KR101694405B1 - 폴리펩티드―중합체 접합체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드-중합체 접합체를 제공한다. 또한, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 다양한 용도에서 유용한데, 용도들도 또한 제공한다.

Description

폴리펩티드―중합체 접합체 및 그의 사용 방법{POLYPEPTIDE-POLYMER CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF}
교차-참조
본 출원은 2008년 5월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/040,556의 이익을 청구하고, 이 출원은 그 전체가 참고문헌으로서 본 발명에 포함된다.
배경기술
생물학적 활성제의 고체-상 형태를 창조하기 위한 화학적 속박의 용도는 광범위한 의학적 및 생물학적 응용에 걸친 순환하는 주제이다. 화학적 속박은 생물활성 펩티드 또는 단백질을 표면에 접착시키기 위해, 다공성 또는 하이드로겔 이식물에 생물활성을 첨가하기 위해 또는, 약물 전달 응용에서 사용할 수 있다. 고체-상 제시는 생물활성 분자들이 생물학적 환경에서 기능하는 방법을 바꿀 수 있다.
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발명의 개요
본 발명은 폴리펩티드-중합체 접합체를 제공한다. 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 다양한 용도에서 유용한데, 용도들도 또한 제공한다.
도 1은 재조합 단백질(Shh, 소닉 헤지호그)을 중합체 히알루론산(HyA)에 이식하기 위한 생접합체 도식을 묘사한다.
도 2a 및 도 2b는 Shh 및 폴리(아크릴산)(pAAc)(도 2a) 및 HyA(도 2b)와의 접합산물을 묘사한다.
도 3은 Shh 신호 전달 경로의 도식 및 그의 생물활성에서 Shh의 다원자가의 영향에 대해 제시된 기작을 묘사한다.
도 4은 가용성 Shh(◆, 진한 선), 가용성 HyA가 있는 가용성 Shh(■, 점선), 및 0.6:1(Δ), 3.5:1(○), 7:1(◇), 14:1(□), 및 22:1(×)의 화학양론 비율에서의 Shh-HyA 접합체에 대한 C3H10T1/2 생물활성 결과를 묘사한다.
도 5a 내지 도 5c 음성 대조군 샘플(도 5a), 자유 가용성 Shh(도 5b), 및 14:1의 Shh/HyA 다가형(도 5c)에 대한 병아리 융모막(CAM) 반응을 묘사하는 현미경 사진의 패널을 나타낸다.
도 6은 현미경 사진 화상 분석에서 유도된 CAM 분석에서 신생혈관형성의 정량 결과를 묘사한다.
도 7은 C3H10T1/2 세포에서 Shh-HyA 접합체 생물활성의 수치해석 모델 결과를 묘사한다. 상위 패널은 입체 상호작용을 포함하는 모델에서 1:1 내지 30:1의 화학양론 비율에 대한 Shh 농도의 기능으로서 활성을 나타낸다. 하위 패널은 모델의 두 형태 대 실험 결과에 대한 EC50 대 치환 수준의 그래프를 나타낸다.
정의
용어 "펩티드" "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 교환적으로 사용하였고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 말하며, 암호화 및 비-암호화 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산 및 변형된 펩티드 뼈대를 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 이종의 아미노산 서열과의 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 이종 및 동종의 선도 서열과의 융합; 면역학적으로 표지된 단백질; 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 융합 단백질을 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 지방산 모이어티, 지질 모이어티, 당 모이어티, 및 탄수화물 모이어티 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드"는 번역후 변형된 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바, 용어 "공중합체(copolymer)"는 서브유니트의 하나 이상의 형태를 함유하는 중합체를 설명한다. 이 용어는 서브유니트의 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 여섯 개 형태를 포함하는 중합체를 포함한다.
용어 "피험자" "개체" "숙주" 및 "환자"는 본 발명에서 임의의 포유동물 또는 비-포유동물 종에 대하여 상호 교환적으로 사용하였다. 따라서 피험자 및 환자는 인간, 비-인간 영장류, 개과 동물, 고양이과 동물, 유제류(예를 들어, 말, 소, 돼지과(예를 들어, 돼지)), 조류, 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 및 다른 피험자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물 모델, 특히 포유류, 예를 들어 비-인간 영장류, 쥐과 동물(예를 들어, 마우스, 래트), 토끼 목, 등을 실험적인 연구에서 사용할 수 있다.
이상 또는 질병의 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 이상의 적어도 하나의 증상을 예방하는 것, 즉, 아직 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않지만 질병에 노출되었거나, 질병에 취약할 수 있는 포유류에서 임상적 증상이 유의하게 발달하지 않게 하는 것, (2) 질병을 억제하는 것, 즉, 질병 또는 그의 증상의 발달을 저지하는 것 또는 감소시키는 것, 또는 (3) 질병을 경감하는 것, 즉, 질병 또는 그의 임상적 증상을 퇴화하게 하는 것을 포함한다.
"치료적 효과량" 또는 "효과량"은 질병을 치료하기 위해 하나 이상의 투여량에서 다른 제제와 함께 조합되거나 단일로 포유류 또는 다른 피험자에게 투여될 때, 질병에 대한 이러한 치료가 충분히 효력이 있는 화합물의 양을 의미한다. "치료적 효과량"은 화합물, 치료되어야 할 피험자의 질병, 심각성 및 연령, 체중 등에 의존하여 다양할 것이다.
본 발명에서 사용된 바, 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 동물 피험자에 대한 단일의 투여량으로서 적절한 실제로 분리된 단위를 지칭하며, 미리 결정된 본 발명의 화합물을 함유하는 각각의 단위는 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 연관하여 원하는 효과를 내기에 충분한 양으로 계산된다. 본 발명의 신규 단위 투여 형태에 대한 상세 사항은 사용된 특정 화합물 및 이루고자 하는 효과, 숙주 내 각 화합물과 관련된 약동학에 의존한다.
용어 "생리학적 조건"은 살아있는 세포와 호환가능한 조건, 예를 들어, 살아있는 세포와 호환가능한 온도, pH, 염도, 등의 우세한 수성 조건을 포함하는 것을 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 첨가제", "약학적으로 허용가능한 희석제", "약학적으로 허용가능한 담체", 및 "약학적으로 허용가능한 보조제"는 일반적으로 생물학적인 것도 다른 바람직하지 않은 것도 아닌, 안전하고, 비-독성인 약학적 조성물을 제조하는데 유용한 첨가제, 희석제, 담체 및 보조제를 의미하며, 수의학적 용도뿐 아니라 인간의 약학적 용도에서도 허용가능한 첨가제, 희석제, 담체 및 보조제를 포함한다. 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바 "약학적으로 허용가능한 첨가제, 희석제, 담체 및 보조제"는 하나 이상의 이러한 첨가제, 희석제, 담체 및 보조제를 포함한다.
본 대상 발명을 더 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 구체예에 제한되지 않고, 이러한 구체예들이 물론 변경될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 제한하려는 의도는 아니므로, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
수치의 범위가 제공되는 경우, 각각의 개재하는 수치는 문맥에서 명확하게 지시하지 않는 한, 그 범위 및 임의의 다른 진술된 범위 또는 그 진술된 범위에서 개재하는 수치의 상한 및 하한 한계 사이에서, 하한 한계의 열 번째 단위까지 본 발명에 포함된다. 이들의 더 작은 범위의 상한 및 하한 한계는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한, 본 발명에 포함되며, 진술된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계를 종속시킨다. 진술된 범위가 한계의 한쪽 또는 둘 다를 포함할 때, 이들의 포함된 한계의 어느 한쪽 또는 둘 다를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 한정하지 않는 한, 본 발명에서 사용한 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 발명에서 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 또한 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료들은 이제 설명한다. 본 발명에 언급된 모든 간행물들은 간행물이 인용하고 있는 것과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시 및 설명하기 위해 본 발명에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형은 문맥상 명확히 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상도 포함한다는 것을 유념해야 한다. 따라서 예를 들면, "합성 기질"에 대한 언급은 이러한 기질의 복수를 포함하고, "재조합 폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 재조합 폴리펩티드 및 당업자가 알고 있는 그것의 등가물, 등을 포함한다. 나아가 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배재하는 것으로 기초될 수 있음을 유념해야한다. 이와 같이, 이 진술은 청구항 요소의 언급과 관련하여 "단지", "뿐" 등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "음성" 제한의 사용을 위한 앞선 근거로서 제공하는 것을 의도한다.
본 발명에서 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 전에 발표된 내용들에 대해서만 제공한다. 본 발명에서 어느 것도 선행 발명에 의하여 이러한 간행물들에 선행하여 권리를 받지 못한다는 승인의 뜻으로 파악되지 않는다. 나아가, 제공된 간행물의 날짜는 실제 간행일과 다를 수 있으며, 이것은 개별적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
상세한 설명
본 발명은 폴리펩티드-중합체 접합체를 제공하고, 이런 접합체는 조절된 부착 화학량론을 갖는다. 또한, 다양한 응용에서 유용한 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 제공한다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 하기 식과 같다:
X-(Y)n-Z,
X는 생물학적 활성 폴리펩티드;
Y는 선택적인 링커 모이어티, n은 0 또는 1에서 약 10까지의 정수; 및
Z는 약 50개에서 100,000개까지의 서브유니트를 포함하는 생체적합성 중합체.
중합체 기질에 접합된 폴리펩티드의 생물학적 활성은 가용성 형태의 폴리펩티드의 활성과 비례하여, 예를 들어, 중합체에 접합되지 않은 폴리펩티드의 활성과 비교하여 증가된다. 어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 가용성(비접합된) 형태의 폴리펩티드의 생물학적 활성보다 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1000-배, 또는 1000-배 이상 크다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 1:1의 몰비로 중합체에 접합되었을 때의 폴리펩티드의 생물학적 활성보다 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1000-배, 또는 1000-배 이상 크다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 중합체와의 혼합물에 존재할 때의 폴리펩티드의 생물학적 활성보다 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1000-배, 또는 1000-배 이상 크다.
예를 들면, 어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드의 EC50은 가용성(비접합된 형태)의 폴리펩티드의 EC50보다 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1000-배, 또는 1000-배 이상 낮다.
대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드의 생물학적 활성이 가용성(비접합된) 형태의 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비례하여 증가하는지 여부는 생물학적 활성에 대한 적합한 분석을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.
중합체에 대한 폴리펩티드의 몰비는 약 5:1에서 약 100:1까지, 예를 들어, 약 5:1에서 약 7:1까지, 약 7:1에서 약 10:1까지, 약 10:1에서 약 12:1까지, 약 12:1에서 약 15:1까지, 약 15:1에서 약 20:1까지, 약 20:1에서 약 25:1까지, 약 25:1에서 약 30:1까지, 약 30:1에서 약 35:1까지, 약 35:1에서 약 40:1까지, 약 40:1에서 약 45:1까지, 약 45:1에서 약 50:1까지, 약 50:1에서 약 60:1까지, 약 60:1에서 약 70:1까지, 약 70:1에서 약 80:1까지, 약 80:1에서 약 90:1까지, 또는 약 90:1에서 약 100:1까지 다양할 수 있다.
예를 들면, 대상 폴리펩티드 중합체 접합체는 신생혈관형성(예를 들어, 폴리펩티드는 신생혈관형성 폴리펩티드이다)을 유도하는 폴리펩티드를 포함하고, 어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 신생혈관형성 폴리펩티드는 신생혈관형성 폴리펩티드 중합체와의 혼합물에 존재할 때, 가용성(비접합된) 형태일 때 또는, 1:1의 몰비로 중합체에 접합되었을 때보다 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 15-배, 적어도 약 20-배, 적어도 약 25-배, 적어도 약 30-배, 적어도 약 40-배, 적어도 약 50-배, 적어도 약 75-배, 적어도 약 100-배, 적어도 약 200-배, 적어도 약 500-배, 또는 적어도 약 1000-배, 또는 1000-배 이상 더 신생혈관형성을 유도한다.
중합체
생물학적 활성 폴리펩티드에 접합된 적절한 중합체는 약 50에서 약 100,000 서브유니트까지, 예를 들어, 약 50 서브유니트에서 약 100 서브유니트까지, 약 100 서브유니트에서 약 500 서브유니트까지, 약 500 서브유니트에서 약 1,000 서브유니트까지, 약 1,000 서브유니트에서 약 5,000 서브유니트까지, 약 5,000 서브유니트에서 약 10,000 서브유니트까지, 약 10,000 서브유니트에서 약 25,000 서브유니트까지, 약 25,000 서브유니트에서 약 50,000 서브유니트까지, 또는 약 50,000 서브유니트에서 약 100,000 서브유니트까지 포함하는 생체적합성 중합체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 선형 중합체는 100,000 서브유니트 이상을 포함한다.
서브유니트는 모두 동일할 수 있고, 예를 들어, 중합체는 호모중합체이다. 다른 구체예에서, 서브유니트의 하나 이상의 종이 존재하고, 예를 들어, 중합체는 헤테로중합체 또는 코-중합체이다. 어떤 구체예에서, 중합체는 선형 중합체이다. 다른 구체예에서, 중합체는 하나 이상의 가지를 포함할 수 있다.
적절한 중합체는 천연의 중합체, 반합성 중합체 및 합성 중합체를 포함한다.
적절한 천연의 중합체는 히알루론산, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸, 셀룰로스, 다당류, 등을 포함한다.
적절한 반합성 중합체는 알데하이드 또는 동종의 전구체로 교차결합된 콜라겐, 다이카르복실산 또는 그들의 할로겐 화합물, 다이아민, 셀룰로스 유도체, 히알루론산, 키틴질, 키토산, 겔란 껌, 크산탄, 펙틴 또는 펙트산, 폴리글리칸, 폴리만난, 한천, 아가로스, 천연 껌 및 글리코스아미노글리칸을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
적절한 합성 중합체는 폴리다이옥세인, 폴리포스파젠, 폴리술폰 레진, 폴리(아크릴산), 폴리(아크릴산) 부틸 에스테르, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌), 폴리우레탄 레진, 폴리(메타크릴산), 폴리(메타크릴산)-메틸 에스테르, 폴리(메타크릴산)-n 부틸 에스테르, 폴리(메타크릴산)-t 부틸 에스테르, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리페르플루오로프로필렌, 폴리 N-비닐 카르바졸, 폴리(메틸 이소프로페닐 케톤), 폴리 알파메틸 스티렌, 폴리비닐아세트산, 폴리(옥시메틸렌), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세트산), 폴리우레탄, 폴리(비닐 알콜), 및 폴리에틸렌 테레프탈염산; 에틸렌 비닐 알콜 공중합체(보통 일반명 EVOH 또는 상호 EVAL로 알려져 있음); 폴리부틸메타크릴산; 폴리(하이드록시길초산); 폴리(L-젖산); 폴리카프로락톤; 폴리(락티드-코-글리콜리드); 폴리(하이드록시부티르산); 폴리(하이드록시부티르산-코-길초산); 폴리다이옥세논; 폴리오르쏘에스테르; 폴리무수물; 폴리(글리콜산)(PGA); 폴리(D,L-젖산)(PLA); PGA 및 PLA의 공중합체; 폴리(글리콜산-코-트리메틸렌 탄산염); 폴리포스포에스테르; 폴리포스포에스테르 우레탄; 폴리(아미노산); 시아노아크릴산; 폴리(트리메틸렌 탄산염); 폴리(이미노탄산염); 코폴리(에테르-에스테르)(예를 들어, PEO/PLA); 폴리알킬렌 옥살산; 폴리포스파젠; 폴리우레탄; 실리콘; 폴리에스테르; 폴리올레핀; 폴리이소부틸렌 및 에틸렌-알파올레핀 공중합체; 아크릴 중합체 및 공중합체; 폴리비닐 클로라이드와 같은 비닐 할로겐화물 중합체 및 공중합체; 폴리비닐 메틸 에테르와 같은 폴리비닐 에테르; 폴리비닐리덴 플루오르화물 및 폴리비닐리덴 클로라이드와 같은 폴리비닐리덴 할로겐화물; 폴리아크릴오니트릴; 폴리비닐 케톤; 폴리스티렌과 같은 폴리비닐 방향족; 폴리비닐 아세트산과 같은 폴리비닐 에스테르; 서로에 대한 비닐 단량체의 공중합체 및 에틸렌-메틸 메타크릴산 공중합체, 아크릴오니트릴-스티렌 공중합체, ABS 레진, 및 에틸렌-비닐 아세트산; 나일론 66 및 폴리카프로락탐과 같은 폴리아마이드; 알키드 수지 레진; 폴리탄산염; 폴리옥시메틸렌; 폴리이미드; 폴리에테르; 에폭시 레진; 폴리우레탄; 레이온; 레이온-트리아세트산; 셀룰로스; 셀룰로스 아세트산; 셀룰로스 부티르산; 셀룰로스 아세트산 부티르산; 셀로판; 셀룰로스 질산염; 셀룰로스 프로피온 에스테르; 셀룰로스 에테르; 비결정질 테플론; 및 카르복시메틸 셀룰로스로부터 유도된 중합체 또는 공중합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
생물학적 활성 폴리펩티드가 접합된 중합체는 히알루론산, 아크릴산, 에틸렌 글리콜, 비닐, 프로필렌, 메틸 메타크릴산, 메타크릴산, 아크릴아마이드, 하이드록시에틸 메타크릴산, 테트라플루오로에틸렌, 옥시메틸렌, 당(예를 들어, 글루코스, 만니톨, 말토스, 아라비노스, 등), 타우린, 베타인, 변형된 세룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 변형된 녹말, 소수성으로 변형된 녹말, 하이드록시에틸 녹말, 하이드록시프로필 녹말, 아밀로스, 아밀로펙틴, 산화된 녹말, 아미노산, 및 이들의 임의의 공중합체로부터 선택되는 다중 서브유니트를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 중합체는 아미노산을 포함하지 않는다.
어떤 구체예에서, 중합체는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체이다. 카르복실 기능의 일부 또는 모두가 지방족, 방향족, 아릴지방족, 사이클로지방족 또는 헤테로사이클릭 계열의 알콜; 숙신산의 헤미에스테르 또는, 히알루론산과 또는 히알루론산의 일부 또는 전체 에스테르와 숙신산의 헤미에스테르의 중금속 염; 황산염화 또는 N-황산염화 히알루론산으로 에스테르화 되었을 때 히알루론산 유도체는 예를 들어, 히알루론산 에스테르를 포함한다.
폴리펩티드
대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드 구성요소는 생물학적으로 활성이고, 예를 들어, 생체 내 및/또는 시험관 내에서 하나 이상의 생물학적 활성을 나타낸다. 생물학적 활성은 예를 들어, 항원 결합; 진핵 세포에서 신호 전달 경로의 활성화; 세포 증식의 유도; 세포 분화의 유도, 신생혈관형성의 유도, 아폽토시스의 유도, 신생혈관형성의 유도; 신생혈관형성의 억제; 응고의 감소; 세포 부착의 감소; 세포 부착의 증대; 세포 운명의 조절; 등을 포함한다.
대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드 구성요소는 자연적으로 발생한 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 비-아미노산 모이어티, 예를 들어, 지질 모이어티, 당 모이어티, 탄수화물 모이어티, 등을 포함할 수 있다.
어떤 구체예에서, 폴리펩티드의 단일 종이 중합체에 부착되는데, 예를 들어, 모두 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 복수가 중합체에 부착된다. 다른 구체예에서, 첫 번째 폴리펩티드가 첫 번째 아미노산 서열을 갖고, 두 번째 폴리펩티드가 첫 번째 아미노산 서열과 다른(예를 들어, 두 번째 아미노산 서열은 첫 번째 아미노산 서열과 약 95%에서 약 99%까지, 약 90%에서 약 95%까지, 약 85%에서 약 90%까지, 약 80%에서 약 85%까지, 약 75%에서 약 80%까지, 약 70%에서 약 75%까지, 약 65%에서 약 70%까지, 또는 65% 미만의 아미노산 서열 동일성을 가질 때) 두 번째 아미노산 서열을 가질 때, 폴리펩티드의 두 개 이상의 종이 중합체에 부착된다. 예를 들면, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 다른 세포 표면 수용체를 표적할 수 있는데, 예를 들어, 첫 번째 폴리펩티드는 인테그린 수용체를 통해 세포 부착을 제공할 수 있고, 두 번째 폴리펩티드는 예를 들어, 성장 인자 수용체, 등을 통해 결합된 세포의 활성화를 제공할 수 있다. 다른 예시로서, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 세포 분화를 유도할 수 있는데, 예를 들어, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 둘 다 근발생(myogenesis)을 유도할 수 있고, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 둘 다 심근발생(cardiomyogenesis)을 유도할 수 있고, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 둘 다 신경발생을 유도할 수 있고, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 둘 다 전구 세포의 연골세포로의 분화를 유도할 수 있고, 또는, 첫 번째 및 두 번째 폴리펩티드는 전능(totipotent), 만능(pluripotent) 또는 다능(multipotent) 전구 세포에서 혈액 생성(hematopoiesis)을 유도할 수 있다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드 구성요소는 재조합, 예를 들어, 폴리펩티드와의 아미드 결합 연결에서 정상적이지 않은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 폴리펩티드를 폴리펩티드-중합체 접합체의 중합체 구성요소에 대한 결합을 용이하게 하는 아미노산을 포함하도록 조작할 수 있다. 한 예로서, 폴리펩티드는 폴리펩티드-중합체 접합체의 중합체 구성요소에 대한 결합을 용이하게 하는 시스테인 잔기를 포함하도록 조작할 수 있다.
폴리펩티드의 크기는 2 kDa에서 약 2000 kDa까지, 예를 들어, 약 2 kDa에서 약 5 kDa까지, 약 5 kDa에서 약 10 kDa까지, 약 10 kDa에서 약 25 kDa까지, 약 25 kDa에서 약 50 kDa까지, 약 50 kDa에서 약 100 kDa까지, 약 100 kDa에서 약 250 kDa까지, 약 250 kDa에서 약 500 kDa까지, 약 500 kDa에서 약 1000 kDa까지, 약 1000 kDa에서 약 2000 kDa까지의 범위일 수 있다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드 구성요소는 검출가능한 표지를 포함한다. 적절한 표지는 예를 들어, 방사선동위원소(예를 들어, 125I; 35S, 등); 검출가능한 신호를 발생하는 효소(예를 들어, 루시퍼라제, β-갈락토시다아제, 서양고추냉이 페록시다아제, 알칼리 포스파타아제, 등); 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 등); EDTA와 같은 금속 킬레이트 그룹을 통해 항체에 부착된 형광 방사 금속, 예를 들어, 152Eu, 또는 다른 란탄계; 화학발광 화합물, 예를 들어, 루미놀, 이소루미놀, 아크리디늄 염, 등; 생물발광 화합물, 예를 들어, 루시페린; 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 노랑 형광 단백질, 빨강 형광 단백질, 등); 등을 포함한다.
대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 생성하기 위한, 중합체로의 부착에 관심 있는 폴리펩티드는 예를 들어, 성장 인자, 수용체, 수용체에 대한 폴리펩티드 리간드, 효소, 항체, 응고 인자, 항-응고 인자, 신생혈관형성 인자, 항-신생혈관형성 인자, 등을 포함한다. 적절한 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드 및 사이클릭 폴리펩티드를 포함한다. 적절한 폴리펩티드는 천연적으로 발생한 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 등을 포함한다.
적절한 폴리펩티드는 인터페론(예를 들어, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-ω; IFN-τ); 인슐린(예를 들어, Novolin, Humulin, Humalog, Lantus, Ultralente, 등); 에리스로포이에틴("EPO"; 예를 들어, Procrit, Eprex, 또는 Epogen(에포이틴-α); Aranesp(다르베포이에틴-α); NeoRecormon, Epogin(에포이틴-β); 등); 단일 클론 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항체(예를 들어, 단일클론 항체)(예를 들어, Rituxan(리툭시맙); Remicade(인플릭시맙); Herceptin(트라스투주맙); Humira™(아달리무맙); Xolair(오말리주맙); Bexxar(토시투모맙); Raptiva™(에팔리주맙); Erbitux™(세툭시맙); 등); 혈액 인자(예를 들어, Activase(알테팔라제) 조직 플라스미노젠 활성제; NovoSeven(재조합 인간 인자 VIIa); 인자 VIIa; 인자 VIII(예를 들어, Kogenate); 인자 IX; β-글로빈; 헤모글로빈; 등); 콜로니 자극 인자(예를 들어, Neupogen(필그라스팀; G-CSF); 뉴라스타(페그필그라스팀); 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 거핵구 콜로니 자극 인자; 등); 성장 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 예를 들어, Genotropin, Nutropin, Norditropin, Saizen, Serostim, Humatrope, 등; 인간 성장 호르몬; 등); 인터루킨(예를 들어, IL-1; IL-2, 예를 들어, Proleukin; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9; 등 포함); 성장 인자(예를 들어, Regranex(베클라페르민; PDGF); Fiblast(트라페르민; bFGF); Stemgen(안세스팀; 줄기 세포 인자); 케라티노사이트 성장 인자; 산성 섬유아세포 성장 인자, 줄기 세포 인자, 기본 섬유아세포 성장 인자, 간세포 성장 인자; 등); 수용체(예를 들어, Enbrel(etanercept)과 같은 TNF-α-결합 가용성 수용체; VEGF 수용체; 인터루킨 수용체; γ/δ T 세포 수용체; 등); 뉴로트랜스미터 수용체(예를 들어, 니코티닉 아세틸콜린 수용체, 글루탐산 수용체, GABA 수용체, 등); 효소(예를 들어, α-글루코시다아제; Cerazyme(이미글루카라아제; β-글루코세레브로시다아제, Ceredase(알글루세라아제); 효소 활성제(예를 들어, 조직 플라스미노젠 활성제); 케모카인(예를 들어, IP-10; Mig; Groα/IL-8, RANTES; MIP-1α; MIP-1β; MCP-1; PF-4; 등); 신생혈관형성 제제(예를 들어, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); 항-신생혈관형성 제제(예를 들어, VEGF 수용체); 브래디키닌, 콜레시스토키닌, 가스틴, 시크리틴, 옥시토닌, 성선 자극 호르몬-분비 호르몬, 베타-엔돌핀, 엔케팔린, 기질 P, 소마토스타틴, 프로락틴, 갈라닌, 성장 호르몬-분비 호르몬, 봄베신, 디노르핀, 뉴로텐신, 모틸린, 티로트로핀, 뉴로펩티드 Y, 황체형성 호르몬, 칼시토닌, 인슐린, 글루카곤, 바소프레신, 안지오텐신 II, 티로트로핀-분비 호르몬, 혈관작용 장 펩티드, 수면 펩티드, 등과 같은 신경활성 펩티드; 혈전용해제, 심방 나트륨뇨배설촉진제 펩티드, 골 형성 단백질, 트롬보포이에틴, 릴렉신, 아교세포 소섬유성 산성 단백질, 소낭 자극 호르몬, 인간 알파-1 안티트립신, 백혈병 억제 인자, 형질전환 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 황체형성 호르몬, 대식세포 활성 인자, 종양 괴사 인자, 호중성 주화소 인자, 메탈로 프로테아제의 신경 성장 인자 조직 억제자와 같은 다른 단백질; 혈관작용 장 펩티드, 안지오제닌, 안지오트로핀, 피브린; 히루딘; 백혈병 억제 인자; IL-1 수용체 길항제(예를 들어, Kineret(아나긴라)); 이온 채널, 예를 들어, 낭포성 섬유증 막통과 전도력 조절자(CFTR); 디스트로핀; 유트로핀, 종양 억제자; 리소조말 효소 산 α-글루코시다아제(GAA); 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적절한 폴리펩티드는 소닉 헤지호그(Shh), 골 형성 단백질-4, 인터루킨-3(IL-3), 줄기 세포 인자-1(SCF-1), fms-유사 티로신 키나아제-3(Flt3) 리간드, 백혈병 억제 인자(LIF), 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2), 및 상피 성장 인자(EGF)를 포함한다. 적절한 폴리펩티드는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴로트로핀-5(NT-5), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 아교세포-유래 뉴로영양 인자(GDNF), 및 프로타아제 넥신-1을 포함한다. 적절한 신생혈관형성 폴리펩티드는 네트린-1 폴리펩티드, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 폴리펩티드, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 폴리펩티드, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 폴리펩티드, 및 안지오포이에틴 폴리펩티드를 포함한다.
적절한 폴리펩티드는 또한 응고 인자, 예를 들어, 트롬빈, 등을 포함한다. 적절한 폴리펩티드는 또한 항-응고제를 포함한다. 적절한 폴리펩티드는 또한 세포-결합 폴리펩티드를 포함한다.
적절한 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 네스틴, 비멘틴, 프로미닌/CD133, 소닉 헤지호그 및 다른 헤지호그 리간드, Wnt 리간드, 뉴로칸/테나신 C, Nurr 1, Pax-6, Sox-2, 무사시-1, NG2/CSPG-4, 뉴로 D3, 뉴로제닌 1, 및 임의의 이들 폴리펩티드의 활성 단편 및 서브서열을 포함한다.
적절한 폴리펩티드는 또한 예를 들어, β 튜불린 III, MAP2, 신경세포 특이적 에놀라아제, NCAM, CD24, HAS, 시냅신 I, 시냅토피신, CAMK Iia, 티로신 하이드록시라아제, 글루탐산 수송자, 글루탐산 수용체, 콜린 수용체, 니코티닉 A2, EphB2, GABA-A 수용체, 세로토닌(5HT-3) 수용체, 콜린 아세틸기전이효소, 및 임의의 상기의 것의 단편 및 서브서열을 포함한다.
적절한 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 칼슘 채널; T-세포 항원 수용체; 케모카인 수용체; 칼륨 채널; 뉴로트랜스미터 수용체(예를 들어, 세로토닌 수용체; GABA 수용체; 글루탐산 수용체; 니코티닉 아세틸콜린 수용체; 등); 성장 인자 수용체(예를 들어, 상피 성장 인자 수용체; 혈관 내피세포 성장 인자 수용체, 등); 골 형성 단백질; 세포 신호 전달 경로를 활성화시키는 폴리펩티드; 등을 포함한다.
대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 폴리펩티드 구성요소는 생물학적으로 활성이다. 당업자는 주어진 폴리펩티드가 생물학적으로 활성인지 여부를 특정 생물학적 활성에 대한 시험에 대해서 설계된 잘 알려진 다수의 임의의 분석을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 특정 생물학적 활성 폴리펩티드에 대한 유용한 분석의 예시는 GMCSF를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(Eaves, A. C. and Eaves C. J., 세포 배양에서 적혈구 생성. In: McCullock E A (edt) 세포 배양 기술--혈액학 강의. W B Saunders, Eastbourne, pp 371-91 (1984); Metcalf, D., International Journal of Cell Cloning 10: 116-25 (1992); Testa, N. G., et al., 조혈 성장 인자에 대한 분석. In: Balkwill F R (edt) Cytokines A practical Approach, pp 229-44; IRL Press Oxford 1991) EPO (생물분석: Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140 p323 (1989)); 히루딘(혈소판 응집 분석: Blood Coagul Fibrinolysis 7(2):259-61 (1996)); IFNα (항-바이러스 분석: Rubinstein et al., J. Virol. 37(2):755-8 (1981); 항-증식 분석: Gao Y, et al Mol Cell Biol. 19(11):7305-13 (1999); 및 생물분석: Czarniecki et al., J. Virol. 49 p490 (1984)); GCSF (생물분석: Shirafuji et al., Exp. Hematol. 17 p116 (1989); 쥣과 NFS-60 세포의 증식(Weinstein et al, Proc Natl Acad Sci 83:5010-4 (1986)); 인슐린(3H-글루코스 섭취 분석: Steppan et al., Nature 409(6818):307-12 (2001)); hGH (Ba/F3-hGHR 증식 분석: J Clin Endocrinol Metab 85(11):4274-9 (2000); 성장 호르몬에 대한 국제 표준: Horm Res, 51 Suppl 1:7-12 (1999)); 인자 X (인자 X 활성 분석: Van Wijk et al. Thromb Res 22:681-686 (1981)); 인자 VII (프로트롬빈 응고 시간을 사용한 응고 분석: Belaaouaj et al., J. Biol. Chem. 275:27123-8(2000); Diaz-Collier et al., Thromb Haemost 71:339-46 (1994)).
세포 신호 전달 경로의 활성화에 대한 분석은 당업계에 알려져 있다. 세포 증식의 유도에 대한 분석은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 3H-티미딘 섭취 분석, 등을 포함한다. 신생혈관형성의 유도에 대한 분석은 예를 들어, 병아리 융모막(CAM) 분석, 시험관 내 내피 세포 분석, 마트리겔 분석, 디스크 신생혈관형성 시스템, 등을 포함한다. 세포 분화의 유도에 대한 분석은 당업계에 알려져 있고, 분화된 세포 형태와 연관된 유전자 산물을 탐지하기위한 분석을 포함한다.
링커
앞에서 언급한 바, 어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 중합체에 폴리펩티드를 연결시키는 링커 그룹을 포함한다. 적절한 링커는 펩티드 링커 및 비-펩티드 링커를 포함한다.
링커 펩티드는 임의의 다양한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대표적인 펩티드 링커는 약 6개 및 약 40개 아미노산 길이 사이, 또는 약 6개 및 약 25개 아미노산 길이 사이이다. 대표적인 링커는 폴리(글리신) 링커(예를 들어,(Gly)n, n은 정수 2에서 약 10까지이다); Gly 및 Ser을 포함하는 링커; 등을 포함한다.
접합
다양한 접합 방법 및 화학 작용을 폴리펩티드를 중합체에 접합시키는데 사용할 수 있다. 다양한 영-길이(zero-length), 호모-이중기능성, 및 헤테로-이중기능성 교차결합 시약을 이용할 수 있다. 영-길이 교차결합 시약은 외인성 물질의 도입 없이 두 개의 내재성 화학 그룹의 직접적 접합을 포함한다. 다이설파이드 본드의 형성을 촉진시키는 제제도 이 범주에 속한다. 다른 예시는 카르보다이이미드, 에틸클로로포름산, Woodward's 시약 K(2-에틸-5-페닐이소자졸리움-3'-설폰산), 및 카르보닐다이이미드아졸과 같은 아미드 결합을 형성하기 위한 카르복실 및 일차 아미노 그룹과 같은 축합을 유도하는 시약이다. 호모- 및 헤테로-이중기능성 시약은 일반적으로 두 개의 동일한 또는 두 개의 비-동일한 위치를 각각 포함하고, 이는 아미노, 설프히드릴, 구아니디노, 인돌 또는 비특이적 그룹과 반응할 수 있다.
어떤 구체예에서, 중합체는 폴리펩티드 또는 링커에서 일차 아민 그룹과 반응할 수 있는 아미노-활성 그룹을 포함한다. 적절한 아미노-활성 그룹은 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르, 이미도에스테르, 이소시아네이트, 아실할로겐화물, 아릴아자이드, p-니트로페닐 에스테르, 알데하이드, 및 설포닐 클로라이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
어떤 구체예에서, 중합체는 예를 들어, 폴리펩티드에서 시스테인 잔기와 반응하기 위한 설프히드릴-활성 그룹을 포함한다. 적절한 설프히드릴-활성 그룹은 말레이미드, 알킬 할로겐화물, 피리딜 다이설파이드, 및 티오프탈이미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체예에서, 물 및 유기 용매 모두에서 가용성인 카르보다이이미드를 카르복실-반응 시약으로서 사용할 수 있다. 이들 화합물은 유사요소(pseudourea)를 형성하는 자유 카르복실 그룹과 반응한 후, 아마이드 결합을 야기할 수 있는, 이용가능한 아민과 연결시킬 수 있다.
앞에서 언급한 바, 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 호모이중기능성 교차링커를 사용하여 중합체에 접합된다.
어떤 구체예에서, 호모이중기능성 교차링커는 일차 아민과 반응한다. 일차 아민과 반응하는 호모이중기능성 교차링커는 NHS 에스테르, 이미도에스테르, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 아실할로겐화물, 아릴아자이드, p-니트로페닐 에스테르, 알데하이드, 및 설포닐 클로라이드을 포함한다.
호모이중기능성 NHS 에스테르의 비-제한적 예시는 다이숙신이미딜 글루타르산(DSG), 다이숙신이미딜 수베르산(DSS), 비스(설포숙신이미딜) 수베르산(BS), 다이숙신이미딜 타타르산(DST), 다이설포숙신이미딜 타타르산(설포-DST), 비스-2-(숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸술폰(BSOCOES), 비스-2-(설포숙신이미도옥시카르보닐옥시)에틸술폰(설포-BSOCOES), 에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙신산)(EGS), 에틸렌 글리콜비스(설포숙신이미딜숙신산)(설포-EGS), 다이티오비스(숙신이미딜프로피온 에스테르(DSP), 및 다이티오비스(설포숙신이미딜프로피온 에스테르(설포-DSP)를 포함한다. 호모이중기능성 이미도에스테르의 비-제한적 예시는 다이메틸 말론이미드산(DMM), 다이메틸 숙신이미드산(DMSC), 다이메틸 아디피미드산(DMA), 다이메틸 피멜이미드산(DMP), 다이메틸 슈퍼이미드산(DMS), 다이메틸-3,3'-옥시다이프로피온이미드산(DODP), 다이메틸-3,3'-(메틸렌다이옥시)다이프로피온이미드산(DMDP), 다이메틸-,3'-(다이메틸렌다이옥시)다이프로피온이미드산(DDDP), 다이메틸-3,3'-(테트라메틸렌다이옥시)다이프로피온이미드산(DTDP), 및 다이메틸-3,3'-다이티오비스프로피온이미드산(DTBP)을 포함한다.
호모이중기능성 이소티오시아네이트의 비-제한적 예시는 p-페닐렌다이이소티오시아네이트(DITC), 및 4,4'-다이이소티오시아노-2,2'-다이술폰산 스틸벤(DIDS)를 포함한다. 호모이중기능성 이소시아네이트의 비-제한적 예시는 자일렌-다이이소시아네이트, 톨루엔-2,4-다이이소시아네이트, 톨루엔-2-이소시아네이트-4-이소티오시아네이트, 3-메톡시다이페닐메탄-4,4'-다이이소시아네이트, 2,2'-다이카르복시-4,4'-아조페닐다이이소시아네이트, 및 헥사메틸렌다이이소시아네이트를 포함한다. 호모이중기능성 아릴할로겐화물의 비-제한적 예시는 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠(DFDNB), 및 4,4'-다이플루오로-3,3'-다이니트로페닐-술폰을 포함한다. 호모이중기능성 지방족 알데히드 시약의 비-제한적 예시는 글리옥살, 말론다이알데히드, 및 글루타르알데히드를 포함한다. 호모이중기능성 아실화 시약의 비-제한적 예시는 다이카르복실산의 니트로페닐 에스테르를 포함한다. 호모이중기능성 방향족 설포닐 클로라이드의 비-제한적 예시는 페놀-2,4-다이설포닐 클로라이드, 및 α-나프톨-2,4-다이설포닐 클로라이드를 포함한다. 추가적인 아미노-반응 호모이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 비스카르바마산을 제공하기 위해 아민과 반응하는 에리트리톨비스탄산염을 포함한다.
어떤 구체예에서, 호모이중기능성 교차링커는 자유 설프히드릴 그룹과 반응한다. 자유 설프히드릴 그룹과 반응하는 호모이중기능성 교차링커는 예를 들어,말레이미드, 피리딜 다이설파이드, 및 알킬 할로겐화물을 포함한다.
호모이중기능성 말레이미드의 비-제한적 예시는 비스말레이미도헥산(BMH), N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드, N,N'-(1,2-페닐렌)비스말레이미드, 아조페닐다이말레이미드, 및 비스(N-말레이미도메틸)에테르를 포함한다. 호모이중기능성 피리딜 다이설파이드의 비-제한적 예시는 1,4-다이-3'-(2'-피리딜다이티오)프로피온아미도부탄(DPDPB)을 포함한다. 호모이중기능성 알킬 할로겐화물의 비-제한적 예시는 2,2'-다이카르복시-4,4'-다이요도아세트아미도아조벤젠, α,α'-다이요도-p-자일렌술폰산, α,α'-다이브로모-p-자일렌술폰산, N,N'-비스(b-브로모에틸)벤질아민, N,N'-다이(브로모아세틸)페닐히드라진, 및 1,2-다이(브로모아세틸)아미노-3-페닐프로판을 포함한다.
앞에서 언급한 바, 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 헤테로이중기능성 시약을 사용하여 중합체에 접합된다. 적절한 헤테로이중기능성 시약은 피리딜 다이설파이드 모이어티를 포함하는 아미노-반응 시약; 말레이미드 모이어티를 포함하는 아미노-반응 시약; 알킬 할로겐화물 모이어티를 포함하는 아미노-반응 시약; 및 알킬 다이할로겐화물 모이어티를 포함하는 아미노-반응 시약을 포함한다.
피리딜 다이설파이드 모이어티 및 아미노-반응 NHS 에스테르와의 헤테로-이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피온 에스테르(SPDP), 숙신이미딜 6-3-(2-피리딜다이티오)프로피온아미도헥산산(LC-SPDP), 설포숙신이미딜 6-3-(2-피리딜다이티오)프로피온아미도헥산산(설포-LCSPDP), 4-숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜다이티오)톨루엔(SMPT), 및 설포숙신이미딜 6-α-메틸-α-(2-피리딜다이티오)톨루아미도헥산산(설포-LC-SMPT)를 포함한다.
말레이미드 모이어티 및 아미노-반응 NHS 에스테르를 포함하는 헤테로이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 숙신이미딜 말레이미딜아세트산(AMAS), 숙신이미딜 3-말레이미딜프로피온 에스테르(BMPS), N-감마-말레이미도부티릴옥시숙신이미드 에스테르(GMBS)N-감마-말레이미도부티릴옥시설포숙신이미드 에스테르(설포-GMBS) 숙신이미딜 6-말레이미딜헥산산(EMCS), 숙신이미딜 3-말레이미딜벤조산(SMB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르(설포-MBS), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실산(SMCC), 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실산(설포-SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티르산(SMPB), 및 설포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티르산(설포-SMPB)을 포함한다.
알킬 할로겐화물 모이어티 및 아미노-반응 NHS 에스테르를 포함하는 헤테로이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 N-숙신이미딜-(4-요도아세틸)아미노벤조산(SIAB), 설포숙신이미딜-(4-요도아세틸)아미노벤조산(설포-SIAB), 숙신이미딜-6-(요도아세틸)아미노헥산산(SIAX), 숙신이미딜-6-(6-((요도아세틸)-아미노)헥사노일아미노)헥산산(SIAXX), 숙신이미딜-6-(((4-(요도아세틸)-아미노)메틸)-사이클로헥산-1-카르보닐)아미노헥산산(SIACX), 및 숙신이미딜-4((요도아세틸)-아미노)메틸사이클로헥산-1-카르복실산(SIAC)을 포함한다.
아미노-반응 NHS 에스테르 및 알킬 다이할로겐화물 모이어티를 포함하는 헤테로이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 N-하이드록시숙신이미딜 2,3-다이브로모프로피온 에스테르(SDBP)이다. 알킬 할로겐화물 모이어티 및 아미노-반응 p-니트로페닐 에스테르 모이어티를 포함하는 헤테로이중기능성 시약의 비-제한적 예시는 p-니트로페닐 요도요도트산(NPIA)을 포함한다.
조성물
본 발명은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 포함하는 조성물을 제공한다.
어떤 구체예에서, 대상 조성물은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함하고, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 동종, 예를 들어, 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드-중합체 접합체의 전체 폴리펩티드이다. 예를 들면, 어떤 구체예에서, 대상 조성물은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 복수(예를 들어, 다중 복제)를 포함하고, 각각의 폴리펩티드-중합체 접합체 분자는 모두 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 대상 조성물은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 두 개 이상의 종을 포함하는데, 예를 들어, 대상 조성물은 첫 번째 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 폴리펩티드-중합체 접합체; 및 첫 번째 아미노산 서열과 다른 두 번째 아미노산 서열의 폴리펩티드를 포함하는 적어도 두 번째 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 대상 조성물은 세 번째 또는 추가적인 펩티드-중합체 접합체를 포함한다. 하나의 비-제한적 예시로서, 첫 번째 폴리펩티드-중합체 접합체는 인테그린에 결합하기 위해 제공되는 첫 번째 폴리펩티드를 포함하고; 두 번째 폴리펩티드-중합체 접합체는 세포 신호 전달 경로를 활성화하는 두 번째 폴리펩티드를 포함한다. 첫 번째, 두 번째 등의 다양한 다른 조합의 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 대상 조성물에서 첫 번째 폴리펩티드-중합체 접합체의 두 번째 폴리펩티드-중합체 접합체에 대한 비율은 예를 들어, 약 0:001에서 103까지부터 약 103에서 0.001까지로 다양할 수 있다. 유사하게, 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함하는 대상 조성물의 경우 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 폴리펩티드-중합체 접합체의 비율은 다양할 수 있다.
대상 조성물은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체에 추가로, 염, 예를 들어, NaCl, MgCl, KCl, MgSO4, 등; 완충제, 예를 들어, 트리스 버퍼, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES), 2-(N-모르포리노)에탄술폰산(MES), 2-(N-모르포리노)에탄술폰산 나트륨 염(MES), 3-(N-모르포리노)프로판술폰산(MOPS), N-트리스[하이드록시메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS), 등; 용해제; 계면활성제, 예를 들어, Tween-20, 등과 같은 비-이온 계면활성제; 프로테아제 억제제; 등에서 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 대상 폴리펩티드-중합체 접합체 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 조성물을 제공한다. 적절한 첨가제 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등 및 그들의 조합이다. 게다가, 만약 원한다면, 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 포함할 수 있다. 이런 투약 형태를 제조하는 실질적 방법은 알려져 있거나, 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985)을 참고하라. 투여되는 조성물 또는 제형은 임의의 경우에서, 치료될 피험자에서 원하는 상태를 달성하기에 적합한 양의 제제를 포함한다. 부형제, 보조제, 담체 또는 희석제와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제는 일반이 용이하게 이용할 수 있다. 게다가, pH 조절제 및 완충제, 강장 조절제, 안정제, 습윤제 등과 같은 약학적으로 허용가능한 보조 물질은 일반이 용이하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 첨가제"는 상호교환적으로 사용하였고, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체과 결합되었을 때 접합체의 생물학적 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않고, 숙주에서 면역 반응을 유도하지 않으며, 숙주에서 임의의 실질적인 불리한 생리학적 효과를 갖지 않는 임의의 물질을 포함한다. 예시는 인산염 버퍼 식염수, 물, 유성/수성 유제와 같은 유제, 및 다양한 형태의 습윤제와 같은 임의의 표준 약학적 담체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 담체는 또한 멸균 용액, 코팅된 정제를 포함하는 정제 및 캡슐을 포함할 수 있다. 전형적으로 이런 담체는 녹말, 우유, 당, 어떤 형태의 진흙, 젤라틴, 스테아르산 또는 그들의 염, 마그네슘 또는 칼슘 스테아르산염, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 껌, 글리콜, 또는 다른 알려진 첨가제와 같은 첨가제를 함유한다. 이러한 담체는 또한 향미료 및 색소 첨가제 또는 다른 구성요소를 포함할 수 있다. 이런 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 고전적 방법에 의해 명확히 하였다.
약학적 조성물은 예를 들면, 국소, 경구, 코, 정맥, 두개 내, 복막 내, 종양 내, 종양주위, 피하, 또는 근육 내 투여를 포함하는 투여의 선택된 방법에 대하여 명확히 할 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여에 있어서, 담체는 물, 식염수, 알콜, 지방, 밀랍 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 경구 투여에 있어서, 임의의 상기 담체 또는 만니톨, 유당, 녹말, 마그네슘 스테아르산, 사카린 나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 자당, 및 마그네슘 탄산염과 같은 고체 담체를 사용할 수 있다. 생분해성 미소구체(예를 들어, 폴리젖산 폴리글리콜산) 또한 대상 약학적 조성물에 대한 담체로서 사용할 수 있다. 적절한 생분해성 미소구체는 예를 들면, 미국 특허 번호 4,897,268 및 5,075,109에서 개시되었다.
어떤 구체예에서, 대상 약학적 조성물은 비경구적, 예를 들어, 정맥주사로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 버퍼 용액, 식염수, 인산염-버퍼 식염수, 등에 용해하거나, 부유시킨 대상 접합체를 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 강장 조절제, 습윤제, 계면활성제 등과 같은 생리학적 조건에 근접하는데 요구되는 바의 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다.
대상 조성물은 고전적 멸균 기술에 의해 멸균할 수 있거나, 여과에 의해 멸균할 수 있다. 결과적인 수성 용액을 그대로 사용하기 위해 또는 감압하에 동결건조하여 포장하고, 감압하에 동결건조된 표본은 투여 전에 멸균 수성 담체와 결합될 것이다. 표본의 pH는 3 내지 11, 예를 들어, 약 pH 5에서 약 pH 9까지, 또는 약 pH 7에서 약 pH 8까지의 범위일 수 있다.
이식형 조직 및 장치
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 예를 들어, 인공 조직; 조직으로의 이식물; 이식형 장치(혈관내 스텐트, 인공 관절, 골격, 그라프트(예를 들어, 대동맥 그라프트), 인공 심장 판막, 뇌척수액 션트, 관상동맥 션트, 심장박동 조절기 전극, 심내막 전극선, 등과 같은)에 대한 코팅; 이식형 약물 전달 시스템; 등의 이식형 조직 또는 장치에 코팅되거나, 층을 이루거나, 통합되거나, 이를 형성한다. 인공 조직은 예를 들어, 합성 심장 판막(예를 들어, 합성 대동맥 판막, 합성 승모 판막, 등)을 포함한다. 스텐트는 예를 들어, 자가-확장 스텐트, 풍선-확장 스텐트, 및 스텐트-이식을 포함한다. 생물질은 예를 들어, 필름, 겔, 해면, 가제, 부직포 직물, 막, 미소구체, 미소캡슐, 무명실, 안내 채널, 등을 포함한다.
예를 들면, 어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 합성 이식형 장치를 형성하기 위한 주형에서 층을 이루거나, 코팅되거나, 달리 부착된다. 예를 들면, 주형(또한 "생체적합성 기질"이라고 지칭됨)은 피험자에게 이식하는데 적절하고, 그 위에 대상 폴리펩티드-중합체 접합체가 층을 이루거나, 코팅되거나 또는 달리 부착된다. 생체적합성 기질은 피험자에게 일단 이식되면 독성 또는 해로운 효과를 유발하지 않는다. 일 구체예에서, 생체적합성 기질은 재생 또는 대체할 필요가 있는, 원하는 구조로 형상화할 수 있는 표면의 중합체이다. 생체적합성 기질은 또한 재생 또는 대체할 필요가 있는, 구조의 일부로 형상화할 수 있다. 생체적합성 기질은 층을 이루거나, 코팅되거나, 달리 부착될 수 있는 대상 폴리펩티드-중합체 접합체에 보조적인 뼈대를 제공한다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체가 부착되어 포함된 주형 또는 골격은 나아가 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함하는 주형 또는 골격에 결합하는 하나 이상의 세포 및/또는 하나 이상의 세포 형태를 포함한다. 이런 매트릭스 또는 골격은 조직 공학, 세포 배양, 세포 이식, 등에 유용하다.
어떤 구체예에서, 약물 전달 장치는 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함한다. 예를 들면, 약물 분비 장치는 확산 시스템, 환류 시스템 또는 침습적 시스템(예를 들어, 침식-기반 시스템)에 기반할 수 있다. 예를 들면, 약물 분비 장치는 전기화학적 펌프, 삼투 펌프, 전기삼투 펌프, 증기 압력 펌프 또는, 예를 들어, 약물이 중합체에 통합되어 있고, 중합체가 약물-포화 중합 물질(예를 들어, 생분해성, 약물-포화 중합 물질)의 분해를 수반하는 약물 제형의 분비를 제공할 때, 삼투 파열 주형일 수 있다. 다른 구체예에서, 약물 분비 장치는 전기확산 시스템, 전해질 펌프, 발포정 펌프, 압전기 펌프, 가수분해 시스템, 등에 기반한다.
어떤 구체예에서, 이식형 약물 전달 시스템을 활성제의 투여에 제공하기 위해 프로그램할 수 있다. 대표적인 프로그램가능하고, 이식형인 시스템은 이식형 주입 펌프를 포함한다. 대표적인 이식형 주입 펌프 또는 이와 같은 펌프와 관련하여 유용한 장치는 예를 들면, 미국 특허 번호 4,350,155; 5,443,450; 5,814,019; 5,976,109; 6,017,328; 6,171,276; 6,241,704; 6,464,687; 6,475,180; 및 6,512,954에서 설명되어 있다. 나아가 대표적인 장치는 Synchromed infusion pump(Medtronic)이다.
이식형 약물 전달 장치는 임의의 다양한 제제, 예를 들어, 면역 반응 변경자, 항-증식, 항-아폽토시스 제제, 항-유사 분열 제제, 항-혈소판 제제, 백금 배위 복합체, 호르몬, 항응고제, 섬유소 분해 제제, 항-분비 제제, 항-이주 제제, 면역억제제, 신생혈관형성 제제, 안지오텐신 수용체 차단제, 산화질소 공급자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 세포 주기 억제제, 피질스테로이드, 혈관억제 스테로이드, 항-기생충 약물, 항-녹내장 약물, 항생제, 분화 조절자, 항바이러스 약물, 항암 약물, 및 항-염증 약물을 전달하는데 사용할 수 있다.
용도
대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 치료(예를 들어, 약물 전달, 이식형 장치, 조직 공학, 재생 의학), 진단, 약물 개발 및 연구적 응용을 포함하는 다양한 응용에서 용도를 찾는다.
치료적 응용
대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 다양한 치료적 응용에서 용도를 찾는다.
예를 들면, 앞에서 논한 바, 폴리펩티드-중합체 접합체의 생물학적 활성 폴리펩티드 구성요소가 기능성에 기여하고, 약물 전달 장치가 치료제를 제공할 때, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 약물 전달 장치에 부착시킬 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성 폴리펩티드는 치료제로 치료할 필요가 있는 특정 세포 형태 또는 조직 형태를 표적하는 것을 제공할 수 있고, 약물 전달 장치는 국소적 방법에서 치료제를 제공할 수 있다.
다른 예시로서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 생물학적 활성 폴리펩티드 구성요소는 예를 들어, 종양 세포에서 아폽토시스의 유도에 제공하는 것에 의해; 치료 부위에서 혈액의 응고를 유도하는 것에 의해; 혈소판 응집을 억제하는 것에 의해; 신생혈관형성을 유도하는 것에 의해; 세포 분화를 유도하는 것에 의해; 등, 그 자신이 치료제일 수 있다.
다른 예시로서, 앞에서 논한 바, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 생물학적 활성 폴리펩티드 구성요소가 원하는 활성, 예를 들어, 네오혈관내막 과형성 재발협착증의 저하; 세포 증식의 억제; 세포 부착의 억제; 등을 제공할 때, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 이식형 의학적 장치, 예를 들어, 스텐트, 션트, 인공 판막, 전극선, 인공 관절, 그라프트, 전극, 등에 부착시킬 수 있다.
다른 예시로서, 앞에서 논한 바, 폴리펩티드-중합체 접합체가 세포 결합을 제공할 때, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 주형 또는 골격에 부착시킬 수 있다. 폴리펩티드-중합체 접합체에 결합된 세포를 포함하거나 포함하지 않는 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 포함하는 주형 또는 골격을 세포 이식, 조직 공학, 등의 정황에서 개체로 도입시킬 수 있다.
어떤 구체예에서, 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 허혈 조직에 또는 그 근처에서 신생혈관형성(예를 들어, 폴리펩티드가 신생혈관형성을 유도하는 것일 때)을 유도하는 용도를 찾는다.
연구적 응용
대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 다양한 연구적 응용, 예를 들어, 세포 신호 전달 경로; 등을 연구하는 것에서 용도를 찾는다. 모델에서의 생리학적 반응에 대하여 대상 폴리펩티드-중합체 접합체의 효과를 시험하기 위해 대상 폴리펩티드-중합체 접합체를 질병의 실험적 비-인간 동물 모델에 투여할 수 있다. 대상 폴리펩티드-중합체 접합체는 또한 약물 스크리닝 응용에서 사용할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 제법 및 사용법에 대한 완전한 정보공개 및 설명을 제공하는 바와 같이 제안하지만, 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하도록 의도하거나, 아래의 모든 실험 또는 단지 수행된 실험만을 나타내도록 의도하는 것은 아니다. 사용한 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 보장하기 위해 노력하였으나, 다소의 실험적 오차 및 편차를 설명하여야 할 것이다. 달리 지시하지 않는 한, 부분은 중량 부분, 분자량은 평균 분자량 무게, 온도는 섭씨, 그리고 압력은 대기압이다. 예를 들어, bp, 염기쌍; kb, 킬로베이스; pl, 피코리터; s 또는 sec, 초; min, 분; h 또는 hr, 시간; aa, 아미노산; kb, 킬로베이스; bp, 염기쌍; nt, 뉴클레오티드; i.m., 근육 내; i.p., 복막 내; s.c., 피하; 등의 표준 약어를 사용하였다.
실시예 1 : 폴리펩티드-중합체 접합체의 합성 및 특성화
소닉 헤지호그(Shh) 단백질의 효능있는 활성 다가형은 선형 중합체 폴리아크릴산(pAAc) 및 히알루론산(HyA)의 카르보다이이미드 및 말레이미드 화학작용의 두 단계 반응을 통한 Shh의 변형된 재조합 형태의 생접합에 의해 제조되었다. 접합 효율은 선형 HyA 사슬당 30개 Shh 분자의 화학양론 비율(즉, 30:1 Shh:HyA)에서 조차 ~75%였다. 접합체의 생물활성은 0.6:1 Shh:HyA에서 22:1 Shh:HyA까지 다양한, HyA 선형 사슬에 대한 Shh 분자의 화학양론 비율의 범위에 걸쳐 세포 분석을 통해 시험하였다. 결과는 낮은 접합 비율은 Shh 생물활성을 감소시키고, 높은 비율은 단량체 가용성 Shh 및 7:1 Shh:HyA로 접합된 Shh 사이에서 대략 동등한 활성으로, 단량체의 효능을 넘어 이 활성을 증가시키는 것을 가리킨다. 게다가, 높은 비율은 생체 내 병아리 융모막(CAM) 분석에 의해 결정된 증가된 신생혈관형성을 구축한다. 이들 결과는 낮은 용적의 Shh 농도에서 더 높은 세포 신호전달을 야기하는 Shh:HyA 접합체 및 세포 표면 수용체 사이의 다중 상호작용의 역학 모델에 의해 획득하였다.
방법
재조합 Shh 및 생접합 기술
이전에 설명된(15) 래트 Shh의 N-말단 신호전달 도메인의 cDNA를 사용하여, 설프히드릴-기반 반응 및 단백질 정제를 위해 추가적인 시스테인 잔기 및 6×His 표지를 각각 PCR을 통해 단백질의 C-말단에 첨가하였다. 이러한 속박 부위는 단백질의 이 범위가 그의 활성 부위에서 떨어져있음을 증명한 연구를 기반으로 명확히 선택하였고, 비활성 분자를 활성을 변화시키지 않고 거기에 부착하였다(16). 생산된 변형된 Shh PCR 산물을 pBAD-HisA(Invitrogen, Carlsbad, CA) 플라스미드에 삽입하였고, 결과적인 플라스미드를 DNA 서열 분석을 통해 확인하고, 단백질을 BL21(DE3).pLys.E E에서 아라비노스 유도를 통해 발현시켰다. 단백질 발현의 유도 후에, 세포를 분쇄하였고, 결과적으로 발현된 Shh 단백질을 NiNTA(Qiagen, Valencia, CA) 결합 후의 이미다졸 용출을 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 10% 글리세롤, 2mM EDTA, 및 50 mM ZnSO4을 함유하는 pH 7.4 PBS에서 투석하였다.
정제된 Shh는 카르복실산 그룹에서의 카르보다이이미드 화학작용 및 단백질 C-말단 시스테인에서의 말레이미드 반응을 사용한 2-단계 반응을 통해 선형 중합체에 결합시켰다(도 1). 첫 번째 단계는 단백질의 이후의 부착을 감안하여 선형 중합체에 [N-e-말레이미도카프로산] 하이드라자이드(EMCH, Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 첨가하였다. 이 비-면역성 하이드라자이드-말레이미드 헤테로이중기능성 교차링커는 동일한 일반적 절차이지만, 다소 다른 반응 조건을 사용하여 두 개의 선형 중합체에 첨가하였다. pAAc 접합체에 있어서, 2 mg/ml의 450,000 Da pAAc(Polysciences, Warrington, PA)을 3.9 mg/ml의 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카르보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC), 1.1 mg/ml 및 N-하이드록시설포숙신이미드(설포-NHS), 및 0.5 mg/ml EMCH와 pH 6.5 MES 버퍼에서 상온에서 2 시간 동안 소형 펩티드 서열의 부착에 대해 설명한 바와 같이 반응시켰다(17). HyA의 활성화에 있어서, 하이드라자이드의 부착에 대해 이전에 설명된 것과 유사한 방법(9)을 106 Da MW HyA에 사용하였다.(Genzyme, Cambridge MA) 이를 용해시키고, 3 mg/ml에서 pAAc 반응에서 사용된 같은 농도의 EDC, 설포-NHS, 및 EMCH와 0.1 M MES 버퍼, pH 5.0에서 밤새 반응시켰다. EMCH의 부착 후에, 결과적인 말레이미드 활성화 선형 중합체는 일련의 희석 및 50,000 MW 컷오프 원심분리 필터(Pall Gellman)에서의 원심분리를 통해 비접합된 시약으로부터 분리하였다.
활성화된 중합체를 이후 가지각색의 분자 치환의 접합체 생산을 위해 다양한 화학양론 공급 비율에서 Shh와 반응시켰다. 반응이 지속되는 동안 환원된 C-말단 Shh 시스테인을 유지하기 위하여, 이 반응은 50 mM 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, Pierce Biotechnology, Rockford, IL)을 함유하는 0.1 M MES 버퍼(pH 6.5)에서 4℃에서 밤새 수행하였다. 반응 이후, 선형 중합체에 남아있는 임의의 말레이미드 그룹을 0.5 mM 다이티오트레이톨의 첨가한 후 4℃에서 1 시간 동안 배양하여 환원시켰다.
단백질의 커플링 효율을 시각적으로 면밀히 살피기 위해 모든 접합 반응은 동등한 질량의 반응시키지 않은 Shh에 대한 반응 용액과 비교하여, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 게다가, HyA에 대한 Shh의 몰라 공급 비율을 20:1 및 10:1로 하여 세 번 반복수행한 Shh:HyA 접합 반응 세트를 비-접합 Shh를 제거하기 위해 Spectra/PorFloat-A-Lyzer장치(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA)를 사용하여 0.1 MES 버퍼(pH 6.5)에서 밤새 투석하였다. 이후, 투석한 HyA-Shh 용액의 단백질 농도는 microBCA 분석(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)을 사용하여 정량하였다.
생물활성 분석
생물활성을 시험하기 위해, 다른 곳에 설명된 바와 같이(18, 19) 쥣과 배아 C3H10T1/2 세포(American Type Culture Collection, Manassas VA)를 Shh에 노출시킴으로써 골원성 계통으로의 분화를 유도하였다. 간략하면, 세포를 정상 성장 배지(aMEM with 10% FBS)에서 96웰 플레이트에 5000 세포/웰로 깔았다. 2일 후, 배지를 낮은 FBS(2%) 배지로 교체시키고, 단백질 및 접합체 반응 용액을 보충하였다. 시험 조건은 1-100 nM 범위에서 가용성 Shh, 50 mg/ml의 비접합된 HyA와 같이 같은 범위의 가용성 Shh 또는, 배지 용액에서 Shh의 농도 또한 1-100 nM인 다량의 Shh:HyA 접합체를 포함하였다. 추가로 3 일 동안 배양한 후, 세포를 세척 및 분쇄하였고, 세포 분쇄물을 형광 프로브 9-H-(1,3-다이클로로-9,9-다이메틸아크리딘-2-케톤화합물-7-일) 인산염(DDAO, Molecular Probes, Eugene OR)을 사용하여 알칼리 포스파타아제(ALP) 활성을 측정함으로써 분화에 대하여 분석하였다. 비접합된 폴리아크릴산이 세포의 분화를 억제하는 것으로 나타나서, 이들 접합체의 생물활성을 시험하는 것은 수행하지 않았다.
신생혈관형성 분석
Shh는 알려진 신생혈관형성제이다(20). 가용성 Shh 및 Shh:HyA 접합체에 의한 신생혈관형성의 유도는 CAM 윈도우 분석을 사용하여 분석하였다. 수정된 화이트 레그혼종 계란(Charles River, Franklin CT)을 8일까지 습한 환경, 37℃에서 배양하였고, 이때, 2 ml의 알부민을 계란의 무딘 말단으로부터 제거하였으며, 작은 1 cm×1 cm 윈도우를 반대쪽 껍질에 만들었다. 멸균 PBS, 0.1 mg의 Shh, 또는 0.1 mg의 20:1 Shh:HyA 공급 비율 접합체의 Shh를 로딩한 여과지의 멸균 스퀘어를 발달중인 CAM에 직접 위치시켰다. 이후 이 윈도우를 파라핀으로 밀봉하였고, 계란을 배양기로 돌려보냈다. 시험 물질 주위의 신생혈관형성은 3일 후 Olympus SZX7 입체경을 사용하여 현미경으로 평가하였다. 고해상도 현미경 사진을 부착된 QImaging Qfire 카메라를 사용하여 취하였다. 이들 이미지는 이식물과 그의 가장자리로부터 0.1 및 0.25 cm의 거리로 둘러싸는 정사각형 주변에서 단위 길이당 혈관의 수를 정량하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각 그룹의 선형 밀도 측정은 각각의 0.1 및 0.25 cm 거리 데이터에 대하여 one-way ANOVA에 이은 개체 그룹의 페어와이즈 Holm’s t-검정을 사용하여 통계학적 유의미에 대하여 검사하였다.
Shh:HyA 접합체 세포 신호전달의 분자 모델링
단량체 Shh에 반응하는 Gli 전사 작동자의 발현(21, 22)을 설명하는 결합 및 트래피킹 수치 해석 모델 및 다가 리간드-수용체 결합(23)(도 3)을 설명하는 수 역학 모델을 Shh:HyA 접합체 세포 신호전달을 설계하기 위하여 만들었다. 도 3에서, 다가 접합체를 포함하는 Shh 중심 신호전달 네트워크 및 가정된 반응을 표본 세포 주변에 나타냈다. 단백질 사이의 화살표는 결합 또는 해리를 나타내고, 유전자에서 단백질로의 화살표는 발현을 나타내며, 단백질에서 유전자로의 화살표는 활성화 또는 억제를 나타낸다. Smo, Smoothened. 세포 수준에서, Shh는 그의 막통과 수용체, Patched(Ptc)와의 상호작용에 의해 전환되는 세포 운명을 유도한다. Shh가 없을 경우, Ptc는 막통과 단백질 Smo의 신호전달 활성을 억제하고, 그것에 의하여 이전에 설명된 바와 같이 Shh 신호전달의 억제자의 역할을 맡는다(Lai et al., 2004). ptc 상향조절은 음성 피드백을 내지만, gli 상향조절은 양성 피드백을 나타낸다. 시뮬레이션은 다양한 기작의 효과를 탐구한다: HyA:Shh 접합체(avidity)의 결합; 접합체-Ptc 복합체의 내재화; 및 HyA:Shh의 분해.
Shh 신호전달에 대한 무차원 방정식을 아래에 나타내었다:
가용성 Shh 신호 전달에 대하여
Figure 112010069673411-pct00001
접합체 신호 전달에 대하여
앞의
Figure 112010069673411-pct00002
발현을 세포 표면 다가-수용체 복합체의 원자가i(Bcom i ) 및 의 최대 원자가로 대체:
i=1일 때
Figure 112010069673411-pct00003
i=[2,f-1]일 때
Figure 112010069673411-pct00004
i=일 때
Figure 112010069673411-pct00005
앞의
Figure 112010069673411-pct00006
발현을 내면화된 다가-수용체 복합체의 원자가 i(Ccom i )로 대체:
i=[1,]일 때
Figure 112010069673411-pct00007
앞의
Figure 112010069673411-pct00008
발현을 하기로 대체:
Figure 112010069673411-pct00009
시작 조건, 매개 변수, 및 변동할 수 있는 설명은 그들의 문헌적 출처를 표 1에서 기재하였다. "Promoter" 및 "Basal" 용어는 이전에 정의되었다(Lai, Robertson et al. 2004). 가용성 Shh 네트워크에서 매개 변수의 민감도 분석에 대한 문헌(Saha and Schaffer Development, 2006)을 참고하라.
도 4에서 C3H10T1/2 생물활성 데이터에 대한 가장 단순한 모델을 개발하기 위하여, 하기 가정을 가져왔다: Smoothened의 Patched(Ptc) 억제는 Ptc 수용체 응집에 의해 영향을 받지 않고; 리간드-유도 내재화율은 모든 원자가에서 동일하며; 알칼리 포스파타아제 활성은 세포의 Gli1 수준과 선형으로 비례하고; C3H10T1/2 세포의 분화는 그의 Shh에 대한 민감함을 변화시키지 않는다. HyA:Shh 접합체의 시작 결합은 단량체 Shh-Ptc 결합률을 따르는 것으로 추정되지만, Shh 모이어티의 접합체로부터 다른 Ptc 수용체까지의 모든 다른 추가적 결합은 더 높은 속도로 일어나는 것으로 추정된다. 이 추정은 다가 접합체의 시작 결합 이후의 결합의 촉진을 고려하여 등가 부위 가설이라고 불려왔다(24).
모델 매개 변수는 문헌으로부터 가져왔다(21, 22); 그러나, 다수의 매개 변수는 도 4의 생물활성 데이터로부터 직접 추측하였다. 첫째, 단량체 Shh-Ptc 결합 상수 kon/koff 및 알칼리 포스파타아제 활성:Gli1 발현 비율은 가용성 Shh 생물활성 곡선으로부터 추측하였다. 게다가, 다중결합 Shh-Ptc 결합 상수는 22:1 접합체 곡선으로부터 직접 추측하였다(표 1 참조). 매개 변수는 Shh 문헌 또는 유사한 리간드-수용체 시스템의 어느 한쪽으로부터 가져왔다. 모든 세포 속도 상수는 세포의 부피 또는 표면으로 평균하였고, 이로부터 이들 상수는 세포 내에서 공간에 따라 바뀌지 않는다. 도 7에 나타낸 시뮬레이션 결과의 시작 조건은 각 변수로 기재하였다. 미분 방정식에서 모든 용어의 상대적 의의를 이해하는 편리한 방법은 표 1의 무차원 농도 및 매개 변수를 비교하는 것이다.
매개 변수 정의 및 값 범위.
중심 신호 전달 경로
차원 매개 변수 설명 값/범위 출처 비-차원 매개 변수 값/범위 무차원화
[Shh] 세포밖 Shh 농도 시작 조건=0 변할 수 있음 A 시작 조건=0 (mol 막 Shh)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
[PtcShhin] 세포밖 PtcShh 농도 시작 조건=0 변할 수 있음 B 시작 조건=0 (mol 막 Ptc-Shh 복합체)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
[PtcShhout] 세포내 PtcShh 농도 시작 조건=0 변할 수 있음 C 시작 조건=0 (mol 세포내 Ptc-Shh 복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
[Ptcout] 세포밖 Ptc 농도 시작 조건=2.0 nM 변할 수 있음 D 시작 조건=0.605 (mol 막 자유 Ptc)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
[Ptcin] 세포내 Ptc 농도 시작 조건=0.33 nM 변할 수 있음 E 시작 조건=0.402 (mol 세포내 Ptc-Shh 복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
[Gli1] 세포내 Gli1 농도 시작 조건=1.63 nM 변할 수 있음 G1 시작 조건=1.97 (mol 세포내 Gli1)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
[Gli3] 세포내 Gli3 농도 시작 조건=5.81 nM 변할 수 있음 G3 시작 조건=7.00 (mol 세포내 Gli3)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
[Gli3R] 세포내 Gli3 억제자 농도 시작 조건=61.2 nM 변할 수 있음 G3R 시작 조건=18.44 (mol 세포내 Gli3 억제자)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
vf 조직의 빈 분획 0.2 (Lauffenburger and Linderman 1993)
vff 세포내 부피/세포밖 부피 4 (1-vf)/vf
kdeg Gli1의 분해율 상수 0.009 min-1 (Chen, Kessler et al. 1999)
KGli3 Gli1 DNA 결합 부위에 대한 Gli3 결합의 분해 상수 8.3×10-10M (Lai, Robertson et al. 2004)
Kshh Shh-Ptc 결합의 분해 상수 입체가 없는 모델에 대하여 8.5×10-10M; 입체가 있는 모델에 대하여 4.5×10-9M (Fuse, Maiti et al. 1999; Taipale, Cooper et al. 2002)
koff Ptc로부터 Shh의 해리 0.10 min-1 EGF에 대해서 0.3 min-1(Lauffenburger and Linderman 1993) αoff 11 koff/kdeg
kon Ptc와 shh의 회합 입체가 없는 모델에 대하여 120,000,000 M-1min-1; 입체가 있는 모델에 대하여 22,666,667M-1min-1 koff/Kshh αon 44.44 kon*(KGli3*vff)/kdeg
kCdeg 세포내 Shh-Ptc 복합체의 분해율 상수 0.00198 min-1 EGF에 대해서 0.0022 min-1(Lauffenburger and Linderman 1993) ΘC 0.220 kCdeg/kdeg
kPin 표면 자유 수용체의 엔도좀 유입 0.03 min-1 EGFR에 대해서(Lauffenburger and Linderman 1993) δin 3.33 kPin/kdeg
kPout 엔도좀 자유 슈용체의 표면 재순환 0.00036 min-1 0.058 min-1(Lauffenburger and Linderman 1993); Dpp에 대해서 0.003 min-1(Lander, Nie et al. 2002) εout 0.0403
kCin 표면 Shh-결합 복합체의 엔도좀 유입 0.2 min-1 EGF에 대해서 0.03-0.3 min-1(Lauffenburger and Linderman 1993) βin 33.3 kCin/kdeg
kCout 세포내 Shh-결합 복합체의 표면 유출 0.00181 min-1 Dpp에 대해서 0.00402 min-1(Lander, Nie et al. 2002) γout 0.20 kCout/kdeg
kGmax Gli 합성의 최고 속도 1.99×10-10Mmin-1 2.4×10-10Mmin-1(Lai, Robertson et al. 2004) α 30.4 kGmax/(KGli3*kdeg)
kGbas Gli 합성의 기초 속도 1.53×10-12Mmin-1 kGmax/130 β 0.233 kGbas/(KGli3*kdeg)
rg3b Gli3 합성의 기초 속도 3.1×10-19M2min-1 1.6×10-19M2min-1(Lai, Robertson et al. 2004) γ 50.0 rg3b/(KGli3*KGli3*kdeg)
kPdeg Ptc의 분해율 상수 0.09 min-1 0.045-0.071 min-1(French and Lauffenburger 1996); 0.006 min-1(Lander, Nie et al. 2002) ΘE 10.0 kPdeg/kdeg
Kptc Smo 신호전달을 억제하는 Ptc의 반-최고 농도 3.32×10-11M 8.3×10-11M
(Taipale, Cooper et al. 2002) 		ζ 2.50 KGli3/Kptc
kg3r Gli3R에 대한 Gli3의 전환의 속도 상수 0.0117 min-1 0.0117 min-1(Lai, Robertson et al. 2004) δ 1.30 kg3r/kdeg
kPmax Ptc 합성의 최고 속도 1.50×10-10 Mmin-1 7.5×10-10Mmin-1(Lai, Robertson et al. 2004); 도 3의 가용성 곡선으로부터 정함 αP 5.01 kPmax/(KGli3*vff*kdeg)
kPbas Ptc 합성의 기초 속도 1.15×10-12Mmin-1 kPmax/130 βP 0.0385 kPbas/(KGli3*vff*kdeg)
Kg3rc 신호 세기에 대한 전환의 민감도 상수 0.12 0.1(Lai, Robertson et al. 2004)
bc 결합 협동성 1 (Keller 1995)
tc 전사 효율 0.5 (Keller 1995)
r 전사 억제 0.2 (Lai, Robertson et al. 2004)
Afr DNA 결합 부위에 대한 Gli1 및 Gli3 사이의 친화도 비율 0.5
kAP 알칼리 포스파타아제 활성의 RFU 단위에 대한 Gli1 단백질의 비율 9.3 도 3의 가용성 곡선으로부터 정함
다가 접합체 반응
[PtcShhi,in] 원자가 i의 세포밖 PtcShh 시작 조건=0 변할 수 있음 Bcomi 시작 조건=0 (mol 막 Ptc-Shhi복합체)/(세포 밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
[PtcShhi,out] 원자가 i의 세포내 PtcShh 농도 시작 조건=0 변할 수 있음 Ccomi 시작 조건=0 (mol 세포내 Ptc-Shhi복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
i f의 최고 원자가에 대한 원자가 지표 1, 2, 3, …f
kx 이차의 결합에 의한 인자 및 Ptc에 결합하는 접합체에서 다른 Shh 모이어티 12 도 3의 22:1 곡선으로부터 정함
Ptc에 대한 접합체 결합 친화도에서 단순 환원함에 따라 HyA 사슬의 입체 방해를 포함하는 대안적인 모델을 또한 명확히 하였다. 대안적인 모델에 있어서, 언급된 "입체가 있는 모델", 0.6:1, 3.5:1, 및 7:1 접합 공급 비율의 다중결합 Shh-Ptc 결합 상수 Kon은 도 4의 0.6:1 곡선에서 실험적 데이터와 대등하게 5.5배 감소하였다. 하기는 f=5(5:1 Shh:HyA 접합체)일 때, 다가 접합체에 대한 시뮬레이션을 위한 BERKELEY MADONNA 코드이다. 하기 코드는 본문에서 "입체가 없는 모델"이라고 언급하였다. 앞에서 언급한 방법 단락에서, "입체가 있는 모델"에 대하여 오직 하나의 매개 변수 변화를 만들었다: 다중결합 Shh-Ptc 결합 상수 Kon은 도 4의 0.6:1 곡선에서 실험적 데이터와 대등하게 5.5배 감소하였다.
METHOD RK4
STARTTIME=0
STOPTIME=500
DT=0.0000002
Shh=S*Kshh
; ------------------------------------------------------------------
; Lai et. al. Biophys J. 2004로부터 Promoter 및 Basal 변수 정의
; K1=Gli1의 평형 해리 결합 상수
; K2=Gli3의 평형 해리 결합 상수
; afr=친화도비=K2/K1
; bc=결합 협동성
; tc=전사 협동성
; r=억제비
; ------------------------------------------------------------------
; Lai et. al. Biophys J. 2004로부터 Gli 중심 Promoter 및 Basal 발현
Promoter =((afr*G1+G3)*(afr^2*bc^2*G1^2+3*tc^2+3*bc*tc*(G3+2*G3R*r*tc)+afr*bc*G1*(2*bc*G3+3*tc+3*bc*G3R*r*tc)+bc^2*(G3^2+3*G3*G3R*r*tc+3*G3R^2*r^2*tc^2)))/(1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R+3*bc*G3R^2+bc^2*G3R^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R)+3*G3*(1+bc*G3R)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R))^2)
Basal =((1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R*r+3*bc*G3R^2*r^2+bc^2*G3R^3*r^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R*r)+3*G3*(1+bc*G3R*r)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R*r))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R*r))^2))/(1+afr^3*bc^2*G1^3+bc^2*G3^3+3*G3R+3*bc*G3R^2+bc^2*G3R^3+3*bc*G3^2*(1+bc*G3R)+3*G3*(1+bc*G3R)^2+3*afr^2*bc*G1^2*(1+bc*(G3+G3R))+3*afr*G1*(1+bc*(G3+G3R))^2)
; ------------------------------------------------------------------
; Shh 결합 및 수송 방정식에 대한 차원 상수 정의
; ------------------------------------------------------------------
koff=0.1; Ptc로부터 Shh의 해리(min-1)
kdegc=0.00198; Shh-Ptc 복합체에 대한 분해율 상수(min-1)
kp=0.03; EGF keR에 대한 Lauffenburger=3e-2 min-1(p95)
kq=0.00036; EGF krec에 대한 Lauffenburger=5.8e-2 min-1(p95)
kin=0.021; EGF keC에 대한 Lauffenburger=0.03-0.3 min-1(p95)
kout=0.00181; 세포내 Shh-Ptc 복합체의 표면으로의 유출(min-1)
kg=0.09; Ptc에 대한 분해율 상수(.045-0.071 min-1)
kon=koff/Kshh; Ptc와의 Shh의 회합
vf=0.2; 조직의 빈 분획
vff=(1-vf)/vf; 빈 분획 인수=세포내 부피/세포밖 부피
Do=2.0e-9; (막 자유 Ptc의 mol)/(세포밖 액체 부피의 L)에서 슬라이더에 대한 초기 자유 Ptc 농도
Eo=0.33e-9; (내부 Ptc의 mol)/(세포내 액체 부피의 L)에서 슬라이더에 대한 초기 내부 Ptc 농도
; ------------------------------------------------------------------
; 비차원 상수 정의
; 1/kdeg의 단위의 시간, Gli 1에 대한 분해율 상수(.009 min-1)
; ------------------------------------------------------------------
theta_e=kg/kdeg
alph_off=koff/kdeg
alph_on=kon*(Kgli3*vff)/kdeg
beta_in=kin/kdeg
gmma_out=kout/kdeg
theta_c=kdegc/kdeg
alph_p=kcatp/(Kgli3*vff*kdeg)
beta_p=rbas/(Kgli3*vff*kdeg)
eps_out=kq/kdeg
dlta_in=kp/kdeg
ce=Kgli3/Kptc
; ********************************************************************
; 비차원 Shh 결합 상수 정의
; 비차원 변수:
; A=(mol Shh)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
; B=(mol 막 Ptc-Shh 복합체)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
; C=(mol 세포내 Ptc-Shh 복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; D=(막 자유 Ptc의 mol)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
; E=(mol 세포내 Ptc-Shh 복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; Lauffenberger 1993; Perelson 1986로부터 다중결합 모델
; Bcom[i]=(mol 막 Ptc-Shh[i] 복합체)/(세포밖 액체 부피의 L)/(Kgli3)/(vff)
; Ccom[i]=(mol 세포내 Ptc-Shh[i] 복합체)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; ********************************************************************
d/dt(A)=0
d/dt(D)=(alph_p)*Promoter+(beta_p)*Basal+(eps_out)*E-(alph_on)*A*D+k_x*Sum2-kx*Sum1*D-(dlta_in)*D
d/dt(E)=(dlta_in)*D-(eps_out)*E-(theta_e)*E
sum1v[1..(f-1)]=(f-i)*Bcom[i]
sum1=arraysum(sum1v[*])
sum2v[1..f]=(i)*Bcom[i]
sum2=arraysum(sum2v[*])
f=5; 최대 원자가
INIT Bcom[1..f]=0
d/dt(Bcom[1])=(alph_on)*A*D-(alph_off)*Bcom[1]-(f-1)*kx*Bcom[1]*D +2*k_x*Bcom[2]-(beta_in)*Bcom[1]+(gmma_out)*Ccom[1]
d/dt(Bcom[2..(f-1)])=(f-i+1)*kx*Bcom[i-1]*D-i*k_x*Bcom[i]-(f-i)*kx*Bcom[i]*D+(i+1)*k_x*Bcom[i+1]-(beta_in)*Bcom[i]+(gmma_out)*Ccom[i]
d/dt(Bcom[f])=kx*Bcom[i-1]*D-f*k_x*Bcom[i]-(beta_in)*Bcom[i]+(gmma_out)*Ccom[i]
INIT Ccom[1..f]=0
d/dt(Ccom[1..f])=(beta_in)*Bcom[i]-(gmma_out)*Ccom[i]-(theta_c)*Ccom[i]
INIT A=Shh/(Kgli3*vff)
INIT D=Do/(Kgli3*vff)
INIT E=Eo/(Kgli3)
Signal=1/(1+ce*D); Ptc 및 Smo 사이의 스캐차드(Scatchard) 반응에 기반한, 비접합된 Smo의 분획
kxfactor=12; 시작 결합 후 다중결합 shh에 대한 Kon의 촉진
kx=alph_on*kxfactor
k_x=alph_off
; ********************************************************************
; 세포내 방정식 정의
; 비차원 변수:
; G1=(mol Gli1)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; G3=(mol Gli3 활성형)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; G3R=(mol Gli3R 억제형)/(세포내 액체 부피의 L)/(Kgli3)
; ********************************************************************
d_G1=(alph)*Promoter+(beta)*Basal-G1
d/dt(G1)=(alph)*Promoter+(beta)*Basal-G1
d/dt(G3)=(gmma)/(G1+const)-G3*(1+(dlta)/(Kg3rc+Signal))
d/dt(G3R)=G3*(dlta)/(Kg3rc+Signal)-G3R
G3o=5.81e-9
G3Ro=61.2e-9
G1o=1.63e-9
INIT G1=G1o/Kgli3
INIT G3=G3o/Kgli3
INIT G3R=G3Ro/Kgli3
; ------------------------------------------------------------------
; 세포내 방정식에 대한 차원 상수 정의
; ------------------------------------------------------------------
basfactor=130
kcatg=1.992732e-10; Gli 합성의 최대 속도 of (2.4e-10 M/min)
rgbas=2.74e-10/basfactor; Gli 합성의 기초 속도(vmax,g/100)
kcatp=1.5e-10; Ptc 합성의 최대 속도(4.5e-10 M/min)
rbas=2.25e-9/basfactor; Ptc 합성의 기초 속도(vmax,P/100)
rg3b=3.1e-19; gli3 합성의 기초 속도(1.6e-19 M2/min)
Kshh=8.3e-10; Shh-Ptc 결합의 해리 상수
Kgli3=8.3e-10; Kptc에 대하여 사용
kdeg=0.009; Gli 1에 대한 분해율 상수(.009 min-1)
kdegp=0.09; Ptc에 대한 분해율 상수(.045-0.071 min-1)
Kptc=3.32e-11; Smo 신호전달을 억제하는 Ptc에 대한 반(Half)-최대 농도
kg3r=0.0117; Gli3R으로의 Gli3의 전환에 대한 속도 상수(0.012 min-1)
Kg3rc=0.12; 신호 강도에 대한 전환의 민감도 상수
bc=1; 결합 협동성
tc=0.5; 전사 효율
r=0.2; 전사 억제
afr=0.5; 친화도비
S=120
alph=kcatg/(Kgli3*kdeg)
beta=rgbas/(Kgli3*kdeg)
gmma=rg3b/(Kgli3*Kgli3*kdeg)
dlta=kg3r/kdeg
epsilon=kcatp/(kdeg*Kgli3)
etta=rbas/(Kgli3*kdeg)
const=1e-30
결과
화학 접합
C-말단 근처에 시스테인 잔기가 있는 재조합 래트 Shh 변이체를 구축하고, 발현시키고, 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 재조합 단백질의 접합은 pAAc 및 HyA 모두에서 고효율로 달성하였다. 겔 전기영동을 사용했을 때, 반응이 단량체 Shh 밴드의 감소(도 2) 및 고분자량 접합체의 출현을 생산하는 것이 명백하였다. pAAc(도 2a)(MW=450,000)에 있어서, 이는 Shh 접합 몰라 공급 비율이 1:1에서 30:1로 증가함에 따라 양이 증가하면서 겔을 통과하며 번짐을 만들어냈다. HyA(MW=106 Da)에 있어서, 고분자량 접합체는 겔을 깊게 관통하지 않았다(도 2b). 대조적으로, Shh를 미가공 pAAc 또는 HyA와 단순히 혼합한 것은 겔에서 Shh 이동성을 변화시키지 않았다. 3번 반복수행한 10:1 및 30:1 몰라 공급 비율에서의 정제된 Shh:HyA의 단백질 분석은 반응이 대략 70-75%에서 고도의 효율을 재생하는 것을 나타냈다(표 2). 1:1, 5:1, 10:1, 20:1, 및 30:1의 몰라 공급 비율은 각각 0.6:1, 3.5:1, 7:1, 14:1, 및 22:1의 몰라 치환 비율로 Shh:HyA 접합체를 생산하였다.
30:1 및 10:1 몰라 공급 비율에서 Shh:HyA 반응에 대해 결정된 접합 비율 및 커플링 효율.
Shh:HyA의 몰비 커플링 퍼센트
공급 비율 30:1 10:1 30:1 10:1
시도 1 21.80 6.91 73.3% 69.8%
시도 2 22.58 6.65 76.0% 67.1%
시도 3 22.09 7.02 74.3% 70.8%
평균 22.16 6.86 74.5% 69.2%
표준편차 0.40 0.19 1.3% 1.9%
C3H10T1/2 세포 생물활성 분석
쥣과 배아 세포주 C3H10T1/2를 사용하여, 용액에서 실제 Shh 농도에 대하여 평가하였을 때, Shh의 접합이 속박된 단백질의 활성을 극적으로 변화시키는 것을 나타냈다(도 4). 가용성 Shh가 세포주에서 유도하는 분화를 pAAc가 억제하기 때문에, 오직 HyA-접합 Shh만을 이 세포주를 사용하여 시험할 수 있었다. 낮은 속박에서(예를 들어, 3.5:1), 아마도 큰 선형 중합체가 부착되었을 때 야기하는 입체 방해에 기인하여, 용액의 Shh의 EC50은 10-배 증가하는 것으로 추측되었지만, 활성은 감소하였다. 활성은 접합 비율이 7:1에 도달했을 때 다시 정상으로 증가하였다. 이 범위를 넘어서, 22:1 컨스트럭트까지 추측된 EC50 값은 비속박된 Shh에서 10-배 감소하였지만, 속박된 Shh의 활성은 극적으로 증가하였다.
CAM 신생혈관형성 모델
CAM 결과는 접합된 Shh:HyA의 증가된 효능을 나타낸다. 사진 분석 및 정량화(각각, 도 5 및 도 6)는 이식물을 가까운 거리(0.1 mm)내에서 음성 대조군과 비교했을 때 Shh-로딩 샘플 주위의 맥관 구조에서 통계학적으로 유의한 증가를 나타냈다. 14:1 비율에서 접합된 Shh:HyA가 0.1 cm에서 음성 대조군 및 비접합된 Shh 모두를 넘는 증가된 평균 혈관수를 가졌고, 또한 0.25 cm에서 음성 대조군을 넘는 장-범위의 지속적인 증가를 가졌다. 비록 가용성 Shh 또한 이 거리에서 음성 대조군을 넘는 증가된 평균 혈관수를 가졌더라도, 이 관찰은 통계학적으로 유의하지 않았다.
다가 Shh 생물활성의 수치해석 모델링
HyA:Shh 접합체 결합, 트래피킹, 및 하류 신호전달 활성화의 단순 역학 모델을 개발하였다. 접합체 다원자가의 효과에 초점을 맞춰, 다수의 가정을 단순화시킨 모델에 가져왔다: Ptc 수용체 응집은 신호 전달에 영향을 미치지 않고; 리간드-내재화는 원자가에 영향을 받지 않으며; 알칼리 포스파타아제 활성은 분화에 개의치 않고 세포에서 Gli1 수준에 선형으로 비례하고; 접합체 결합의 오직 두 속도만 일어난다-접합체의 시작 결합 및 접합체에서 다른 Ptc 수용체로 모든 추가적 Shh 모이어티에 대한 더 높은 결합 속도(모델 공식에 대한 방법 단락 및 매개 변수에 대한 표1을 참조). 이러한 가정과 함께, 모델의 두 형태, 하나는 Ptc에 대한 접합체 결합 친화도에서 단순 환원함에 따라 HyA 사슬의 입체 방해를 포함하는 것, 및 하나는 입체 방해의 임의의 영향을 무시하는 것을 개발하였다. 이들 두 모델은 각각 "입체가 있는 모델" 및 "입체가 없는 모델"로 언급하였다. 이들 가정 하에서, 모델링 결과는 생물학적 분석에서 Shh가 그의 HyA 담체에 대한 결합 비율을 증가시키는 것을 가리키고, 이는 다세포 신호전달의 연속적 증가 및 EC50의 감소를 야기시킬 수 있다(도 7). 실험적 데이터로부터 추측된 EC50 값은 시험된 결합 비율에서의 역학 모델의 형태 및 앞에서 언급한 가정 모두를 이용하였을 때 잘 맞았다(R2=입체가 없는 모델에서 0.7; R2=입체가 있는 모델에서 0.8). 입체가 없는 모델에 있어서, EC50 값은 높은 결합 비율에서 실험 결과와 잘 맞았지만, 모델링 결과는 결합 비율 7:1 및 더 낮을 때의 결합 비율에서의 EC50 값을 과추측하였다(도 7). 입체가 있는 모델에 대한 결과를 이 편차로 보정할 수 있다(도 7).
본 발명이 그의 특정 구체예와 관련하여 설명된다 하더라도, 이는 다양한 변형이 있을 수 있고, 등가물이 본 발명의 참된 사상과 범위를 벗어나지 않고 치환될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 게다가, 많은 변형이 본 발명의 목적, 사상 및 범주에 따라 특정 상황, 물질, 합성물, 가공, 과정 단계 또는 단계에 적응하기 위해 만들어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (27)

  1. a) i) 수용체; 또는 ii) 수용체의 리간드이고, 5 kDa에서 50 kDa까지의 분자량을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드;
    b) 50,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 생체적합성 중합체
    를 포함하는 접합체로서,
    생물학적 활성 폴리펩티드는 직접적으로 또는 링커를 통해 중합체에 공유적으로 연결되고, 중합체에 대한 생물학적 활성 폴리펩티드의 몰비는 적어도 10:1인 것을 특징으로 하는 접합체.
  2. 제 1항에 있어서, 중합체는 히알루론산, 아크릴산, 에틸렌 글리콜, 메타크릴산, 아크릴아마이드, 하이드록시에틸 메타크릴산, 만니톨, 말토스, 글루코스, 아라비노스, 타우린, 베타인, 변형된 세룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 변형된 녹말, 소수성으로 변형된 녹말, 하이드록시에틸 녹말, 하이드록시프로필 녹말, 아밀로스, 아밀로펙틴, 산화된 녹말, 및 이들의 공중합체로부터 선택되는 다중 서브유니트를 포함하는 선형 중합체인 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제 1항에 있어서, 중합체는 선형 폴리아크릴산인 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제 1항에 있어서, 중합체는 히알루론산인 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제 4항에 있어서, 히알루론산은 황산염화된 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 중합체에 대한 생물학적 활성 폴리펩티드의 몰비는 10:1에서 25:1까지 인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제 1항에 있어서, 중합체에 대한 생물학적 활성 폴리펩티드의 몰비는 25:1에서 50:1까지인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 10 kDa에서 50 kDa까지의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.
  13. 삭제
  14. 제 1항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 성장 인자, 인터루킨, 성장 호르몬, 콜로니 자극 인자, 인터페론, 또는 신경활성 펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  15. 제 1항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 수용체의 리간드인 것을 특징으로 하는 접합체.
  16. 제 15항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 소닉 헤지호그(Shh), 골 형성 단백질-4, 인터루킨-3(IL-3), 줄기 세포 인자-1(SCF-1), fms-유사 티로신 키나아제-3(Flt3) 리간드, 백혈병 억제 인자(LIF), 상피 성장 인자(EGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴로트로핀-5(NT-5), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 아교세포-유래 뉴로영양 인자(GDNF), 및 프로타아제 넥신-1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  17. 제 1항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 수용체인 것을 특징으로 하는 접합체.
  18. 제 17항에 있어서, 생물학적 활성 폴리펩티드는 TNF-α-결합 수용체, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체, 인터루킨 수용체, 뉴로트랜스미터 수용체, 또는 EphB2인 것을 특징으로 하는 접합체.
  19. 제 1항에 있어서, 접합체의 폴리펩티드의 EC50은 가용성 형태의 폴리펩티드의 EC50보다 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 낮은 것을 특징으로 하는 접합체.
  20. 제 1항에 있어서, 접합체의 폴리펩티드의 EC50은 가용성 형태의 폴리펩티드의 EC50보다 적어도 25% 낮은 것을 특징으로 하는 접합체.
  21. 제 1항에 있어서, 접합체의 폴리펩티드의 생물학적 활성은 가용성 형태의 폴리펩티드의 생물학적 활성보다 적어도 25% 큰 것을 특징으로 하는 접합체.
  22. 제 1항에 있어서, 접합체는 생물학적 활성 폴리펩티드의 두 개 이상의 종을 포함하는 것을 특징으로 하는 접합체.
  23. 삭제
  24. 제 1항 내지 제 5항, 제 7항, 제 8항, 제 12항 및 제 14항 내지 제 22항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 이식형 장치.
  25. 제 24항에 있어서, 이식형 장치는 스텐트, 션트, 인공 판막, 전극선, 인공 관절, 골격, 그라프트 또는 전극인 것을 특징으로 하는 이식형 장치.
  26. 제 1항의 접합체를 포함하는 이식형 약물 전달 장치.
  27. 삭제
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