KR101677433B1 - 이온 교환수지를 이용한 개선된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 합성방법 및 이를 이용한 구강 붕해 필름(odf)제형의 제조방법 - Google Patents

이온 교환수지를 이용한 개선된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 합성방법 및 이를 이용한 구강 붕해 필름(odf)제형의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성을 촉진하는 기능으로 인해 B형 간염 및 에이즈 치료제 등으로 사용되고 있는 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Teno-DF)의 합성시 불순물과 부산물이 적게 생성될 수 있는 합성방법에 관한 것이며, 또한 본 발명의 합성방법에서는 이온교환 수지(Dowex 50W hydrogen form, Sulfonic acidic cation exchange Resin)를 사용함으로써 상기 화합물의 합성 수율과 순도를 높일 수 있었고, 본 발명의 합성방법에 의해 고순도로 수득된 상기 화합물을 유효성분으로 하는 의약품의 제조시 구강붕해 필름제형으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이온 교환수지를 이용한 개선된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 합성방법 및 이를 이용한 구강 붕해 필름(ODF)제형의 제조방법{Ion exchanging process method for Tenofovir disoproxil fumarate in manufacturing synthesis and a preparation method of the Fast Dissolving Films for Oral Dosage of Tenofovir disoproxil fumarate}
본 발명은 항 바이러스 기능으로 인해 B형 간염 및 에이즈 감염치료제 등으로 사용되는 테노포비르와 그 유도체의 합성에 있어서 적절한 촉매의 사용과 이온교환 수지를 이용함으로써 상기 화합물을 효과적으로 합성하는 방법에 관한 것이고, 또한 상기 합성방법을 통해 고순도로 수득된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 유효성분으로 하는 B형 간염 또는 에이즈 감염치료제를 구강 붕해 필름의 제형으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
지금까지 본 발명과 같은 방법으로 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 합성한 사례는 보고되지 않았다. 특히 테노포비르 합성시에는 중간 공정 중에 포함되는 가수분해 공정과 가수분해 후 진행되는 알카리 중화처리 공정이 포함되어 있어서 상기 공정들로 인해 많은 부산물과 분해산물이 생성되고, 이러한 부산물 등과 혼합되어 생성되는 테노포비르는 물에 대한 용해도 저하와 결정수 함유 문제로 합성 수율이 낮아서, 상기에 생성된 테노포비르 물질을 다음 단계의 반응으로 진행시에는 테노포비르 분자 내에 함유되어 있는 결정수를 제거해야만 부산물인 다양한 형태의 에스테르 화합물의 발생을 줄일 수 있다. 따라서 상기에서 생성된 결정수 함유 테노포비르(Tenofovir H2O, MW 305.3)에서 결정수의 제거를 위해서 일반적으로 고온에서 감압 건조하는 공정을 포함하고 있으나, 본 발명의 합성방법에서는 테노포비르 물질의 합성단계에서 발생하는 부산물을 최소화할 수 있어서 상기의 일반적으로 포함되는 고온에서 감압 및 건조하는 공정을 필요로 하지 않고, 또한 이온교환수지를 사용하여 합성용액을 정밀히 중화하고 유기 용매로 처리함으로써 비교적 저온에서 진행되는 간단한 감압 건조 공정을 거침으로써 부산물과 분해산물이 적은 고 순도의 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 합성할 수 있다는 우수한 이점이 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 합성방법에 의해 합성된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 유효성분으로 하는 B형 간염 또는 에이즈 치료제를 제조할 시에 있어서 복용이 간편하고 생리활성 효과가 빠르게 나타날 수 있도록 구강 붕해 필름제형을 제조하는 방법에 관한 것이다.
미국 길리어드사이언스 회사에 의해 개발된 B형 간염치료제인 비리어드정(Viread?)은 그 주성분의 일반명은 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Tenofovir disoproxil fumarate, 이하 ‘Teno-DF’라고 한다, MP 219℃, MW 635.52)이며, 구조식에 따른 화학명은 9-[2-(R)-[[비스[[(이소프로폭시카르보닐)옥시]메톡시]포스피노일]메톡시]프로필]아데닌 푸마르산 염(9-[(R)-2-[[bis[[(isopropoxycarbonyl)oxy]methoxy]phosphinyl]]methoxy]propyl]adenine fumarate)이다.
상기 Teno-DF는 2001년도에 에이즈(AIDS)치료제로 미국 FDA에서 승인 받아 사용되어 왔으며, 2008년 4월에는 유럽에서 B형 간염(HBV)치료제로 승인 받았고 동년 11월에 미국 FDA로부터 다시 B형 간염치료제로 재차 허가 되었다. Teno-DF는 테노포비르(Tenofovir, MP 267~280℃, MW 287.21)의 생체내 흡수력 기능을 향상시키기 위해 친지방 성분의 구조체인 이소프로필카보닐메톡시기를 테노포비르에 치환하여 전구 약물로 제조한 것이다. 따라서 상기 Teno-DF의 합성시에 가장 중요한 문제점은 항바이러스 효과를 가지고 있는 주성분인 테노포비르를 고수율 및 고순도로 합성하는 것이다.
테노포비르의 합성시 사용되는 원료물질은 히드록시프로필 아데닌(HPA, ((R)-9-[2-(hydroxy)propyl]adenine, MW. 193.2)인데, 상기 원료물질로부터 테노포비르를 합성하는 과정에서 불순물 및 분해물질을 최소화하는 것이 중요한 해결과제이다.
테노포비르(포스포노메톡시프로필아데닌,
(R)-9-[2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine, PMPA)는 상기 HPA 원료물질로 하여 합성하는 과정 중 하나인 인산메틸화 과정에서 생성하는 에스테르 물질인 DEPMPA((R)-9-[2-(Diethylphosphono methoxy)propyl]adenine)의 촉매화학 반응 방법에 최종생성물인 테노포비르의 수율과 순도가 좌우된다. 그러나 상기 HPA로부터 DEPMPA를 고수율로 합성하고 이를 가수분해하여 순도가 높은 테노포비르(Tenofovir, PMPA)를 합성하는 과정이 상당히 어려워서 이에 관한 다수의 연구가 수행되었고 저마다 우수하다고 강조되는 합성방법을 개발하여 논문과 특허를 지속적으로 출원하고 있다.
상기 촉매화학 반응은 여러가지 알카리 촉매를 복합하여 사용하고 각 반응에 따른 반응 유기 용매와 추출방식을 다르게 사용하고 있다. 축합 촉매인 알콕사이드류 촉매로서는 초기에 리튬부톡사이드로부터 시작하여 점차 마그네슘부톡사이드, 마그네슘이소프로폭사이드, 나트륨아마이드와 마그네슘아세테이트의 복합촉매, 부틸마그네슘클로라이드 등의 촉매의 존재하에 인산메틸렌 분자를 도입할 수 있는 원료인 디에틸파라톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트
(Diethyl-p-toluenesulfonyloxymethylphosphonate, DEPTSMP)와 HPA를 축합반응시킨다. 상기의 촉매 등을 사용하여 일단 테노포비르가 고순도 및 고수율로 생산되면 차후 반응에 의한 전구물질 유도체인 Teno-DF를 만드는 것은 종래의 방법에 준하면 된다.
합성된 테노포비르(Tenofovir)에 불순물이 많을 경우 발생하는 문제점으로는 Teno-DF를 합성하기 위한 다음 단계의 반응에 많은 영향을 미쳐 최종 생성물인 Teno-DF를 이용한 제품의 안정성이 낮아지고, 또한 분해산물이 과다로 존재하여 허용기준을 초과하여 반응 공정상 부생하는 잔재물의 분리제거시에 여과가 불가능한 조해성 물질이 생성되어 Teno-DF를 이용한 산업화가 상당히 어려워진다. 이러한 이유에 의해 원료의 가격이 상당히 높아진다.
테노포비르 디소프록실(Tenofovir disoproxil, Teno-D, MP 61~65℃, MW 519.45)은 순도가 좋지 못하면 보관중 분해산물이 더 생성하고 자체로 중합체인 Teno-D Dimer가 생성된다고 보고 되어있다(Organic Process Research & Development, 2010, Vol.14, 1194-1201, Pharmaceutical Research, 2001, Vol.18, 234-237).
<테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (Teno-DF)의 합성 반응식과 공정도>
Figure 112014104079112-pat00001
<기존 특허자료 검토내역>
0008-1. 공개특허 CN 102219805A(2011.03.10) Novel production process of Tenofovir.
위 특허는 HPA를 여러 가지 촉매를 사용하여 메틸렌 인산화한 후 생성한 디에틸에스테르물질을 가수분해한뒤, 강산성물질을 40% 수산화나트륨을 사용하여 수소이온 농도인 PH를 3으로 중화하여 테노포비르 결정을 얻는 방법에 관한 것이다. 그러나 상기 특허에서는 테노포비르의 용해도를 감안하여 농도가 짙은 알카리 중화 용액인 40% 수산화나트륨 용액을 사용할 수밖에 없는데, 이러한 방법으로는 정확한 등전점을 가지는 물질인 테노포비르를 수득하기는 어렵다.
0008-2. 공개특허 CN 102295660A(2011.07.04) Process for synthesizing Tenofovir
위 특허는 HPA로부터 에틸인산에스테르를 제조한 다음 이를 브롬수소산으로 가수분해한 후에 수산화나트륨 용액으로 PH를 3.2 부근으로 조절하여 생성된 침전을 얻는 방법에 관한 것이다.
0008-3. 공개특허 CN 103374039A (2012.04.20) Synthesis of Tenofovir
위 특허는 상기 0008-2와 동일한 공정을 거쳐 가수분해한 후에 PH를 2.5~4로 조정하여 얻는 방법에 관한 것이다.
0008-4. 공개특허 CN 102899367B(2012.09.24) A biological method and chemically combined with the method of synthetic Tenofovir
위 특허는 중화 알카리 용액으로서 탄산염을 사용하여 PH를 3.0으로 중화하여 제조하는 방법에 관한 것이다.
0008-5. 등록특허 CN 01239189B(2008.03.17) Tenofovir, Adefovir and intelligent polymer conjugates and preparation and use thereof.
위 특허는 중화시 인산 완충액을 이용하여 PH를 2~3으로 조정하는 방법에 관한 것이다.
0008-6. 공개특허 US 2013/0165413 A1(2013.06.27) Process for the preparation of Tenofovir
위 특허는 알카리 축합촉매로서 다양한 금속 알콕사이드 촉매를 사용하는 것인데, 이러한 촉매로서는 나트륨아마이드 및 마그네슘클로라이드의 복합촉매 등 기타 여러가지 촉매를 사용하고 가수분해 후에 감압 농축과정을 거쳐 고농도로 반응액을 농축한 후에 알카리 수용액을 이용하여 PH를 2~3으로 중화하는 방식이다. 또한 Teno-DF의 결정다형(X-ray powder diffraction pattern, XRPD)도 제시하고 있다.
0008-7. US 2014/0303368 A1(2014.10.9.) Process for the preparation of Tenofovir
위 특허는 0008-6의 특허와 유사하나 디에틸테노포비르의 합성시에 알루미늄과 아마이드산 촉매를 복합하여 합성하고 다음 가수분해한 후에 알카리 수용액으로 PH를 2~3으로 중화하는 방법에 관한 것이다.
<비특허 자료(문헌)>
0008-8. Tetrahedron Letters 39 (1998) 1853-1856) Practical Synthesis of the anti-HIV Drug, PMP(PMPA, (R)-9-[2-(Phosphonomethoxy)propyl]adenine)
위 문헌은 상기 HPA로부터 소디움하이드라이드(NaH) 또는 리튬부톡사이드(Lthium TertiaryButoxide) 등을 촉매로 메틸렌인산화반응을 수행한 후에 생성한 디에스테르 화합물을 Bromotrimethylsilane용액으로 가수분해한뒤 이를 50% 수산화나트륨 수용액으로 PH를 3으로 중화하는 방식에 관한 것이다.
0008-9. Organic Process Research & Development (2010),Vol.14, 1194p-1201, Process Improvements for the manufacture of Tenofovir disoproxil fumarate at commercial scale.
위 문헌은 HPA를 마그네슘부톡사이드(Magnesium tertiary butoxide)를 촉매로 사용하여 메틸렌인산화 에스테르를 제조하고 이를 가수분해하여 Tenofovir 결정을 얻을 때 40% 수산화나트륨 수용액으로 PH를 2.8~3.2 로 조정하여 결정을 얻는 방식에 관한 것이다.
0008-10. Authorized USP Pending Monograph version 1 (2011) Tenofovir Disoproxil Fumarate
위 문헌의 미국약전 잠정원료(USP Pending) 규격에는 10가지 이상의 불순물에 따른 함량에 제한을 두고 있으며 이를 통해 원료물질의 순도를 규격화하고 있다. 상기 문헌으로부터 원개발사(Gilead ,USA)가 정밀한 기술력으로 타회사가 좀처럼 쉽게 테노포비르를 합성할 수 없게 하기 위한 기술적 보호망을 설치하고 있음을 알 수 있다(원 개발사인 Gilead 특허의 만료기간은 2017년이나, 특허심사지연에 따른 특허존속기간을 연장받을 경우에는 그 존속기간은 2018년까지임).
0008-11. World Health Organization, Final Text for addition to The International Pharmacopoeia(2010.06)-Tenofovir Disoproxil Fumarate
위 문헌의 자료는 WHO의 국제 원료규격으로서 잠정 설정되었다.
상기에서 서술한 11가지 항목의 기술특허와 참고문헌으로 보면 테노포비르의 합성시에 발생하는 많은 불순물로 인해 그 합성 수율이 높지 않음을 알 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 기술특허 및 참고문헌의 문제점을 해결하여 테노포비르의 합성시에 최종 생성물의 고순도 및 고수율을 충족할 수 있는 신규한 합성방법에 관한 것이다.
미국 길리어드사이언스 회사에 의해 개발된 B형 간염치료제인 비리어드정(Viread?)은 그 주성분의 일반명은 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Tenofovir disoproxil fumarate, 이하 ‘Teno-DF’라고 한다, MP 219℃, MW 635.52)이며, 구조식에 따른 화학명은 9-[2-(R)-[[비스[[(이소프로폭시카르보닐)옥시]메톡시]포스피노일]메톡시]프로필]아데닌 푸마르산 염
(9-[(R)-2-[[bis[[(isopropoxycarbonyl)oxy]methoxy]phosphinyl]]methoxy]propyl]adenine fumarate)이다.
상기 Teno-DF는 2001년도에 에이즈(AIDS)치료제로 미국 FDA에서 승인 받아 사용되어 왔으며, 2008년 4월에는 유럽에서 B형 간염(HBV)치료제로 승인 받았고 동년 11월에 미국 FDA로부터 다시 B형 간염치료제로 재차 허가 되었다. Teno-DF는 테노포비르(Tenofovir, MP 267~280℃, MW 287.21)의 생체내 흡수력 기능을 향상시키기 위해 친지방 성분의 구조체인 이소프로필카보닐메톡시기를 테노포비르에 치환하여 전구 약물로 제조한 것이다. 따라서 상기 Teno-DF의 합성시에 가장 중요한 문제점은 항바이러스 효과를 가지고 있는 주성분인 테노포비르를 고수율 및 고순도로 합성하는 것이다. 그러나 테노포비르를 합성하기 위한 종래의 기술에서는 중화과정에서 알칼리성 물질을 이용하여 PH를 조절하기 때문에 상기 테노포비르를 결정화 시키는 과정에서 발생하는 많은 부산물과 분해산물이 생성되어 테노포비르의 오염도가 증가되고 이로인해 테노포비르를 이용한 약물의 제조시에도 그 약물의 안정성에도 문제가 발생하였다.
따라서 본 발명은 종래기술의 문제점이었던 테노포비르의 합성시 발생하는 부산물 및 분해물질을 최소화하여 고순도 및 고수율로 테노포비르를 합성하기 위한 방법을 제공하는 것이고 또한 테노포비르를 이용한 약물의 생리활성을 촉진하기 위해 상기 약물을 필름제형으로 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 테노포비르 디소프록실 푸마레이트의 합성시 촉매를 사용하는 신속한 반응과 불순물과 부산물이 적게 생성될 수 있는 반응조건 및 그 공정 중에 간편하고 정밀하게 반응의 진행을 추정할 수 있는 방법에 관한 것이며, 또한 중간체의 정제과정 중 이온교환 수지(Dowex 50W x 4 Hydrogen form, Sulfonic acidic cation exchange Resin)를 사용하여 최종 생성물인 테노포비르를 고순도로 수득하고 이를 이용하여 생리활성이 우수한 속방성 구강붕해 필름제형으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 종래의 기술과 다르게 테노포비르를 제조할 때 중화제로서 사용되는 알칼리성 화합물과 이온교환수지를 혼합하여 사용하여 합성용액을 정밀히 중화하고 유기 용매로 처리함으로써 비교적 저온에서 진행되는 간단한 감압 건조 공정을 거침으로써 부산물과 분해산물이 적은 고순도의 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 합성할 수 있다는 우수한 이점이 있을 뿐만 아니라, 상기 화합물의 안정성도 종래의 제조방법에 의해 제조된 것보다 우수하다는 장점이 있다.
본 발명은 테노포비르를 합성하는데 있어서 이미 개선되었다고 주장하는 종래기술의 합성 수율보다 높고 더 순수한 원료를 생산하기 위한 방법에 관한 것이며, 특히 그동안 문제되어온 장시간의 합성 생산과정 중에 일어나는 반응물의 이성화 및 조해성 물질의 발생 등의 문제를 해결하고 합성과정 중 분자 중합체의 생성을 억제하여 고순도의 원료를 합성하는 방법에 관한 것이다.
테노포비르는 전형적으로 (R)-9-[2-(히드록시)프로필]아데닌(HPA)과 디에틸파라톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(DEPTSMP)를 촉매의 존재하에 반응시켜서 디에틸테노포비르에스테르화합물(DEPMPA)를 얻고 이를 다시 가수분해하여 테노포비르(PMPA)를 생성시키는 것이 주요 공정이고 이러한 과정을 거쳐 생성된 테노포비르가 바로 항바이러스 물질이다. 이후 합성인 Teno-D와 Teno-DF의 합성은 테노포비르를 지용성물질로 생리 활성화하는 전구 물질로 만드는데 불과하다. 지금까지도 위의 여러 특허 사례에서 살펴본 바와 같이 세계적으로 개발된 기술에 대한 특허는 바로 이 과정에 있어서 수율 향상과 순도 개선에 좌우 되고 있다.
본 발명은 HPA에서 DEPMPA를 합성할 때 전형적인 시약촉매인 마그네슘부톡사이드에 일정 비율로 칼슘하이드라이드를 첨가하여 종래 반응 시간이 18시간인 것을 6시간 이내로 단축시키고 또한 톨루엔 술폰산칼슘의 생성을 동반하여 조해성을 감소시키는 효과를 얻었으며 상기 에스테르 화합물을 테노포비르로 탈알콜 가수분해시에 역전적 알카리 용액으로 중화한 후에 이온교환수지(Dowex 50W, Sulfonic acid cation exchage Resin)를 사용함으로서 정밀한 등전점(PH 3.2)으로 유도하여 테노포비르의 합성 수율을 추가적으로 항상시킨 방법에 관한 것이다. 일반적으로 중화시의 PH가 2.5~3.5인 경우에는 수용액 중에 테노포비르(H2O, 1분자 결정수)가 7% 정도로 녹아 있으나 이온 교환수지로 정확히 중화했을 때에는 이를 4%이하로 줄일 수 있었다.
또한 반응 공정 중 반응 진행 정도를 면밀히 파악하는 방법으로서는 종래의 문헌상 장시간이 걸리는 HPLC법으로 진행과정을 점검할 수밖에 없으나 간편한 TLC 방법을 추가함으로서 장시간 기다리는 HPLC 결과를 사전에 참작할 수 있게 하였다.
상기 가수분해 공정 중에는 여러 가지 시약이 사용될 수 있으나 부산물이 적게 나오는 시약을 선택하여 빠르고 아울러 반응시간의 단축이 가능한 알킬살리실브로마이드 시약으로 선택하게 되었다. 반응온도의 설정은 메틸인산에스테르화 반응이 75~80℃에서 4~6 시간, 가수분해 반응이 80~90℃이며 반응 시간은 4시간~6 시간이다. 테노포비르 결정화 석출공정은 초기 반응에서 0~5℃이다.
<HPA에서 디에틸 테노포비르의 합성단계 반응 진행검사>
TLC분석 조건(UV254nm) 관찰 : 전개용매 메틸렌클로라이드(MC)/에틸알콜(EtOH) = 10/2, Silca gel 60 F254, 25 Aluminium sheets 20 X 20 cm, RF(HPA) = 0.3, RF(Diethyl Tenofovir) = 0.4
HPLC 분석 조건 : USP Pending Monograph Tenofovir Disoproxil Fumarate(2011), UV Detector 260nm, column 4.6-mm 25cm ; 5micro Packing L1,Col. Temp. 35℃, Sam.Temp. 4℃ Flow Rate 1ml/min. Inj. Sz. 10micro L.
<디에틸 테노포비르의 가수분해 반응>
TLC 분석 조건(UV254nm) : 전개용매 메틸알콜단독 용매(100% MtOH), Silica gel 60 F254 25 Aluminium Sheets, RF(Tenofovir) = 0.62, 미반응 테노포비르에스테르는 MC/EtOH = 10/2로 관찰
HPLC 분석 조건 ; 상기 HPA 반응 진행 검사시와 동일 (USP Pending M.자료와 동일)
<테노포비르에서 테노포비르 디소프록실(Teno-D) 합성반응 진행검사>
TLC 분석 조건(UV254nm) : 전개용매 메틸알콜 단독용매, Silica gel 60 F254, Al. sheets, RF(Teno-D)= 0.75, RF(Tenofovir) = 0.62
HPLC 분석 조건 ; 위 HPA 반응시와 동일 (USP Pending M. 자료와 동일)
<비교 실시예>
[비교실시예 1]
(R)-9-(2-히드록시프로필)아데닌((R)-9-(2-hydroxypropyl)adenine, HPA)의 제조 방법
아데닌 40g (0.296mol)을 Dimethylformamide(DMF) 200ml에 용해시키고 수산화나트륨(NaOH) 0.94g(0.0235mol, 0.08Equiv.)을 가한 다음 상온에서 20분간 교반하고 (R)-프로필렌카본네이트((R)-propylene carbonate) 39.2g(0.390mol, 1.32 Equiv.)을 가한 뒤에 30분간 교반하였다.
반응온도를 120℃로 상승시키고 24 시간동안 가열 축합 반응시켰다. 이후부터 TLC와 HPLC로 반응 상태를 검사하고 반응이 거의 완료(90%이상)된 후에 반응온도를 70℃로 냉각하고 여기에 이소프로필알콜(IPA) 240ml를 가하여 결정화시켰다. 이후 계속 교반하고 냉각하여 10℃에서 결정을 여과하고 IPA로 세척한 다음 감압 건조기에서 70℃로 건조시켜서 HPA 41g을 얻었다(수율 71.8%).
테노포비르((R)-9-[2-(phosphonomethoxy)propyl]adenine, Tenofovir)의 합성
(리튬터셔리부톡사이드 촉매 사용법) (Ref : Tetrahedron Letters 39(1998) 1853)
HPA 40g(0.21mol)을 Dimethylformamide(DMF) 200ml에 용해시킨 후 리튬터셔리부톡사이드(Lithium t-butoxide) 25.2g(0.315mol, 1.5 Equiv.)를 넣고 현탁시켰다. 반응온도를 30~35℃에서 디에틸-p-톨루엔설포닐옥시메탄포스포네이트(DEPTSMP) 100g(0.325mol, 1.5 Equiv.)를 번갈아 2회에 나누어 첨가하여 반응시키고 80℃에서 5시간 이상 교반하면서 반응진행 여부를 TLC와 HPLC로 확인하였다(12시간 소요).
반응이 종료된 후에 20℃로 냉각한 후 빙초산을 첨가하여 PH를 약산성인 6~6.5로 조절하였다. 여기에 에틸아세테이트 1,000ml를 가하고 50~60℃로 가온 후에 다시 이를 40℃로 냉각하고 여과하였다. 반응 부산물 리튬 무기물 잔사를 에틸아세테이트 500ml로 추가한 후 교반하고 같은 온도에서 여과하여 무기물을 제거한 후에 유기용매를 합쳐서 10℃ 이하의 냉정제수 100ml를 이용하여 2회 세척하고 아울러 포화 염화나트륨 용액 50ml로 세척한 후에 무수황산나트륨으로 유기층을 탈수시킨 뒤에 상기 유기층을 감압유거하여 테노포비르 에스테르(DEPMPA)를 얻었다. 잔사(DEPMPA)에 톨루엔 300ml를 가하여 감압 증류하여 불순물로 함유된 DMF와 에틸아세테이트를 구축 제거하고 다시 사이클로헥산 300ml를 가하여 감압 증류하여 에틸아세테이트와 DMF를 다시 구축 제거한 후에 상기 DEPMPA를 탈 알킬 반응인 가수분해반응을 실시하였다.
상기의 과정에서 얻은 테노포비르에스테르(DEPMPA)를 아세토니트릴 200ml에 용해시키고 브로모트리메틸실란(Bromotrimethylsilane) 120ml를 가하여 환류반응시켰다. 5시간 반응 이후부터 TLC와 HPLC로 반응공정을 검사하면서 반응을 완료하였다(14시간 소요). 반응 완료액에 냉 정제수 200ml을 주의하여 넣고 희석한 다음 에틸아세테이트 200ml로 2회 세척하여 트리메틸실란 성분을 제거한 후에 그 수용액을 상온에서 감압 농축하여 용기 중에 용매 잔량을 구축한 후 냉각하여 영상 5℃ 수용액으로 하였다.
다음 상기 수용액을 50% 수산화나트륨으로 중화하여 PH를 3으로 조정하였다. 생성된 결정을 여과하고 냉 정제수(5℃)로 세척하여 테노포비르 1결정수(H2O)를 얻었다. 상기 결정을 65℃에서 진공감압(30Torr) 건조하여 상기 결정 35.2g을 얻었다(수율 55.6%). 상기에서 수득된 결정을 다시 100℃에서 감압 건조하여(30Torr) 최종적으로 테노포비르 결정 33g을 얻었다(무수물 수율 55.4%). 상기 무수물 테노포비르를 이용하여 테노포비르 디소프록실(Teno-D)과 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Teno-DF)를 종래의 기술문헌 등에 기재된 상법에 따라 합성하였다.
[비교실시예 2]
테노포비르(Tenofovir)의 합성
(마그네슘터셔리부톡사이드 촉매 사용법)(Ref: 공개특허 US2009/0286981 A1)
히드록시프로필아데닌 40g(0.21mol)을 Dimethylformamide(DMF) 80ml에 녹이고 마그네슘터셔리부톡사이드(Magnecium t-butoxide) 28.4g(0.167mol, 0.79 Equiv.)을 넣고 현탁 시킨다. 반응온도를 74℃로 유지하고 여기에 디에틸-p-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(DEPTSMP) 80g(0.2486mol, 1.18 Equiv.)를 21시간에 걸쳐 적하하고 추가로 80℃에서 5시간 반응을 유지하면서 교반하며 반응진행여부를 TLC와 HPLC로 확인하였다(26시간 소요).
반응이 종료된 후에 20℃로 냉각한 후에 빙초산 24g(0.4mol)을 첨가하여 약산성인 PH 6~6.5로 조절하였다. 다음 상기 반응액을 80℃에서 완전히 감압 증류하였다. 잔사 반응액을 20℃로 냉각하고 메틸렌클로라이드(MC) 240ml와 정제수 40ml를 가하여 생성되는 무기물을 여과하고 유기층을 분리하였다. 수층과 무기물 잔사를 MC 100ml로 추가 추출하여 같은 온도에서 여과하여 무기물을 제거한 후에 유기용매를 첨가하여 10℃ 이하의 냉 정제수 50ml로 세척하고 아울러 포화 염화나트륨 용액 50ml로 세척한 후에 무수황산나트륨을 이용하여 유기층을 탈수시킨 후에 상기 유기층을 감압증류 유거하여 테노포비르에스테르(DEPMPA)를 얻었다. 잔사에 톨루엔 200ml를 가하고 감압증류하여 잔존 DMF를 다시 구축하고 잔액인 상기 DEPMPA를 탈 알킬반응인 가수분해반응을 실시하였다.
상기의 과정에서 수득된 테노포비르에스테르(DEPMPA)에 HBr 수용액 260ml를 넣고 90℃에서 5시간 교반한 다음 5시간 반응 이후부터 TLC와 HPLC로 각각 반응공정을 검사하면서 반응을 완료하였다(10시간 소요). 상기 반응 완료액에 냉 정제수 120ml을 주의하여 넣고 희석한 다음 MC 120ml로 2회 세척하여 트리메틸실란 성분을 제거한 후에 그 수용액을 상온에서 약간 감압 농축하여 용기 내 MC 잔량을 구축한 후 냉각하여 수용액의 온도가 영상 5℃가 되도록 하였다.
다음 상기 냉각된 수용액을 40% 수산화나트륨 용액으로 중화하여 PH를 2.5~3.0으로 조정하였다. 상기의 과정 중에 생성된 결정을 여과하고 냉 정제수(5℃)로 세척하여 테노포비르 결정을 얻었다. 상기 결정을 65℃에서 진공감압(30Torr) 건조하여 44g을 얻었다(수율 70%). 상기 결정을 다시 100℃에서 감압건조하여(30Torr) 테노포비르 결정 41,2g을 얻었다(무수물 수율 69%).상기 무수물 테노포비르를 이용하여 테노포비르 디소프록실(Teno-D)과 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Teno-DF)를 종래의 기술문헌 등에 기재된 상법에 따라 합성하였다.
[비교실시예 3]
테노포비르(Tenofovir)의 합성법
(나트륨아마이드 및 마그네슘클로라이드 복합촉매사용법)(Ref: 공개특허 US 2013/0165413 A1)
히드록시프로필아데닌 40g(0.21mol)을 디메틸포름아마이드 (Dimethylformamide,DMF) 80ml에 녹인다. 반응온도를 0℃로 유지하고 나트륨아마이드 16.16g 을 첨가한 후에 30분 교반한 뒤에 25℃에서 마그네슘클로라이드 19.7g을 넣고 1시간 교반한 후 톨루엔 120ml를 가하고 75~80℃에서 디에틸-p-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(DEPTSMP) 100g(0.31mol, 1.48 Equiv.)을 4시간에 걸쳐 적하하고 추가로 80℃에서 5시간 동안 반응을 유지하면서 교반하며 반응진행여부를 TLC와 HPLC로 확인하였다(16시간 소요).
반응이 종료된후 반응액을 70℃에서 완전히 감압 증류하였다. 잔사 반응액을 20℃로 냉각하고 메틸렌클로라이드(MC) 240ml와 정제수 40ml를 가하여 생성되는 무기물을 여과하고 유기층을 분리하였다. 수층과 무기물 잔사를 MC 100ml로 추가 추출하여 같은 온도에서 여과하여 무기물을 제거한 후, 유기용매를 첨가하고 10℃ 이하 냉 정제수 50ml로 세척하고 포화 염화나트륨액 50ml로 세척후 무수황산나트륨으로 유기층을 탈수시킨 뒤에 유기층을 감압 유거하여 테노포비르에스테르(DEPMPA)를 얻었다. 잔사에 톨루엔 100ml를 가하여 감압증류하여 잔존 DMF 다시 구축하고 잔액인 이 DEPMPA를 탈 알킬반응인 가수분해반응을 실시하였다.
위에서 얻은 테노포비르 에스테르(DEPMPA)에 HBr 수용액 260ml를 넣고 90℃로 5시간 교반한 다음 5시간 반응 이후부터 TLC와 HPLC로 반응공정을 검사하면서 반응을 완료하였다(10시간 소요). 반응 완료액에 냉 정제수 120ml을 주의하여 넣고 희석한 다음 MC 120ml로 2회 세척하여 트리메틸실란 성분을 제거하고 수용액을 상온에서 약간 감압 농축하여 용기내 MC잔량을 구축한 후 냉각하여 영상 5℃ 수용액으로 하였다.
다음 50% 수산화나트륨으로 중화하여 PH를 2.5~ 3.0으로 조정하였다. 생성된 결정을 여과하고 냉 정제수(5℃)로 세척하고 다시 냉 아세톤 40ml로 세척하고 테노포비르 1결정수(H2O)를 얻었다. 상기 결정을 정제수 360ml를 넣고 90℃로 30분간 가열하고 0℃로 냉각하고 4시간 후에 여과한다. 상기 결정을 건조기 온도 65℃ 진공감압(30Torr)에서 건조하여 결정 36g을 얻었다(수율 57%). 상기 결정을 100℃에서 감압건조하여(30Torr) 최종적으로 테노포비르 무수물 결정 33.7g을 얻었다(무수물 수율 56.6%).
상기 무수물 테노포비르를 가지고 다음 반응으로 테노포비르 디소프록실
(Teno-D)과 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Teno-DF)를 종래의 문헌에 기재된 상법에 따라 합성하였다.
[실시예]
테노포비르 (Tenofovir)의 합성법(본 발명에 따른 합성방법)
(마그네슘 t-부톡사이드, 칼슘 하이드라이드 복합 촉매 및 이온교환수지 사용방법)
히드록시프로필아데닌((R)-9-(2-hydroxypropyl)adenine, HPA) 40g(0.21mol)을 Dimethylformamide(DMF) 200ml에 녹이고 마그네슘터셔리부톡사이드(Magnecium t-butoxide) 143.2g(0.84mol, 4,0 Equiv.)과 반응촉매로 칼슘하이드라이드(Calciumhydride) 4.42g(0.105mol)을 넣고 현탁시킨다. 반응온도를 30~35℃로 하고 디에틸-p-톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트(DEPTSMP) 100g(0.325mol, 1.5 Equiv.)를 2시간에 거쳐 첨가하여 반응시키고 80℃에서 5시간 이상 교반하면서 반응진행여부를 TLC와 HPLC로 확인한다(7시간 소요).
반응이 종료된 후에 20℃에서 빙초산을 적가하여 약산성인 PH 6~6.5로 조절한다. 반응액에 에틸아세테이트 1,000ml를 가하여 50~60℃로 가온후 40℃로 냉각하고 여과한다. 에틸아세테이트 500ml를 추가하여 무기물 잔사를 추가 추출하고 같은 온도에서 여과하여 무기물을 제거한 후 유기용매를 가하여 70℃ 이하에서 용매를 감압 유거시킨다. 잔사액을 20℃ 이하로 냉각하고 다시 에틸아세테이트 1,000ml와 냉 정제수 100ml를 넣어 분리하고 유기층을 추가 100ml 냉수로 2회 세척하고 다시 포화 식염수(염화나트륨액) 50ml로 세척후 무수황산나트륨으로 유기층을 탈수시키고 유기층을 감압 유거하여 테노포비르 에스테르(DEPMPA)를 얻는다. 잔사에 톨루엔 300ml를 가하여 잔존하는 DMF와 에틸아세테이트를 다시 감압증류 유거하여 구축하고 다시 사이클로헥산 300ml를 가하여 감압증류 하여 에틸아테이트와 DMF를 다시 구축한 다음 이 DEPMPA 잔액을 탈 알킬반응인 가수분해반응을 실시하였다.
위에서 얻은 테노포비르 에스테르(DEPMPA)를 아세토니트릴 200ml에 녹이고 브로모트리메틸실란(Bromotrimethylsilane) 120ml를 가하여 환류반응 시켰다. 5시간 반응이후부터 TLC와 HPLC로 반응공정을 검사하면서 반응을 완료하였다(12간 소요). 반응 완료액에 냉 정제수 200ml을 주의하여 넣고 희석한 다음 에틸아세테이트 200ml로 2회 세척하여 트리메틸실란 성분을 제거하고 수용액을 상온에서 약간 감압 농축하여 용기용매 잔량을 구축한후 냉각하여 영상 5℃ 수용액으로 하였다.
상기 용액을 40% 수산화나트륨으로 중화하여 PH를 3.5로 조정하였다. 역으로 이온 수지 Dowex 50W 양이온 교환수지를 사용하여 정밀히 PH를 3.2로 하고 생성된 결정을 여과하였다. 상기 결정을 냉 정제수(5℃)로 세척하여 테노포비르 결정을 얻었다. 이 결정을 메탄올 400ml에 녹이고 여과하여 상기 이온 수지를 제거하고 감압 농축하였다. 잔사 결정을 건조기 온도 65℃ 진공감압(30Torr)에서 건조하여 테노포비르 결정 48.0g을 얻었다(수율 75.9%). 상기 결정을 95℃에서 감압 건조하여(30Torr) 최종적으로 무수 테노포비르 결정45g을 얻었다(무수물 수율 75.7%).
이 상기 무수물 테노포비르를 가지고 다음 반응으로 테노포비르 디소프록실(Teno-D)을 합성하였다.
[테노포비르 디소프록실 (Teno-D)의 합성방법]
상기 실시예에서 얻은 테노포비르 무수물 25g을 N-methyl-2-pyrrolidinone(NMP) 100ml와 톨루엔 50ml를 넣고 60℃에서 감압증류 유거하여 다시 수분을 제거하고 다시 톨루엔 50ml를 넣어 한번 더 증류유거하였다.
상기 반응액을 35℃로 냉각하고 트리에틸아민(Triethylamine) 35.2g(4 Equiv.)을 가하고 결정이 생성되나 계속 교반하여 균질화 현탁시키고 테트라부틸암모니움브로마이드(Tetrabutylammoniumbromide) 28g(1.0Equiv.)를 가하고 45℃로 가열하였다.
여기에 클로로메틸이소프로필 카르보네이트(Chloromethyisopropyl carbonate) 66.4g(5.0 Equiv.)을 가하고 45~55℃에서 계속 교반하였다. 5시간이 경과후부터 TLC와 HPLC로 반응 경과를 추적 검사하여 반응이 종결되고 점조액이 투명한 붉은 색이 됐을 때에 상온으로 냉각하고 사이클로헥산 150ml를 가하여 강하게 교반한 뒤에, 감압 스포이드튜브로 상층의 액을 제거하고 다시 사이클로헥산 100ml로 세척하여 제거하였다. 반응층에 에틸아세테이트 300ml와 물 냉수100ml를 넣고 교반하여 수층을 제거하고 수층은 에틸아세테이트 50ml로 2회 세척하여 원액에 합친다. 유기층을 냉수 50ml와 포화 식염수 50ml 로 세척하고 황산마그네슘으로 탈수한 후 감압 유거하여 53g의 결정 슬러지 상태인 테노포비어 디소프록실을 얻었다. 다시 더 저온으로 냉각하여 결정화시킨 뒤 이를 HPLC로 함량 분석하였다(순도 85% 면적 대비 실제량 45g, 수율96%).
[테노포비르 디소프록실 푸마레이트 (Teno- DF)의 합성방법]
테노포비르 디소프록실 조 결정 53g(실 45g)(0.087mol)을 이소프로필알콜 120ml에 녹이고 푸말산(Fumaric acid)12.5g(0.107mol, 1.2 Equiv.)를 넣고 50~55℃로 2시간 교반하였다. 이 반응액을 3~5℃로 냉각하고 생성되는 결정을 충분히 교반한 후 여과하였다. 상기 결정을 에틸아세테이트 250ml에 현탁시키고 1시간 교반한 후에 반응액을 10℃ 이하로 감온하고 여과하여 세척하였다. 이러한 방식으로 수득된 결정을 40℃에서 진공감압 건조하여 35g의 테노포비르디소프록실푸마레이트를 얻었다(HPLC area Purity 98.5%, 수율 63.6%).
[필름형 제제의 제조 방법 ]
조성 실시예 1 실시예 2 실시예 3

테노포비르디소프록실
푸마레이트		 37.5%
(테노포비르디소프록실
푸마레이트로서150mg)		 37.5%
(테노포비르디소프록실
푸마레이트로서150mg)		 37.5%
(테노포비르디소프록실
푸마레이트로서150mg)
하이드록시프로필
메칠셀룰로오스
-
20.00%
20.00%
풀루란 35.0% 15.00% 15.00%
폴리에틸렌글리콜600 15% 15% -
폴리에틸렌글리콜400 - - 15%
글리세린 2% 2% 2%
폴리소르베이트20 0.10% 0.10% 0.10%
아세설팜 10.40% 10.40% 10.40%
정제수 정량 정량 정량
소계 100% 100% 100%
총중량(mg/매) 400mg 400mg 400mg
(상기 표에서 각 성분의 함량은 총중량에 대한 중량%를 의미한다)
실시예 1
1. 정제수에 폴리에틸렌글리콜600, 글리세린, 폴리소르베이트20, 아세설팜을 넣고 완전히 용해시킨다.
2. 단계1의 용해액에 풀루란을 넣고 완전히 용해시켜 혼합액을 제조한다.
3. 상기 혼합액을 실온(25℃)에서 12시간 이상 숙성시킨다.
4. 주성분인 테노포비르디소프록실푸마레이트를 상기 혼합액에 가하고 잘 교반한다.
5. 12cm2 면적에 주성분이 150mg 함유 되도록 상기 혼합액을 도포한다.
6. 도포한 뒤 65℃에서 30분, 45℃에서 3시간 이상 건조 시킨다.
실시예 2
풀루란 함량을 15 중량%, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 함량을 20 중량%로 변경한 것을 제외하고는 실시예 1의 제조방법과 같다.
실시예 3
폴리에틸렌글리콜600 대신 폴리에틸렌글리콜400을 사용하고 그 함량을 15 중량%로 변경한 것을 제외하고는 실시예 2의 제조방법과 같다.
[필름제의 성성 시험 및 분석방법과 평가]
1) 관능 test
1: 쓴맛이 거의 없음, 2: 쓴맛이 적음, 3: 쓴맛이 약간 남, 4: 쓴맛이 심함, 5: 쓴맛이 매우 심함
2) 벤딩 테스트(bending test)
벤딩테스트는 두 손가락을 이용하여 속용필름을 반으로 반복해서 접었을때 반으로 쪼개질 때까지 접은 횟수로서 속용필름의 개봉후 30분이 경과된 후에 테스트를 실시했으며 이때의 온도와 습도는 22℃, 55% RH이였다. 숫자가 높을수록 브리틀니스가 양호한 것으로 추정할 수 있다.
3) 붕해 test
대한약전 일반시험법 붕해시험법 일반방출제제 조작법에 따라 보조판을 사용하여 시험한다. 위 시험법에 따라 시험할 때 붕해시간은 3분 이하이어야 한다.
4) 박리 test
박리테스트는 지지필름인 PET필름으로부터 박리되는 정도를 측정한다.
1: 박리가 매우 안됨, 2: 박리가 잘 안됨, 3: 박리가 보통임, 4: 박리가 잘됨, 5: 박리가 매우 잘됨
5) 필름제 평가표
실시예 1 실시예 2 실시예 3
관능 test 3 3 3
bending test 3 5 8
붕해 test 3분 이하 3분 이하 3분 이하
박리 test 5 5 5
시험 및 분석방법과 평가
<합성품 HPLC 자료 : 테노포비르 및 Tenofovir-DF 합성물의 비교 HPLC 자료>
Figure 112014104079112-pat00002
Tenofovir 합성물
Figure 112014104079112-pat00003
Tenofovir 표준품
Figure 112014104079112-pat00004
Teno-DF 합성물
Figure 112014104079112-pat00005
Teno-DF 표준품
[필름제형 HPLC 분석 평가 자료 : 24주 안정성 HPLC 자료]
Figure 112014104079112-pat00006
실시예 1의 함량 시험(Tenofovir DF 표준품)
Figure 112014104079112-pat00007
실시예 1의 함량 시험(Tenofovir DF 필름제)
Figure 112014104079112-pat00008
실시예 1의 4주 안정성 시험(Tenofovir DF 표준품)
Figure 112014104079112-pat00009
실시예 1의 4주 안정성 시험(Tenofovir DF 필름제)
Figure 112014104079112-pat00010
실시예 1의 12주 안정성 시험(Tenofovir DF 표준품)
Figure 112014104079112-pat00011
실시예 1의 12주 안정성 시험 (Tenofovir DF 필름제)
Figure 112014104079112-pat00012
실시예 1의 24주 안정성 시험(Tenofovir DF 표준품)
Figure 112014104079112-pat00013
실시예 1의 24주 안정성 시험(Tenofovir DF 필름제)
[테노포비르의 합성 방법의 개선과 비교평가 및 필름 제형 종합평가]
본 합성방법(실시예)은 HPA에서 테노포비르를 합성할때 원료사용량 기준으로 40g(합성원료물질인 HPA의 중량)에서 45g(최종 생성물인 테노포비르 결정의 중량)을 생산함으로 1.125비율(112.5%)을 수득하였고 이는 비교실시예 1의 0.825비율(82.5%, 33/40=0.825)보다 우수하고, 비교실시예 2의 1.03비율(103%, 41.2/40=1.03)보다 우수하며(약9.5% 증가, 이론 수율대비 69%->75.7% = 6.7% 증가), 비교실시예 3의 0.842비율(84.2%, 33.7/40= 0.842)보다 우수하였다.
또한 본 발명에 따른 합성방법에 의해 합성된 테노포비르(무수물)를 가지고 테노포비르 디소프록실(Teno-D)의 중간단계를 거쳐 최종 합성한 테노포비르 디소프록실 푸마레이트(Teno-DF)의 수득율은 본 발명의 합성방법이 테노포비르(무수물)원료 사용량 기준으로 25g에서 35g 생산함으로 1.4비율(140%) 증가로 이 생산단계의 합성구간별 비율은 비특허 문헌인 Organic Process Reseach & Development(2010, Vol.14, 1194-1201)에 나타난 합성수율비 1.38비율(138%, 69/50=1.36)과 대동소이함을 알 수 있다.
그러므로 테노포비르를 높은 수율로 생산할 수 있는 본 발명에 따른 합성방법이 종래의 합성방법보다 우수하고 유효한 것임을 알 수 있었다.
또한 이렇게 합성한 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 이용한 의약의 필름제형도 안정한 것으로 판명된바, 본 발명에 따라 합성된 테노포비르 디소프록실 푸마레이트를 이용한 의약품을 신규한 필름형 제품으로서 개발할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (7)

  1. 테노포비르를 합성하고 이를 이용하여 테노포비르 결정을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 제조방법은 히드록시프로필아데닌(HPA)을 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시키는 단계; 상기 단계의 용액에 반응촉매로서 마그네슘부톡사이드와 칼슘하이드라이드를 첨가하고 현탁시키는 단계; 상기 단계의 용액에 디에틸톨루엔설포닐옥시메틸포스포네이트를 첨가하여 반응시키는 단계; 상기 단계의 반응이 종료된 후 에틸아세테이트와 정제수로 상기 단계의 용액을 세척하고 무수황산나트륨으로 유기층을 탈수시킨후 유기층을 감압하여 테노포비르에스테르를 수득하는 단계; 상기 단계에서 수득된 테노포비르에스테르를 아세토니트릴에 용해시킨 후 브로모트리메틸실란을 첨가하는 단계; 상기 단계의 용액에 술폰산계 양이온 교환수지를 사용하여 용액의 PH를 조절하는 단계 및 상기 단계의 용액을 세척, 농축 및 감압건조하여 무수물 테노포비르 결정을 수득하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 테노포비르 결정의 제조방법
  2. 제1항에 있어서 상기 반응촉매로서 원료 100중량부에 대하여 마그네슘부톡사이드 300 내지 400중량부 및 칼슘하이드라이드를 3 내지 11중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 테노포비르 결정의 제조방법
  3. 삭제
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  7. 삭제
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