KR101698153B1 - Ｐ2ｘ1 및 ｐ2ｘ3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Ｐ2ｘ1 및 ｐ2ｘ3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 P2X1 및 P2X3 수용체 길항제로 유용한 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물은 P2X1 및 P2X3 수용체를 강력하게 길항하므로, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환인 만성염증 질환 또는 신경성 통증 질환의 치료 및 예방을 위한 약제로 이용가능하다.

Description

Ｐ2Ｘ1 및 Ｐ2Ｘ3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물 {Novel pyridine carboxylic acid compound as a P2X1 and P2X3 receptor antagonist, the preparation method thereof and a composition containing the same}
본 발명은 P2X1 및 P2X3 수용체에 대한 강력한 길항 작용을 나타내, P2X1 및 P2X3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
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세포외 아데노신 5‘-트리포스페이트 (Extracellular adenosine 5’-triphosphate; ATP)는 P2 수용체 활성화를 통한 통증 전달 또는 염증성 신호전달과 같은 뚜렷한 역할을 갖고 신경, 근육, 심장, 신장 및 면역계를 포함하는 다양한 세포 및 기관에 작용한다.(Burnstock, G., et al, 2006) 상기 P2 뉴클레오티드 수용체는 3개의 과(families)로 대별되는데, 즉, 리간-간극성 양이온 채널과(ligand-gated cation channel family)로서의 P2X 수용체 및 G-단백질 결합 수용체 과(G-protein coupled receptor family)로서의 P2Y 수용체가 알려져 있다(Communi, D. et al, 1997).
상기 P2Y 수용체들은 CNS에서 탐지되는 P2Y1, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, 및 P2Y14 으로부터 유래된 적어도 10개 아형(subtypes)으로 표시된다.(Illes, P. et al, 2004).
P2Y 수용체는 1차 구심성 신경에서의 자극 발생 및 시냅스성 조절에 의하여 말초 및 중추신경계의 기능에 유의적인 역할을 수행한다 (Burnstock, G., et al. 2001). 현재, 7개 인간 P2X 수용체 아형 (P2X1 -7)이 클론되어 단백질 수준에서 30-50% 서열 상동성을 공유하고 379-595 아미노산 길이를 갖는다. P2X 수용체 서브유니트(subunits)은 구조적 위상학상 유사성을 갖으며, ATP 결합 부위 및 다양한 길이의 세포내 N 및 C 말단을 포함하는 긴 세포외 루프에 의하여 연결된 2개의 막간 스패닝 도메인(transmembrane spanning domains; TM1 및 TM2)으로 구성된다 (Vial, C. et al, 2004).
동종성(Homomeric) P2X3 및 이종성(heteromeric) P2X2 /3 수용체는 ATP의 1차 감각 효과를 매개하는데 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 (Jarvis, M. F., et al, 2003) 이는 주로 신경절(dorsal root), 삼중신경(trigeminal) 및 결절성(nodose) 감각 신경절(sensory ganglia) 내의 소-중 크기 C-섬유 및 Aδ 감각성 신경세포상에 주로 분포한다(Dunn, P. M. et, 2001). P2X2 및 P2X3 결핍 마우스로부터 얻은 감각 신경세포를 대상으로 한 전기생리학적 연구를 통하여 P2X3 및 P2X2 /3 수용체는 결절성(nodose) 감각 신경절에 주로 분포함에도 DRG 감각성 신경세포에서의 모든 ATP 반응을 담당하는 것으로 밝혀졌다 (Burgard, E. C. et al., 1999).
P2X3 및 P2X2 /3 수용체는 체성감각(somatosensory) 및 피부, 관절, 뼈, 폐, 방광, 수뇨관 및 위장관을 포함하는 내장 기관들에 뻗어 나간 1차 감각구심(primary sensory afferents)의 말초 및 중심 말단에 모두 존재한다 (Gever, J. R. et al, 2006). 최근 연구는 방광상피, 기도 상피 세포, 및 폐신경 상피세포를 포함하는 상피세포가 P2X3 및 P2X2 /3 채널을 발현하고 이는 특정한 기계적 감각 또는 화학적 감각 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(Wang, E. C. et al. 2005).
P2X 수용체의 강력하고 선택적인 길항제의 치료학적 잠재성이 기존 약학 활성제인 (1) P2X1, P2X3, 및 P2X2 /3 수용체에서의 TNP-ATP, (Honore, P. et al, 2002), (2) P2X3 및 P2X2 /3 수용체에서의 A-317491, (Jarvis, M. F. et al, 2002), (3) P2X3 수용체에서의 Spinorphin (Jung, K.Y. et al, 2007) 및 (4) P2X3 수용체에서의 RO-85 (Roche Co., Brotherton-Pleiss, C. E. et al, 2009)들을 대상으로 연구되어 왔다.
본 연구에서 말초 및 척수성 P2X3 및 P2X2 /3 수용체는 지속적이고, 만성적인 염증 및 신경병증성 통증 신호를 전달하는 과정과 연관된다는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 계열의 P2 수용체 길항제인, PPADS (pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2’,4’-disulfonic acid) 및 이의 유도체들은 나노몰 범위의 IC50 값 및 P2Y1 수용체에 대한 선택성을 갖고 P2X1 ,3 수용체에 대한 강력한 길항제로 밝혀졌다 (Kim, Y. C. et al, 2001).
P2X1 및 P2X3 수용체는 만성염증 질환(Michael, F. et al, 2009), 혈소판 질환 (Oury, C. et al, 2002) 또는 신경성 통증 질환(Charles, Kennedy. et al, 2005) 등의 질환들과 직접적인 관련이 있는 것으로 보고된 바 있다.
그러나, 상기 문헌 어디에도 피리딘 카르복실산 계 화합물을 P2X1 및 P2X3 수용체에 대한 길항제로써 유용성에 대한 기술내용이 개시되거나 교시된 바는 없다.
본 발명자들은 피리독살(pyridoxal) 또는 피리독식 산(pyridoxic acid)의 카르복실산 유도체를 제조하고 불안정한 아조기를 안정한 탄소-탄소 사슬로 대체하여 강력한 음이온 포스페이트 대신에 카르복실산 측쇄를 포함하는 6-아릴 알킬(arylalkyl) 피리딘 유도체를 개발하였다. (피리독살-5-포스페이트의 화학구조 및 이의 아조(azo) 계 유도체 (PPADS, iso-PPADS) 및 MRS 화합물들 구조식-하기 화학식 참조)).
Figure 112010026852648-pat00001
본 발명자는 본 발명자들에 의하여 새롭게 제조된 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물들이 P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타냄을 클론된 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체로 발현된 개구리 난자(Xenopus oocyte)에서 2-전극 전압 클램프 어세이법(TEVC)을 이용하여 확인함으로서, 본 발명의 화합물들이 P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환인 만성염증 질환 또는 신경성 통증 질환의 치료 및 예방 약제로서 개발가능성이 높음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 P2X1 및 P2X3 수용체 길항제로 사용되는 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00002
상기 식에서,
R1 , R2 , 및 R3 는 각각 독립적으로, 수소원자, 히드록시기, 설포닐기, 할로겐원자, 카르복실산, C1-C6 저급 알킬기, C1-C6 저급 알콕시기, 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이며;
A는
Figure 112010026852648-pat00003

또는
Figure 112010026852648-pat00004
이고, 여기에서 n은 0 내지 5의 정수이며, Ra 는 수소원자, 히드록시기, 할로겐원자, 카르복실산, C1-C6 저급 알킬기, C1-C6 저급 알콕시기, 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며;
B는
Figure 112010026852648-pat00005
,
Figure 112010026852648-pat00006
또는
Figure 112010026852648-pat00007
이며, 여기에서 R‘ 및 R" 는 수소원자, 히드록시기, 할로겐원자, 카르복실산, 설포닐기, C1-C6 저급 알킬기, C1-C6 저급 알콕시기, 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며, C는 하나 이상의 5원 내지 18원의 방향환이며, m은 0 내지 5의 정수이며,
(-----)표시는 단일결합 또는 이중결합을 의미한다.
상기 일반식 (Ⅰ)에 속하는 화합물군 중에 바람직하기로는 R1 , R2 , 및 R3 는 각각 독립적으로, 수소원자, 히드록시기, 설포닐기, C1-C3 저급 알킬기 및 C1-C3 저급 알콕시기로 구성된 군으로부터 선택된 치환기인 화합물군;
A는 A1인 경우는 n은 0 내지 2의 정수이며, A2인 경우는 Ra는 수소원자, 히드록시기 및 할로겐원자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군;
B는 B1 또는 B2인 경우에 상기 R‘ 및 R" 는 수소원자, 히드록시기, 할로겐원자, 카르복실산, 설포닐기, C1-C3 저급 알킬기, C1-C3 저급 알콕시기 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며, m은 0 내지 2의 정수이며; B3인 경우는 상기 C는 하나 이상의 6원 내지 12원의 방향환인 화합물군을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 하나의 구현예로서, P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰa)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00008
상기 식에서,
R1 , R2 , R3 , B 및 n의 치환기 정의는 상기 일반식 (I)에서 정의된 바와 같다.
또한 본 발명은 또 하나의 구현예로서, P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰb)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00009
상기 식에서,
R1 , R2 , R3 , Ra 및 B의 치환기 정의는 상기 일반식 (I)에서 정의된 바와 같다.
또한 본 발명은 또 하나의 구현예로서, P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰc)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00010
상기 식에서,
R1 , R2 , R3 , R' 및 A의 치환기 정의는 상기 일반식 (I)에서 정의된 바와 같다.
또한 본 발명은 또 하나의 구현예로서, P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰd)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00011
상기 식에서,
R1 , R2 , R3 , R", m 및 A의 치환기 정의는 상기 일반식 (I)에서 정의된 바와 같다.
또한 본 발명은 또 하나의 구현예로서, P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타내는, 하기 일반식 (Ⅰe)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure 112010026852648-pat00012
상기 식에서,
R1 , R2 , R3 , R", A 및 C의 치환기 정의는 상기 일반식 (I)에서 정의된 바와 같다.
상기 일반식 (Ⅰa) 내지 (Ie)에 속하는 화합물군 중에 보다 바람직하기로는 R1, R2 , 및 R3 는 각각 독립적으로, 수소원자, 히드록시기, 설포닐기, 메틸기, 에틸기, 메톡시기 및 에톡시기로 구성된 군으로부터 선택된 치환기인 화합물군; A는 A1인 경우는 n은 0 또는 1의 정수이며, A2인 경우는 Ra는 수소원자, 또는 히드록시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군; B는 B1 또는 B2인 경우에 상기 R‘ 및 R" 는 수소원자, 히드록시기, 카르복실산, 설포닐기, 메틸기, 에틸기, 메톡시기 및 에톡시기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이며, m은 0 또는 1의 정수이며; B3인 경우는 상기 C는 1개 또는 2개의 페닐환, 나프탈렌기, 페녹시페닐기, 아다만틴기, 피라진기, 테트라졸기, 인돌기, 안트라센기, 피페리딘기, 퀴놀린기, 아이소퀴놀린기, 퀴나졸린기, 벤자제핀기, 피리딘기, 피리다진기, 피라졸기, 옥사졸기, 치아졸기, 아데닌기 등으로 구성된 군으로부터 선택된 호모 또는 헤테로 방향환, 바람직하게는 페닐환 또는 나프탈렌 등과 같은 방향환인 화합물군을 포함할 수 있다.
상기 일반식 (Ⅰa) 내지 (Ie)에 속하는 화합물군 중에 가장 바람직한 화합물로서,
상기 일반식 (Ia)에 속하는 화합물로는
에틸 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)프로파노익 산 (13), 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14), (3-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)아크릴산 (15), 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)아크릴산 (16), 3-(4-프로밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)아크릴산 (17), 5-(2-카르복시비닐)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 (18), N-벤질-1-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일) 메탄아민 (19), (에틸3-(벤질((2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)메틸)아미노)프로파노에이트 (20), (3-(벤질(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)메틸)아미노)프로판노익산 (21)을 포함한다.
상기 일반식 (Ib)에 속하는 화합물로는
3-(벤질((4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)메틸)아미노) 프로파노익산 (22), 5-((벤질(2-카르보에틸)아미노)메틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 (23)을 포함한다.
상기 일반식 (Ic)에 속하는 화합물로는
3-(2-((2,5-디설포페닐)디아제닐)-4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일) 프로판산 (24), 3-(2-카르복시에틸)-2-((2,5-디설포페닐)디아제닐)-5-히드록시-6-메틸이소니코틴산(25), 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸-2-((4-설포페닐)디아제닐)피리딘-3-일)프로판산 (26), 3-(2-카르복시에틸)-5-히드록시-6-메틸-2-((4-설포페닐)디아제닐) 이소니코틴산 (27), 4-((3-(2-카르복시에틸)-4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-2-일) 디아제닐) 벤조산 (28), 3-(2-카르복시에틸)-2-((4-카르복시페닐)디아제닐)-5-히드록시-6-메틸이소니코틴산 (29)을 포함한다.
상기 일반식 (Id)에 속하는 화합물로는
2-벤질-5-히드록시-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (35), 5-히드록시-6-메틸-2-펜에틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (36), 5-히드록시-2-[2-(4-메톡시-페닐)에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (37), 5-히드록시-6-메틸-2-스티릴-피리딘-3,4-디카르복실산 (38), 2-[2-(4-카르복시-페닐)-에틸]-5-히드록시-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (39), 5-히드록시-2-[2-(3-메톡시-페닐)-에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (40), 5-히드록시-2-[2-(2-메톡시-페닐)-에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (41), 4-아세틸-2-벤질-5-히드록시-6-메틸니코틴산 (44), 4-아세틸-5-히드록시-6-메틸-2-펜에틸니코틴산 (45), 4-아세틸-5-히드록시-2-(4-메톡시펜에틸)-6-메틸니코틴산 (46), (E)-4-아세틸-5-히드록시-6-메틸-2-스티릴니코틴산 (47), (E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(3-메톡시스티릴)-6-메틸니코틴산 (48), (E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(2-메톡시스티릴)-6-메틸니코틴산 (49), 3-(4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸피리딘 -3-일) 프로파노익산(61), (E)-3-(4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸피리딘 -3-일) 아크릴 산(64), 4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸니코틴산 (67)을 포함한다.
상기 일반식 (Ie)에 속하는 화합물로는
5-히드록시-6-메틸-2-(나프탈렌-1-일메틸)피리딘-3,4-디카르복실산 (50) 및 2-(2,2,-디페닐에틸)5-히드록시-6-메틸피리딘-3,4-디카르복실산 (51)을 포함한다.
상기 구조식 (Ⅰ)로 표시되는 본 발명의 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한, 상기의 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 일반식 (Ⅰ) 화합물의 제조방법을 제공하는 것으로, 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 본 발명의 여러 화합물들은 반응식 1 내지 3의 합성과정에서 사용되는 시약, 용매 및 반응 순서를 바꾸는 등의 작은 변경으로 제조될 수 있다.
본 발명의 몇몇 화합물들은 반응식들의 범주에 포함되지 않는 과정에 따라 합성되었으며, 이러한 화합물들에 대한 상세한 합성 과정은 이들 각각의 실시예에 설명되어 있다.
(반응식 1)
5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산의 제조
Figure 112010026852648-pat00013
상기 반응식 1에서의 시약 및 조건: (a) 2,2-dimethoxypropane, TsOH, acetone; (b) pyridinium dichromate, DCM; (c) triethylphosphoacetate, NaH, THF; (d) 10% formic acid in water, reflux, 3 hr; (e) Pd/C, H2, MeOH; (f) MnO2, DCM; (g) 5% KOH, MeOH; (h) OXONE, 0.2 M DMF/ACN
(반응식 2)
5-(2-카르복시비닐)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산의 제조
Figure 112010026852648-pat00014
상기 반응식 2에서의 시약 및 조건: (a) 5% KOH in MeOH, r.t, 3 hr; (b) 10% formic acid in water, reflux, 3 hr; (c) MnO2, 0.3M THF/Water; (d) OXONE, 0.2 M DMF/ACN
(반응식 3)
5-((벤질(2-카르복시에틸)아미노)메틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산의 제조
Figure 112010026852648-pat00015
상기 반응식 3에서의 시약 및 조건: (a) benzylamine, NaBH3CN, 1% AcOH in DCM; (b) ethyl acrylate, EtOH, reflux, 24 hr; (c) 10% formic acid in water, reflux, 3 hr; (d) 5% KOH in MeOH, r.t, 3 hr; (e) MnO2, 0.3M THF/Water; (f) OXONE, 0.2 M DMF/ACN
상기 반응식 1은 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산; 반응식 2는 5-(2-카르복시비닐)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산; 및 반응식 3은 5-((벤질(2-카르복시에틸)아미노)메틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 유도체를 각각 제조하는 방법을 각각 도시한 것으로,
피리독살(pyridoxal)의 카르복실산 유도체 또는 피리독식 산(pyridoxic acid) 유도체들은 상기 반응식 1 내지 3에 개시된 바와 같은 반응공정을 통하여 제조가능하다.
예를 들어, 피리독신(Pyridoxine 6)을 아세톤 용매중 p-톨루엔설폰산 등의 산존재하에 2,2-디메톡시프로판으로 반응시키고, 디클로로메탄중 피리디늄 디크로메이트(pyridinium dichromate)를 이용한 5-알콜의 산화반응을 수행하여 5´-알데히드 유도체 (8)을 제조한다. 상기 5´-알데히드 유도체 (8)을 트리에틸포스포아세테이트로 위티그-호르너 반응(Wittig-Hornor reaction)을 수행하여 화합물 (9)를 제조하고, 10% 포름산 등의 약산으로 가수분해를 수행하여 화합물 (10)을 제조한다. 수소화 반응 조건하에서 화합물 (10)의 α,β-불포화 결합을 환원시킨 후, 4-히드록시메틸기를 메탄올중 망간 이산화물로 알데히드기로 전환시킨다. 화합물 (12)의 에스테르기를 가수분해하여 상응하는 산(13)으로 전환시키고, 옥손(OXONE)으로 산화반응을 수행하여 4-카르복실산 유사체로 전환시킨다.
화합물 17 및 18, 화합물 13 및 14의 상응하는 α,β-불포환 유도체들은 화합물 9를 출발물질로 하여 상기와 유사한 공정으로 제조가능하며, 화합물 23은 상기 반응식 3에 개시된 6 단계 공정을 이용하여 합성가능하다.
(반응식 4)
아조 커플링 반응(azo coupling reaction)을 통한 PPADS 유도체의 일반적 합성 방법
Figure 112010026852648-pat00016
상기 반응식 4는 아조 커플링 반응(azo coupling reaction)을 통한 PPADS 유도체의 일반적 합성 방법을 도시한 것으로서,
예를 들어, 화합물 (8)의 알데히드기를 NaBH3CN 존재하의 환원적 아민화 반응(reductive amination) 조건하에서 벤질아민과 반응시켜 산물 19을 제조한다. 화합물 19의 2차 아민기를 1,4-첨가 반응(addition reaction)에 따라 에탄올 중 에틸 아크릴레이트와 반응시킨다. 프로판-2,2-디올 보호기를 10% 포름산 등의 약산으로 절단하고 5% KOH 등이 염기로 연속적인 가수분해를 통하여 화합물 (21)을 제조하고, 이를 물 중 0.3 M THF 중에 망간 이산화물과 반응시켜 화합물 (22)를 제조한다. 화합물 (22)의 알데히드기를 옥손(OXONE)에 의해 상응하는 카르복실산으로 전환시킨다. 최종적으로, 4´-카르복실레이트(carboxylate), 4´-설포네이트(sulfonate), 및 2´,5´-디설포네이트(disulfonate) 유도체가 아조 커플링 반응(azo coupling reaction)을 통하여 화합물 24-29의 페닐환에서 제조된다. (반응식 4 참조).
(반응식 5)
3,4-디카르복시피리딘 유도체들의 합성 방법
Figure 112010026852648-pat00017

상기 반응식 5에서의 시약 및 조건:(a) TEA, EDCI, DCM, room temperature, 2hr (b) P2O5, CHCl3, 2hr, (c) dimethyl maleate, neat, 5 hr (d) 20% KOH (aq).
(반응식 6)
4-아세틸-3-디카르복시피리딘 유도체들의 합성 방법
Figure 112010026852648-pat00018
상기 반응식 6에서의 시약 및 조건:(a) DMF, DCM, 상온, 24hr (b) (E)-ethyl 4-oxopent-2-enoate, neat, 5 hr (c) HCl(g), EtOH, 0oC, (e) 5% KOH in MeOH, 상온.
반응식 5 및 6은 각각 3,4-디카르복시피리딘 유도체 및 4-아세틸-3-디카르복시피리딘 유도체들의 합성 방법을 도시한 것으로서,
예를 들어, 3,4-디카르복시피리딘 유도체 화합물들 35-41 및 4-아세틸-3-카르복시피리딘 유도체 화합물들 44-49은 반응식 5 및 6에 개시된 바와 같은 합성 과정을 이용하여 L-알라닌 에틸 에스테르를 출발물질로 하여 합성가능하다. L-알라닌 에틸 에스테르 (30)을 EDCI 커플링제(coupling agent) 존재하에 적합한 카르복실산 유도체 31a-g와 결합시켜 화합물 32a-g를 제조한다. 오산화인으로 화합물 32a-g의 환 개열반응은 옥사졸 화합물들 33a-g로의 반응을 3단계 공정으로 전제 수율이 약 92%에 달하는 순조로운 반응을 유도한다. 디메틸 말리이트로 화합물 33a-g의 딜스-엘더 반응(Diels-Alder reaction)을 통하여 환류 조건하에서 피리딘 환의 합성이 달성된다. 최종적으로, 화합물 34a-g를 20% KOH 등의 염기로 처치하여 최종 목적물질 35-41을 제조한다 (반응식 5 참조). 화합물 34a-g의 피리딘 환 4-위치에 아세틸기를 도입하기 위하여 (E)-에틸 4-옥소펜타-2-에놀레이트를 딜스-엘더 반응을 수행하여 상응하는 피리딘 유도체 화합물들 44-49을 제조가능하다 (반응식 6 참조).
(반응식 7)
4-포르밀-3-카르복시피리딘 유도체들의 합성 방법
Figure 112010026852648-pat00019

상기 반응식 7에서의 시약 및 조건: (a) Dimethyl maleate, Et-OH, HCl gas; (b) benzyl bromide, Acetone, K2CO3 ; (c) LiAlH4, THF; (d,i) Pd/C, H2 gas, MeOH; (e) 2,2-dimethoxypropane, p-TsOH, acetone; (f) pyridinium dichromate, DCM; (g) triethylphoshpoacetate, NaH, THF; (h,m,p) 10 % formic acid, reflux; (j,n,q) MnO2, DCM; (k,l) 5% KOH in MeOH; (o) oxone, 2M DMF/ACN.
상기 반응식 7은 4-포르밀-3-카르복시피리딘 유도체들의 합성 방법을 도시한 것으로서,
예를 들어, 4-포르밀-3-카르복시피리딘 유도체 화합물들 61,64는 반응식 7에 개시된 바와 같은 합성 과정을 이용하여 옥사졸 화합물인 33d를 출발물질로 하여 합성가능하다. 디메틸 말리이트로 화합물 33d의 딜스-엘더 반응(Diels-Alder reaction)을 통하여 환류 조건하에서 피리딘 환의 합성이 달성된다. 최종적으로, 화합물 34d를 벤질브로마이드와 결합반응을 진행 후 리튬알루미늄하이드라이드 등의 환원제로 디메틸에스터를 환원시키고, 수소화 반응 조건하에서 벤질부분을 제거해 화합물 54를 제조한다. 화합물 54를 아세톤 용매중 p-톨루엔설폰산 존재하에 2,2-디메톡시프로판으로 반응시키고, 디클로로메탄중 피리디늄 디크로메이트(pyridinium dichromate)를 이용한 5-알콜의 산화반응을 수행하여 5´-알데히드 유도체 (56)을 제조한다. 보호기 5´-알데히드 유도체 (56)을 트리에틸 포스포아세테이트로 위티그-호르너 반응(Wittig-Hornor reaction)을 수행하여 화합물 (57)를 제조하고, 10% 포름산 등의 산으로 가수분해를 수행하여 화합물 (58)을 제조한다. 수소화 반응 조건하에서 화합물 (58)의 α,β-불포화 결합을 환원시킨 후, 4-히드록시메틸기를 메탄올중 망간 이산화물로 알데히드기로 전환시킨다. 화합물 (60)의 에스테르기를 가수분해하여 상응하는 산으로 전환시켜 최종화합물(61)을 제조한다. 또 다른 최종 화합물(63), 화합물 60의 상응하는 α,β-불포환 유도체는 화합물 57을 출발물질로 하여 상기와 유사한 공정으로 제조가능하다. 또한, 최종 화합물(67)도 화합물 56을 출발물질로 하여 상기와 유사한 공정으로 제조가능하다.
따라서 본 발명에서는 상기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 제조방법으로 얻어진 일반식 (I) 화합물들은 P2X1 및 P2X3 수용체에 대한 강력한 길항작용을 나타내므로 P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환, 예를 들어, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 방광염 등의 만성염증 질환; 신경병증성통증, 이질통, 당뇨성 신경장애증, 자발성통증, 과민성통증, 환지통, 복합부위통증증후군 등의 신경성 통증 질환 또는 동맥경화, 뇌졸중, 혈전증, 색전증, 심근경색, 죽상경화증, 말초혈액순환장애 등의 혈소판 응집관련 질환 등을 치료 또는 예방할 수 있는 치료제로서 유용함을 확인하였다.
따라서, 상기 일반식 (I) 화합물을 유효성분으로 함유한, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 만성염증 질환, 신경성 통증 질환 또는 혈소판 응집관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.
본원에서 정의되는 “ P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 만성염증 질환”은 예를 들어, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 방광염을 포함하며,“ P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 신경성 통증 질환”은 예를 들어, 신경병증성통증, 이질통, 당뇨성 신경장애증, 자발성통증, 과민성통증, 환지통, 복합부위통증증후군 등을 포함하며, “ P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 혈소판 응집관련 질환 ”은 예를 들어, 동맥경화, 뇌졸중, 혈전증, 색전증, 심근경색, 죽상경화증, 말초혈액순환장애 등을 포함한다.
따라서, 본 발명은 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물을 유효성분으로 포함하는 P2X1 및 P2X3 수용체에 대한 길항제를 제공한다.
본 발명자는 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물들이 P2X1 및 P2X3 수용체에 대하여 강력한 길항 활성을 나타냄을 클론된 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체로 발현된 개구리 난자(Xenopus oocyte)에서 2-전극 전압 클램프 어세이법(TEVC)을 이용하여 확인함으로서, 본 발명의 화합물들이 P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환인 만성염증 질환, 신경성 통증 질환 또는 혈소판 응집 관련 질환의 치료 및 예방 약제로서 개발가능성이 높음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 피리딘 카르복실산계 화합물을 포함하는, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환을 예방, 치료하기 위한 약제학적 조성물과 피리딘 카르복실산계 화합물을 사용하여 상기 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 피리딘 카르복실산계 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 P2X1 및 P2X3 수용체 활성과 관련된 모든 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물의 투여로 P2X1 및 P2X3 수용체 활성과 관련된 모든 질병을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 피리딘 카르복실산계 화합물을 포함하는 조성물 및 치료방법은 인간뿐만 아니라 P2X1 및 P2X3 수용체 활성과 관련된 모든 질병이 발병할 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물에게도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산계 화합물을 유효성분으로 포함하는 P2X1 및 P2X3 수용체 활성과 관련된 모든 질병의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 0.0001 ~ 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다.
또한, 본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 P2X1 및 P2X3 수용체 길항제로 유용한 신규한 피리딘 카르복실산 계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 화합물은 P2X1 및 P2X3 수용체를 강력하게 길항하므로, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 질환인 만성염증 질환 또는 신경성 통증 질환의 치료 및 예방을 위한 약제로 이용가능하다.
도 1은 A 부분에서, 화합물 (24)의 마우스 P2X1 수용체-매개성 전류의 저해율을 나타낸 도이며 (대표적인 내향성 전류는 마우스 P2X1 수용체 아형 (A)을 발현하는 아프리카 개구리 난자(Xenopus oocytes)에서의 2가지 농도의 화합물 (24)의 조절 및 존재하에서 2 μM ATP에 의해 방출된다. 마우스 P2X1 수용체 (B) 및 인간 P2X3 수용체 (C)에 대한 화합물 24 (■), 28 (●), 및 iso-PPADS 3 (▲)의 농도-저해 곡선을 의미함. ATP에 대한 연속선은 수학 공식(I = I max/(1 + IC50/L)nH, )을 이용하여 맞추었고 여기에서 I 는 리간드 농도에 대한 실제 전류(actual current) (L), nH 는 힐 계수 (Hill coefficient,) 및 I max 은 최대 전류를 의미함).
도 2은 A: 마우스 P2X1 수용체에 대한 MRS2159 (■), 36 (●), 38 (▲), 및 39 (▼) 의 농도-저해 곡선을 나타냄. ATP 에 대한 연속선은 수학 공식(I = I max/(1 + IC50/L)nH, )을 이용하여 맞추었고 여기에서 I 는 리간드 농도에 대한 실제 전류(actual current) (L), nH 는 힐 계수 (Hill coefficient,) 및 I max 은 최대 전류를 의미함).
B: 인간 P2X3 수용체에 대한 A-317491 (■), 36 (●), 38 (▲), 및 39 (▼) 의 농도-저해 곡선을 나타낸 도이다. ATP 에 대한 연속선은 수학 공식(I = I max/(1 + IC50/L)nH, )을 이용하여 맞추었고 여기에서 I 는 리간드 농도에 대한 실제 전류(actual current) (L), nH 는 힐 계수 (Hill coefficient,) 및 I max 은 최대 전류를 의미함).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.
참고예 1. 실험 준비 및 기기
1-1. 시약 및 재료
본 실험에서 사용한 ATP (disodium salt), 피리독신(Pyridoxine), 및 아조 커플링 반응용 시약은 회사(Aldrich, St. Louis, MO 및 TCI, Tokyo)에서 구입하였다. 아닐린-2,5-디설폰산은 회사(K & K Laboratories, Inc., Hollywood, CA)에서 구입하였다. 기타 시약 및 용매는 분석급을 회사(Merck, Darmstadt, Germany)에서 구입하였다. 작용제 및 길항제들은 매일 세포외 욕조용액에서 제조하여 스톡용액(10 mM, stored frozen)으로부터 제조하였다.
1-2. 분석 방법
본 실험에서 사용한 분석용 TLC는 미리 코팅된 유리 플레이트(precoated silica glass plates, Merck silica gel 60, F254)에서 수행하고 UV 광선(light)으로 시각화하거나 설폰산 염색시약으로 염색하였다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피는(Flash column chromatography) 실리카(silica, Merck, 70-230 mesh)로 수행하였다. 수소 핵자기 공명스펙트럼(Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy)은 기기(JEOL JNM-LA 300WB spectrometer)로 측정하고 스펙트럼은 DMSO-d 6.에서 수득하였다. 별달리 지적하지 않는 한, 화학적 이동(chemical shifts)은 내부 표준물질(tetramethylsilane)로부터의 ppm 저자장 또는 DMSO (2.5 ppm)로부터의 상대적 ppm으로 표시하였다. 데이터는 하기한 바와 같이 표시함: 화학적 이동(chemical shift), 다중도(multiplicity) (s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet; b, broad; app., apparent), 결합상수(coupling constants), 및 통합(integration). 질량분석기(Mass spectroscopy)는 기기들(MALDI-TOF 및 FAB instruments)으로 수행하였다. 순도 측정은 선형 경사 용매계(linear gradient solvent systems)에서 컬럼(Shimadzu Shim-pack C18 analytical column (250 mm 4.6 mm, 5 μm, 100Å)을 이용하여 기기(Shimadzu SCL-10A VP HPLC system)로 측정하였다. 하나의 용매계(A)는 0.1 M triethylammonium acetate buffer:CH3CN = 95:5에서 40:60으로 30분간 유속량(1 mL/min)이었다. 다른 용매계 (B)는 5 mM tetrabutylammonium phosphate buffer:CH3CN = 80:20에서 40:60으로 30분간 유속량 (1 mL/min)이었다.
인간 P2X3 수용체의 cRNA는 인간 P2X3 수용체의 cRNA를 역전사하여 수득하였고, 이는 독일 막스-플랑크 연구소(Max-Plank Institute) 연구실(Dr. W. Stuhmer 및 Dr. F. Soto)로부터 제공받았다. 마우스 P2X1 (clone ID: 4189541) 및 인간 P2X7 수용체 (clone ID: 5286944)의 전장 cDNAs를 포함하는 EST 클론(clones)은 회사(Invitrogen, CA, U.S.A.)에서 구입하고 그 서열은 DNA sequencing으로 확인하였다.
1-3. 약어
본 실험에서 사용한 약어의 정의는 하기와 같다.
ATP adenosine 5’-triphosphate
BzATP 3'-O-(4-benzoyl)benzoyl adenosine 5'-triphosphate
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
EDAC 1-ethyl-3-(3-dimethlyaminopropyl)carbodiimide
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
HEK human embryonic kidney
HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(4-butanesulfonic acid)
HPLC high-pressure liquid chromatography
iso-PPADS pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2’,5’-disulfonic acid
KN62 1-[N,O-bis(1,5-isoquinolinesulphonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenylpiperizine
NMP N-methyl-2-pyrrolidinone
PPADS pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2’,4’-disulphonic acid
PyBOP (Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate
SAR structure-activity relationship
SPPS solid phase peptide synthesis
TFA trifluoroacetic acid
실시예 1. 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일)프로판산 (13)의 제조
1-1. 에틸 4- 옥소펜트 -2- 에놀레이트 ( ethyl 4- oxopent -2- enoate ) 중간체의 제조
소량의 디클로메탄 용매중 21.3 g (카르브에톡시메틸렌)트리페닐포스포란 ((carbethoxymethylene)triphenylphosphorane) 용액 (61.0 mmol)에 46.7 mL 수성 피루브알데히드(pyruvaldehyde)(305.0 mmol)를 상온에서 서서히 적가하였다. 상기 혼합물을 30 mL N,N-디메틸포름아미드로 희석시키고, TLC 상으로 반응 완료가 확인되기까지 교반하고, 300 ml의 물을 첨가하고 700 ml의 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 유기성 추출물을 물 및 염수로 연속적으로 세척하고, MgSO4으로 건조하고 감압하 증발하여 1H NMR 스펙트럼상에서 2개의 이성체 혼합물(E 및 Z 이성체; 9:1))로 구성된 것으로 확인된 오일상의 물질을 얻었다. 상기 혼합물을 플래쉬 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (용출용매: n-hexanes-ethyl acetate = 3:1), E 이성체형태의 에틸 4-옥소펜트-2-에놀레이트를 분리하였다 (Rf 0.80 : hexanes-ethyl acetate = 1:1). 분리한 E 이성체는 NMR의 J 결합 상수로 확인하였다 (E 이성체 J 결합 상수 = 12 ~ 18 Hz).
1H NMR (acetone-d6): 1.4 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.3 (3H, s, COCH3), 4.15 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 6.6 (1H, d, J = 15.0 Hz, =CH), 6.9 (1H, d, J = 15.0 Hz, =CH); Z isomer: Rf 0.74 (hexane-ethyl acetate = 1:1); δ(acetone-d6) 1.3 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.3 (3H, s, COCH3), 4.15 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 5.9 (1H, d, J = 12.0 Hz, =CH), 6.4 (1H, d, J = 12.0 Hz, =CH).
1-2. (2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일)메탄올 ((2,2,8-Trimethyl-4H-[1,3]dioxino[4,5-c]pyridin-5-yl)methanol (7) 중간체의 제조
20 g (0.1 mol) 피리독신 및 244 mL (1.9 mol) 2,2-디메톡시프로판 혼합물에 화염-건조시킨 1 리터 3-구 플라스크에 90 g (0.4 mol) para-톨루엔설폰산을 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 30시간동안 교반하고 NaHCO3 으로 중화시키고 감압농축하였다. 디클로로메탄으로 추출한 후에, 상기 조합된 유기 층을 염수로 세척하고 MgSO4으로 건조, 여과, 농축 및 컬럼크로마토그래피으로 정제하여(용매: dichloromethane/methanol = 20:1)을 수행하여 고체형태의 표제물질인 (2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)메탄올(7)을 수득하였다 (수율: 65.7%)
1H NMR (CDCl3): δ 1.52 (6H, s, 2xCH3), 2.34 (3H, s, CH3), 4.52 (2H, s, CH2), 4.91 (2H, s, CH2), 7.78 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 210.2 (M+ + 1).
1-3. (2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5- 카르브알데히드 (2,2,8-Trimethyl-4H-[1,3]dioxino[4,5-c]pyridine-5-carbaldehyde) (8) 중간체의 제조
50mL 무수 디클로메탄중 5 g (2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)메탄올 (7)의 교반용액(23.9 mmol)에 피리디늄 디크로메이트를 격렬한 교반하에 첨가하였다. 하룻밤 동안 반응시킨 후에, 상기 혼합물을 메탄올로 셀라툼 베드(celatum bed)으로 여과하였다. 상기 여과물을 진공하에 증발하고 컬럼크로마토그래피로 정제를(전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 3:1) 수행하여 고체형태의 표제물질인 (2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-카르브알데히드 (8)을 수득하였다(수율:67.5%).
1H NMR (CDCl3) δ 1.57 (6H, s, 2xCH3), 2.51 (3H, s, CH3), 5.18 (2H, s, CH3), 8.48 (1H, s, H-6), 10.05 (1H, s, CHO);
MS (ESI): m/z = 208.0 (M+ + 1).
1-4. 에틸 3-(2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일) 아크릴레이트 (Ethyl 3-(2,2,8- trimethyl -4H-[1,3] dioxino [4,5-c] pyridin -5- yl ) acrylate (9) 중간체의 제조
무수 테트라히드로퓨란중 500 mg NaH 현탁액((16.9 mmol)에 i3 mL (16.8 mmol) 트리에틸포스포아세테이트를 적가하였다. 상기 혼합물은 수소가스가 방출되면서 명맥한 황색 용액으로 변화하였다. 5분간 교반후, 40 mL 테트라히드로퓨란중 3.2g (2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-카르브알데히드 (8)(15.3 mmol)을 첨가하고 반응 용액을 1시간동안 교반하였다. 상기 혼합물을 클로로포름 및 염수로 추출하였다. 상기 유기성 잔사를 조합하고 MgSO4으로 건조, 여과, 농축 및 컬럼크로마토그래피로 정제를(전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 3:1) 수행하여 고체형태의 표제물질인 에틸 3-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)아크릴레이트 (9)을 수득하였다(수율: 81.3%).
1H NMR (CDCl3)δ 1.33 (3H, s, CH3), 1.57 (6H, s, 2xCH3), 2.44 (3H, s, CH3), 4.28 (2H, q, J = 8.8 Hz, CH2), 4.93 (2H, s, CH2), 6.37 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 7.54 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 8.26 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 278.3 (M+ + 1).
1-5. 에틸 3-(5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 아크릴레이트 (Ethyl 3-(5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-6- methylpyridin -3- yl ) acrylate (10) 중간체의 제조
20 mL 10% 포름산 용액중 3 g 에틸 3-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)아크릴레이트 9 (10.8 mmol)용액을 3시간동안 환류시켰다. 상온에서 냉각시킨 후, 상기 혼합물을 클로로포름 및 포화 NaHCO3으로 추출하였다. 상기 유기성 추출물을 조합하고 MgSO4으로 건조, 여과, 농축 및 컬럼크로마토그래피로 정제를(전개용매: dichloromethane/methanol = 10:1) 수행하여 고체형태의 표제물질인 에틸 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피피딘-3-일)아크릴레이트(10)을 수득하였다 (수율: 97.8%).
1H NMR (CDCl3)δ 1.35 (3H, s, CH3), 2.48 (3H, s, CH3), 4.28 (2H, q, J = 8.8 Hz, CH2), 5.12 (2H, s, CH2), 6.30 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 7.67 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 8.14 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 238.1 (M+ + 1).
1-6. 에틸 3-(5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노에이트 (Ethyl 3-(5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-6- methylpyridin -3- yl ) propanoate (11) 중간체의 제조
디클로로메탄중 2 g 에틸 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피피딘-3-일)아크릴레이트(10) 용액에(8.4 mmol) 0.5 g Pd/C을 가하고 수소 대기하에 4시간동안 교반하였다. 상기 혼합물을 셀라툼 베드 (celatum bed)를 통하여 여과하였다. 상기 여과물을 감압증발시키고 컬럼크로마토그래피로 정제를(전개용매: chloroform/methanol = 10:1) 수행하여 고체형태의 표제물질인 에틸 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)프로파노에이트(11)을 수득하였다 (수율: 89.2%)
1H NMR (CDCl3) δ 1.23 (3H, t, J = 7.1 Hz, CH3), 2.40 (3H, s, CH3), 2.50 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 2.80 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 4.10 (2H, q, J = 7.1 Hz, CH2), 4.99 (2H, s, CH2), 7.73 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 240.1 (M+ + 1).
1-7. 에틸 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노에이트 (12)( Ethyl 3-(4-formyl-5-hydroxy-6-methylpyridin-3-yl)propanoate (12)) 중간체의 제조
50 mL 무수 디클로로메탄 중 1 g (4.2 mmol) 에틸 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)프로파노에이트(11)에 질소 대기하, 상온에서 2시간동안 격렬하게 교반하면서 활성화 망간 이산화물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 셀라툼 베드 (celatum bed)를 통하여 여과, 감압증발하고 컬럼크로마토그래피로 정제를 (전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 4:1) 수행하여 고체형태의 표제물질인 에틸 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)프로파노에이트(12)을 수득하였다(수율: 71.1%)
1H NMR (CDCl3) δ 1.24 (3H, t, J = 7.1 Hz, CH3), 2.51 (3H, s, CH3), 2.69 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 3.25 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 4.12 (2H, q, J = 7.1 Hz, CH2), 8.02 (1H, s, H-6), 10.46 (1H, s, CHO);
MS (ESI): m/z = 238.1 (M+ + 1).
1-8. 에틸 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노익 산 (13)( Ethyl 3-(4-Formyl-5-hydroxy-6-methylpyridin-3-yl)propanoic acid (13)) 의 제조
메탄올중 5% KOH 용액을 330 mg 에틸 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)프로파노에이트(12)(1.4 mmol)을 1시간 동안 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 상기 반응 용매를 증발로 제거하고, 산물을 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 에틸 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)프로파노익 산 (13)을 수득하였다(수율: 53.9%)
1H NMR (D2O) δ 2.47 (3H, s, CH3), 2.55 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 3.15 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 7.58 (1H, s, H-6), 10.44 (1H, s, CHO);
MS (ESI): m/z = 210.2 (M+ + 1).
실시예 2. 5-(2- 카르복시에틸 )-3-히드록시-2- 메틸이소니코틴산 (14)(5-(2-Carboxyethyl)-3-hydroxy-2-methylisonicotinic acid (14))의 제조
아세토니트릴중 0.2M DMF 용매중 177 mg 에틸 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)프로파노익 산(13)(0.8 mmol)을 3시간동안 격렬하게 교반하면서 520 mg (0.8 mmol) 옥손(oxone)을 첨가하였다. 반응 색이 황색에서 무색으로 변화되었다. 산물을 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를 (Amberlite CG-50 resin사용) 수행하고 동결건조하여 고체형태의 표제물질인 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)을 수득하였다(수율: 47.7%).
1H NMR (D2O) δ 2.34 (3H, s, CH3), 2.50 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 2.74 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 7.53 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 226.3 (M+ + 1).
실시예 3. (3-(2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일)아크릴산 (15))(3-(2,2,8-Trimethyl-4H-[1,3]dioxino[4,5-c]pyridin-5-yl)acrylic acid (15))의 제조
100 mL 메탄올중 50 mL 수성 5% KOH용액에 3 g 에틸 3-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)아크릴레이트 (9) (12.1 mmol)을 3시간동안 격렬하게 교반하면서 첨가하였다. 반응용매를 감압농축하고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하고 동결건조하여 고체형태의 표제물질인 (3-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)아크릴산 (15)을 수득하였다(수율: 74.5%).
1H NMR (D2O) δ 1.57 (6H, s, 2xCH3), 2.38 (3H, s, CH3), 5.08 (2H, s, CH2), 6.43 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 7.20 (1H, d, J = 16.6 Hz), 8.17 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 250.2 (M+ + 1).
실시예 4. 3-(5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 아크릴 산 (16)(3-(5-Hydroxy-4-(hydroxymethyl)-6-methylpyridin-3-yl)acrylic acid (16)의 제조
메탄올중 수성 4N HCl용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 3-(5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)아크릴 산 (16)을 수득하였다(수율: 60.5%).
1H NMR (D2O) δ 2.45 (3H, s, CH3), 4.87 (2H, s, CH2), 6.43 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 7.26 (1H, d, J = 16.6 Hz, CH), 7.98 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 210.1 (M+ + 1).
실시예 5. 3-(4- 프로밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일)아크릴산 (17)(3-(4- Formyl -5-hydroxy-6-methylpyridin-3-yl)acrylic acid (17))의 제조
메탄올중 수성 4N HCl용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 3-(4-프로밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)아크릴산 (17)을 수득하였다 (수율: 52.4%).
1H NMR (DMSO-d 6) δ 2.39 (3H, s, CH3), 6.95 (1H, d, CH, J = 16.1 Hz), 7.58 (1H, d, CH, J = 16.1 Hz), 8.34 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 208.2 (M+ + 1).
실시예 6. 5-(2- 카르복시비닐 )-3-히드록시-2- 메틸이소니코틴산 (18)(5-(2-Carboxyvinyl)-3-hydroxy-2-methylisonicotinic acid (18))의 제조
메탄올중 수성 4N HCl용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 5-(2-카르복시비닐)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 (18)을 수득하였다 (수율: 71.3%).
1H NMR (DMSO-d 6) δ 2.31 (3H, s, CH3), 6.12(1H, d, CH, J = 16.8 Hz), 7.89 (1H, d, CH, J = 16.8 Hz), 8.76 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 224.2 (M+ + 1).
실시예 7. ( N -벤질-1-(2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일) 메탄아민 (19))( N - Benzyl -1-(2,2,8- trimethyl -4H-[1,3] dioxino [4,5-c] pyridin -5- yl ) methanamine (19))의 제조
디클로로메탄중 1.0% 초산용액에 녹인 200 mg (2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-카르브알데히드 (8)(1.0 mmol)용액에 126 μL (1.2 mmol) 벤질아민을 첨가하고 30분간 교반하였다. 90 mg NaBH3CN (1.4 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고 4시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 클로로포름 및 포화 NaHCO3으로 추출하고 MgSO4으로 건조, 여과, 농축 및 컬럼크로마토그래피로 정제(전개용매:dichloromethane/methanol = 30:1)를 수행하여 고체형태의 표제물질인 N-벤질-1-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일) 메탄아민 (19)을 수득하였다 (수율: 50.7%).
1H NMR (CDCl3) δ 1.54 (6H, s, 2xCH3), 2.39 (3H, s, CH3), 3.64 (2H, s, CH2), 3.78 (2H, s, CH2), 4.93 (2H, s, CH2), 7.25~7.40 (5H, m, phenyl), 7.92 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 299.4 (M+ + 1).
실시예 8. (에틸 3-(벤질((2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일) 메틸 ) 아미노) 프로파노에이트 (20)( Ethyl 3-(benzyl((2,2,8- trimethyl -4H-[1,3]dioxino[4,5-c]pyridin-5-yl)methyl) amino ) propanoate (20))의 제조
에탄올중 50 mg N-벤질-1-(2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일) 메탄아민 (19) 용액 (0.2 mmol)에 37 μL (0.3 mmol) 에틸아세테이트를 첨가하고 상온에서 하룻밤동안 교반하였다. 상기 혼합물을 감압농축하고 컬럼크로마토그래피로 정제(전개용매:chloroform/methanol = 50:1.)를 수행하여 고체형태의 표제물질인 (에틸 3-(벤질((2,2,8-트리메틸-4H-[1,3]디옥시노[4,5-c]피리딘-5-일)메틸) 아미노)프로파노에이트 (20)을 수득하였다(수율: 34.6%).
1H NMR (CDCl3) δ 1.14 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.45 (6H, s, 2xCH3), 2.31 (3H, s, CH3), 2.39 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 2.68 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2) , 3.36 (2H, s, CH2), 3.46 (2H, s, CH2), 4.01 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.69 (2H, s, CH2), 7.17~7.26 (5H, m, phenyl), 7.84 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 399.5 (M+ + 1).
실시예 9. (3-(벤질((5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 메틸 ) 아미노) 프로판노익산 (21))(3-(Benzyl((5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-6-methylpyridin-3-yl)methyl) amino ) propanoic acid (21))의 제조
메탄올중 수성 4N HCl용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 (3-(벤질((5-히드록시-4-(히드록시메틸)-6-메틸피리딘-3-일)메틸) 아미노) 프로판노익산 (21))을 수득하였다 (수율: 46.9%)
1H NMR (D2O) δ 2.42(3H, s, CH3), 2.53 (2H, t, J =7 .2 Hz, CH2), 3.02 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.95 (2H, s, CH2), 4.62 (2H, s, CH2), 7.35~7.45 (5H, m, phenyl), 7.62 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 331.4 (M+ + 1).
실시예 10. 3-(벤질((4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일) 메틸 )아미노) 프로파노익산 (22)(3-( Benzyl ((4- formyl -5- hydroxy -6- methylpyridin -3- yl ) methyl ) amino ) propanoic acid (22))의 제조
메탄올중 수성 4N HCl 용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 3-(벤질((4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일)메틸)아미노) 프로파노익산 (22)을 수득하였다 (수율: 34.5%).
1H NMR (CDCl3) δ 2.47 (3H, s, CH3), 2.51 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 2.78 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.61 (2H, s, CH2), 3.76 (2H, s, CH2), 7.24~7.33 (5H, m, phenyl), 8.01 (1H, s, H-6), 10.21 (1H, s, CHO);
MS (ESI): m/z = 329.4 (M+ + 1).
실시예 11. 5-(( 벤질(2-카르보에틸)아미노 ) 메틸 )-3-히드록시-2- 메틸이소니코틴산 (23)(5-((Benzyl(2-carboxyethyl)amino)methyl)-3-hydroxy-2-methylisonicotinic acid (23))의 제조
메탄올중 수성 4N HCl용액을 2 g 5-(2-카르복시에틸)-3-히드록시-2-메틸이소니크틴산 (14)(8.0 mmol)에 첨가하고 2일간 교반하였다. 반응은 분석용 HPLC 시스템으로 검색하였고 이온-교환 수지 컬럼 크로마토그래피를(Amberlite CG-50 resin사용) 수행하여 고체형태의 표제물질인 5-((벤질(2-카르보에틸)아미노)메틸)-3-히드록시-2-메틸이소니코틴산 (23)을 수득하였다 (수율: 42.6%)
1H NMR (D2O) δ 2.58 (3H, s, CH3), 2.55 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 2.82 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.71 (2H, s, CH2), 3.82 (2H, s, CH2), 7.24~7.33 (5H, m, phenyl), 8.01 (1H, s, H-6);
MS (ESI): m/z = 345.4 (M+ + 1).
실시예 12. 아조기 포함 화합물들의 일반적 합성법(화합물 24-29)
8 mg (0.1 mmol) NaNO2 를 아닐린 유사체 (0.1 mmol) 및 1 mL H2O 중 13 mg Na2CO3 용액 (0.1 mmol)의 교반용액에 0 oC에서 첨가하였다. 60 μL (0.3 mmol) 6 N HCl을 적가하고 상기 혼합물을 0 oC에서 5-10분간 교반하였다. 1 mL H2O 중 피리독살(pyridoxal)- 또는 피리독식 산(pyridoxic acid)의 카르복산 유사체 (0.1 mmol)를 한번에 첨가하고 혼합물의 pH 를 1N NaOH (~300 μL)를 첨가하여 pH 10-11으로 적정하였다. 황색에서 적색으로 변화했고(가끔 점차적으로) 이는 반응이 생기는 것을 의미한다. 0 oC에서 30분 및 25 oC에서 30분간 상기 혼합물을 교반한 후에, 물을 용출용매로 하여(유속량: 0.5 mL/min) 이온-교환 수지 컬럼크로마토그래피를 수행하여(Amberlite CG-50 resin사용; H+form, 약산성) 수행하여 정제하였다. HPLC상에서 단일 피크를 나타내는 적색 분획을 회수하고 동결건조하여 95% 순도 이상을 갖는 목적물질들을 수득하였다.
12-1. 3-(2-((2,5- 디설포페닐 ) 디아제닐 )-4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로판 산 (24)(3-(2-((2,5- Disulfophenyl ) diazenyl )-4- formyl -5- hydroxy -6-methylpyridin-3-yl) propanoic acid (24))의 제조.
상기 실시예 12의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 3-(2-((2,5-디설포페닐)디아제닐)-4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-3-일) 프로판 산 (24)을 수득하였다 (수율: 28.5%).
1H NMR (D2O) δ 2.39 (3H, s, CH3), 2.65 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.54 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 8.34 (1H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 8.62 (1H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 9.06 (1H, s, phenyl), 10.20 (1H, s, CHO);
MS (MALDI-TOF): m/z = 474.4 (M+ + 1).
12-2. (3-(2- 카르복시에틸 )-2-((2,5- 디설포페닐 ) 디아제닐 )-5-히드록시-6- 메틸이소니코틴산 (25)(3-(2- Carboxyethyl )-2-((2,5- disulfophenyl ) diazenyl )-5- hydroxy -6-methylisonicotinic acid (25))의 제조.
상기 실시예 12의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 3-(2-카르복시에틸)-2-((2,5-디설포페닐)디아제닐)-5-히드록시-6-메틸이소니코틴산(25)을 수득하였다 (수율: 32.4%)
1H NMR (D2O) δ 2.74 (3H, s, CH3), 2.85 (2H, t, J = 8.7 Hz, CH2), 3.84 (2H, t, J = 8.7 Hz, CH2), 8.03 (1H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 8.13 (1H, s, phenyl), 8.22 (1H, d, J = 8.1 Hz, phenyl);
MS (MALDI-TOF): m/z = 489.4 (M+ + 1).
12-3. 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸 -2-((4- 설포페닐 ) 디아제닐 )피리딘-3-일)프로판산 (26)(3-(4- Formyl -5- hydroxy -6- methyl -2-((4- sulfophenyl ) diazenyl ) pyridin -3-yl) propanoic acid (26))의 제조.
상기 실시예 12에 개시된 일반적 합성법과 유사한 방법으로 고체형태의 3-(4-포르밀-5-히드록시-6-메틸-2-((4-설포페닐)디아제닐)피리딘-3-일)프로판산 (26)을 수득하였다(수율: 26.2%)
1H NMR (D2O) δ 2.43 (3H, s, CH3), 2.65 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.50 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 7.67 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.82 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 10.29 (1H, s, CHO).
MS (MALDI-TOF): m/z = 394.3 (M+ + 1).
12-4. 3-(2- 카르복시에틸 )-5-히드록시-6- 메틸 -2-((4- 설포페닐 ) 디아제닐 ) 이소니코틴산 (27)(3-(2- carboxyethyl )-5- hydroxy -6- methyl -2-((4- sulfophenyl ) diazenyl ) isonicotinic acid (27))의 제조.
상기 실시예 12에 개시된 일반적 합성법과 유사한 방법으로 고체형태의 3-(2-카르복시에틸)-5-히드록시-6-메틸-2-((4-설포페닐)디아제닐) 이소니코틴산 (27)을 수득하였다 (수율: 28.3%).
1H NMR (D2O) δ 2.65 (3H, s, CH3), 2.73 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.68 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 7.79 (2H, d, J = 7.2 Hz, phenyl), 7.98 (2H, d, J = 7.2 Hz, phenyl);
MS (MALDI-TOF): m/z = 410.3 (M+ + 1).
12-5. 4-((3-(2- 카르복시에틸 )-4- 포르밀 -5-히드록시-6- 메틸피리딘 -2-일) 디아제닐 ) 벤조산 (28)(4-((3-(2- carboxyethyl )-4- formyl -5- hydroxy -6- methylpyridin -2- yl ) diazenyl) benzoic acid (28))의 제조.
상기 실시예 12에 개시된 일반적 합성법과 유사한 방법으로 고체형태의 4-((3-(2-카르복시에틸)-4-포르밀-5-히드록시-6-메틸피리딘-2-일) 디아제닐) 벤조산 (28)을 수득하였다 (수율: 32.5%).
1H NMR (D2O) δ 2.53 (3H, S, CH3), 2.62 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.75 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 7.94 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 8.06 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 10.52 (1H, s, CHO).
MS (MALDI-TOF): m/z = 358.3 (M+ + 1).
12-6. 3-(2- 카르복시에틸 )-2-((4- 카르복시페닐 ) 디아제닐 )-5-히드록시-6-메틸이소니코틴산(29)(3-(2- carboxyethyl )-2-((4- carboxyphenyl ) diazenyl )-5- hydroxy -6- methy lisonicotinic acid (29))의 제조.
상기 실시예 12에 개시된 일반적 합성법과 유사한 방법으로 고체형태의 3-(2-카르복시에틸)-2-((4-카르복시페닐)디아제닐)-5-히드록시-6-메틸이소니코틴산 (29)을 수득하였다 (수율: 24.5%)
1H NMR (D2O) δ 2.43 (3H, s, CH3), 2.58 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 3.52 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 7.63 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl), 7.98 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl).
MS (MALDI-TOF): m/z = 374.3 (M+ + 1).
실시예 13. 3,4- 디카르복시피리딘 유도체들의 일반적 제조방법 (화합물 35-41, 50,51).
13-1. 아미드 화합물 중간체의 제조 (32a-i)
150ml 디클로로메탄 중 다양한 카르복실산들 화합물들, 즉 2-phenylacetic acid (31a), 3-phenylpropanoic acid (31b), 3-(-4methoxyphenyl)propanoic acid (31c) cinnamic acid (31d), 3-((4methoxycarbonyl)phenyl)propanoic acid (31e), 3-(3-methoxyphenyl)propanoic acid (31f), 3-(2-methoxyphenyl)propanoic acid (31g) 3,3-diphenylpropanoic acid (31h), 2-naphtyl acetic acid(31i) (39.0 mol) 및 6 g (39.0 mmol) L-알라닌 에틸 에테르 용액에 15 g (78.0 mmol) EDCI [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide]을 도입하고 트리에틸아민(39.0 mmol)을 30분동안 적가하였다. 이 혼합물을 상온에서 12시간동안 교반하였다. 반응후, 혼합물을 탄산나트륨으로 중화시키고 물 및 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 회수하고 포화 Na2SO4로 처치하였다. 여과후, 유기성 추출물을 감압농축하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 1:1) 하기 중간체들을 제조하였다.
2- 페닐아세틸아미노 -프로판 산 에틸 에스테르 (32a)(2- Phenylacetylamino -propionic acid ethyl ester (32a).
수율: 97.4%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.22 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3) 1.33 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 3.59 (2H, s, CH2), 4.13 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.54 (1H, q, J = 7.2 Hz, CH), 6.12 (1H, d, J= 6.3 Hz, NH), 7.30 (2H, s, phenyl-1H), 7.32 (2H, s, phenyl-2H), 7.35 (1H, s, phenyl-3H);
MS (ESI): m/z = 236.1 (M+ + 1).
2-(3- 페닐 - 프로피오닐아미노 )-프로판산 에틸 에스테르 (32b)(2-(3- phenyl -propionylamino)-propionic acid ethyl ester (32b)).
수율: 92.3%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.24 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.32 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 2.48 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH2), 2.94 (2H, t, J = 8.1 Hz, CH2), 4.14 (2H, d, J = 6.9 Hz, CH2), 4.54 (1H, m, CH), 6.12 (1H, d, J= 6.6 Hz, NH), 7.18 (1H, s, phenyl-1H), 7.20 (1H, s phenyl-2H), 7.21 (1H, s, phenyl-3H), 7.25 (1H, s, phenyl-4H), 7.28 (1H, s, phenyl-5H);
MS (MALDI-TOF): m/z = 248.4 (M+ + 1).
2-[3-(4- 메톡시 - 페닐 )- 프로피오닐아미노 ]-프로판산 에틸 에스테르 (32c). (2-[3-(4-Methoxy-phenyl)-propionylamino]-propionic acid ethyl ester (32c))
수율: 95.6%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.25 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.33 (3H, d, J = 6.9 Hz, CH3), 2.48 (2H, t, J = 5.1 Hz, CH2), 2.89 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 3.78 (3H, s, CH3O), 4.15 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 4.52 (1H, m, CH), 5.95 (1H, d, J = 5.4 Hz, NH), 6.81 (2H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-1H), 7.10 (2H, d, J= 9.0 Hz, phenyl-2H),
MS (MALDI-TOF): m/z = 279.3 (M+ + 1).
2-(3- 페닐 - 아크릴로아미노 )-프로판산 에틸 에스테르 (32d). (2-(3- Phenyl -acroloylamino)-propionic acid ethyl ester (32d)).
수율: 81.3%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.49 (3H, d, J = 6.9 Hz, CH3), 4.22 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 4.72 (1H, m, CH), 6.27 (1H, d, J = 6.0 Hz, NH), 6.43 (1H, d, J= 15.6 Hz, CH), 7.37 (3H, phenyl-1H), 7.51 (2H, phenyl-2H), 7.63 (1H, d, J = 15.6 Hz, CH);
MS (ESI): m/z = 248.2 (M+ + 1).
4-[2-(1- 에톡시카르보닐 - 에틸카르바모일 )-에틸]-벤조산 메틸 에스테르 (32e)(4-[2-(1-Ethoxycarbonyl-ethylcarbamoyl)-ethyl]-benzoic acid methyl ester )(32e)
수율: 81.3%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.25 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.33 (3H, d, J = 6.9 Hz, CH3), 2.48 (2H, t, J = 5.1 Hz, CH2), 2.89 (2H, t, J = 7.5 Hz, CH2), 3.78 (3H, s, CH3O), 4.15 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 4.52 (1H, m, CH), 5.95 (1H, d, J = 5.4 Hz, NH), 6.81 (2H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-1H), 7.10 (2H, d, J= 9.0 Hz, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 307.5 (M+ + 1).
2-[3-(3- 메톡시 - 페닐 )- 프로피오닐아미노 ]-프로피온산 에틸 에스테르 (32f). (2-[3-(3-Methoxy-phenyl)-propionylamino]-propionic acid ethyl ester (32f)).
수율: 67.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.22 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.35 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 2.51 (2H, t, J= 6.9 Hz, CH2), 2.93 (2H, t, J = 8.1 Hz, CH2), 3.80 (3H, s, CH3O), 4.17 (2H, q, J= 7.2 Hz, CH2), 4.55 (1H, m, CH), 5.99 (1H, d, J = 5.4 Hz, NH), 6.80 (2H, m, phenyl-1H), 7.22 (2H, m, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 280.3 (M+ + 1).
에틸 2-(3-(2- 메톡시페닐 ) 프로판아미도 ) 프로파노에이트 (32g). ( Ethyl 2-(3-(2-methoxyphenyl)propanamido)propanoate (32g)).
수율: 79.8%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.22 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.35 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 2.53 (2H, t, J= 6.9 Hz, CH2), 2.88 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.79 (3H, s, CH3O), 4.15 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.53 (1H, m, CH), 5.96 (1H, d, J = 5.4 Hz, NH), 6.82-7.19 (4H, m, phenyl);
MS (ESI): m/z = 280.4 (M+ + 1).
에틸 2-(3,3- 디페닐프로판아미도 ) 프로파노에이트 (32h) ( Ethyl 2-(3,3-diphenylpropanamido)propanoate (32h)).
수율: 65%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.12 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 1.22 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.91 (2H, m, CH2), 4.12 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.43 (1H, m, CH), 4.55 (1H, m, CH), 5.8 (1H, d, J = 7.2 Hz, NH), 7.15-7.29 (10H, m, phenyl);
MS (ESI): m/z = 325.7 (M+ + 1).
에틸 2-(2-(나프탈렌-2-일) 아세트아미도 ) 프로파노에이트 (32i). ( Ethyl 2-(2-(naphthalen-2-yl)acetamido)propanoate) (32i).
수율: 73.6%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.20 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.31 (3H, d, J = 7.2 Hz, CH3), 3.74 (2H, s, CH2), 4.12 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.57 (1H, m, CH), 6.01 (1H, d, J = 6.8 Hz, NH), 7.38-7.50 (3H, m, naphtyl), 7.73-7.85 (4H, m, naphtyl);
MS (ESI): m/z = 285.8 (M+ + 1).
13-2. 옥사졸 화합물 중간체의 제조 (33a-i)
무수 클로로포름 중 2 g (14.0 mmol) 화합물들 32a-i 및 4g (14.0 mmol) 오산화 인 혼합물을 4시간동안 환류반응하였다. 상온에서 냉각후, 혼합물을 50 mL of 20% 수성 KOH 용액으로 처치하고 30분간 격렬하게 교반하였다. 상기 혼합물을 물 및 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기잔사를 회수하고 Na2SO4을 처리하였다. 여과후, 유기성 추출물을 감압농축하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 3:1) 하기 중간체들을 제조하였다.
2-벤질-5- 에톡시 -4- 메틸 - 옥사졸 (33a). (2- Benzyl -5- ethoxy -4- methyl - oxazole (33a)).
수율: 94.1%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.29 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.01 (3H, s, CH3), 3.94 (2H, s, CH2), 4.05 (2H, q, J = 6.9 Hz, CH2), 7.23 (1H, s, phenyl-1H), 7.26 (1H, s, phenyl-2H), 7.28 (1H, s, phenyl-3H), 7.31 (1H, s, phenyl-4H), 7.34 (1H, s, phenyl-5H);
MS (MALDI- TOF): m/z =216.9 (M+ + 1).
5- 에톡시 -4- 메틸 -2- 펜에틸 - 옥사졸 (33b) (5- Ethoxy -4- methyl -2- phenethyl - oxazole (33b)).
수율: 94.4%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.34 (3H, t, J = 6.0 Hz, CH3), 2.02 (3H, s, CH3), 2.90 (2H, t, J = 6.0 Hz, CH2), 4.02 (2H, t, J= 6.0 Hz, CH2), 7.22 (1H, s, phenyl-1H), 7.23 (1H, s, phenyl-2H), 7.27 (1H, s, phenyl-3H), 7.28 (1H, s, phenyl-4H), 7.30 (1H, s, phenyl-5H);
MS (MALDI- TOF): m/z = 232.0 (M+ + 1).
5- 에톡시 -2-[2-(4- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-4- 메톡시 - 옥사졸 (33c) ( 5- Ethoxy -2-[2-(4-methoxy-phenyl)-ethyl]-4-methoxy-oxazole (33c))
수율: 91.0%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.31 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.01 (3H, s, CH3), 2.83 (2H, t, J = 6.0 Hz, CH2), 2.90 (2H, t, J = 6.0 Hz, CH2), 4.05 (3H, s, OCH3), 6.81 (1H, d, J= 8.7 Hz, phenyl-1H), 7.10 (1H, d, J = 5.4 Hz, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 262.4 (M+ + 1).
5- 에톡시 -4- 메틸 -2- 스티릴 - 옥사졸 (33d). (5- Ethoxy -4- methyl -2- styryl - oxazole (33d))
수율: 92.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.36 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.11 (3H, s, CH3), 4.30 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 6.45 (1H, d, J = 15.9 Hz, CH), 6.76 (1H, d, J = 17.1 Hz, CH), 7.38 (3H, s, phenyl-1H), 7.52 (2H, s, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 230.3 (M+ + 1).
4-[2-(5- 에톡시 -4- 메틸 - 옥사졸 -2-일)-에틸]- 벤조 산 메틸 에스테르 (33e). (4-[2-(5-Ethoxy-4-methyl-oxazole-2-yl)-ethyl]-benzoic acid methyl ester (33e))
수율: 66.5%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.32 (3H, t, J = 6.0 Hz, CH3), 2.01 (3H, s, CH3), 2.91 (2H, t, J = 5.4 Hz, CH2), 3.04 (2H, t, J = 6.0 Hz, CH2), 3.91 (3H, s, OCH3), 4.06 (2H, d, J = 6.0 Hz, CH2), 7.27 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl-1H), 7.95 (2H, d, J= 8.1 Hz, phenyl-2H);
MS (MALDI-TOF): m/z = 290.4 (M+ + 1).
5- 에톡시 -2-[2-(3- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-4- 메톡시 - 옥사졸 (33f). (5- Ethoxy -2-[2-(3-methoxy-phenyl)-ethyl]-4-methoxy-oxazole (33f)).
수율: 46.4%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.34 (3H, t, J = 6.9 Hz, CH3), 2.04 (3H, s, CH3), 2.90 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.01 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.81 (3H, s, CH3O), 6.78 (3H, m, phenyl-1H), 7.20 (1H, m, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z =262.3 (M+ + 1).
5- 에톡시 -2-(2- 메톡시펜에틸 )-4-메틸옥사졸(33g)(5- ethoxy -2-(2-methoxyphenethyl)-4-methyloxazole (33g)).
수율: 79.8%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.32 (3H, t, J = 6.9 Hz, CH3), 2.03 (3H, s, CH3), 2.90 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.02 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.92 (3H, s, CH3O), 6.76-7.32 (4H, m, phenyl);
MS (MALDI-TOF): m/z = 262.3 (M+ + 1).
2-(2,2- 디페닐에틸 )-5- 에톡시 -4- 메틸옥사졸 (33h) (2-(2,2- diphenylethyl )-5-ethoxy-4-methyloxazole (33h))
수율: 99%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.20 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.92 (3H, s, CH3), 3.33 (2H, d, J = 8.4 Hz, CH2), 3.93 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.53 (1H, t, J = 8.0 Hz, CH), 7.15-7.28 (10H, m, phenyl);
MS (MALDI-TOF): m/z = 307.8 (M+ + 1).
5- 에톡시 -4- 메틸 -2-(나프탈렌-2- 일메틸 ) 옥사졸 (33i) (5- ethoxy -4- methyl -2-(naphthalen-2-ylmethyl)oxazole (33i))
수율: 98%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.29 (3H, t, J = 6.8 Hz, CH3), 2.01 (3H, s, CH3), 4.04 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.10 (2H, s, CH2), 7.39-7.46 (3H, m, naphtyl), 7.71-7.81 (4H, m, naphtyl);
MS (MALDI-TOF): m/z = 262.3 (M+ + 1).
13-3. 3,4-디메틸에스테르 피리딘 화합물 중간체의 제조 (34a-i)
750 mg (3.4 mmol) 화합물 33a-i 에 1 mL (1.9 mmol) 디메틸말리에이트( dimethyl maleate)를 적가하고 교반하에 5시간동안 환류시키고 상온에서 냉각시켰다. 혼합물을 HCl 가스로 포화시키고 감압농축하였다. 얻어진 하기 화합물 중간체들(34a-g)을 제조하였다.
2-벤질-5-히드록시-6- 메틸 -피리딘-3,4- 디카르복실 산 디메틸 에스테르 (34a) (2-Benzyl-5-hydroxy-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34a))
수율: 59.1%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.84 (3H, s, CH3), 3.76 (3H, s, CH3O), 4.00 (3H, s, CH3O), 4.42 (2H, s, CH2), 7.24 (1H, s, phenyl-1H), 7.27 (1H, s, phenyl-2H), 7.28 (1H, s, phenyl-3H), 7.30 (1H, s, phenyl-4H), 7.31 (1H, s, phenyl-5H);
MS (MALDI-TOF): m/z = 314.9 (M+ + 1).
5-히드록시-6- 메틸 -2- 펜에틸 -피리딘-3,4- 디카르복실 산 디메틸 에스테르 (34b). (5-Hydroxy-6-methyl-2-phenethyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34b))
수율: 30.1%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.64 (3H, s, CH3), 3.10 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.35 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 4.00 (3H, s, CH3O), 4.10 (3H, s, CH3O), 7.20 (1H, s, phenyl-1H), 7.22 (1H, s, phenyl-2H), 7.24 (1H, s, phenyl-3H), 7.26 (1H, s, phenyl-4H), 7.29 (1H, s, phenyl-5H);
MS (ESI): m/z = 330.4 (M+ + 1).
5-히드록시-2-[2-(4- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 디메틸 에스테르(34c). (5- Hydroxy -2-[2-(4- methoxy - phenyl )- ethyl ]-6- methyl - pyridine -3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34c)).
수율: 37.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 3.02 (3H, s, CH3), 3.04 (2H, t, J= 4.8 Hz, CH2), 3.32 (2H, t, J = 4.8 Hz, CH2), 3.79 (2H, s, CH2), 4.00 (3H, s, CH3O), 4.08 (3H, s, CH3O), 6.83 (2H, d, J = 8.7 Hz, phenyl-1H), 7.27 (1H, d, J = 5.4 Hz, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 360.4 (M+ + 1).
5-히드록시-6- 메틸 -2- 스티릴 -피리딘-3,4-디카르복실산 디메틸 에스테르 (34d)(5-Hydroxy-6-methyl-2-styryl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34d))
수율: 23.3%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.49 (3H, s, CH3), 3.83 (6H, s, 2xCH3O), 6.82 (1H, d, J = 15.4 Hz, olefin-CH), 7.20 (3H, m, phenyl-1H), 7.38 (2H, d, J= 5.4 Hz, phenyl-2H), 7.72 (1H, t, J = 15.6 Hz, olefin-CH);
MS (ESI): m/z = 328.2 (M+ + 1).
5-히드록시-2-[2-(4- 메톡시카르보닐 - 페닐 )-에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 디메틸 에스테르 (34e) (5- Hydroxy -2-[2-(4- methoxycarbonyl - phenyl )- ethyl ]-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34e)).
수율: 33.4%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.57 (3H, s, CH3), 2.90 (2H, t, J= 9.0 Hz, CH2), 3.04 (2H, t, J = 9.3 Hz, CH2), 3.86 (3H, s, CH3O), 3.91 (3H, s, CH3O), 3.95 (3H, s, COOCH3), 7.25 (2H, d, J = 8.7 Hz, phenyl-1H), 7.94 (2H, d, J = 6.6 Hz, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 388.4 (M+ + 1).
5-히드록시-2-[2-(3- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 디메틸 에스테르 (34f). (5- Hydroxy -2-[2-(3- methoxy - phenyl )- ethyl ]-6- methyl - pyridine -3,4-dicarboxylic acid dimethyl ester (34f))
수율: 7.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 3.00 (3H, s, CH3), 3.10 (2H, t, J = 3.9 Hz, CH2), 3.35 (2H, t, J = 7.8 Hz, CH2), 3.86 (2H, s, CH2), 3.98 (3H, s, CH3O), 4.10 (3H, s, CH3O), 6.78 (1H, dd, J = 7.5 Hz, 8.1 Hz, phenyl-1H), 6.90 (1h, d, J= 7.5 Hz, phenyl-2H), 7.00 (1H, s, phenyl-3H), 7.21 (1H, t, J = 8.1 Hz, phenyl-4H);
MS (ESI): m/z = 360.1 (M+ + 1).
디메틸 5-히드록시-2-(2- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸피리딘 -3,4- 디카르복실레이트 (34g). (Dimethyl 5- hydroxy -2-(2- methoxyphenethyl )-6- methylpyridine -3,4- dicarboxylate (34g))
수율: 23.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.58 (3H, s, CH3), 2.92 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 2.99 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.83 (3H, s, CH3O), 3.86 (3H, s, COOCH3), 3.94 (3H, s, COOCH3), 6.84-7.21 (4H, m, phenyl), 10.55 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 340.4 (M+ + 1).
디메틸2 -(2,2- 디페닐에틸 )-5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3,4- 디카르복실레이트 (34h)(Dimethyl 2-(2,2- diphenylethyl )-5- hydroxy -6- methylpyridine -3,4- dicarboxylate (34h))
수율: 21%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.46 (3H, s, CH3), 3.37 (2H, t, J = 8.0 Hz, CH2), 3.75 (3H, s, COOCH3), 3.88 (3H, s, COOCH3), 7.10-7.24 (1H, m, phenyl), 10.47 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 406 (M+ + 1).
디메틸 5-히드록시-2-(2- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸피리딘 -3,4- 디카르복실레이트 (34i) ( Dimethyl 5- hydroxy -2-(2- methoxyphenethyl )-6- methylpyridine -3,4-dicarboxylate (34i)).
수율: 23.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.54 (3H, s, CH3), 3.72 (3H, s, COOCH3), 3.92 (3H, s, COOCH3), 4.21 (2H, s, CH2), 7.35-7.48 (3H, m, naphtyl), 7.62-7.78 (4H, m, naphtyl), 10.57 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 366.4 (M+ + 1).
13-4. 3,4- 디카르복시피리딘 화합물의 제조 (35-41, 50, 51)
1 g (3.2 mmol) 화합물들 34a-i 에 20 mL 수성20% KOH 용액을 첨가하여 6시간동안 격렬하게 교반하였다. 상기 혼합물을 이온-교환 수지 컬럼크로마토그래피를 수행하여(Amberlite CG-50 resin사용) 정제하여 하기 목적물질들인 화합물 35-41, 50, 51을 각각 수득하고 순도는 분석용 HPLC 시스템으로 측정하였다.
2-벤질-5-히드록시-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (35)( 2- Benzyl -5- hydroxy -6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (35))
수율: 65.9%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.28 (3H, s, CH3), 3.91 (3H, s, CH3O), 7.11 (1H, s, phenyl-1H), 7.13 (1H, s, phenyl-2H), 7.16 (1H, s, phenyl-3H), 7.18 (1H, s, phenyl-4H), 7.20 (1H, s, phenyl-5H);
MS (ESI): m/z = 286.1 (M+ + 1);
원소분석: (C15H13NO5) C, H, N.
5-히드록시-6- 메틸 -2- 펜에틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (36)( 5- Hydroxy -6- methyl -2-phenethyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (36))
수율: 69.7%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.31 (3H, s, CH3), 2.84 (4H, m, 2xCH2), 7.18 (1H, s, phenyl-1H), 7.22 (1H, s, phenyl-2H), 7.24 (1H, s, phenyl-3H), 7.26 (1H, s, phenyl-4H), 7.29 (1H, s, phenyl-4H), MS (ESI): m/z = 300.1 (M+ + 1);
원소분석: (C16H15NO5) C, H, N.
5-히드록시-2-[2-(4- 메톡시 - 페닐 )에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (37) (5-Hydroxy-2-[2-(4-methoxy-phenyl)ethyl]-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (37))
수율: 74.6%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.25 (3H, s, CH3), 2.80 (4H, m, 2xCH2), 3.80 (3H, s, CH3O), 6.91 (2H, d, J= 8.7 Hz, phenyl-1H), 7.21 (2H, d, J = 9.0 Hz, phenyl-2H), MS (ESI): m/z = 332.3 (M+ + 1);
원소분석: (C17H17NO6) C, H, N.
5-히드록시-6- 메틸 -2- 스티릴 -피리딘-3,4-디카르복실산 (38)(5- Hydroxy -6- methyl -2-styryl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (38))
수율: 56.0%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.42 (3H, s, CH3), 7.11 (1H, t, J = 16.5 Hz, olefin-CH), 7.30 (1H, t, J = 16.5 Hz, olefin-CH), 7.28 (3H, m, phenyl-1H), 7.55 (2H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-2H), MS (ESI): m/z = 298.1 (M+ + 1);
원소분석: (C16H13NO5) C, H, N.
2-[2-(4- 카르복시 - 페닐 )-에틸]-5-히드록시-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (39) (2-[2-(4-Carboxy-phenyl)-ethyl]-5-hydroxy-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (39)).
수율: 83.8%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.38 (3H, s, CH3), 2.94 (4H, m, 2xCH2), 7.22 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl-1H), 7.72 (2H, d, J = 8.1 Hz, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 346.3 (M+ + 1);
원소분석: (C17H15NO7) C, H, N.
5-히드록시-2-[2-(3- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (40). (5-Hydroxy-2-[2-(3-methoxy-phenyl)-ethyl]-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (40))
수율: 59.3%;
1H-NMR (CDCl3) δ 2.34 (3H, s, CH3), 2.87 (4H, m, 2xCH2), 3.74 (3H, s, CH3O), 6.77 (3H, m, phenyl-1H), 7.24 (2H, m, phenyl-2H);
MS (ESI): m/z = 332.3 (M+ + 1);
원소분석:(C17H17NO6) C, H, N.
5-히드록시-2-[2-(2- 메톡시 - 페닐 )-에틸]-6- 메틸 -피리딘-3,4-디카르복실산 (41) (5-Hydroxy-2-[2-(2-methoxy-phenyl)-ethyl]-6-methyl-pyridine-3,4-dicarboxylic acid (41))
수율: 71.8%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 2.99 (3H, s, CH3), 2.86 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 2.89 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 6.88 (1H, t, J = 7.2 Hz, phenyl-1H), 6.96 (1H, dd, J = 0.9 Hz, 0.9 Hz, phenyl-2H), 7.11 (1H, dd, J= 1.8 Hz, 1.8 Hz, phenyl-3H), 7.19 (1H, s, phenyl-5H);
MS (ESI): m/z = 332.3 (M+ + 1);
원소분석: (C17H17NO6) C, H, N.
5-히드록시-6- 메틸 -2-(나프탈렌-1- 일메틸 )피리딘-3,4-디카르복실산 (50) (5-Hydroxy-6-methyl-2-(naphthalene-1-ylmethyl)pyridine-3,4-dicarboxylic acid (50))
수율: 54.5%;
1H-NMR (MeOH-d4) δ 2.36 (3H, s, CH3), 4.22 (2H, s , CH2), 7.34 (4H, m, naphtyl-4H), 7.71 (3H, m, phenyl-3H);
MS (ESI): m/z = 337.3 (M+ + 1);
원소분석: (C19H15NO5) C, H, N.
2-(2,2,- 디페닐에틸 )5-히드록시-6- 메틸피리딘 -3,4-디카르복실산 (51) (2-(2,2,-diphenylethyl)5-hydroxy-6-methylpyridine-3,4-dicarboxylic acid (51))
수율: 55.6%;
1H-NMR (MeOH-d4) δ 2.36 (3H, s, CH3), 3.38 (2H, d, J = 8.0 Hz, phenyl-2H), 4.74 (H, t, J = 8.0 Hz, CH), 7.19 (10H, m, diphenyl-10H);
MS (ESI): m/z = 377.4 (M+ + 1);
원소분석: (C22H19NO5) C, H, N.
실시예 14. 4-아세틸-3- 카르복시피리딘 유도체들의 일반적 제조방법(화합물 44-49)
14-1. 4-아세틸-3- 메틸에스테르 피리딘 중간체의 제조 (43a-g)
상기에서 제조한 옥사졸 유도체 중간체들 즉, 화합물들 33a-f (8.0 mmole) 및 2 g (12.0 mmol) 에틸 4-옥소펜트-2-에놀레이트를 서로 잘 혼합하고 10-14시간동안 55-60oC 로 가열하였다. 중간체들(Diels-Alder 부가물)을 25 mL 에탄올에 용해시키고 0oC로 냉각시켰다. HCl 가스를 20분 동안 반응혼합물에 통과시키고 반응 혼합물을 0-10oC에서 약 30분 및 상온에서 1시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 100 mL of 8% 수성 탄산 나트륨 용액에 가하고 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 농축하고 조 산물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 하기 화합물 중간체들을(43a-g) 수득하였다.
에틸 4-아세틸-2-벤질-5-히드록시-6- 메틸니코티네이트 (43a) ( Ethyl 4- acetyl -2-benzyl-5-hydroxy-6-methylnicotinate (43a))
수율: 22.9%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.17 (3H, t, J = 6.9 Hz, CH3), 2.55 (3H, s, CH3-pyridine), 2.59 (3H, s, CH3CO), 3.21 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH2), 3.58 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 4.43 (2H, q, J = 6.9 Hz, CH2O), 7.17-7.45 (5H, m, phenyl), 11.34 (1H, s, OH);
MS (FAB+): m/z = 314.3 (M+ + 1).
에틸 4-아세틸-5-히드록시-6- 메틸 -2- 펜에틸니코티네이트 (43b) ( Ethyl 4- acetyl -5-hydroxy-6-methyl-2-phenethylnicotinate (43b))
수율: 9.5%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.28 (3H, t, J = 6.9 Hz, CH3), 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 3.00 (2H, t, J= 7.2 Hz, CH2), 3.23 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 4.41 (2H, q, J = 6.9 Hz, CH2O), 7.18-7.30 (5H, m, phenyl), 11.42 (1H, s, OH);
MS (MALDI-TOF): m/z = 328.4 (M+ + 1).
에틸 4-아세틸-5-히드록시-2-(4- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸니코티네이트 (43c)( Ethyl 4-acetyl-5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinate (43c))
수율: 12.8%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.34 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 2.94(2H, d, J= 7.2 Hz, CH2), 3.03 (2H, d, J = 7.2 Hz, CH2), 3.80 (3H, s, CH3O), 4.35 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2O), 6.82 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl-1H+5H), 7.11 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl-2H+4H), 11.38 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 358.3 (M+ + 1).
(E)-에틸 4-아세틸-5-히드록시-6- 메틸 -2- 스티릴니코티네이트 (43d) ((E)- ethyl 4-acetyl-5-hydroxy-6-methyl-2-styrylnicotinate (43d))
수율: 14.2%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.20 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.89 (3H, s, CH3-pyridine), 2.66 (3H, s, CH3CO), 4.10 (3H, q, J= 7.2 Hz, CH2O), 7.26-7.40 (3H, m, phenyl-2H+3H+4H), 7.65 (1H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-1H), 7.67 (1H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-5H), 7.96 (1H, d, J = 15.9 Hz, =CH), 8.01 (1H, d, J = 15.9 Hz, =CH);
MS (ESI): m/z = 326.2 (M+ + 1).
에틸 4-아세틸-5-히드록시-2-(3- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸니코티네이트 (43e) ( Ethyl 4-acetyl-5-hydroxy-2-(3-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinate (43e)).
수율: 9.5%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.21 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 1.85 (3H, s, CH3-pyridine), 2.60 (3H, s, CH3CO), 2.98 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.43 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.78 (3H, s, CH3O), 6.79-6.84 (3H, m, phenyl-1H+2H+3H), 7.31 (1H, s, phenyl-5H), 11.28 (1H, b, OH);
MS (ESI): m/z = 357.4 (M+ + 1).
에틸 4-아세틸-5-히드록시-2-(2- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸니코티네이트 (43f) ( Ethyl 4-acetyl-5-hydroxy-2-(2-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinate (43f))
수율: 12.8%;
1H-NMR (CDCl3) δ 1.34 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3), 2.51 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 2.96 (2H, t, J= 6.9 Hz, CH2), 3.40 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.81 (3H, s, CH3O), 6.85-7.26 (4H, m, phenyl-1H+2H+3H+4H), 11.35 (1H, b, OH);
MS (ESI): m/z = 357.4 (M+ + 1).
14-2. 4-아세틸-3- 카르복시 피리딘 화합물들의 제조 (44-49)
상기에서 제조한 유도체 중간체들 즉, 화합물들 43a-f (0.84 mmole)을 메탄올중 40 mL 5% KOH을 첨가하고 2-3시간동안 상온에서 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 1:1 HCl으로 산성화시키고 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고 농축하였다. 조 산물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (전개용매: ethyl acetate/n-hexanes solvent system) 하기 화합물들을(44-49) 수득하였다.
4-아세틸-2-벤질-5-히드록시-6- 메틸니코틴산 (44)(4- acetyl -2- benzyl -5- hydroxy -6-methylnicotinic acid (44).
수율: 82.1%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 2.55 (3H, s, CH3-pyridine), 2.59 (3H, s, CH3CO), 3.21 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 7.17-7.45 (5H, m, phenyl), 11.30 (1H, s, OH);
MS (FAB+): m/z = 286.2 (M+ + 1);
원소분석: (C16H15NO4) C, H, N.
4-아세틸-5-히드록시-6- 메틸 -2- 펜에틸니코틴산 (45)(4- acetyl -5- hydroxy -6- methyl -2-phenethylnicotinic acid (45))
수율: 78.9%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 3.00 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.23 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2) 7.18-7.30 (5H, m, phenyl), 11.42 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 300.2 (M+ + 1);
원소분석: (C17H17NO4) C, H, N.
4-아세틸-5-히드록시-2-(4- 메톡시펜에틸 )-6- 메틸니코틴산 (46)(4- acetyl -5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinic acid (46))
수율: 89.8%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 2.94(2H, d, J = 7.2 Hz, CH2), 3.03 (2H, d, J = 7.2 Hz, CH2), 3.80 (3H, s, CH3O), 6.82 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl-1H+5H), 7.11 (2H, d, J= 8.4 Hz, phenyl-2H+4H), 11.38 (1H, s, OH);
MS (ESI): m/z = 330.4 (M+ + 1);
원소분석: (C18H19NO5) C, H, N.
(E)-4-아세틸-5-히드록시-6- 메틸 -2- 스티릴니코틴산 (47) ((E)-4- acetyl -5- hydroxy -6-methyl-2-styrylnicotinic acid (47))
수율: 83.6%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 1.89 (3H, s, CH3-pyridine), 2.66 (3H, s, CH3CO), 7.26-7.40 (3H, m, phenyl-2H+3H+4H), 7.65 (1H, d, J= 7.2 Hz, phenyl-1H), 7.67 (1H, d, J = 7.2 Hz, phenyl-5H), 7.96 (1H, d, J = 15.9 Hz, =CH), 8.01 (1H, d, J= 15.9 Hz, =CH);
MS (ESI): m/z = 298.2 (M+ + 1);
원소분석: (C17H15NO4) C, H, N.
(E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(3- 메톡시스티릴 )-6- 메틸니코틴산 (48)( (E)-4- acetyl -5-hydroxy-2-(3-methoxystyryl)-6-methylnicotinic acid (48))
수율: 69.9%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 1.85 (3H, s, CH3-pyridine), 2.60 (3H, s, CH3CO), 2.98 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.43 (2H, t, J = 7.2 Hz, CH2), 3.78 (3H, s, CH3O), 6.79-6.84 (3H, m, phenyl-1H+2H+3H), 7.31 (1H, s, phenyl-5H), 11.28 (1H, b, OH);
MS (ESI): m/z =330.2 (M+ + 1);
원소분석: (C18H19NO5) C, H, N.
(E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(2- 메톡시스티릴 )-6- 메틸니코틴산 (49) ((E)-4- acetyl -5-hydroxy-2-(2-methoxystyryl)-6-methylnicotinic acid (49))
수율: 75.2%;
1H-NMR (DMSO-d 6) δ 2.51 (3H, s, CH3-pyridine), 2.56 (3H, s, CH3CO), 2.96 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.40 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2), 3.81 (3H, s, CH3O), 6.85-7.26 (4H, m, phenyl-1H+2H+3H+4H), 11.35 (1H, b, OH), MS (ESI): 330.4 (M+ + 1);
원소분석: (C18H19NO5) C, H, N.
실시예 15. 4- 포르밀 -3- 카르복시피리딘 유도체들의 일반적 제조방법(화합물 61,64)
15-1. 디메틸 5-[ 벤질옥시 ]-2-[2- 메톡시페닐 ]-6- 메틸피리딘 -3,4- 디카르복시레이트 (Dimethyl 5-[ benzyloxy ]-2-[4- methoxyphenethyl ]-6- methylpyridine -3,4-dicarboxylate) 중간체의 제조 (52)
무수 아세톤 중 480 mg (1.4 mmol) 화합물 34d 에 192 uL (1.7 mmol) 벤질브로마이드(benzyl bromide)를 적가하고 2시간동안 환류시키고 상온에서 냉각시켰다. 암모늄클로라이드(NH4Cl)로 중화를 시킨 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기잔사를 회수하고 Na2SO4을 처리하였다. 여과 후, 유기성 추출물을 감압농축하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (전개용매: n-hexanes/ethyl acetate = 3:1) 하기 중간체를 제조하였다.
수율: 83.5%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.56 (3H, s, CH3-pyridine), 2.94 (2H, m, CH2), 3.18 (2H, m, CH2), 3.78 (3H, s, CH3O), 3.83 (3H, s, CH3O), 3.85 (3H, s, CH3O), 4.95 (2H, s, CH2-benzyl), 6.83 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.16 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.41 (5H, m, phenyl),
MS (ESI): m/z = 449.5 (M+ + 1),
원소분석: (C27H26NO6) C, H, N.
15-2. (5-[ 벤질옥시 ]-2-[4- 메톡시페네틸 ]-6- 메틸피리딘 -3,4- 디일 ) 디메탄올 ({5-[benzyloxy]-2-[4-methoxyphenethyl)-6-methylpyridine-3,4-diyl}dimethanol) 중간체의 제조 (53)
무수 THF(tetrahydrofuran) 중 20 mg (0.04 mmol) 화합물 52 에 12 uL (0.26 mmol) 리튬알루미늄하이드라이드(LiAlH4)를 적가하고 0 oC에서 2시간동안 교반시켰다. 암모늄클로라이드(NH4Cl)로 중화를 시킨 후 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기잔사를 회수하고 Na2SO4을 처리하였다. 여과 후, 유기성 추출물을 감압농축하고 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (전개용매: chloroform/methanol = 100:1) 하기 중간체를 제조하였다.
수율: 47.5%,
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.54 (3H, s, CH3-pyridine), 2.95 (2H, m, CH2), 3.10 (2H, m, CH2), 3.76 (3H, s, CH3O), 4.55 (2H, s, CH2OH), 4.68 (2H, s, CH2OH), 4.91 (2H, s, CH2-benzyl), 6.78 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.04 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.41 (5H, m, phenyl), MS (ESI): m/z = 394.4 (M+ + 1),
원소분석: (C24H27NO4) C, H, N.
15-3. (5-히드록시-2-[4- 메톡시페네틸 ]- 6메틸피리딘 -3,4- 디일 ) 디메탄올 피리딘 ({5-hydroxy-2-[4-methoxyphenethyl]-6-methylpyridine-3,4-diyl}dimethanol) 중간체의 제조 (54)
무수 메탄올 중 65 mg (0.16 mmol) 화합물 53 에 20 mg (0.26 mmol) Pd/C을 가하고 0 oC에서 수소 대기하에 15분동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 세라툼 베드(celatum bed)를 통하여 여과하였다. 상기 여과물을 감압증발시키고 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 (전개용매: chloroform/methanol = 50:1) 하기 중간체를 제조하였다.
수율: 90%,
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.47 (3H, s, CH3-pyridine), 2.88 (2H, m, CH2), 3.01 (2H, m, CH2), 3.76 (3H, s, CH3O), 4.36 (2H, s, CH2OH), 4.98 (2H, s, CH2OH), 6.75 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 6.95 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl),
MS (ESI): m/z = 304.4 (M+ + 1),
원소분석: (C17H21NO4) C, H, N.
15-4. 6-(4- 메톡시페네틸 )-2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5-일 메탄올 ((6-(4- methoxyphenethyl )-2,2,8- trimethyl -4H-[1,3] dioxino [4,5-c] pyridin -5-yl) methanol 중간체의 제조 (55)
상기 실시예 1-2의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 62%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.55 (6H, s, 2CH3), 2.41 (3H, s, CH3-pyridine), 2.92 (2H, m, CH2), 3.01 (2H, m, CH2), 3.75 (3H, s, CH3O), 4.31 (2H, s, CH2OH), 4.88 (2H, s, CH2OH), 6.77 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 6.96 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), MS (ESI): m/z = 344.4 (M+ + 1),
원소분석: (C20H25NO4) C, H, N.
15-5. 6-(4- 메톡시페네틸 )-2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘-5- 카르브 알데히드 6-(4- methoxyphenethyl )-2,2,8- trimethyl -4H-[1,3] dioxino [4,5-c]pyridine-5- carbaldehyde 중간체의 제조 (56)
상기 실시예 1-3의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 96%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.55 (6H, s, 2CH3), 2.47 (3H, s, CH3-pyridine), 2.94 (2H, m, CH2), 3.30 (2H, m, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 5.08 (2H, s, CH2OH), 6.78 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.03 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 10.19 (H, s, CHO), MS (ESI): m/z = 342.2 (M+ + 1),
원소분석: (C20H23NO4) C, H, N.
15-6. (E)-에틸 3-(6-(4- 메톡시페네틸 )-2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c] 피리딘-5-일) 아크릴레이트 {(E)- ethyl 3-(6-(4- methoxyphenethyl )-2,2,8-trimethyl-4H -[1,3] dioxino [4,5-c] pyridin -5- yl ) acrylate } 중간체의 제조 (57)
상기 실시예 1-5의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 93%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.32 (3H, t, J = 7.2 Hz CH3), 1.55 (6H, s, 2CH3), 2.42 (3H, s, CH3-pyridine), 2.88 (2H, m, CH2), 2.97 (2H, m, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 4.25 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.75 (2H, s, CH2OH), 5.81 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH), 6.77 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.04 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.54 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH),
MS (ESI): m/z = 412.3 (M+ + 1),
원소분석: (C24H29NO5) C, H, N.
15-7. (E)-에틸 3-(5-히드록시-4- 히드록시메틸 -2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 아크릴레이트 {(E)- ethyl 3-(5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-2- (4-methoxyphenethyl)-6-methylpyridin-3-yl)acrylate} 중간체의 제조 (58)
상기 실시예 1-6의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 83%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.30 (3H, t, J = 7.2 Hz CH3), 2.45 (3H, s, CH3-pyridine), 2.82 (2H, m, CH2), 2.87 (2H, m, CH2), 3.76 (3H, s, CH3O), 4.21 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.90 (2H, s, CH2OH), 5.61 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH), 6.75 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 6.99 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.54 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH),
MS (ESI): m/z = 372.1 (M+ + 1),
원소분석: (C21H25NO5) C, H, N.
15-7. 에틸 3-(5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노에이트 { ethyl 3-(5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-2- (4-methoxyphenethyl)-6-methylpyridin-3-yl)propanoate} 중간체의 제조 (59)
상기 실시예 1-6의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 84%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.18 (3H, t, J = 7.2 Hz CH3), 2.31 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 2.45 (3H, s, CH3-pyridine), 2.75 (2H, t, J = 7.6 Hz, CH2), 2.82 (2H, m, CH2), 2.91 (2H, m, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 4.05 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 4.94 (2H, s, CH2OH), 6.78 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.54 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), MS (ESI): m/z = 373.9 (M+ + 1),
원소분석: (C21H27NO5) C, H, N.
15-8. 에틸 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노에이트 { ethyl 3-(4- formyl -5- hydroxy -2-(4- methoxyphenethyl )-6- methylpyridin-3-yl)propanoate} 중간체의 제조 (60)
상기 실시예 1-7의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 81%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.21 (3H, t, J = 7.2 Hz CH3), 2.40 (2H, t, J = 8.0 Hz, CH2), 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.98 (4H, m, 2CH2), 3.10 (2H, t, J = 8.0 Hz, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 4.11 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 6.78 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 10.42 (1H, s, CHO). MS (ESI): m/z = 371.9 (M+ + 1),
원소분석: (C21H25NO5) C, H, N.
15-9. 3-(4- 포르밀 -5-히드록시-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 프로파노익산 {3-(4- formyl -5- hydroxy -2-(4- methoxyphenethyl )-6- methylpyridin -3-yl)propanoic acid } 화합물의 제조 (61)
상기 실시예 1-8의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 화합물을 제조하였다.
수율: 32%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.43 (2H, t, J = 8.4 Hz, CH2), 2.52 (3H, s, CH3-pyridine), 2.98 (4H, m, 2CH2), 3.08 (2H, t, J = 8.4 Hz, CH2), 3.76 (3H, s, CH3O), 6.78 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 7.04 (2H, d, J = 8.8 Hz, phenyl), 10.41 (1H, s, CHO). MS (ESI): m/z = 343.9 (M+ + 1),
원소분석: (C19H21NO5) C, H, N.
15-9. (E)-3-(6-(4- 메톡시페네틸 )-2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘 -5-일) 아크릴산 {(E)-3-(6-(4- methoxyphenethyl )-2,2,8- trimethyl -4H-[1,3]dioxino [4,5-c] pyridin -5- yl ) acrylic acid } 중간체의 제조 (62)
상기 실시예 1-8의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 90%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.55 (6H, s, 2CH3), 2.43 (3H, s, CH3-pyridine), 2.89 (2H, m, CH2), 3.02 (2H, m, CH2), 3.75 (3H, s, CH3O), 4.77 (2H, s, CH2), 5.84 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH), 6.77 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.04 (2H, d, J = 8.0 Hz, phenyl), 7.62 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH). MS (ESI): m/z = 381.9 (M+ - 1),
원소분석: (C22H25NO5) C, H, N.
15-10. (E)-3-(5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 아크릴산 {(E)-3-(5- hydroxy -4-( hydroxymethyl )-2-(4- methoxyphenethyl ) -6-methylpyridin-3-yl)acrylic acid } 중간체의 제조 (63)
상기 실시예 1-5의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 43%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.37 (3H, s, CH3-pyridine), 2.70 (2H, m, CH2), 2.81 (2H, m, CH2), 3.67 (3H, s, CH3O), 4.72 (2H, s, CH2), 5.67 (1H, d, J = 16.4 Hz, =CH), 6.65 (2H, d, J = 8.0 Hz, phenyl), 6.95 (2H, d, J = 8.0 Hz, phenyl), 7.43 (1H, d, J = 16.0 Hz, =CH),
MS (ESI): m/z = 342.9 (M+ - 1),
원소분석: (C19H21NO5) C, H, N.
15-11. (E)-3-(4- 포르밀 -5-히드록시-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸피리딘 -3-일) 아크릴 산(64) {(E)-3-(4- formyl -5- hydroxy -2-(4- methoxyphenethyl )-6- methylpyridin -3-yl)acrylic acid } 화합물의 제조 (64)
상기 실시예 1-7의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 화합물을 제조하였다.
수율: 27%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.59 (3H, s, CH3-pyridine), 2.93 (2H, m, CH2), 3.03 (2H, m, CH2), 3.75 (3H, s, CH3O), 5.73 (1H, d, J = 16.0 Hz, =CH), 6.76 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 6.96 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.73 (1H, d, J = 16.0 Hz, =CH), 10.01 (1H, s, CHO),
MS (ESI): m/z = 339.7 (M+ - 1),
원소분석: (C19H19NO5) C, H, N.
15-12. 6-(4- 메톡시페네틸 )-2,2,8- 트리메틸 -4H-[1,3] 디옥시노 [4,5-c]피리딘- 5카르복실산 {6-(4- methoxyphenethyl )-2,2,8- trimethyl -4H-[1,3] dioxino [4,5-c] pyridine-5-carboxylic acid } 중간체의 제조 (65)
상기 실시예 2의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 80%,
1H-NMR (CDCl3) δ 1.55 (6H, s, 2CH3), 2.47 (3H, s, CH3-pyridine), 2.93 (2H, m, CH2), 3.11 (2H, m, CH2), 3.76 (3H, s, CH3O), 5.07 (2H, s, CH2OH), 6.77 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.01 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl),
MS (ESI): m/z = 358.2 (M+ + 1),
원소분석: (C20H23NO5) C, H, N.
15-13. 5-히드록시-4-( 히드록시메틸 )-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸니코틴산 {5-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinic acid } 중간체의 제조 (66)
상기 실시예 1-6의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 중간체를 제조하였다.
수율: 80%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.47 (3H, s, CH3-pyridine), 2.94 (2H, m, CH2), 3.30 (2H, m, CH2), 3.77 (3H, s, CH3O), 5.08 (2H, s, CH2OH), 6.78 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 7.03 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl),
MS (ESI): m/z = 318.3 (M+ + 1),
원소분석: (C27H29NO5) C, H, N.
15-14. 4- 포르밀 -5-히드록시-2-(4- 메톡시페네틸 )-6- 메틸니코틴산 {4- formyl -5-hydroxy-2-(4-methoxyphenethyl)-6-methylnicotinic acid } 화합물의 제조 (67)
상기 실시예 1-7의 일반적 합성법에 개시된 방법과 유사한 방법으로 고체형태의 화합물을 제조하였다.
수율: 27%,
1H-NMR (CDCl3) δ 2.59 (3H, s, CH3-pyridine), 2.93 (2H, m, CH2), 3.03 (2H, m, CH2), 3.75 (3H, s, CH3O), 6.76 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 6.96 (2H, d, J = 8.4 Hz, phenyl), 10.03 (1H, s, CHO),
MS (ESI): m/z = 316.7 (M+ - 1),
원소분석: (C17H17NO5) C, H, N.
실험예 1. 수용체 길항작용 시험
상기 실시예에서 준비된 화합물들의 (1) 재조합 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에 대한 길항 활성 및 (2) 인간 P2X7 수용체에서의 에티디움(Ethidium+ ) 축적에 미치는 영향을 시험하기 위하여 문헌들에 개시된 측정 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Song-Yi Lee et al. 2006).
1-1. 재조합 마우스 P2X 1 및 인간 P2X 3 수용체에 대한 길항 활성
아프리카 개구리 난자( Xenopus oocytes)를 문헌에 개시된 방법에 따라 얻어 수확하였다 (Harald S. et al. 1998).
여포제거 난자에 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체 cRNA를 세포질적으로 각각 주사하고 (40 nL, 1 μg/mL), 24시간동안 18 oC에서 바쓰 용액(Barth’s solution)에서 배양하고 전기생리학적 실험에 사용 전까지 4 oC에서 12일간까지 보관하였다. ATP-활성화 막 전류 (Vh = -70 mV)를 2-전극 볼티지-클램프 기법(two-electrode voltage-clamp technique; Axoclamp 2B amplifier)을 이용하여 cRNA-주사 난소에서 기록하였다. 볼티지 기록 (1-2 MΩ tip resistance) 및 전류-기록용 미세전극(5 MΩ tip resistance)에 3.0 M KCl을 채웠다. 난소를 전기생리학적 챔버에 보관하고 링거액 (5 mL/min, at 18 oC; (mM) NaCl, 110; KCl, 2.5; HEPES, 5; BaCl2, 1.8, 함유, pH 7.5로 적정)로 절취하였다. ATP를 난소로부터 60-120초간 절취하고 20분 이상 세척하였다. 저해 곡선을 위하여, 데이터를 pH 7.5에서 ATP에 의해 야기되는 전류를 정상화하였다. 시험용 물질들을 ATP 노출 전에 20분간 첨가하였다: 모든 펩티드를 그 효과의 변환성을 시험하였다. 50% 까지 ATP 반응을 저해하는 데 요구되는 농도(IC50)를 수학 공식 (log(I/ I max -I), 여기에서 I 는 길항제 존재시 ATP에 의해 발생되는 전류임)을 이용하여 구성되는 힐 공식(Hill plots)으로부터 얻었다. 데이터는 만자의 서로 상이한 배치(batches)로부터 얻은 데이터로 평균 ±SEM (n=4)로 표시되었다.
1-2. 인간 P2X 7 수용체에서 에티듐 ( Ethidiu m + ) 축적 시험
인간 배아 신장세포인 인간 P2X7-발현 HEK293 세포를 단층배양물로 10% 우태아 혈청을 함유한 DMEM에서 5% CO2. 가습 대기하의 37 ℃에서 배양하였다. 세포를 Trypsin/EDTA 용액 처치로 수확하고, 원심분리법 (200 g for 5 min)으로 모았다.
상기 세포들을 (mM) HEPES 10, KCl 140, glucose 5, EDTA 1 (pH 7.4), 및 에티듐 브로미드 (100 μM)가 추가된 시험용 완충액에서 2.5×106cells/mL 의 농도에서 재현탁하였다. 세포 현탁물을 P2×105 세포/웰에서 2X7 수용체 작용제, ATP 또는 BzATP을 함유한 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 120 분간 37 oC에서 배양하였고 에티듐(Ethidium+) 의 세포성 축적량을 측정기기(Bio-Tek instrument FL600 형광 플레이트 판독기; 여기 파장 530 nm 및 방출 파장 590 nm)로 형광도를 측정하여 결정하였다. PPADS, KN62, 및 시험용 펩티드과 같은 길항제의 영향을 연구하고, 길항제들을 예비-배양없이 작용제와 같이 처치하였다.
실험 결과, 기존에 재조합 P2X1 수용체에서 작용제-유도 양이온 유입을 길항하는 것으로 잘 알려진 피리독살-5-포스페이트(이하, PDP라 함, IC50 : 약 10 μM)의 5’-포스페이트기를 아형에 대해 선택적으로 길항하도록 카르복실산으로 대체하여 합성한 결과 (반응식 1-3 참조) P2 수용체 아형에 대하여 선택적으로 길항하는 길항제들 13, 14, 17, 18, 22, 및 23을 합성하였으며, 이중 화합물 13 및 14가 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에 대하여 PDP와 동등내지 보다 우수한 길항 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 1 참조). 상기 화합물 13 및 14를 아조 커플링 반응을 합성한 화합물들 24-29중, 화합물 25, 27, 및 29, 인간 P2X3 수용체 보다 마우스 P2X1 수용체에 대하여 강력한 길항작용을 나타냈고, 아조페닐기를 2’,5’-디설폰산기로 대체한 화합물 25 은 마우스 P2X1수용체에 대하여 100nM에서 이온 전류를 60% 저해하였으며, 여기서 선택된 화합물 24 및 28에 대하여 농도-의존적 길항작용을 시험한 결과, 화합물 24는 마우스 P2X1 수용체에서 ATP-유도성 이온 전류에 대하여 농도-의존적인 저해활성을 나타냈다 (도 1A 참조).
도 1의 B 부분에서, IC50 값 및 힐 계수는 하기와 같다[(■) 화합물 24, 70.54±2.72, -1.13±0.40; (●) 화합물 28, 130.26±13.61, -1.20±0.45. (▲) 화합물 3, 30.71±5.12, -1.09±0.13], C 부분에서, 값은 하기와 같다 [ (■) 화합물 24, 105.47±17.49, -1.18±0.25; (●) 화합물 28, 79.75±1.21, -1.08±0.02. (▲) 화합물 3, 96.22±20.98, -1.11±0.27].
iso PPADS 3, 화합물 24, 및 화합물 28의 전체 농도-반응 곡선은 도 2B 및 2C에 나타냈다. 마우스 P2X1 수용체 및 인간 P2X3 수용체에서의 24시간동안의 IC50 값은 각각 70 nM 및 105 nM이었다. 화합물 28은, 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에서의 IC50 값은 각각 130 및 80 nM이었다.
도 2A에서 IC50 값은 32 nM (MRS2159); 361 nM (36); 509 nM (38); 186 nM (39)이며 힐 계수는 -1.13±0.20 (MRS2159); -1.03±0.21 (36); -0.98±0.11 (38); -1.00±0.09 (39)으로 각각 나타났으며, 각 값은 4회 관찰의 평균 ±SEM이다. 상기 기록은 2 μM ATP의 유지전위(70 mV)에서 수행되었다.
PPADS 및 isoPPADS 피리독살 및 페닐 부위가 연결된 아조 (-N=N-) 가교가 화학적으로 불안정하므로 상온에서 분해되기 쉬워 새로운 PPADS 유사체를 개발하기 위하여 피리독살 부위를 3,4-디카르복시피리딘 또는 4-아세틸-3-카복시피리딘 유사체로 전환한 화합물들의 인간 P2X1, 인간 P2X3, 및 인간 P2X7 수용체에 대한 효과를 시험한 결과, 화합물 44는 10 μM 농도에서 마우스 P2X1 수용체에 대하여 46% 저해효과를 나타냈다. 페닐에틸기기로 치환한 화합물 45은 마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에 대하여 벤질기로 치환한 치환체화합물 44보다 강력한 활성을 나타냈다. 4-메톡시펜에틸기를 함유한 화합물 46이 3-메톡시펜에틸 화합물 48 또는 2-메톡시펜에틸 화합물 49들보다 보다 우수한 길항활성을 나타냈다.
3,4-디카복시피리딘 유사체인 화합물들 35-41은 4-아세틸-3-카복시피리딘 유사체 화합물들 44-49보다 마우스 P2X1 및 P2X3 수용체에서 보다 강력한 길항활성을 나타냈다. 이중 펜에틸기 화합물 36, 4-메톡시펜에틸기 화합물 37, 및 4-카복시펜에틸 화합물 39들은 마우스 P2X1 r수용체에 대하여 10 μM 농도에서 각각 77%, 78%, 및 82% 저해효과를 나타냈다.
MRS2159, 화합물 36, 38, 및 39의 전체 농도-반응 곡선을 도 2A에 나타냈으며, 화합물 36, 38, 및 39 이 361 nM, 509 nM, 및 186 nM의 IC50 로 길항작용을 나타냈다. 화합물 36, 38, 및 39 은 잘 알려진 길항제인 A-317491 의 길항활성보다 효과가 적었다(도 2B). 도 2B에서 IC50 값은 38 nM (A-317491); 432 nM (36); 782 nM (38); 339 nM (39)이며 힐 계수는 -0.68±0.18 (A-317491); -0.63±0.20 (36); -0.52±0.12 (38); -0.58±0.27 (39)으로 각각 나타났으며, 각 값은 4회 관찰의 평균 ±SEM이었다. 상기 기록은 2 μM ATP의 유지전위(70 mV)에서 수행되었다.
여기에서 화합물 36, 38, 및 39은 100 nM 농도에서 각각 38.3%, 19.2%, 및 34.0% 저해율을 나타냈다. 일부 화합물들이 기존 길항제인 MRS2159및 A-317491에 비하여 낮은 활성을 나타내나, 본 화합물들은 적정한 길항 활성을 갖으며, 지나치게 극성이 높은 산성기 대신에 안정한 산성기를 갖고 불안정한 아조(-N=N-) 가교대신에 안정한 탄소-탄소 사슬을 가지므로 의약품으로서 적합하다. 기존 길항제인 PPADS의 단점은 P2 수용체에 대하여 비가역적인 차단활성을 나타내나 본 발명의 화합물들은 가역적인 활성을 나타내는 장점을 갖는다. 특히. 화합물 39는 20분 후에 약 95%의 회수율을 보였다.
Figure 112010026852648-pat00020
마우스 P2X1 및 인간 P2X3 수용체에서의 피리딘 유도체들의 길항작용
Figure 112010026852648-pat00021
마우스 P2X1, 인간 P2X3 및 인간 P2X7 수용체에서의 3,4-디카복시피리딘 및 4-아세틸-3-카복시 피리딘, 4-포르밀-3-카복시 피리딘 유도체들의 길항작용

Claims (14)

  1. 하기 일반식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 피리딘 카르복실산 계 화합물, 그 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유한, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 i) 신경성 통증질환; 또는 ii) 동맥경화, 뇌졸중, 혈전증, 색전증, 심근경색, 죽상경화증 및 말초혈액순환장애로 이루어진 군으로부터 선택된 혈소판 응집관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물:
    Figure 112016128101295-pat00022

    상기 식에서,
    R1, R2, 및 R3 는 각각 독립적으로, 수소원자, 히드록시기, 설포닐기, 할로겐원자, 카르복실산, C1-C6 저급 알킬기, C1-C6 저급 알콕시기, 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 치환기이고;
    A는
    Figure 112016128101295-pat00023
    이며,
    여기에서 n은 0 또는 1이고,
    B는
    Figure 112016128101295-pat00026

    또는
    Figure 112016128101295-pat00027
    이며,
    여기에서 R" 는 수소원자, 히드록시기, 할로겐원자, 카르복실산, 설포닐기, C1-C6 저급 알킬기, C1-C6 저급 알콕시기, 및 C1-C6 저급 알킬에스테르기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기이고, C는 하나 이상의 5원 내지 10원의 방향환이며, m은 0 또는 1이고, (-----)표시는 단일결합 또는 이중결합을 의미한다.
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  9. 2-벤질-5-히드록시-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실 산 (35), 5-히드록시-6-메틸-2-펜에틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (36), 5-히드록시-2-[2-(4-메톡시-페닐)에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (37), 5-히드록시-6-메틸-2-스티릴-피리딘-3,4-디카르복실산 (38), 2-[2-(4-카르복시-페닐)-에틸]-5-히드록시-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (39), 5-히드록시-2-[2-(3-메톡시-페닐)-에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (40), 5-히드록시-2-[2-(2-메톡시-페닐)-에틸]-6-메틸-피리딘-3,4-디카르복실산 (41), 4-아세틸-2-벤질-5-히드록시-6-메틸니코틴산 (44), 4-아세틸-5-히드록시-6-메틸-2-펜에틸니코틴 산 (45), 4-아세틸-5-히드록시-2-(4-메톡시펜에틸)-6-메틸니코틴 산 (46), (E)-4-아세틸-5-히드록시-6-메틸-2-스티릴니코틴산 (47), (E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(3-메톡시스티릴)-6-메틸니코틴산 (48), (E)-4-아세틸-5-히드록시-2-(2-메톡시스티릴)-6-메틸니코틴산 (49), 3-(4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸피리딘-3-일)프로파노익산(61), (E)-3-(4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸피리딘-3-일)아크릴산(64), 4-포르밀-5-히드록시-2-(4-메톡시페네틸)-6-메틸니코틴산 (67); 5-히드록시-6-메틸-2-(나프탈렌-1-일메틸)피리딘-3,4-디카르복실산 (50) 및 2-(2,2,-디페닐에틸)5-히드록시-6-메틸피리딘-3,4-디카르복실산 (51)으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 그 이성체 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, P2X1 및 P2X3 수용체 활성에 기인한 i) 신경성 통증 질환; 또는 ii) 동맥경화, 뇌졸중, 혈전증, 색전증, 심근경색, 죽상경화증 및 말초혈액순환장애로 이루어진 군으로부터 선택된 혈소판 응집관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물.
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  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경성 통증 질환은 신경병증성통증, 이질통, 당뇨성 신경장애증, 자발성통증, 과민성통증, 환지통, 또는 복합부위 통증증후군인 약학조성물.
  13. 삭제
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