡광도는 microplate reader (Model EL800, BIO-TEK, Winooski, VT)를 사용하여 450 nm에서 확인하였다.

그 결과, 도 5를 참고하면, TLR2 차단 항체가 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1을 포함한 LPS로 유도된 염증매개체 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 TLR2가 PA-LPS로 유도되는 염증 반응과 관련있는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> LPS로 유도된 MAPK 및 AKT 신호기전 활성화에 대한 YCG063 효과 확인

앞서 전술한 바와 같이 PA-LPS로 유도되는 염증매개체에 대한 YCG063의 발현 억제효과에 대한 매거니즘을 확인하기 위해, LPS/TLR 신호의 중요한 하위경로이며, 염증성인자들을 조절하는 MAPKs 및 AKT 신호기전의 활성을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 6과 같이 PA-LPS로 자극시킨 ARPE-19 세포에서 AKT 및 ERK의 인산화가 증가되었으나, p38의 인산화는 나타나지 않았다.

반면, 10 또는 50 μM YCG063을 세포에 2시간 동안 사전처리한 후 10 μg/mL LPS를 30분간 처리한 세포에서는 LPS에 의해 유도되는 AKT의 인산화가 약화되었으나, ERK의 인산화에는 어떠한 영향도 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 YCG063은 PA-LPS에 의해 유도되는 AKT의 인산화를 억제하여 염증성인자들의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

< 실시예 5> PA- LPS로 자극된 세포에서 NF - κB 활성에 대한 YCG063의 효과 확인

많은 염증성 사이토카인, 케모카인 및 접합분자의 생성은 PA-LPS 자극과 함께 전사인자 NF-κB에 의해 조절된다. 따라서, YCG063가 PA-LPS에 의해 유도되는 NF-κB p65의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.

그 결과, 도 7A와 같이 YCG063는 핵 내 LPS에 의해 유도되는 NF-κB p65의 발현을 현저하게 억제시켰다.

상기 결과를 확인하기 위하여 EMSA를 이용하여 NF-κB의 DNA 결합 활성에 대한 YCG063의 영향을 추가적으로 확인하였다.

먼저, NE-PER 6 nuclear extraction reagent (Pierce)를 이용하여 핵산을 추출하여 준비하였다. 겔 이동분석(gel retardation assay)을 위한 프로브로 면역글로불린 κ-chain 결합 부위(κB, 5’-GATCTCAGAGGGGACTTTCCGAGAGA-3’)가 포함된 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 비방사성 방법으로 프로브의 3’말단에 바이오틴을 결합시켰다.

핵산 추출 단백질 5 μg, 버퍼(10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.05% Nonidet P-40, 및 2.5% 12 글리세롤), 폴리(dI-dC) 50 ng 및 바이오틴 표시된 DNA 20 fM이 포함된 결합 반응물을 20 μl 최종 부피로하여 실온에서 20분간 인큐베이트하였다.

또한, 상기 반응 혼합물에 표시되지 않은 P65 NF-κB를 100배 초과 되도록 첨가하여 경쟁반응을 수행하고, 상기 혼합물을 0.5×트리스 버퍼(Tris-borate buffer)를 사용하여 5% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 분리시키고 나일론 막으로 옮겼다.

LightShift chemiluminescent electrophoretic mobility shift assay kit(EMSA) (Pierce)를 이용하여 바이오틴이 표시된 DNA를 검출하였다.

그 결과, 도 7B와 같이 LPS 처리에 의해 NF-κB의 DNA 결합 활성이 유의하게 증가된 반면, YCG063가 함께 처리된 실험군에서는 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 DNA 결합 활성이 현저하게 감소하였다.

NF-κB의 활성이 AKT 의존적인 것으로 보고됨에 따라, AKT 억제제인 LY294002를 이용하여 NF-κB의 활성 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 7C와 같이 NF-κB p65의 상향조절된 발현이 AKT 억제제인 LY294002에 의해 유의하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 확인하기 위해, NF-κB 억제제인 BAY 11-7082 및 파테놀라이드가 PA-LPS로 자극된 ARPE-19 cells 세포에서 염증매개체의 발현을 조절할 수 있는지 확인하였다.

그 결과, 도 8과 같이 BAY 11-7082 및 파테놀라이드는 PA-LPS로 자극된 ARPE-19 cells 세포에서 염증매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1의 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 YCG063은 AKT 및 NF-κB 활성을 조절하여 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

< 실시예 6> PA- LPS로 자극된 세포에서 ROS 발생 확인

LPS에 의해 유도되는 염증에서 염증매개체의 생산은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 발생과 관련있기 때문에 DCFDA 분석을 통하여 PA-LPS에 의해 ROS 발생이 유도되는지 확인하였다.

ARPE-19 세포(1×10⁴ cells/well)를 96 웰 플레이트에 분주하고 5% CO₂, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 μg/mL PA-LPS를 세포에 처리하고 5시간 동안 추가 배양하였다.

세포 내 ROS 분석을 위해, 세포를 10 μM DCFDA와 함께 30분간 배양하고 동량의 4% 포름알데하이드로 세포를 고정하여 즉시 측정하였다.

세포 내 ROS 수준은 형광 플레이트 리더기(SpetraMax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 492 nm 여기파장과 515 nm 방출파장으로 확인하였다.

미토콘드리아 ROS 분석을 위해, 세포(1 mL, 1×10⁵ cells/mL)를 5 μM Mito SOX 및 Mito PY1와 30분간 인큐베이트한 후, PBS로 세포를 세척하고 즉시 FACSort 및 Cell QuestPro software (BD science, San Jose, CA)를 사용하여 미토콘드리아 ROS 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 9A와 같이 10 μg/mL LPS를 처리한 세포에서 ROS의 세포내 수준이 LPS 처리되지 않은 세포와 비교하여 증가되지 않았다.

또한, 유세포분석 결과인 도 9B에서도 10 μg/mL LPS가 처리된 세포의 미토콘드리아 ROS가 처리되지 않은 세포보다 증가하지 않았다.

상기 결과로부터 PA-LPS에 의한 염증반응은 ROS 의존성 매커니즘에 의한 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 YCG063을 유효성분으로 함유하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
[화학식 1]
청구항 1에 있어서, 상기 염증성 안구질환은 세균 감염에 의한 염증성 안구질환인 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 세균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa ; PA), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae) 및 대장균(Escherichia coli)으로 이루어진 그람-음성균 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 염증성 안구질환은 결막염, 안구내염, 각막염, 각결막염, 포도막염, 안검염, 공막염 및 홍채염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 YCG063은 TLR2(toll-like receptors 2)에 의해 유도되는 AKT 및 NF-κB 활성을 조절하여 염증성 매개체인 IL-6, IL-8, MCP-1 및 ICAM-1 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여, YCG063을 0.01 내지 10 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 염증성 안구질환 예방 또는 치료용 약학조성물.