KR101672251B1 - 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 사상의학에 기초하여 생약재를 선별 후 혼합 추출함으로써, 피부개선활성이 우수한 생약복합추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

Description

생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising an extract of mixed herbs}

본 발명은 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 사상의학에 기초하여 생약재를 선별 후 혼합 추출함으로써, 피부개선활성이 우수한 생약복합추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

현대사회의 산업화와 도시화로 인해 환경이 변화되면서 현대인들의 피부 질환 발병률은 증가하고 있으며, 이러한 때에 새로운 패러다임의 하나로 동양사상과 한의학에 대한 인식이 새로워졌다. 의학뿐 아니라 사회 전반적인 사고와 피부건강에서도 동양사상의 개념이 도입되어 적용되고 있다. 피부는 한의학 관점에서 피부만의 문제로 한정되지 않고 오장육부(五臟六腑)의 영향을 받는 것으로 인식한다. 즉 피부의 상태를 보면 내장의 상태를 알 수 있어, 피부가 맑고 윤이 나면 내장이 건강하고, 피부가 거칠고 탁하면 내장에 병이 들어 있는 것이라 하여, 얼굴이 붉고 윤이 나는 사람을 신선이라고 했다. 인체에서 피부의 역할은 각기 존재하는 곳의 기능에 따라 외부의 자극에 다르게 반응한다고 보고 피부를 독립된 기관으로 생각하지 않은 것이다.

이런 오장육부의 상태에 따라 네 가지 체질로 나눈 대표적인 이론은 조선말엽 1894년 동무(東武) 이제마(李濟馬)선생에 의해 창안된 사상의학이론이다. 사상의학이론은 태양인(太陽人), 소양인(少陽人), 태음인(太陰人), 소음인(少陰人)의 네 가지 체질로 분류되며, 각 체질에 대한 생리, 병리, 진단, 변증, 치료와 약물에 이르기까지 서로 연계를 갖고서 임상에 응용할 수 있는 새로운 방향을 제시한 우수한 이론이다.

사상의학에서 가장 중요한 것은 체질 감별에 있는데, 사상체질 분류에 있어서 밖으로는 체형기상(體型氣像)을 말하고 있고, 안으로는 사상인의 성격과 재간, 성질 등을 제시하고 있어서, 외형적인 육체만을 다루는 체질의학이 아니고, 정신과 육체를 불가분의 관계로 설명하고 있다. 사상체질을 분류 할 때에는 외형, 용모, 성정, 태도, 거동, 식성 이외에도 여러 가지 각도로 사람을 관찰하여 판단 내려야하겠지만, 이중에서도 외모, 심성, 병증이 중요한 지표가 된다. 이 중 어느 한 가지만으로는 판단이 충분치 않기 때문에 이 세가지 방법을 함께 종합적으로 판단하여 체질을 분류한다.

이렇게 분류한 체질별 특성을 정리하면, 태양인은 폐대간소라 하여 폐의 기능은 뛰어나지만 간의 기능이 떨어지는 체질이며, 태음인은 간대폐소라 하여 간의 기능은 뛰어나지만 폐의 기능이 약하여 심장 및 호흡기 관련 질환이 많은 체질이며, 소양인은 비대신소라 하여 비위계통은 강하지만 신장 및 내분비 계통이 약하며, 몸에 열이 많이 발생하는 체질이며, 소음인은 신대비소라 하여 신장의 기능이 좋지만 비위가 약하여 소화가 잘 안되고, 몸이 비교적 약하고 찬 체질이다. 최근 사상의학은 실생활과 접목되어서 평소 자신에게 이로운 음식과 생활을 통해 건강을 유지하도록 하기 위해 건강 보조식품, 의약품 등에 이용되고 있으며, 만병통치약으로 알려진 인삼의 경우도 모든 사람에게 좋은 효과를 나타내지 않고 체질에 따라 구분하여 복용하는 것도 이 사상의학의 원리를 접목한 것이다.

한편, 사람의 체질이 다르다는 것은 결국 장기의 강약이 다른 것이고, 그로 인해서 체질별로 독특한 피부타입을 가지고 태어남을 의미한다. 사람마다 햇빛에 예민한 사람, 잔주름이 많이 생기는 사람, 주름이 잘 생기지 않는 다럼 등 서로 다른 피부상태를 가지는 경우가 많다. 각 체질에 따른 독특한 피부타입 즉 피부 톤, 유분상태, 피부 결, 피부 탄력, 주름형태를 갖게 되는 것이다.

이러한 특성과 관련하여 대한민국 공개특허 제2006-0132110호 "동양인의 체질 및 두피타입에 적합한 모발화장품 조성물"에는 사상의학에 의한 체질별 모발화장품 조성물에 대하여 개시하고 있다.

그러나 사람에 따라 그 체질을 명확하게 구분할 수 없고, 여러 가지 특성들을 복합적으로 가지는 경우가 많으므로, 사상의학에 따른 한 가지 체질에 맞춘 화장품은 다수의 일반적인 사람들에게는 효과적이지 않을 수 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 사상의학 원리에 의해 각 체질에 적합한 한방원료들을 최적의 비율로 혼합 추출하여 추출물을 제조하고, 이를 다시 혼합하여 복합추출물 형태로 화장료로 사용하는 경우 서로 다른 피부특성을 가지는 다양한 사람들의 피부를 개선하는 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 사상의학에 기초하여 선별된 생약재를 혼합 추출하여 제조되는 생약복합추출물을 함유하여 피부 개선활성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초의 제1혼합추출물; 구기자, 산수유, 지골피, 하고초 및 황련의 제2혼합추출물; 길경, 맥문동, 상백피, 오배자 및 의이인의 제3혼합추출물; 및 감초, 건강, 당귀, 인삼 및 천궁의 제4혼합추출물로 이루어지는 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

바람직하게는 상기 제1혼합추출물은 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초가 1:1:2:1:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

바람직하게는 상기 제2혼합추출물은 구기자, 산수유, 지골피, 하고초 및 황련이 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

바람직하게는 상기 제3혼합추출물은 길경, 맥문동, 상백피, 오배자 및 의이인이 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

바람직하게는 상기 제4혼합추출물은 감초, 건강, 당귀, 인삼 및 천궁이 1:2:1:1:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 것이다.

유효성분으로서의 상기 생약복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01~15 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 피부보습, 주름개선, 피지분비개선, 피부톤 개선을 위한 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 생약복합추출물은 피부보습, 주름개선, 피지분비조절, 피부톤 개선 효과가 우수하므로 피부개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1, 2는 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 피부보습효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 피부 장벽 보호 기능을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 피부 세포 보호 기능을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 MMP-1 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6, 7은 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 피부 주름 개선효과를 나타내는 그래프이다.
도 8, 9, 10은 본 발명의 제조예에 따른 혼합추출물의 항염 및 피지분비조절 효과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초의 제1혼합추출물; 구기자, 산수유, 지골피, 하고초 및 황련의 제2혼합추출물; 길경, 맥문동, 상백피, 오배자 및 의이인의 제3혼합추출물; 및 감초, 건강, 당귀, 인삼 및 천궁의 제3혼합추출물로 이루어지는 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 각 혼합추출물은 사상의학에 기초하여 선별된 생약재를 혼합하여 추출한 것이다. 상기 각 혼합추출물은 열수 추출물이거나, 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올, 부틸렌글리콜, 글리세린, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤, 아세토나이트릴, 페트로레움에테르 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매에 의한 용매 추출물이다. 추출은 통상적인 방법에 의하여 이루어 질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생약재들을 추출용기에 넣고 정제수를 이용하여 30분 내지 10시간 동안 환류 추출하는 단계, 이를 여과하고 농축하는 단계를 통해 제조된다.

상기 제1혼합추출물의 제조에 사용된 원물은 태양인의 체질에 맞는 생약재로 선별된 것이다. 태양인은 일반적으로 열이 많고 피부에 홍조 및 건조함을 나타내므로 이를 개선하여 피부에 열을 내려주고 보습을 제공하도록 하였다. 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초를 1:1:2:1:2의 중량비로 혼합 추출하는 경우 가장 우수한 보습 및 피부장벽보호기능을 나타내었다.

교맥(蕎麥)은 메밀의 여문씨를 말린 것으로, 교맥의 유효성분인 루틴은 모세혈관의 취약성을 감소시켜 정상적인 저항력을 회복시켜 줌으로 모세혈관 파열로 인한 출혈을 예방하는 역할을 한다. 메밀의 검은 겉껍질은 원활한 통변과 이뇨 작용을 도와 노폐물을 몸 밖으로 내보내 피를 맑게 하고 혈관을 부드럽게 하며 혈압을 안정시킨다. 동충하초는 달고 순하며, 신장 기능을 돕고 폐를 튼튼히 하며 강장, 정력 보강, 진정, 빈혈 등에 효과가 있다. 모과는 폐를 도와 가래를 삭혀 주고 기침을 멎게 하므로 만성 기관지염에 효과가 있고 체력이 약하여 쉽게 피로하여 감기에 잘 걸리는 사람에게 좋다. 또한 모과는 신맛이 강한데 한의학에서 신맛은 간장과 연계되며 간장은 근육을 연관이 있다. 모과는 근육을 원활하게 움직이게 하는 효능과 혈액순환을 개선시켜 주는 효능이 있다. 송엽은 송모(松毛)라고도 하는데 악창(惡瘡)을 고치고 모발을 나게 하며 오장을 편안하게 하며 이것을 오랫동안 복용하면 곧 몸이 가벼워지고 늙지 않으며 곡식을 끊어도 배고프지 않고 목마르지 않는다 라고 본초강목에 기록되어 있다. 어성초는 지상부를 약용부위로 쓰며, 잎을 비벼서 부수면 생선비린내가 나며 맛은 맵고 성질은 약간 차다. 차가운 성질로 인해 해열작용을 한다.

상기 제2혼합추출물의 제조에 사용된 원물은 소양인의 체질에 맞는 생약재로 선별된 것이다. 소양인성 피부는 열이 많아 건조하고 외부 자극에 의해 쉽게 주름이 생기는 것으로 알려져 있어, 피부를 보호하고 주름 개선 효과를 부여하기 위하여 선별되었다. 구기자, 산수유, 지골피, 하고초 및 황련을 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합 추출하는 경우 가장 우수한 피부보호, 주름 및 탄력개선활성을 나타내었다.

구기자는 만성간염, 간경변증 등에 복용하면 염증이 제거되고 기능을 활성화시키는 약재이다. 또한 구기자를 오래 복용하면 몸이 가벼워지고 기력이 왕성해지며, 다리, 허리 등의 힘이 강해지고 세포의 노화를 억제하는 효과가 있다. 산수유는 간이 허하여 어지러운 것을 치료하므로 간경(肝經)으로 들어가는 약으로 달여 먹는다라고 증류본초에 기록되어져 있다. 지골피(地骨皮)는 구기자 나무의 뿌리껍질을 말린 것으로, 지골피는 강장, 해열제로 폐결핵, 에 쓰고, 구기자로는 술을 담가 로 쓴다. 『본초경』에서는 오랫동안 복용하면 근골을 단단하게 하며 몸이 가벼워져서 늙지 않고 더위와 추위를 타지 않는다고 소개되어 있다. 하고초는 간염에 복용하면 황달이 없어지고 간기능이 정상으로 회복된다고 알려져 있다. 또, 안과질환에도 이용되고 두통과 유방염, 결핵성 임파선염 및 간기능 장애로 인한 고혈압에도 효과가 있으며, 흉막염이나 폐결핵에도 치료효과가 인정되고 있다. 황련은 열기(熱氣)를 치료하고 눈이 아픈 증상을 치료하며 눈꼬리 부분이 손상되어 눈물이 나오는 것을 치료하기 위해 사용된다. 또한 눈을 밝게 하는 효능이 있으며, 피 섞인 설사와 복통을 치료하고 여성들의 생식기 부위가 붓고 아픈 것을 치료한다.

상기 제3혼합추출물의 제조에 사용된 원물은 태음인의 체질에 맞는 생약재로 선별된 것이다. 피지 분비가 왕성하게 일어나 여드름이 쉽게 발생하는 태음인성 피부에 대하여 피지를 조절하고 항염 효과를 제공하기 위해 선별되었다. 길경, 맥문동, 상백피, 오배자 및 의이인을 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합 추출하는 경우 가장 우수한 항염 및 피지분비조절 활성을 나타내었다.

길경은 폐에 작용하여 해수와 가래가 많고 호흡이 불편한 증상을 치료하며, 폐를 맑게 하고 답답한 가슴을 풀어주며 뱃속의 찬 기운을 풀어주어 기침을 멈추고 담을 없애주는 약재이다. 맥문동은 진액을 보하는 대표적인 약으로 폐음손상으로 인한 마른기침, 각혈, 가래, 해수에 쓰며, 위음부족으로 인한 갈증, 소갈 및 변비에도 사용한다. 약리효과는 항산화작용, 혈류량촉진, 심장수축력증가, 진정, 면역증강, 혈당강하, 항균작용등이 보고되었다. 상백피는 내복하면 폐의 염증을 제거하고 기침을 멈추게 하는 작용으로 많이 이용되는 생약이다. 만성기관지염의 기성 발작 때나 폐렴 치유 후의 흉통이나 기침, 침출성 흉막염의 침출액에 의한 흉부통증의 팽만감 등에 효과가 있다. 오배자(五倍子)는 수렴작용으로 인해 폐가 허하여 생기는 만성해수, 오래된 기침, 그리고 오랜 설사, 저절로 나는 땀, 식은땀, 유정 등을 치료하고 대변출혈, 코피, 자궁출혈, 외상출혈, 조기, 피부염, 가려움증에 사용한다. 의이인(薏苡仁)은 율무의 종피를 제거한 씨이다. 의이인은 열풍으로 근맥이 오그라들고 당기는 것을 주치한다. 또한 근이 당기고 오그라드는 것도 주치한다고 증류본초에 기록되어 있다.

상기 제4혼합추출물의 제조에 사용된 원물은 소음인의 체질에 맞는 생약재로 선별된 것이다. 피부 면역력이 낮아져 칙칙한 소음인성 피부에 피부 톤 개선 효과를 부여하도록 선별되었다. 감초, 건강, 당귀, 인삼 및 천궁을 1:2:1:1:2의 중량비로 혼합 추출하는 경우 가장 우수한 피부톤 개선효과를 나타내었다.

감초는 해독, 강심(强心), 간 보호, 항궤양, 진정(鎭靜), 항균활성을 가지는 약재이다. 건강(乾薑)은 생강의 말린 뿌리 줄기로서 항염, 진통작용, 항균작용이 있다. 당귀는 피가 부족할 때 피를 생성해 주는 보혈 작용(補血作用)이 주를 이룬다. 또한 약리학적으로는 의 혈류량을 촉진시키고, 생성을 왕성하게 한다. 인삼은 만병통치약으로 불릴정도로 그 효과는 다양하다. 인삼은 면역 글로블린의 양과 림프세포 수를 늘리고 림프세포의 유약화를 촉진하며 망상 내피 계통의 기능을 강화할 뿐 아니라 몸에 나쁜 영향을 주는 물리적 및 화학적 요인에 대한 저항성을 높인다. 천궁(川芎)은 미나리과 식물인 궁궁이(Ligusticum officinale Kitag.)나 산궁궁이(Ligusticum jeholense Nakai)의 뿌리줄기를 말린 것이다. 진정(鎭靜) 작용, 혈압 강하 작용, 자궁 수축 작용, 항균 작용 등이 있음이 밝혀졌다.

사상 체질별 혼합추출물을 혼합하여 사용하는 경우 각각의 혼합추출물을 사용하는 경우에 비하여 다양한 부분, 즉 피부보습, 주름개선, 피지분비개선, 피부 톤 개선에 있어서 전반적으로 더욱 우수한 피부개선활성을 나타내었다. 각 혼합추출물의 혼합비는 제한적이지 않지만, 동일 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다.

사상 체질별 혼합추출물을 혼합하여 제조되는 본 발명 생약복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01~15 중량% 함유된다.

본 발명의 생약복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 사상 체질별 각각의 화장료는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 생약복합추출물에 추가로 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형으로 적용될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

제조예 1~3: 제1혼합추출물 제조

건조된 교맥, 동충하초, 모과, 송엽, 어성초를 하기 표 1의 비율로 혼합 한 후, 건조 중량의 10배에 해당하는 정제수에서 100℃, 2시간 환류 추출하였다. 이를 감압농축하고 동결 건조하여 제1혼합추출물을 제조하였다.

(g)	교맥	동충하초	모과	송엽	어성초
제조예 1	5.0	2.5	2.5	5.0	2.5
제조예 2	5.0	2.5	5.0	2.5	2.5
제조예 3	2.5	2.5	5.0	2.5	5.0

시험예 1: Hyaluronic acid 생성량 측정

상기 제조예 1 ~ 3에서 제조된 혼합추출물의 Hyaluronic acid 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 50ug/m씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 회수한 배양액은 ELISA kit를 이용하여 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초가 1:1:2:1:2의 중량비로 혼합되어 추출된 제조예 3에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 2 : HAS mRNA 발현에 미치는 효과

상기 제조예 1~3에서 제조된 혼합추출물의 HAS mRNA 발현량을 측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 50ug/m씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 hyaluronic acid synthase(HAS) mRNA 발현량을 조사하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. HAS mRNA 발현을 조사한 결과, HAS-1은 모든 시료 처리군에서 mRNA 발현이 187.2%, 216.8%, 297.8%로 현저하게 증가하였으며, HAS-2의 경우 제조예 2와 3에서 발현이 증가하였으며, 그 발현량은 제조예 3에서 가장 높게 나왔다.

시험예 3: Human β-defensin-1, 2, 3의 mRNA발현에 미치는 영향

각 시료(50 μg/ml)를 처리한 후 24시간을 배양한 HaCaT 세포를 TRI-reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리하고, UV-1700 spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 260 nm에서 RNA를 정량 한 후 total RNA 1 μg은 first strand cDNA synthesis kit를 이용하여 역전사 시켰다. cDNA는 RT-PCR 증폭을 위한 template로 사용되었으며, PCR primer는 선택적인 primer를 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. PCR은 95℃에서 10초(denaturation), 56℃에서 30초(annealing), 72℃에서 1분(extension)의 반응을 30회 반복하는 것을 조건으로 하였다. PCR에 의한 생성물은 1% agarose gel에서 전기영동을 실시한 후 digital capture system (DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel)을 이용하여 확인하였다. 유전자의 발현은 internal control gene인 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)로 표준화하였다.

혼합추출물의 피부 장벽 보호 기능을 확인하기 위하여 항균 펩타이드인 human β-defensin(HBD)-1, 2, 3의 mRNA 발현을 RT-PCR을 이용하여 조사하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, HBD-1은 모든 시료 처리군에서 112.2%, 121.2%, 121.1%로 발현이 증가하였으며, HBD-2는 모든 시료 처리군에서 발현되지 않음을 확인하였다. HBD-3는 제조예 2와 3에서 발현이 증가하였으며, 그 값은 제조예 3에서 가장 높게 증가하였다.

제조예 4~6: 제2혼합추출물 제조

건조된 구기자, 산수유, 지골피, 하고초, 황련을 하기 표 2의 비율로 혼합하였다. 건조 중량의 10배에 해당하는 정제수에서 100℃, 2시간 환류 추출하고, 이를 감압농축하고 동결 건조하여 혼합추출물을 제조하였다.

(g)	구기자	산수유	지골피	하고초	황련
제조예 4	2.5	5.0	2.5	5.0	2.5
제조예 5	2.5	5.0	5.0	2.5	2.5
제조예 6	2.5	2.5	2.5	5.0	5.0

시험예 4: H ₂ O ₂ 에 의해 유발된 세포사멸 억제 효과

H₂O₂에 의해 야기되는 세포 독성 억제 효과를 확인하기 위한 시험법으로 CCD-986sk cell을 96-well plate에 1×10⁴cells/well되게 접종하고, 24시간 배양하였다. 여기에 H₂O₂ 3mM과 제2혼합추출물을 농도 별로 첨가하여 24시간 배양한 후 MTT용액(5 mg/mL)을 10 μL씩 첨가하였다. 4시간 후 배지를 버리고 DMSO를 넣어 formazan을 용해시키고 570 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. H₂O₂에 의해 야기되는 세포 사멸을 MTT assay를 통하여 확인한 결과, 제조예 4, 5, 6 모두 농도 의존적으로 증가함을 확인하였고, 그 중에서도 제조예 6에서 가장 크게 피부 세포를 보호하는 능력을 갖고 있음을 알 수 있다.

시험예 5: MMP-1 생성 억제 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 제2혼합추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도 별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit(Amersham, USA)를 사용하여 정량하였다. 측정된 MMP-1 양은 Lowry assay로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. MMP-1 생성 억제 효과를 살펴본 결과, 비교물질 transforming growth factor-β(TGF-β) 보다 높은 억제 효과를 나타내었으며, 그 중에서도 제조예 6에서 가장 높은 억제율을 나타내었다.

시험예 6: 엘라스테이즈 활성 억제 효과 시험

96-well plate에 농도별로 준비한 시료 100 μL, Trisbuffer 60 μL를 넣고 여기에 8.8 mM 농도의 기질(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide) 20 μL, 10μg/mL 농도의 효소(elastase)를 20μL 넣고 25℃에서 15 min 동안 반응시킨 후 410 nm에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 이 때 대조군은 시료 대신 Tris buffer를 넣은 것으로 하였으며, 효소를 넣지 않은 공시험의 흡광도를 뺀 값을 elastase 활성 억제 효과평가에 이용하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 엘라스테이즈 활성 억제 효과 시험을 수행한 결과, 제조예 4, 5, 6 시료 모두에서 농도 의존에 따라 elastase 활성을 억제하는 효과를 나타내었으며, 그 중에서도 제조예 6에서 가장 우수한 억제효과를 보였다.

시험예 7: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 제2혼합추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay으로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 제조예 6에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

제조예 7~9: 제3혼합추출물 제조

건조된 길경, 맥문동, 상백피, 오배자, 의이인을 하기 표 3의 비율로 혼합하고, 건조 중량의 10배에 해당하는 정제수에서 100℃, 2시간 환류추출하고, 이를 감압농축하고 동결 건조하여 생약혼합추출물을 제조하였다.

구분	길경	맥문동	상백피	오배자	의이인
제조예 7	2.5	5.0	5.0	2.5	2.5
제조예 8	5.0	5.0	2.5	2.5	2.5
제조예 9	2.5	2.5	2.5	5.0	5.0

시험예 8: NO 생성 억제율 시험

LPS에 의해 손상된 세포로부터 생성된 nitrite를 측정하기 위하여 Griess 반응을 이용하였다. MA JS 등(2010)의 방법을 응용하여 Griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색의 반응을 측정하였다. RAW264.7 세포를 24-well plates에 5×10⁴cells/well이 되도록 분주하고, 12시간 배양한 후 혼합추출물을 0, 10, 50 그리고 100 ug/mL와 LPS 0.1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다. Nitrite의 측정은 Griess reagent system을 이용하여 분석하였다.

도 8의 결과에서 보는 바와 같이, 손상된 세포로부터 생성되는 nitrite를 측정 결과 제조예 9에서 가장 높은 NO 생성 억제율 효과를 나타내었다.

시험예 9: IL-2 생성에 대한 영향

RAW 264.7 cell의 cytokine 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 96 well plate에 1×10⁵cells/ml의 cell을 100 ul씩 넣은 후, CO₂배양기에서 24시간 배양한 뒤 배지를 버린 다음, 표면을 PBS 용액으로 씻었다. LPS 1 ug/ml를 다양한 농도의 혼합추출물과 함께 배지에 담아 각 well에 처리한 후 CO₂배양기에서 24시간 배양하고, 배양이 끝나면 상층액을 채취한 뒤 Bio-Plexsuspension array system의 multiplex cytokine assay를 실시하여 cytokine을 측정하였다.

IL-2는 활성화된 CD⁴⁺Tlymphocyte에 의해 합성되어 lymphotoxin, IFN-γ 및 LAK cell 등의 합성과 NK cell의 성장을 자극하는데, LPS에 의해서 유의하게 증가된 RAW 264.7 cell의 IL-2를 제조예 9에서 가장 효과적으로 감소시킴을 확인하였다(도 9).

시험예 10: TNF-α 생성량

염증매개인자 발현억제 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다. RAW 264.7 cell의 cytokine 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 96 well plate에 1×10⁵cells/ml의 cell을 100 ul씩 넣은 후 CO₂배양기에서 24시간 배양한 뒤 배지를 버린 다음 표면을 PBS 용액으로 씻었다. LPS 1 ug/ml를 다양한 농도의 혼합추출물과 함께 배지에 담아 각 well에 처리한 후 CO₂배양기에서 24시간 배양하고, 배양이 끝나면 상층액을 채취한 뒤 Bio-Plexsuspension array system의 multiplex cytokine assay를 실시하여 cytokine을 측정하였다.

TNF-α는 macrophage와 fibroblast에 의해 분비되어 endothelial cell, neutrophil 및 B cell 등을 자극함으로써 chemokines, prostaglandins, proteases 및 growth factors 등의 분비를 촉진하는데, LPS에 의해서 유의하게 증가된 RAW 264.7 cell의 TNF-α를 제조예 9에서 가장 효과적으로 감소시킴을 확인하였다(도 10).

제조예 10~12: 제4혼합추출물 제조

건조된 감초, 건강, 당귀, 인삼, 천궁을 하기 표 4의 비율로 혼합한 건조 중량의 10배에 해당하는 정제수에서 100℃, 2시간 환류 추출하였다. 이를 감압농축하고 동결 건조하여 제4혼합추출물을 얻었다.

구분	감초	건강	당귀	인삼	천궁
제조예 10	5.0	5.0	2.5	2.5	2.5
제조예 11	2.5	5.0	2.5	5.0	2.5
제조예 12	2.5	5.0	2.5	2.5	5.0

시험예 11: 세포독성 측정 시험

세포독성은 3-(4,5-dimethythiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 쥐 유래 멜라닌 세포 B16F10를 2×10⁴cells/well 농도로 96 well plate에 접종한 후, 각 well 에 시료를 투여하여 CO₂배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액(5ug/ml)을 첨가하고 4시간 후 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 10ul acid-iso-propanol(0.04N acid in iso-propanol)를 첨가한 후 푸른색의 formazan이 용출되도록 하여 microplate reader로 556nm에서 흡광도를 측정하였다.

시료 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율 (%)
	제조예 10	제조예 11	제조예 12
10	100	100	100
50	100	100	100
100	99.54	100	99.23
200	98.42	99.37	98.90

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 적용한 시료 모두 처리농도에서 98% 이상의 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

시험예 12: Tyrosinase 활성 억제 시험

Tyrosianse 억제 효과는 dopachrome 방법을 이용하여 측정하였다. 15ul의 mushroom tyrosinase-150 unit, 225ul의 2.5mM L-tyrosine, 225ul의 0.4M hepes buffer (pH 6.8), 그리고 ethanol용액 혹은 시료(1mg/ml)용액을 섞은 후 배양 전과 15분간 배양 후 각각의 흡광도를 475nm에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다. Tyrosinase 억제 정도는 다음과 같이 계산하였다.

A: 시료가 첨가된 용액의 배양 전 흡광도

B: 시료가 첨가된 용액의 배양 후 흡광도

C: 시료가 첨가되지 않은 용액(기준용액)의 배양 전 흡광도

D: 시료가 첨가되지 않은 용액(기준용액)의 배양 후 흡광도

(tyrosinase 억제효과는 100으로 나타낼 때 완전한 억제를 의미하며, 0일 때 전혀 억제를 하지 못하는 것을 의미한다.)

시료 농도 (㎍/㎖)	Inhibition ratio (%)
	제조예 10	제조예 11	제조예 12	Ascorbic acid
10	40.7	45.8	43.2	68.1
50	46.6	51.4	49.4	68.7
100	51.9	58.4	55.1	69.4
200	55.4	61.8	59.7	70.1

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 피부의 멜라닌 형성에 작용하는 tyrosinase 활성 억제 효과를 살펴 본 결과, 제조예 11의 혼합비율에서 가장 우수한 tyrosinase 활성 억제 효과를 나타내었다.

시험예 13: Melanin 생성량 측정 시험

melanocyte인 B16F10 세포는 melanin을 생성한다. Melanin은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte내의 소기관인 melanosome에서 생합성되며 이는 가시광선 영역대의 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교할 수 있다. 따라서 본 시험에서는 B16F10 세포 접종 후 3일간 시료를 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 well 당 1ml의 1N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 melanin성분을 녹여 나오게 하여, 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인 400nm에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.

시료 농도 (㎍/㎖)	Melanin production (%)
	제조예 10	제조예 11	제조예 12	Ascorbic acid
10	99.6	94.4	96.2	90.7
50	94.3	86.3	90.3	90.0
100	87.4	73.6	77.1	77.5
200	71.0	59.7	62.1	66.7

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 피부 색소 침착의 원인이 되는 멜라닌 생성량을 측정한 결과 제조예 11의 혼합비율에서 가장 우수한 멜라닌 생성억제 효과를 나타내었다.

실시예 1: 생약복합추출물을 함유하는 크림 제조

상기 시험예에서 가장 바람직한 혼합추출물로 확인된 제조예 3, 제조예 6, 제조예 9 및 제조예 11을 동일 중량비로 혼합한 생약복합추출물을 제조하고 이를 포함한 로션을 하기의 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	대조예	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	실시예 1
제조예 3	-	5.0	-	-	-	-
제조예 6	-	-	5.0	-	-	-
제조예 9	-	-	-	5.0	-	-
제조예 11	-	-	-	-	5.0	-
생약복합추출물	-	-	-	-	-	5.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2	2.2	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100	100	100	100

시험예 14: 피부 보습 개선 효과 확인

생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물의 보습효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 60명을 대상으로 시험하였다.

피부 보습 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 2주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 2부위를 정하고 피부의 수분량을 각각 3회에 걸쳐 측정한 후 2주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 수분함량 측정 장치를 이용하여 각질층 바로 아래의 표피층의 수분을 측정하였다. 상기 측정결과를 표 9에 정리하였다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균	수분 증가량(%)
대조예	34	37	8.8
비교예 1	33	45	36.4
비교예 2	35	44	25.7
비교예 3	36	40	11.1
비교예 4	35	39	11.4
실시예 1	36	51	41.7

상기 표 9로부터, 제조예 3의 제1혼합추출물을 함유하는 비교예 1의 제형에서 보습개선효과가 비교적 높게 나타났으며, 본 발명의 생약복합추출물을 함유하는 실시예 1에서 가장 높은 보습효과를 나타내었다.

시험예 15: 피부 주름 개선 효과 확인

생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부주름 개선효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 60명을 대상으로 시험하였다.

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 10에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
대조예	7
비교예 1	36
비교예 2	43
비교예 3	25
비교예 4	19
실시예 1	51

상기 표 10으로부터 확인되는 바와 같이, 제조예 6의 제2혼합추출물을 함유하는 비교예 2의 제형에서 주름개선효과가 비교적 높게 나타났으며, 본 발명의 생약복합추출물을 함유하는 실시예 1에서 가장 높은 주름 개선 효과를 나타내었다.

시험예 16: 피지분비 개선 효과 확인

생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피지분비 개선효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 60명을 대상으로 시험하였다.

피지분비 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 2주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 2부위를 정하고 피부의 피지분비량을 각각 3회에 걸쳐 측정한 후, 2주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 피지분비량 변화를 Sebumeter를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11에 정리하였다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균
대조예	141.8	139.7
비교예 1	144.3	132.1
비교예 2	140.1	128.3
비교예 3	145.5	123.9
비교예 4	147.7	129.6
실시예 1	146.4	120.5

상기 표 11로부터 확인되는 바와 같이, 제조예 9의 제3혼합추출물을 함유하는 비교예 3의 제형에서 피지분비 개선효과가 비교적 높게 나타났으며, 본 발명의 생약복합추출물을 함유하는 실시예 1에서 가장 높은 피지분비 개선 효과를 나타내었다.

시험예 17: 피부 톤 개선 효과 확인

생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 톤 개선효과를 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 60명을 대상으로 시험하였다.

피부 톤 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 피부의 톤을 측정한 후 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 톤 개선도를 색차계를 사용하여 그 효과를 측정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*, a*, b*표색계를 쓰며 본 실험에서는 주로 L*값(명도)을 지표로 하였다. L*값은 검정색(L*=0)으로부터 흰색(L*=100) 까지를 나타내며 4주 후의 ΔL*를 구하여, 그 결과를 하기 표 12에 정리하였다.

구분	ΔL*
대조예	0.47
비교예 1	4.71
비교예 2	3.08
비교예 3	6.42
비교예 4	9.93
실시예 1	11.29

상기 표 12로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조예 11의 제4혼합추출물을 함유하는 비교예 4의 제형에서 피지 톤 개선효과가 비교적 높게 나타났으며, 본 발명의 생약복합추출물을 함유하는 실시예 1에서 가장 높은 피부 톤 개선 효과를 나타내었다.

실시예 2: 유연 화장수

본 발명의 생약복합추출물을 포함한 유연 화장수를 하기의 표 13의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 2
생약복합추출물	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 3: 영양 화장수(밀크로션)

본 발명의 생약복합추출물을 포함한 영양 화장수를 하기의 표 14의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 3
생약복합추출물	2.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (11)

1. 교맥, 동충하초, 모과, 송엽 및 어성초가 1:1:2:1:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 제1혼합추출물; 구기자, 산수유, 지골피, 하고초 및 황련이 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 제2혼합추출물; 길경, 맥문동, 상백피, 오배자 및 의이인이 1:1:1:2:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 제3혼합추출물; 및 감초, 건강, 당귀, 인삼 및 천궁이 1:2:1:1:2의 중량비로 혼합되어 추출되는 제4혼합추출물로 이루어지는 생약복합추출물을 함유하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 유효성분으로서의 상기 생약복합추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대해 0.01~15 중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름 개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피지분비 개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 톤 개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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