KR101706017B1 - Hepatoprotective composition comprising extracts of fruits of stauntonia hexaphylla for preventing alcoholic liver injury - Google Patents
Hepatoprotective composition comprising extracts of fruits of stauntonia hexaphylla for preventing alcoholic liver injury Download PDFInfo
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Abstract
우리나라 천연자원인 멀꿀 열매 열수 추출물을 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 고부가가치 기능성 약학조성물에 관한 것으로 멀꿀 열매 조추출물 또는 비극성가용추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 인체에 부작용이 없으면서 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능이 뛰어나기 때문에 천연물인 멀꿀 열매 조추출물을 유효성분으로 사용함으로써 장기간 복용하여도 부작용 없이 안전한 알콜성 간 손상에 대한 간 보호에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a high-value-added functional pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage which can be safely used without toxicity and side effects by using a mulberry fruit hot water extract of Korea as a natural resource. The pharmaceutical composition of the present invention is free from adverse effects on the human body and has excellent liver protection against alcoholic liver damage. Therefore, even when used for long time, it is safe to use alcoholic liver damage Can be used for liver protection.
Description
본 발명은 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 천연원료인 멀꿀 열매 추출물을 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition having liver protection against alcoholic liver damage. More particularly, the present invention relates to a composition for protecting liver against alcoholic liver damage which can be safely used without toxicity and side effects by using mulberry fruit extract as a natural raw material. ≪ / RTI >
멀꿀(Stauntonia hexaphylla)은 쌍떡잎식물 미나리아재비목 으름덩굴과의 상록 덩굴 식물으로, 멀꿀나무라고도 한다. 상기 멀꿀은 암수 한그루로 원줄기는 약 5 m 정도 뻗어가고, 잎은 어긋나며 5개 내지 7개의 작은 잎으로 된 손바닥모양 겹잎이다. 작은 잎은 두껍고 달걀모양 또는 타원형이며, 가장자리가 밋밋하다. Mullen (Stauntonia hexaphylla) is an evergreen vine plant with crossbred plants, buttercups, and the like. It is also called a mulberry tree. The mullen is male and female, and the main stem extends about 5 m. The leaves are alternate phyllotaxis of 5 to 7 small leaves. Leaves are thick, ovate or oval, with flat edges.
잎자루는 길이가 6 cm 내지 8 cm 정도이고, 작은 잎자루는 약 3 cm 정도이다. 꽃은 5월에 피고, 황백색이며 총상 꽃차례에 달린다. 암꽃의 작은 꽃가지는 가을에 적갈색으로 되고, 많은 피목이 있어 거칠다. 열매는 장과로 달걀모양 또는 타원형이고 길이가 5 cm 내지 10 cm이며, 10월에 적갈색으로 익고 과육은 으름보다 맛이 좋다. 종자는 달걀모양의 타원형으로 흑색이다. 상기 멀꿀은 주로 한국, 일본, 타이완또는 중국 등지에 분포한다. 우리나라에서는 주로 전라남도, 경상남도 및 충청남도 등의 남쪽지방의 계곡이나 숲 속에서 잘 생육한다.The petiole is about 6 to 8 cm long, and the petiole is about 3 cm long. Flowers bloom in May, yellowish white, and run on gun inflorescence. Small flower blooms of female flower become reddish brown in autumn, and there are many shrubs and are rough. The fruit is ovate or oval with a length of 5 cm to 10 cm in length, ripe in reddish brown in October and tastes better than flesh in flesh. Seeds are oval oval and black. The mullen is mainly distributed in Korea, Japan, Taiwan or China. In Korea, it grows well in valleys and forests in southern provinces such as Jeollanam-do, Gyeongsangnam-do and Chungcheongnam-do.
한편, 현대인들에게 음주는 필요 불가결한 것으로 과다한 음주는 일시적으로 두근거림, 두통, 갈증, 멀미, 위장장애, 설사 등의 숙취현상(hangover)을 유발하며, 만성적으로는 지방간, 간경화 등의 질환을 일으킬 수 있다. 숙취현상 중 두통은 두뇌 혈관의 확장 작용으로 인한 것이며, 갈증과 탈수현상은 에탄올이 뇌하수체에서 분비되는 항이뇨호르몬인 바소프레신의 분비를 억제함으로써 생기는 에탄올의 이뇨작용 때문이다. 또한, 위장장애 등의 소화기관 이상은 위산분비의 증가 때문으로, 가장 큰 원인은 간세포에 축적된 에탄올(ethanol)이나 아세트알데히드(acetaldehyde)의 독성 작용에 의한 것이다.Drinking is indispensable for modern people. Excessive drinking temporarily causes hangover such as throbbing, headache, thirst, nausea, gastrointestinal disorder, diarrhea, etc., and chronic diseases such as fatty liver and cirrhosis Can cause. Headaches during hangover are due to the expansion of brain blood vessels. Thirst and dehydration are caused by the diuretic effect of ethanol, which is produced by the suppression of the secretion of vasopressin, an antidiuretic hormone secreted by ethanol in the pituitary gland. In addition, digestive organ abnormalities such as gastrointestinal disorders are caused by an increase in gastric acid secretion, and the main cause is toxicity of ethanol or acetaldehyde accumulated in hepatocytes.
이와 같은 에탄올의 분해기작 뿐 아니라 에탄올의 독성학적 연구에 대해서도 다양하게 이루어졌는데, 에탄올의 독성은 신경학적 측면에서 관찰될 뿐만 아니라 유전학적으로도 영향을 끼친다는 보고가 있다(J.Caballeria, et al., Life Sci.,41: 1021-1727, 1986). 최근 들어, 에탄올의 독성을 경감시키거나 독성의 발현을 저해할 수 있는 많은 물질에 대한 연구와 실험이 진행되고 있으며, 그 결과 천연식품이나 한약재료로부터 추출한 성분을 함유한 다양한 건강보조식품이 이와 관련되어 개발되고 있다(김정한 등, 한국농화학회지, 38(6): 549-553, 1995).In addition to the mechanism of ethanol degradation, toxicological studies of ethanol have been done in various ways. It has been reported that the toxicity of ethanol is not only observed neurologically but also genetically influenced (J. Caballeria, et al Life Sci., 41: 1021-1727, 1986). In recent years, many researches and experiments have been conducted on a number of substances that can reduce the toxicity of ethanol or inhibit the expression of toxins, and as a result, a variety of health supplements containing ingredients extracted from natural or herbal ingredients (Kim JJ, et al., Journal of the Korean Society of Agricultural Chemistry, 38 (6): 549-553, 1995).
소량의 알코올 섭취는 신체의 피로와 정신적인 긴장감을 해소하는 데 도움을 주고 소화액의 분비를 자극하여 식욕을 증가시키며, 최근에는 적당한 알코올의 섭취가 동맥경화 같은 심혈관계 질환을 예방할 수 있다는 연구들이 보고 되고 있다. 그러나, 과량의 알코올이나 만성적인 알코올의 섭취는 소화관 점막을 손상시키며 이로 인한 영양소 흡수장애와 영양결핍이 문제시되며 모든 장기와 조직에 대해서 유해한 손상을 미친다. 특히 알코올 대사에 중추적 역할을 담당하는 간세포의 장애를 초래하고, 알코올성 간염, 지방간 및 간경변의 원인이 되고 있다.A small amount of alcohol intake helps to relieve body fatigue and mental tension, stimulates the secretion of digestive juices to increase appetite, and recent studies have shown that proper alcohol intake can prevent cardiovascular diseases such as arteriosclerosis . However, excessive intake of alcohol or chronic alcohol impairs the gastrointestinal mucosa, causing problems with nutrient uptake and nutritional deficiencies, and harmful damage to all organs and tissues. Especially, it causes hepatocellular disorder which plays a pivotal role in alcohol metabolism, and causes alcoholic hepatitis, fatty liver and cirrhosis.
만성적인 알코올 섭취시 알코올 대사작용이 촉진되어 산소 소비량이 증가함에 따라 간조직의 부분적인 저산소증과 괴사를 초래하거나 알코올 대사시 생성되는 유리 라디칼에 의해 지질과산화물의 반응이 촉진되어 간 조직을 손상시킬 수도 있다. 이러한 경우, 간조직의 중성지질 및 콜레스테롤 함량이 크게 증가하고, 활성산소가 증가하여 간 세포내 microsome의 약물대사 효소를 유도 증진하여 일상 복용하는 약물들이 중간 대사생성물인 free radical들을 과량 생성하여 독성을 유발하기도 한다. 항산화효소의 활성도가 낮아지면 제거되지 못한 자유라디칼들은 불포화 이중결합을 파괴하고 aldehyde, dialdehyde, short-chain hydrocarbon을 생성하는 연쇄반응을 개시하여 각 조직의 지질과산화를 촉진시킨다. 인체는 정상적인 생리 상태에서는 free radical의 생성과 항산화 방어체계(antioxidant defense system)의 활성이 균형을 이루고 있으나 체내에서 free radical이 다량 생성되거나 혹은 항산화 방어체계의 기능이 감소되면 이 균형이 깨어진 상태인 산화적 스트레스가 증가한다.Chronic alcohol consumption promotes alcohol metabolism and increases oxygen consumption, leading to partial hypoxia and necrosis of liver tissue, or to accelerate the reaction of lipid peroxides by free radicals produced during alcohol metabolism, which may damage liver tissue have. In this case, the neutral lipid and cholesterol content of the liver tissue are greatly increased, and the active oxygen is increased to induce the drug metabolizing enzyme of the microsome in the liver cell, so that the medicines which are taken on a daily basis generate an excessive amount of free radicals, . Free radicals, which are not removed when the antioxidant enzyme activity is lowered, initiate a chain reaction that destroys unsaturated double bonds and generates aldehyde, dialdehyde, short-chain hydrocarbons, and promotes lipid peroxidation of each tissue. In normal physiological state, the free radical is balanced with the activity of antioxidant defense system, but when the free radical is generated in the body or the function of antioxidant defense system is decreased, Enemy stress increases.
알코올을 과다섭취하면 알코올 또는 알코올 산화 과정에서 생성되는 중간 대사산물에 의해 각종 대사성 질환 및 알코올성 간 질환이 발생할 수 있다. 알코올은 alcohol dehydrogenase, CYP450, catalase에 의해 분해되어 acetaldehyde로 대사되며 과량의 알코올 대사에 의해 생성된 acetaldehyde는 acetaldehyde-protein 부산물과 지질과산화물을 생성시켜 간 독성에 관여한다. Overdose of alcohol can lead to various metabolic diseases and alcoholic liver diseases due to the intermediate metabolites produced during the alcohol or alcohol oxidation process. Alcohol is degraded by alcohol dehydrogenase, CYP450, catalase and metabolized to acetaldehyde. Acetaldehyde produced by excessive alcohol metabolism is involved in liver toxicity by producing acetaldehyde-protein by-products and lipid peroxides.
알코올에 의한 자유기의 생성은, 알코올의 대사 및 아세트알데히드의 대사 과정중에 이루어지거나, 장기간 존재하는 hydroxyethyl에 의해 자유기가 생성되는 등 기전이 매우 다양하고 그 결과로서 지질 과산화가 일어난다(Pratt 등 1990). 지질과산화의 최종 산물로서 측정되는 MDA는 생체 조직에서의 과산화적 손상의 생화학적인 지표로서 널리 사용되고 있다. The production of free radicals by alcohol occurs in the course of alcohol metabolism and acetaldehyde metabolism, or in the formation of free radicals by long-standing hydroxyethyl, resulting in lipid peroxidation (Pratt et al. 1990) . MDA, measured as the end product of lipid peroxidation, is widely used as a biochemical indicator of peroxidative damage in living tissue.
따라서 만성적인 알코올의 섭취에 의해 증가된 체내의 산화적 스트레스를 감소시키고 알코올의 독성으로부터 조직을 보호하고 예방하여 알코올로 인한 질병이나 유해 작용을 해소시키기 위한 연구가 중요시되고 있는 실정이다. 본 발명에서는 우리나라의 전통적인 식물자원을 활용할 목적으로 천연원료인 멀꿀 열매를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 멀꿀 열매 추출물을 함유하는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
Therefore, it is important to reduce the oxidative stress in the body, which is increased by chronic alcohol consumption, and to prevent or prevent the diseases and harmful effects caused by alcohol by protecting and preventing the tissue from the toxicity of alcohol. The present invention provides a pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage containing mulberry fruit extract which can be safely used without toxicity and side effects by using mulberry fruit as a natural raw material in order to utilize traditional plant resources of Korea I want to.
우리나라 천연자원인 멀꿀열매 추출물을 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 고부가가치 기능성 약학조성물을 제공하고자 한다.
It is intended to provide a high value-added functional pharmaceutical composition having a liver protecting function against alcoholic liver damage which can be safely used without toxicity and side effects by using mulberry fruit extract as a natural resource of Korea.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 멀꿀열매 조추출물 또는 비극성가용추출물을 유효성분으로 포함하는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학조성물을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage comprising mulberry fruit extract or nonpolar soluble extract as an active ingredient.
멀꿀열매 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 추출용매로 사용하여 추출한 것 일수 있으며, 추출용매를 사용하여 추출한 멀꿀열매 잎 조추출물에 비극성가용 용매로서 헥산, 클로로포름, 디클로메탄 및 에틸아세테이트이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 분획용매로 사용하여 분획한 것일 수 있다. The mullen fruit crude extract may be obtained by extracting at least one selected from the group consisting of water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol or a mixed solvent thereof as an extracting solvent, The extract may be fractionated by using any one selected from the group consisting of hexane, chloroform, dichloromethane and ethyl acetate as a nonpolar solvent as a fraction solvent.
또한, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 식품으로서 음료가 제공될 수 있고, 추출물은 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 전체 조성물의 0.01 내지 100중량%로 포함될 수 있다.
Furthermore, a drink may be provided as a food having liver protection against alcoholic liver damage including the above extract as an active ingredient, and the extract may contain 0.01 to 100 wt% of the total composition having hepatic protection against alcoholic liver damage %. ≪ / RTI >
본 발명의 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학적 조성물은 인체에 부작용이 없으면서 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능이 뛰어나기 때문에 천연물인 멀꿀열매 조추출물을 유효성분으로 사용함으로써 장기간 복용하여도 부작용 없이 안전한 알콜성 간 손상에 대한 간 보호에 유용하게 사용될 수 있다.
Since the pharmaceutical composition having the liver protecting function against alcoholic liver damage of the present invention is excellent in the liver protecting function against alcoholic liver damage while having no adverse effect on the human body, May be useful for liver protection against safe alcoholic liver damage without side effects.
도 1은 멀꿀 열매를 나타낸 사진이다.
도 2는 멀꿀 열매 열수 추출물의 추출과 분획 모식도를 나타낸다.
도 3는 멀꿀 열매 열수 추출물에 대한 세포 생존율 측정결과를 나타낸다.
도 4는 멀꿀열매 열수 추출물에 대한 급성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 MDA 생성량 측정결과를 나타낸다.
도 5는 멀꿀열매 열수 추출물(200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 MDA 생성량 측정결과를 나타낸다.
도 6는 멀꿀열매 열수 추출물(10,50,100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 TBAR(MDA) 생성량 측정결과를 나타낸다.
도 7는 멀꿀열매 열수 추출물(10,50,100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 GOT activity 측정결과를 나타낸다.
도 8는 멀꿀열매 열수 추출물(10,50,100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 GPT activity 측정결과를 나타낸다.
도 9는 멀꿀 열매 열수 추출물(10,50,100,200mg/kg)에 대한 간 조직 내 ALDH activity 측정결과를 나타낸다.Fig. 1 is a photograph showing mulberry fruit.
Fig. 2 shows the extraction and fractionation diagram of the mullen fruit hot water extract.
Fig. 3 shows the results of cell viability measurement for mullen fruit hot water extract.
FIG. 4 shows the results of measurement of MDA production in liver tissue of acute alcoholic liver damaged mice for alum fruit extract.
FIG. 5 shows the results of measurement of MDA production in liver tissue of chronic alcoholic liver injured mice against mullen fruit hot water extract (200 mg / kg).
6 shows the results of measurement of TBAR (MDA) production in hepatic tissue of chronic alcoholic liver injured mice against mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg).
FIG. 7 shows GOT activity measurement results of chronic alcoholic liver injured mice on mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg).
Figure 8 shows the results of measuring GPT activity in chronic alcoholic liver injured mice for mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg).
Figure 9 shows the results of measurement of ALDH activity in liver tissue for mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, 200 mg / kg).
본 발명에서는 멀꿀열매 잎 조추출물 또는 비극성가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 알콜성 간 손상에 대한 간 보호에 유효하게 작용하는 멀꿀열매 잎 추출물 함유 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학조성물이 제공된다.In the present invention, a pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage containing mulberry fruit leaf extract which effectively acts on liver protection against alcoholic liver damage containing mulberry fruit leaf extract or nonpolar soluble extract as an active ingredient / RTI >
본 발명자들에 의해 출원되어 공개된 국내 특허출원번호 제10-2011-0082498호에서는 멀꿀 열매 열수 추출물 0.001중량% 내지 99중량%를 포함하는 간 보호용 조성물을 개시하고 있다. 상기 발명은 멀꿀 열매 열수추출물을 사용한 부분은 본 발명과 동일하나 상기 발명에서 사용된 사염화탄소(CCl4) 또는 아세트아미노펜(APAP)과 같은 간 독성 약물로 유발된 간 손상에 대한 간 보호 조성물을 목적으로 하는 점으로 볼 때, 본원발명과 같이 알코올로 유발되는 간 손상에 대한 간 보호 조성물과는 그 용도와 작용 메카니즘에서 차이를 갖는다. Korean Patent Application No. 10-2011-0082498 filed by the present inventors discloses a composition for protecting the liver comprising 0.001 wt% to 99 wt% of mullen fruit hot water extract. The present invention relates to a composition for preventing liver damage caused by hepatotoxic drugs such as carbon tetrachloride (CCl4) or acetaminophen (APAP) used in the present invention, From the point of view, the use and action mechanism of the liver protective composition against liver injury induced by alcohol as in the present invention are different from each other.
구체적으로, 사염화탄소(CCl4) 또는 아세트아미노펜(APAP)완 같은 간 독성 약물로 유발된 간 손상에 대한 간 보호의 경우, 지질과산화 억제, 혈청 중 GOT. GPT 수치 증가 억제, 사이토크롬 P450의 mRNA 발현량 억제, Nrf-2, HO-1 발현 증가여부를 유효성 평가항목으로 설정한다. Specifically, in the case of liver protection against liver damage induced by hepatotoxic drugs such as carbon tetrachloride (CCl4) or acetaminophen (APAP), inhibition of lipid peroxidation, GOT in serum. The inhibition of mtDNA expression by cytochrome P450, and the increase of expression of Nrf-2 and HO-1 are set as the evaluation items.
반면에 숙취해소의 경우, 지질과산화 억제, 혈청 중 GOT. GPT 수치 증가 억제를 포함한 알코올대사의 주요 바이오 마커인 혈중알코올 농도 감소, 알코올탈수소효소 활성(ADH activity), 알데하이드탈수소효소 활성(ALDH activity) 증가여부를 유효성 평가항목로 설정하여 실험한다. On the other hand, in the case of hangover resolution, inhibition of lipid peroxidation, GOT in serum. We investigated whether the decrease in blood alcohol concentration, the activity of alcohol dehydrogenase (ADH activity), and the increase of aldehyde dehydrogenase activity (ALDH activity), which are major biomarkers of alcohol metabolism including inhibition of GPT increase,
본 발명에서와 같이, 에탄올로 유발된 급성 간 손상, 만성 간 손상에 대한 간 보호의 경우, 알코올 대사에 의한 간 조직에서의 지질과산화를 가장 중요한 유효성평가항목으로 설정하여 결과를 도출하는 점, 에탄올 투여에 의한 만성 간 조직 손상에 따른 GOT, GPT의 변화, 에탄올 투여에 의해 생성되는 간 조직 내 독성물질인 알데하이드(aldehyde)를 분해하는 효소인 ALDH 효소 활성을 유효성평가항목으로 설정하여 결과를 도출하는 점으로부터 APAP, CCl4로 유발된 간 손상에서의 지질과산화 억제와는 또 다른 메카니즘을 갖는다는 점에서 차이가 있음을 알 수 있다. 이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. As in the present invention, in the case of liver protection against acute liver injury and chronic liver injury induced by ethanol, lipid peroxidation in liver tissues by alcohol metabolism is set as the most important evaluation item for efficacy, The effect of ALDH enzyme activity, which is an enzyme that degrades aldehyde, which is a toxic substance in liver tissue produced by ethanol administration, by GOT, GPT, And that the inhibition of lipid peroxidation in liver injury induced by APAP and CCl4 has another mechanism. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
1. 멀꿀 열매 열수 추출물 및 분획물 제조1. Production of mullen fruit hot water extract and fractions
도 2는 멀꿀열매 추출물 및 유기용매에 의한 분획물을 얻는 과정을 나타낸다. 멀꿀 열매 2.1kg을 증류수로 수세한 다음, 증류수 40L를 가하고, 전기약탕기로 100℃에서 3시간 동안 가열, 추출하였다. 추출된 용액은 400 메쉬 여과포로 여과한 다음 감압회전농축기로 농축하였다. 여과 후 남은 잔사에 다시 동량의 증류수를 사용하여 동일 과정으로 2번 더 추출, 여과 및 감압 농축한다. 농축된 열수추출물을 동결건조기 (Freeze dryer)에서 동결건조 하였다. 멀꿀열매 열수추출물 148g(7.05%)을 얻었다.
Figure 2 shows the process of obtaining mulberry fruit extract and fractions by organic solvent. 2.1 kg of mulberry fruit was washed with distilled water, 40 L of distilled water was added, and the mixture was heated and extracted at 100 캜 for 3 hours with an electric chemical booster. The extracted solution was filtered with 400 mesh filter cloth and then concentrated with a rotary evaporator under reduced pressure. After the filtration, the same amount of distilled water is again used for the remaining residue, which is further extracted twice, filtered and concentrated under reduced pressure. The concentrated hot water extract was lyophilized in a freeze dryer. 148g (7.05%) of mullen fruit hot water extract was obtained.
2. 멀꿀 열매 열수추출물의 극성용매, 비극성용매 가용 분획물의 제조2. Preparation of polar and non-polar solvent-soluble fractions of mullen fruit hot water extract
도 2에 도시된 바와 같이 제조된 멀꿀열매 열수추출물을 유기 용매를 이용하여 분획물을 제조하였다. 멀꿀열매의 극성용매, 비극성용매 가용 분획물의 제조는 멀꿀열매 열수 추출물 40g을 증류수 1L에 완전히 용해시킨 후 분획 여두 깔대기에 넣고 헥산(Hexane) 1L를 첨가하여 water층과 hexane 층을 분리하였고 이와 같은 공정을 3번 반복하였다. The extracts of mullen fruit hot water extract prepared as shown in FIG. 2 were fractionated using an organic solvent. The production of polar and nonpolar solvent soluble fractions of mulberry fruit Forty grams of mullen fruit hot water extract was completely dissolved in 1 L of distilled water, and the water layer and the hexane layer were separated by adding 1 L of hexane (Hexane) to the fractional funnel. This process was repeated three times.
동일한 과정을 통해 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)을 순차적으로 가하여 각 분획물을 얻었고, 얻어진 각각의 분획물을 감압여과 장치로 여과하여 농축한 후 동결건조하여 용매를 완전히 제거한 뒤 본 실험에 사용하였다.
Chloroform, ethyl acetate and butanol were sequentially added through the same procedure to obtain fractions. Each of the fractions thus obtained was filtered with a vacuum filtration apparatus and concentrated. The extract was lyophilized to remove the solvent completely This test was used for this experiment.
2.1. 헥산 가용성 분획 분리2.1. Hexane-soluble fraction separation
멀꿀 열매 열수 추출물 40g을 lL의 증류수에 완전히 용해시킨 후에 분획 여두 깔대기에 넣고 헥산 1L를 첨가하여 헥산 불용성층(수층)과 헥산가용성층을 분리하였다. 다시 헥산 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 헥산 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
Forty grams of mullen fruit hot water extract was completely dissolved in lL of distilled water. Then, the mixture was placed in a separating funnel and 1 liter of hexane was added to separate the hexane insoluble layer (water layer) and the hexane soluble layer. Again, the hexane insoluble fraction and the soluble fraction were collected by repeating the same process three times for the hexane insoluble layer (water layer).
2.2.클로로포름 가용성 분획분리2.2. Isolation of Soluble Fraction from Chloroform
헥산불용성 분획(수층)에 클로로포름 5L를 가하여 섞은 후에 클로로포름가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 클로로포름 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 클로로포름 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
The hexane insoluble fraction (aqueous layer) was mixed with 5 L of chloroform, and then the chloroform-soluble fraction and the insoluble fraction were separated. The chloroform-insoluble fraction and the soluble fraction were collected by repeating the same process three times for the chloroform insoluble layer (water layer).
2.3.에틸아세테이트 가용성 분획분리2.3. Ethyl acetate soluble fractionation
클로로포름 불용성 분획(수층)에 에틸아세테이트 5L를 가하여 섞은 후에 에틸아세테이트 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 에틸아세테이트 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 에틸아세테이트 불용성 분획 및 가용성 분획를 수집하였다.
After adding 5 L of ethyl acetate to the chloroform insoluble fraction (aqueous layer), the ethyl acetate soluble fraction and the insoluble fraction were separated. The ethyl acetate insoluble layer (water layer) was subjected to the same process three times to collect the ethyl acetate insoluble fraction and the soluble fraction Respectively.
2.4. 부탄올 가용성 분획분리2.4. Butanol soluble fraction fractionation
에틸아세테이트 불용선 분획(수층)에 부탄올 5L를 가하여 섞은 후에 부탄올 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 부탄올 불용성층을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 부탄올 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
The butanol insoluble fraction and the insoluble fraction were separated by adding 5 L of butanol to the ethyl acetate insoluble fraction (water layer), and the butanol insoluble fraction was repeated three times to collect the butanol insoluble fraction and the soluble fraction.
2.5 멀꿀열매 열수추출물 및 분획물 수득2.5 Acquisition of hot water extract and fractions of mulberry fruit
멀꿀열매 열수추출물 40g에서 헥산 가용성 분획, 클로로포름 가용성 분획, 에틸아세테이트 가용성 분획 및 부탄올 가용성 분획을 감압 농축한 후에 동결건조하여 헥산분획 0.1g, 클로로포름 분획 0.6 g, 에틸아세테이트 분획 2g, 부탄올 분획 15g을 얻어 시료로 사용하였다.
The hexane-soluble fraction, the chloroform-soluble fraction, the ethyl acetate-soluble fraction and the butanol-soluble fraction were concentrated under reduced pressure and then lyophilized to obtain 0.1 g of a hexane fraction, 0.6 g of a chloroform fraction, 2 g of an ethyl acetate fraction and 15 g of a butanol fraction in 40 g of mulberry fruit hot water extract And used as a sample.
3. 멀꿀 열매 열수추출물의 세포 독성시험 (by MTT assay)3. Cytotoxicity test of mullen fruit hot water extract (by MTT assay)
상기 실시예 1에서 제조된 멀꿀 열매 열수 추출물의 세포 독성을 측정하기 위하여, 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 ATCC에서 구입하여 이용하였다. 상기 세포의 배양(Cell culture)에 사용된 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium/ Nutrient Mixture Ham's F12), FBS(fetal bovine serum), L-글루타민(L-glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신은 Gibco/BRL(USA)에서 구입하였다.To measure cytotoxicity of the mullen fruit hot water extract prepared in Example 1, mouse macrophage RAW264.7 cells were purchased from ATCC. (Dulbecco's modified Eagle's medium / Nutrient Mixture Ham's F12), fetal bovine serum (FBS), L-glutamine and penicillin-streptomycin used in the cell culture were purchased from Gibco / BRL (USA).
상기 RAW264.7 세포는 DMEM/F12 배지에 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였고, 37℃ 습윤한 CO₂배양기(5% CO₂/95% air)에서 배양하였다. 상기 세포가 배양접시의 약 80%가 차게 배양시킨 후, PBS(pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 세척하고, 0.25% 트립신 및 2.56 mmol/L EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다. The RAW264.7 cells were cultured in a DMEM / F12 medium supplemented with 10% FBS, 1% penicillin streptomycin and 1% L-glutamine, and incubated at 37 ° C in a humidified CO2 incubator (5% CO2 / 95% air ). After the cells were cultured to about 80% of the culture dish, the cells were washed with PBS (pH 7.4), washed, and subcultured by treatment with 0.25% trypsin and 2.56 mmol / L EDTA. The medium was changed every 2 days.
상기 배양한 세포는, 50,000 cells/well의 밀도로 48 well-plate에 분주하여, 24시간 더 배양하였다. 상기 24시간 경과 후, 아무런 처리를 하지 않고 LPS만 처리한 대조군과 LPS와 상기 실시예 1의 멀꿀 열매 추출물을 세포 생존에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 DMSO를 사용하여 다양한 농도로 제조된 멀꿀 열매 추출물을 처리한 실험군으로 나누어, 24시간 동안 더 배양시킨 후, 배양액을 제거하고 MTT 분석(MTT assay) 방법으로 살아있는 세포의 수를 측정하였다.The cultured cells were divided into 48 wells at a density of 50,000 cells / well and further cultured for 24 hours. After 24 hours, the control group treated with LPS alone without any treatment, LPS and the mullen fruit extract of Example 1 were cultured in DMSO, which was confirmed to have no significant effect on cell survival, After the culture was further cultured for 24 hours, the culture solution was removed and the number of living cells was measured by MTT assay.
상기 MTT 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 세포배양 배지를 제거한 후 MTT를 1 ㎎/㎖로 포함하는 DMEM/F12 배지를 웰 당 1 ㎖씩 처리하고, 37℃ 습윤한 CO₂배양기에서 4시간 더 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후, tetrazolium bromide salt를 제거하고, DMSO 200 ㎕를 분주하여 각 웰에 생성된 포르마잔 크리스탈을 용해시키고, 마이크로 플레이트리더(BIO-RAD)에서 540 ㎚파장으로 흡광도를 측정하여 세포생존율을 확인하였다. 상기 멀꿀 열매 추출물로 처리한 결과는 상기 실험을 동일하게 3회 수행하여, 측정된 값의 평균 값으로 도 3에 나타내었다.The MTT analysis was performed as follows. First, after removing the cell culture medium, DMEM / F12 medium containing 1 mg / ml of MTT was treated with 1 ml per well, followed by further incubation for 4 hours in a 37 ° C humidified CO2 incubator. After the medium was removed, the tetrazolium bromide salt was removed and 200 μl of DMSO was added to dissolve the formazan crystals formed in each well. The absorbance was measured at 540 nm wavelength in a microplate reader (BIO-RAD) Respectively. The results of the treatment with the mulberry fruit extract are shown in FIG. 3 as an average value of the measured values by performing the same experiment three times in the same manner.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 멀꿀 열매 열수 추출물을 다양한 농도, 구체적으로 10 ㎍/㎖ 내지 200 ㎍/㎖까지 농도별로 처리하고, 24시간을 처리한 경우에도, 아무런 시료를 처리하지 않고 LPS만 처리한 대조예와 비교한 결과, 상기 실시예 1에서 제조된 멀꿀 열매 열수 추출물을 다양한 농도로 처리한 경우 모두 세포의 증식에 별다른 영향을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 결과로부터 멀꿀 열매 열수 추출물은 200 ㎍/㎖까지는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
As shown in FIG. 3, even when the mullen fruit hot water extract prepared in Example 1 was treated at various concentrations, specifically, at concentrations ranging from 10 μg / ml to 200 μg / ml for 24 hours, no sample As a result, it was confirmed that the treatment of the mullen fruit hot water extract prepared in Example 1 at various concentrations showed no significant effect on cell proliferation. Therefore, it was confirmed from the above results that the extract of Mulberry fruit was not cytotoxic up to 200 μg / ml.
4. 실험 동물, 사육 4. Experimental animals, breeding
멀꿀열매 열수 추출물의 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능 측정을 위한 실험동물로서 체중 22∼24g, 4주령 된 수컷 생쥐(ICR mouse, male)를 샘타코 사에서 구입하여 정상군(normal), 대조군(control), 시료 투여군으로 나누고 각 군당 5마리씩 배치하였다. 실험동물들은 온도 22ㅁ2℃, 상대습도 65ㅁ5%로, 명암 12시간 주기의 환경에서 7일 동안 사육하여 실험실 환경에 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 고형사료(삼양사료) 및 물은 충분히 공급하였다.
A male rat (ICR mouse, male) weighing 22-24 g and 4 weeks of age was purchased from Samutoco as an experimental animal for the liver protection against alcoholic liver damage of mullen fruit hot water extract, (control), and 5 mice per group. The animals were housed in a 12 hour cycle of contrast medium at a temperature of 22 ° C and 2 ° C and a relative humidity of 65 ° C and 5% for 7 days. Solid feed (Samyang feed) and water were supplied sufficiently.
4.1 알코올 유발 급성 및 만성 간 손상 유도 동물 모델 실험 및 시료 처리4.1 Alcohol induced acute and chronic liver injury induced animal model experiment and sample treatment
전체 실험조는 급성 및 만성 실험 2개조로 나누었으며, 환경적응 7일 후 4주 동안 1회/1일 주기로 멀꿀 열매 열수추출물(10, 50, 100, and 200mg/kg) 시료를 투여하고 30분 후 5g/kg EtOH(50% with saline)농도의 유도제를 투여하는 만성 실험조와 환경적응 7일 후 1주일 동안 1회/1일 주기로 멀꿀열매열수추출물 (50, 100 and 200mg/kg) 시료를 투여하고 30분 후 5g/kg EtOH(50% with saline)농도의 유도제를 투여하는 급성실험조로 나누어 진행하였다.The whole experimental group was divided into two groups of acute and chronic experiment. After 10 days, 50, 100, and 200 mg / kg samples of mullen fruit extract were administered at 1 / (50, 100 and 200 mg / kg) samples were administered to the chronic experimental group in which 5 g / kg EtOH (50% with saline) After 30 minutes, the mice were divided into an acute experimental group in which 5 g / kg EtOH (50% with saline) of inducer was administered.
각각의 실험 조 마지막 날 시료 및 유도제 최종투여 후 절식 및 절수를 실시하고 이로부터 18시간 경과 후 에테르 마취하에 개복하여 복부 대동맥에서 채혈한 후 1,500rpm 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 간 조직을 적출하여 -70℃에 보관 후 실험에 사용하였다.
After the final administration of each sample and the inducer, the animals were fasted and water-saved. After 18 hours, the animals were lavaged under ether anesthesia and blood was collected from the abdominal aorta and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes to separate the serum. Liver tissues were harvested and stored at -70 ° C before use in the experiment.
5. 멀꿀열매 열수 추출물의 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능실험결과 5. Experimental results of liver protection against alcoholic liver damage of mullen fruit hot water extract
5.1 멀꿀열매 열수추출물의 알콜성 급성 간 손상 유발 생쥐의 간 조직에서 지질과산화 억제 효능 측정5.1 Evaluation of lipid peroxidation inhibitory effect in hepatic tissue of alcoholic acute liver injury-induced mice of mulberry fruit hot water extract
도 4는 멀꿀 열매 열수 추출물(50, 100 and 200mg/kg)에 대한 급성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 MDA 생성량 측정결과를 나타낸다. 앞서 실시한 알코올성 급성 간손상 유발 생쥐의 간 조직 0.2g을 1.5ml EP tube에 옮긴다. PBS buffer 1ml을 homogenizer glass tube에 넣고 간 조직을 균질화 시킨다. Figure 4 shows the results of measurement of MDA production in hepatic tissue of acute alcoholic liver injured mice to mullen fruit hot water extract (50, 100 and 200 mg / kg). Transfer 0.2 g of liver tissue from the alcoholic acute hepatic injury-induced mice to the 1.5 ml EP tube. 1 ml of PBS buffer is placed in a homogenizer glass tube and the liver tissue is homogenized.
72% TCA 195ul (final conc. 10%)를 넣고 4℃에서 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리 한다. 상층액을 새 EP tube에 옮기고 원심분리를 한번 더 실행한다. 상층액 0.6ml을 새 EP tube에 옮긴다. 0.8% TBA 272ul (final conc. 0.25%)를 상층액에 넣는다. 95℃에서 boiling한다. Control 색깔이 분홍색으로 바뀌면 얼음에서 반응을 정지시킨다. 상층액 100ul를 96well plate에 옮기고 생성된 MDA(말론디알데하이드)의 양을 532nm에서 흡광도를 통해 측정한다. 72% TCA 195 ul (final conc. 10%) is added and centrifuged at 4 ° C and 12,000 rpm for 15 minutes. The supernatant is transferred to a new EP tube and centrifuged once more. Transfer 0.6 ml of supernatant to a new EP tube. Add 272ul (final conc. 0.25%) of 0.8% TBA to the supernatant. Boiling at 95 ° C. Control When the color changes to pink, stop the reaction on ice.
도 4에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 정상군의 경우, 낮은 MDA 분비량이 확인되었고, 에탄올로 유발한 대조군(급성)의 경우 지질과산화가 유발됨으로써 MDA의 함량이 현저하게 증가하는 것이 확인되었다. 또한 멀꿀 열매 열수추출물(50, 100 and 200mg/kg)을 처리한 실험군의 경우, 에탄올과 함께 처리했음에도 불구하고, MDA의 분비량이 농도 의존적으로 대조군(100% 기준)에 비해 각각 31.9%(50mg/kg), 29.7%(100mg/kg), 29.9%(200mg/kg)낮게 측정되었고, 이는 양성대조군 보다도 더 낮은 MDA분비량임을 확인하였다. 양성 대조물질(YM: 200mg/kg)을 투여한 양성대조군의 경우, 대조군(100% 기준)에 비해 41.7% 낮은 MDA분비량을 확인하였다. As shown in Fig. 4, in the case of the normal group not treated with ethanol, a low MDA secretion amount was confirmed, and in the case of the control group (acute) caused by ethanol, lipid peroxidation was induced, and the content of MDA was remarkably increased . In the experimental group treated with mullen fruit hot water extract (50, 100 and 200 mg / kg), the amount of MDA secreted was 31.9% (50 mg / kg) compared with the control group kg), 29.7% (100 mg / kg), and 29.9% (200 mg / kg) lower than the positive control group. In the positive control group administered with the positive control substance (YM: 200 mg / kg), the amount of MDA secretion was 41.7% lower than that of the control group (100% standard).
이로부터 멀꿀열매 열수추출물이 MDA생성을 억제 즉, 지질과산화 활성 억제효과가 있는 것으로 확인되었다.
From this, it was confirmed that the extract of Mulberry fruit extract inhibited MDA production, that is, the lipid peroxidation activity inhibitory effect.
5.2 멀꿀 열매 열수추출물의 알콜성 만성 간 손상 유발 생쥐의 간 조직에서 지질과산화 억제 효능 측정5.2 Measurement of lipid peroxidation inhibitory effect in liver tissue of alcoholic chronic liver injury induced mullen fruit hot water extract
도 5는 멀꿀열매 열수 추출물(200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 MDA 생성량 측정결과를 나타낸다. 앞서 실시한 알코올성 만성 간손상 유발 생쥐의 간 조직 0.2g을 1.5ml EP tube에 옮긴다. PBS buffer 1ml을 homogenizer glass tube에 넣고 간 조직을 균질화 시킨다. FIG. 5 shows the results of measurement of MDA production in liver tissue of chronic alcoholic liver injured mice against mullen fruit hot water extract (200 mg / kg). Transfer 0.2 g of liver tissue from the alcoholic chronic liver injury-induced mice to the 1.5 ml EP tube. 1 ml of PBS buffer is placed in a homogenizer glass tube and the liver tissue is homogenized.
72% TCA 195ul (final conc. 10%)를 넣고 4℃에서 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리 한다. 상층액을 새 EP tube에 옮기고 원심분리를 한번 더 실행한다. 상층액 0.6ml을 새 EP tube에 옮긴다. 0.8% TBA 272ul (final conc. 0.25%)를 상층액에 넣는다. 95℃에서 boiling한다. Control 색깔이 분홍색으로 바뀌면 얼음에서 반응을 정지시킨다. 상층액 100ul를 96well plate에 옮기고 생성된 MDA(말론디알데하이드)의 양을 532nm에서 흡광도를 통해 측정한다. 72% TCA 195 ul (final conc. 10%) is added and centrifuged at 4 ° C and 12,000 rpm for 15 minutes. The supernatant is transferred to a new EP tube and centrifuged once more. Transfer 0.6 ml of supernatant to a new EP tube. Add 272ul (final conc. 0.25%) of 0.8% TBA to the supernatant. Boiling at 95 ° C. Control When the color changes to pink, stop the reaction on ice.
도 5에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 정상군의 경우, 낮은 MDA 분비량이 확인되었고, 에탄올로 유발한 대조군의 경우 지질과산화가 유발됨으로써 MDA의 함량이 현저하게 증가하는 것이 확인되었다. 또한 멀꿀열매 잎 열수추출물(200mg/kg)을 처리한 실험군의 경우, 에탄올과 함께 처리했음에도 불구하고, MDA의 분비량이 농도 의존적으로 대조군에 비해 낮게 측정되었다. As shown in FIG. 5, in the case of the normal group not treated with ethanol, a low MDA secretion amount was confirmed, and in the case of the ethanol-induced control group, lipid peroxidation was induced, and the content of MDA was remarkably increased. In addition, in the experimental group treated with mullen fruit leaf hydrothermal extract (200 mg / kg), the amount of MDA secreted was lower than that of the control group in spite of treatment with ethanol.
이로부터, 멀꿀열매 열수추출물이 MDA생성을 억제 즉, 지질과산화 활성 억제효과가 있는 것으로 확인되었다.
From these results, it was confirmed that the hot water extract of mullen fruit inhibited the MDA production, that is, the lipid peroxidation activity inhibitory effect.
5.3 멀꿀 열매 열수추출물의 알콜성 만성 간 손상 유발 생쥐의 간 조직에서 지질과산화 억제 효능 측정5.3 Inhibition of lipid peroxidation in hepatic tissues of alcoholic chronic liver injury-induced mice of mullen berries hydrothermal extract
도 6은 멀꿀열매 열수 추출물(10, 50, 100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 간 조직 중 MDA 생성량 측정결과를 나타낸다. 앞서 실시한 알코올성 만성 간손상 유발 생쥐의 간 조직 0.2g을 1.5ml EP tube에 옮긴다. PBS buffer 1ml을 homogenizer glass tube에 넣고 간 조직을 균질화 시킨다. Figure 6 shows the results of measurement of MDA production in liver tissues of chronic alcoholic liver injured mice against mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg). Transfer 0.2 g of liver tissue from the alcoholic chronic liver injury-induced mice to the 1.5 ml EP tube. 1 ml of PBS buffer is placed in a homogenizer glass tube and the liver tissue is homogenized.
72% TCA 195ul (final conc. 10%)를 넣고 4℃에서 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리 한다. 상층액을 새 EP tube에 옮기고 원심분리를 한번 더 실행한다. 상층액 0.6ml을 새 EP tube에 옮긴다. 0.8% TBA 272ul (final conc. 0.25%)를 상층액에 넣는다. 95℃에서 boiling한다. Control 색깔이 분홍색으로 바뀌면 얼음에서 반응을 정지시킨다. 상층액 100ul를 96well plate에 옮기고 생성된 MDA(말론디알데하이드)의 양을 532nm에서 흡광도를 통해 측정한다. 72% TCA 195 ul (final conc. 10%) is added and centrifuged at 4 ° C and 12,000 rpm for 15 minutes. The supernatant is transferred to a new EP tube and centrifuged once more. Transfer 0.6 ml of supernatant to a new EP tube. Add 272ul (final conc. 0.25%) of 0.8% TBA to the supernatant. Boiling at 95 ° C. Control When the color changes to pink, stop the reaction on ice.
도 6에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리하지 않은 정상군의 경우, 낮은 MDA 분비량이 확인되었고, 에탄올로 유발한 대조군의 경우 지질과산화가 유발됨으로써 MDA의 함량이 현저하게 증가하는 것이 확인되었다. 또한 멀꿀열매 잎 열수추출물(10, 50, 100, and 200mg/kg)을 처리한 실험군의 경우, 에탄올과 함께 처리했음에도 불구하고, MDA의 분비량이 농도 의존적으로 대조군에 비해 낮게 측정되었다. As shown in FIG. 6, in the case of the normal group not treated with ethanol, a low MDA secretion amount was confirmed, and in the case of the ethanol-induced control group, lipid peroxidation was induced, and the content of MDA was remarkably increased. In addition, in the experimental group treated with mullen fruit leaf hydrothermal extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg), the amount of MDA secreted was lower than the control group in spite of treatment with ethanol.
특히, 멀꿀 열매 열수 추출물 50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg을 투여한 실험군의 경우, MDA생성량이 알코올만 투여한 대조군(100%)에 비해 각각 57.4%(50mg/kg), 54.3%(100mg/kg), 59.1%(200mg/kg) 생성량을 확인하였다. In particular, MDA production was 57.4% (50 mg / kg) and 54.3% (100%) in the experimental group administered with 50 mg / kg, 100 mg / kg and 200 mg / kg of mullen fruit hot water extract, 100 mg / kg) and 59.1% (200 mg / kg).
이는 멀꿀 열매 열수 추출물 50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg을 투여한 실험군의 경우, MDA 생성억제 효과가 알코올만 투여한 대조군(100%)보다 각각 142.6%, 145.7%, 140.9% 더 높은 효과가 있음을 확인해주는 결과이다. In the experimental group administered 50 mg / kg, 100 mg / kg and 200 mg / kg of mullen fruit hot water extract, the MDA production inhibitory effect was 142.6%, 145.7%, and 140.9% higher than the control group (100% This is the result of confirming that there is.
이로부터, 멀꿀열매 열수추출물이 MDA생성을 억제 즉, 지질과산화 활성 억제효과가 있는 것으로 확인되었다.
From these results, it was confirmed that the hot water extract of mullen fruit inhibited the MDA production, that is, the lipid peroxidation activity inhibitory effect.
5.4 알콜성 만성 간 손상 유발 생쥐모델에서 멀꿀 열매 열수추출물에 대한 GOT/GPT 측정 실험5.4 GOT / GPT assay for hot-water extract of mulberry fruit in alcohol-induced chronic liver injury-induced mouse model
도 7은 멀꿀열매 열수 추출물(10, 50, 100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 혈청 중 GOT 활성도 측정결과를 나타내며, 도 8은 멀꿀열매 열수 추출물(10, 50, 100, and 200mg/kg)에 대한 만성 알콜성 간 손상 생쥐의 혈청 중 GPT 활성도 측정결과를 나타낸다. 마취된 mouse의 복부대동맥으로부터 채혈을 실시하였으며, 채혈된 혈액은 3,000rpm에서 5min동안 원심분리하여 혈청을 얻었다.FIG. 7 shows the results of measurement of GOT activity in serum of chronic alcoholic liver-injured mice against mullen fruit hot water extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg) , and 200 mg / kg) in chronic alcoholic liver injured mice. Blood was collected from the abdominal aorta of the anesthetized mouse, and the collected blood was centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to obtain serum.
분리된 혈청 중 transaminase(GOT, GPT)의 활성도 측정을 위해서 사용한 기질은 GOT의 경우 L-aspartic acid와 a-ketoglutaric acid, GPT의 경우 L-alanine과 a-ketoglutaric acid이다. 이들 기질을 사용하여 37℃에서 39분간 반응시킬 때 생성되는 pyruvic acid가 알칼리성 하에서 2,4-dinitrophenyl hydrazine과 작용하여 발색되는 hydrazine의 비색을 정량하는 Reitman-Frankel 법에 의해 조제된 진단용 kit(아산제약, 한국)를 사용하여 505nm에서 흡광도를 측정하였다. L-aspartic acid and a-ketoglutaric acid for GOT and L-alanine and a-ketoglutaric acid for GPT were used to measure the activity of transaminase (GOT, GPT) in the serum. The diagnostic kit prepared by the Reitman-Frankel method, which quantifies the color of hydrazine produced by the action of 2,4-dinitrophenyl hydrazine under alkaline conditions, is obtained by reacting these substrates with 37 캜 for 39 minutes. , Korea) was used to measure the absorbance at 505 nm.
활성도의 단위는 혈청ml당 Karmen unit로 표시하였다. 도 7과 8에 나타낸 것처럼 멀꿀열매 열수출물을 10, 50, 100, 200mg/kg 농도로 투여한 결과, 알코올을 투여하여 만성적으로 간 손상을 유도시킨 대조군과 비교했을 때 GOT, GPT 상승억제효과가 있는 것으로 나타났다.The unit of activity is expressed as Karmen unit per ml of serum. As shown in FIGS. 7 and 8, when 10 mg / kg of mulberry fruit hydrolyzate was administered at 10, 50, 100 and 200 mg / kg, the inhibitory effect of GOT and GPT .
따라서, 멀꿀 열매 열수추출물은 간 손상에 영향을 주지 않으며, 만성적 알코올 섭취로 인한 GOT, GPT 활성 상승을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
Therefore, it was confirmed that the hot water extract of mullen fruit did not affect liver damage and inhibited the increase of GOT and GPT activity due to chronic alcohol consumption.
5.5 멀꿀 열매 열수추출물에 대한 간 조직 내 ALDH activity 측정 실험5.5 Measurement of ALDH activity in liver tissues for hot water extract of mulberry fruit
상기 알콜 실험을 실시한 쥐를 대퇴부 동맥에서 마지막 채혈 후(4h) 즉시 간을 적출하여 0.25M sucrose를 섞어 4도씨에서 homogenizer를 이용해 균질화하고. 이것을 600xg에서 15분간 원심분리를 하여 핵 및 미마쇄 부분을 제거한 상층액을 얻고, 다시 10,000g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 분리된 상층액은 ALDH assay buffer, developer, 조효소인 NAD+와 혼합한 뒤 37도씨에서 10분 간격으로 30분 동안 반응하여 생성되는 NADH의 양을 흡광도 450nmm에서 측정하였으며(ALDH activity colorimetric assay kit, #731-100; BioVision), 활성도 단위는 단백질 1mg이 1분간 생성한 NADH의 양을 nmole로 표시하고 그래프 산출은 대조군(에탄올 처리군) 값에 대한 상대값(relative, %)으로 표기하였다. After the last blood collection from the femoral artery (4h), the liver was extracted from the alcohol-treated rats and homogenized using a homogenizer at 4 ° C with 0.25M sucrose. This was centrifuged at 600 × g for 15 minutes to obtain a supernatant from which the nuclei and unmarshaled portions were removed. The supernatant was further centrifuged at 10,000 g for 20 minutes to obtain supernatant. The separated supernatant was mixed with ALDH assay buffer, developer and coenzyme NAD +, and the amount of NADH produced by reacting at 37 ° C for 30 minutes at intervals of 10 minutes was measured at 450 nm (ALDH activity colorimetric assay kit, # 731 -100; BioVision), and the activity unit is expressed in nmole as the amount of NADH produced per minute of the
간 조직 중 ALDH activity 활성을 측정한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 에탄올만 처리한 대조군에 비해 멀꿀 열매 열수 추출물(10, 50, 100, 그리고 200mg/kg)을 투여한 군에서 농도 의존적으로 ALDH activity가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 9, ALDH activity activity in liver tissues was significantly higher in ethanol-treated group than in the control group treated with mullen fruit extract (10, 50, 100, and 200 mg / kg) Of the total number of patients.
구체적으로, 멀꿀 열매 열수 추출물 10mg/kg, 50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg을 투여한 실험군의 경우, ALDH activity가 알코올만 투여한 대조군(70.9%)에 비해 각각 91.1%(10mg/kg), 97.3%(50mg/kg), 99.7%(100mg/kg), 106.7%(200mg/kg)로, ALDH activity (활성)이 정상군(100%)에 근접하게 회복하는 것을 확인하였다. Specifically, ALDH activity was 91.1% (10 mg / kg) compared with the control group (70.9%), which was administered with 10 mg / kg, 50 mg / kg, 100 mg / kg and 200 mg / kg of mullen fruit hot water extract ), 97.3% (50mg / kg), 99.7% (100mg / kg), and 106.7% (200mg / kg), the ALDH activity recovered close to the normal group (100%).
특히, 멀꿀 열매 열수 추출물을 투여한 실험군의 경우, ALDH activity가 알코올만 투여한 대조군(100%)과 비교했을 때 각각 120.5%(10mg/kg), 137.2%(50mg/kg), 140.6%(100mg/kg), 150.5%(200mg/kg)로 농도 의존적으로 현저하게 증가 하는 효과를 확인하였다.In particular, ALDH activity in the experimental group treated with mullen fruit hot water extract was 120.5% (10 mg / kg), 137.2% (50 mg / kg) and 140.6% (100 mg) compared with the control group / kg) and 150.5% (200 mg / kg), respectively.
이로부터 멀꿀 열매 열수추출물은 실험동물의 체중대비 일정한 비율로 투여함으로서 자연 생산물에 의한 알데히드 분해효소 활성증가에 관여함으로써 에탄올 투여로 인한 간 조직 내 독소인 알데히드(aldehyde) 분해촉진 효과를 갖는 것이 확인됨으로서 본 발명에 따른 조성물은 알코올 섭취 의하여 야기되는 알콜성 간 손상으로부터 간 조직을 보호 및 예방하는 데에 사용할 수 있다.
From this result, it was confirmed that the extract of mulberry fruit was injected at a certain ratio with respect to the body weight of the experimental animals, and thus it was confirmed that the ethanol extract had an effect of promoting aldehyde decomposition, The compositions according to the present invention can be used to protect and prevent liver tissue from alcoholic liver damage caused by alcohol ingestion.
알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능을 갖는 약학 조성물로서 멀꿀 열매 추출물은 인체에 부작용이 없으면서 알콜성 간 손상에 대한 간 보호 기능이 뛰어나기 때문에 천연물인 멀꿀 열매 조추출물을 유효성분으로 사용함으로써 장기간 복용하여도 부작용 없이 안전한 알콜성 간 손상에 대한 간 보호에 유용하게 사용될 수 있고 자연에 서식하는 식물로 대체함으로 제조생산단가 절감과 산업화를 통한 수입대체 및 수출효과를 기대할 수 있을 것이다.As a pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage, Mullen fruit extract has excellent effects on liver protection against alcoholic liver damage without adverse effect on human body. Therefore, long-term administration It can be used for protecting liver against safe alcoholic liver damage without side effects and it can be expected to reduce the manufacturing production cost by replacing it with a plant inhabited by nature, and to effect import substitution and export through industrialization.
Claims (4)
Wherein the crude extract is extracted with water, ethanol, or a mixed solvent thereof as an extraction solvent. The pharmaceutical composition having liver protecting function against alcoholic liver damage
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Cited By (3)
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