CN116106455B - 取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，包括如下步骤：取所述取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制备对照品溶液；取待测样品，以第二溶剂溶解，制备待测样品溶液；将所述对照品溶液和待测样品溶液进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为体积浓度0.08%~0.12%的磷酸水溶液，流动相B为体积比为1:(0.8~1.2)的乙腈和甲醇的混合液，进行梯度洗脱。上述检测方法通过采用合适的条件对原料药进行高效液相色谱检测，能够有效分离原料药以及各杂质，进而实现原料药有关物质的检测，对原料药的生产质量控制和研究具有重要意义。

Description

取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法

技术领域

本申请涉及质量检测技术领域，特别是涉及一种取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法。

背景技术

研究证实，取代的烟酰胺类药物具有较好的含α5的GABAA受体(α5-GABAA受体)的调控作用。α5-GABAA受体在哺乳动物大脑的海马组织中具有特异性分布，对其进行调控可治疗疼痛，特别是神经性病理疼痛（NPP）。这类取代的烟酰胺类药物可以例如中国专利申请CN110256440A公开的N-异丙基-6-(((3-(5-(甲氧基甲基)异噁唑-3-基)-[1,2,4]三唑[3,4-a]酞嗪-6-基)氧)甲基)烟酰胺（结构如下式（1）所示）。

（1）

目前，N-异丙基-6-(((3-(5-(甲氧基甲基)异噁唑-3-基)-[1,2,4]三唑[3,4-a]酞嗪-6-基)氧)甲基)烟酰胺的原料药合成路线可参见中国专利申请CN114773352A，具体如下所示：

在上述原料药合成路线的工业化生产中，不可避免地残留有机杂质，包括原料、中间体和副产物等，统称为“有关物质”，有关物质的存在会影响成品的质量，甚至可能影响药物的药效和毒性，例如，PA3-6（）具有警示结构，属于基因毒性杂质，其特点是在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤，具有致突变性和致癌性，在用药过程中严重威胁到人类的健康。因此，在原料药中需要对有关物质进行严格控制。通常而言，需严格控制原料药中杂质总含量应小于1.0％，单个杂质含量应小于0.1％。基于此，有必要提供一种针对取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法。

发明内容

基于此，本申请提供一种针对取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法。

具体技术方案如下

一种取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，所述取代的烟酰胺类药物具有如下式（1）所示结构特征：

（1）

所述有关物质包括PA3-1和PA3-6中的一种或两种，结构如下所示：

所述检测方法包括如下步骤：

取所述取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制备对照品溶液；

取待测样品，以第二溶剂溶解，制备待测样品溶液；

将所述对照品溶液和待测样品溶液进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为体积浓度0.08%~0.12%的磷酸水溶液，流动相B为体积比为1:(0.8~1.2)的乙腈和甲醇的混合液，进行梯度洗脱。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱包括如下洗脱程序：

0min~7.5min，保持所述流动相A的体积百分比为50%；

7.5min~11min，所述流动相A的体积百分比由50%下降至35%；

11min~16min，所述流动相A的体积百分比由35%下降至10%；

16min~18min，保持所述流动相A的体积百分比为10%。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱以丙基苯基键合硅胶为填充剂。

在其中一个实施例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括如下（1）~（4）项中的一种或多种：

（1）流速：0.8mL/min~1.2mL/min；

（2）柱温：25℃~35℃；

（3）检测波长：225nm~235nm；

（4）进样量为8μL~12μL。

在其中一个实施例中，所述检测方法还包括构建标准曲线的步骤，以及根据所述待测样品溶液的高效液相色谱检测所得色谱图和所述标准曲线进行含量计算的步骤；

其中，所述PA3-1的标准曲线为：y=44047.3576x-589.5284；

所述PA3-6的标准曲线为：y=36072.8112x+134.1846；

所述取代的烟酰胺类药物的标准曲线为：y=45135.2593x-1741.7706。

在其中一个实施例中，所述构建标准曲线的步骤包括：

取所述有关物质或取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制成不同浓度的标准品溶液；

将所述不同浓度的标准品溶液进行所述高效液相色谱检测，根据检测结果构建各标准曲线。

在其中一个实施例中，所述不同浓度的标准品溶液的浓度分布为0.4~11g/mL。

在其中一个实施例中，所述第一溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液。

在其中一个实施例中，所述第二溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液。

在其中一个实施例中，所述有关物质为PA3-1和PA3-6。

上述取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，通过采用合适的条件对原料药进行高效液相色谱检测，能够有效分离原料药以及各杂质，进而实现原料药有关物质的检测，对原料药的生产质量控制和研究具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中原料药的对照品溶液和待测样品溶液的高效液相色谱检测结果图，其中，（a）原料药的对照品溶液色谱图，（b）待测样品溶液色谱图；

图2为各对照品的标准曲线图；

图3为杂质分离的专属性考察结果图；

图4为不同洗脱程序条件下杂质分离的考察结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本申请的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。

本申请中，第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本申请中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

本申请中的室温一般指4℃~30℃，较佳地指20±5℃。

本申请的一些示例提供一种取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，所述取代的烟酰胺类药物具有如下式（1）所示结构特征：

（1）

所述有关物质包括PA3-1和PA3-6中的一种或两种，结构如下所示：

所述检测方法包括如下步骤：

取所述取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制备对照品溶液；

取待测样品，以第二溶剂溶解，制备待测样品溶液；

将所述对照品溶液和待测样品溶液进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为体积浓度0.08%~0.12%的磷酸水溶液，流动相B为体积比为1:(0.8~1.2)的乙腈和甲醇的混合液，进行梯度洗脱。

具体地，流动相A中磷酸水溶液的体积浓度包括但不限于：0.08%、0.09%、0.1%、0.11%、0.12%或前述任两个数值形成的范围。

具体地，流动相B中乙腈和甲醇的体积比包括但不限于：1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2或前述任两个数值形成的范围。

在其中一些示例中，所述梯度洗脱包括如下洗脱程序：

0min~7.5min，保持所述流动相A的体积百分比为50%；

7.5min~11min，所述流动相A的体积百分比由50%下降至35%；

11min~16min，所述流动相A的体积百分比由35%下降至10%；

16min~18min，保持所述流动相A的体积百分比为10%。

可以理解地，所述梯度洗脱还包括流动相恢复程序，以便下一次进样，步骤如下：

18min~18.1min，所述流动相A的体积百分比由10%上升至50%；

18.1min~25min，保持所述流动相A的体积百分比为50%。

在其中一些示例中，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱以丙基苯基键合硅胶为填充剂。

在其中一些示例中，所述高效液相色谱检测的条件还包括如下（1）~（4）项中的一种或多种：

（1）流速：0.8mL/min~1.2mL/min；具体地，流速包括但不限于：0.8mL/min、0.9mL/min、1mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min或前述任两个数值形成的范围；

（2）柱温：25℃~35℃；具体地，柱温包括但不限于：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或前述任两个数值形成的范围；

（3）检测波长：225nm~235nm；具体地，检测波长包括但不限于：225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm或前述任两个数值形成的范围；

（4）进样量为8μL~12μL；具体地，进样量包括但不限于：8μL、9μL、10μL、11μL、12μL或前述任两个数值形成的范围。

在其中一些示例中，所述检测方法还包括构建标准曲线的步骤，以及根据所述待测样品溶液的高效液相色谱检测所得色谱图和所述标准曲线进行含量计算的步骤；

其中，所述PA3-1的标准曲线为：y=44047.3576x-589.5284；

所述PA3-6的标准曲线为：y=36072.8112x+134.1846；

所述取代的烟酰胺类药物的标准曲线为：y=45135.2593x-1741.7706。

可以理解地，各标准曲线中x表示相应标准品的浓度，y表示该浓度下峰面积的响应值。

在其中一些示例中，所述构建标准曲线的步骤包括：

取所述有关物质或取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制成不同浓度的标准品溶液；

将所述不同浓度的标准品溶液进行所述高效液相色谱检测，根据检测结果构建各标准曲线。

在其中一些示例中，所述不同浓度的标准品溶液的浓度分布为0.4~11g/mL。

在其中一些示例中，所述第一溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液。具体地，所述乙腈水溶液的体积浓度包括但不限于：45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%或前述任两个数值形成的范围。

在其中一些示例中，所述第二溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液。具体地，所述乙腈水溶液的体积浓度包括但不限于：45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%或前述任两个数值形成的范围。

在其中一些示例中，所述有关物质为PA3-1和PA3-6。上述检测方法可以实现取代的烟酰胺类药物中所述有关物质的同步检测，能够极大地提高检测效率，进而提升工业化生产的效率。

以下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的试剂均为市售产品。

实施例中的原料药为取代的烟酰胺类药物，N-异丙基-6-(((3-(5-(甲氧基甲基)异噁唑-3-基)-[1,2,4]三唑[3,4-a]酞嗪-6-基)氧)甲基)烟酰胺，其结构如下式（1）所示：

（1）。

各杂质结构如下所示：

实施例

本发明的实施例中采用的仪器和试药如下：

1、仪器

高效液相色谱仪：waters e2695，可以理解的，也可以采用其它与之相当的色谱系统，比如waters Arc。

色谱柱：Ultimate XB-Phenyl（250mm×4.6mm，5μm）。

2、试药

乙腈、磷酸、甲醇为色谱纯，水为超纯水；

原料药的对照品，来源上海赛默罗生物科技有限公司，纯度99.7%；可参考中国专利申请CN114773352A公开的合成路线进行合成。

PA3-1、PA3-6的对照品，来源均为来源上海赛默罗生物科技有限公司，纯度依次为94.61%、94.43%；可参考中国专利申请CN114773352A公开的合成路线进行合成或通过副产物富集获得。

待测原料药，来源上海赛默罗生物科技有限公司；参考中国专利申请CN114773352A公开的合成路线进行批次生产。

3、溶液配制

流动相A（体积分数0.1%的磷酸水溶液）：移取1.0mL磷酸于1000mL水中，混匀；

流动相B（体积比为1:1的甲醇和乙腈混合液）：分别量取500mL乙腈和500mL甲醇，混匀。

稀释剂：体积分数50%的乙腈水溶液；

空白溶液：稀释剂；

原料药的对照品溶液（0.005mg/mL原料药 ）：称取原料药的对照品约20mg，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。准确移取上述溶液5mL，置200mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。

待测样品溶液（1mg/mL待测样品）：取待测原料药20mg，精密称取，置于20mL容量瓶中，加稀释剂溶解并定容，混匀。

4、检测

将原料药的对照品溶液和待测样品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件如下表1所示：

表1

检测结果如图1所示，由图1可知待测原料药中含PA3-6为0.05%。

5、线性和范围

在0.4~11g/mL浓度范围内配制对照品溶液（具体浓度参见表2~4，以稀释剂进行配制），考察各杂质和原料药的浓度和峰面积之间的线性关系与范围。

接受标准：在0.4~11g/mL浓度范围内，响应值与浓度应呈良好线性，其线性相关系数（r）应不小于0.999。Y轴截距值不得大于0.05%水平响应值的±50%。

将各对照品溶液分别按照“4、检测”项进行检测，记录色谱峰面积，以峰面积为纵坐标（y），对照品浓度为横坐标（x），并绘制标准曲线，结果如图2和表2~4所示。

表2 PA3-1线性结果

表3 PA3-6线性结果

表4 原料药线性结果

参考各线性回归方程的结果，对杂质PA3-1、PA3-6的校正因子进行计算，试验结果见表5。

表5 原料药有关物质校正因子汇总

6、定量限和检测限

接受标准：原料药和各杂质定量限溶液信噪比不得低于10，各峰面积的RSD%不得超过5.0%。原料药和各杂质检测限溶液信噪比不得低于3。

检测方法：取“5、线性”项下各L1水平溶液，作为原料药和各杂质定量限溶液（约0.5μg/mL），浓度为待测样品浓度的0.05%，取上述定量限溶液进样，连续进6针，计算信噪比及峰面积相对平均偏差（RSD%）。精密量取各定量限溶液2.0mL，置于10mL的量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即为原料药和各杂质检测限溶液（0.1μg/mL），为样品检测浓度的0.01%。取上述溶液进样，记录色谱图。

检测结果如表6所示：

表6 原料药有关物质方法验证定量限和检测限结果

由表6可知，原料药、PA3-1、PA3-6的定量限浓度均为0.5μg/mL，为待测样品浓度（1mg/mL）的0.05%，信噪比均大于10，各峰面积的RSD%均小于5.0%；检测限浓度均为0.1μg/mL，为待测样品浓度（1mg/mL）的0.01%，信噪比均大于3。可见，本检测方法灵敏度良好。

7、精密度考察

（1）重复性

接受标准：6份样品中，单个有关物质PA3-1和PA3-6的量的RSD%不得超过5.0%。

检测方法：配制杂质储备液，其中PA3-1和PA3-6的浓度分别为20μg/mL。向原料药中加入杂质储备液，制备成浓度水平为0.3%的溶液，平行制备6份溶液，取各溶液进样。

检测结果如表7所示：

表7 原料药有关物质方法验证重复性试验结果

（2）中间精密度

接受标准：另一实验员使用另一仪器准备6份样品，两位实验员的12份样品中，单个有关物质PA3-1和PA3-6的量的RSD%不得超过10.0%。

检测方法：同一个实验室，不同时间由另一名分析人员使用另一台设备平行制备6份浓度水平为0.3%的溶液，取溶液进样。

检测结果如表8~9所示：

表8 原料药有关物质方法验证中间精密度试验结果

表9 原料药有关物质方法验证精密度试验结果

8、准确度考察

接受标准：PA3-1和PA3-6加样回收率应在90.0%～120.0%，RSD不得大于5.0%。

检测方法：配制杂质储备液，其中PA3-1和PA3-6的浓度分别为20μg/mL。向原料药中加入杂质储备液，制备成浓度水平为0.1%、0.3%和0.5%的溶液，每个水平平行制备三份溶液，取各溶液进样。

检测结果如表10所示：

表10 原料药有关物质方法验证准确度试验结果

9、溶液稳定性

接受标准：按照“8、准确度考察”0.3%水平溶液配制样品溶液，按照方法配制原料药的对照品溶液，将两份溶液在室温和4℃放置，原料药的对照品溶液浓度的差异不得大于5.0%，样品溶液的差异不得大于10.0%，且无新增杂质。

原料药的对照品溶液在室温下50小时稳定，4℃条件下45小时稳定。样品溶液在室温下51小时稳定，4℃条件下45小时稳定。

10、专属性

接受标准：样品主峰出峰时间应与对照品一致；空白溶液在主峰和杂质峰出峰位置应无干扰，若有，不得大于0.05%；杂质与主峰之间的分离度不应小于2.0，杂质之间不得小于1.5。

检测方法：按照“3、溶液配制”方法配制空白溶液、待测样品溶液和原料药的对照品溶液。取适量PA3-1、PA3-6分别用稀释剂溶解，混匀，分别制成浓度为0.2mg/mL的杂质定位溶液。取上述各溶液进样。

检测结果如图3和表11所示：

表11 原料药有关物质方法验证专属性结果

可见，空白溶剂在主峰和杂质峰出峰位置无干扰，杂质与主峰之间以及杂质之间的分离度均大于2.0，本检测方法专属性良好。

11、耐用性

接受标准：供试品溶液在更改检测条件后的杂质含量与初始条件比，若有关物质含量X≤0.10%，偏差的绝对值不大于0.05%；若0.10%<X≤0.25%，二者的偏差结果不大于15%；X>0.25%，二者的偏差结果不大于10%，即认为方法在该条件下耐用性良好。

其中，含量I—被测组分在初始条件的含量，含量C—被测组分在变更条件的含量

检测方法：按“（1）重复性”项配制杂质储备液，然后以配制杂质储备液替代稀释剂配制待测样品溶液和原料药的对照品溶液进行考察。变更色谱柱柱温（25℃、35℃）、流速（0.9mL/min、1.1mL/min）、检测波长（282nm、232nm），照有关物质检测方法进样。

检测结果如下：

表12 方法耐用性结果

可见，各杂质在变更条件后的结果均符合要求，方法耐用性良好。

对比例1

本对比例考察不同的洗脱程序。按照实施例中“4、检测”项的方法进行样品溶液（取PA3-1、PA3-6和原料药的对照品适量，分别加50%乙腈水溶液溶解，再取适量进行混合，制成PA3-1、PA3-6的对照品的浓度为20μg/mL和原料药的对照品的浓度为1mg/mL的样品溶液）的检测，并将洗脱程序调整为：

0min~7.5min，保持所述流动相A的体积百分比为60%；

7.5min~11min，所述流动相A的体积百分比由60%下降至45%；

11min~16min，所述流动相A的体积百分比由45%下降至10%；

16min~18min，保持所述流动相A的体积百分比为10%。

测试结果如图4所示。可见，PA3-1和PA3-6未分离。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述取代的烟酰胺类药物具有如下式（1）所示结构特征：

（1）

所述有关物质包括PA3-1和PA3-6中的一种或两种，结构如下所示：

所述检测方法包括如下步骤：

取所述取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制备对照品溶液；

取待测样品，以第二溶剂溶解，制备待测样品溶液；所述第二溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液；

将所述对照品溶液和待测样品溶液进行高效液相色谱检测，所述高效液相色谱检测的条件包括：流动相A为体积浓度0.08%~0.12%的磷酸水溶液，流动相B为体积比为1:( 0.8~1.2)的乙腈和甲醇的混合液，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱包括如下洗脱程序：

0min~7.5min，保持所述流动相A的体积百分比为50%；

7.5min~11min，所述流动相A的体积百分比由50%下降至35%；

11min~16min，所述流动相A的体积百分比由35%下降至10%；

16min~18min，保持所述流动相A的体积百分比为10%；

所述高效液相色谱检测采用的色谱柱以丙基苯基键合硅胶为填充剂；

所述高效液相色谱检测的条件还包括：流速：0.8mL/min~1.2mL/min，柱温：25℃~35℃，检测波长：225nm~235nm。

2.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，流动相A为体积浓度0.1%的磷酸水溶液，流动相B为体积比为1:1的乙腈和甲醇的混合液。

3.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，流速：1mL/min。

4.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，柱温：30℃。

5.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件还包括：进样量为8μL~12μL。

6.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括构建标准曲线的步骤，以及根据所述待测样品溶液的高效液相色谱检测所得色谱图和所述标准曲线进行含量计算的步骤；

其中，所述PA3-1的标准曲线为：y=44047.3576x-589.5284；

所述PA3-6的标准曲线为：y=36072.8112x+134.1846；

所述取代的烟酰胺类药物的标准曲线为：y=45135.2593x-1741.7706。

7.根据权利要求6所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述构建标准曲线的步骤包括：

取所述有关物质或取代的烟酰胺类药物的对照品，以第一溶剂溶解，制成不同浓度的标准品溶液；

将所述不同浓度的标准品溶液进行所述高效液相色谱检测，根据检测结果构建各标准曲线。

8.根据权利要求7所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述不同浓度的标准品溶液的浓度分布为0.4~11g/mL。

9.根据权利要求1所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述第一溶剂为体积浓度45%~55%的乙腈水溶液。

10.根据权利要求1~9任一项所述的取代的烟酰胺类药物中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质为PA3-1和PA3-6。