KR101961152B1 - 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하는 피부 미백용, 피부 보습용 또는 피부주름 개선용 식품 또는 화장료 조성물 - Google Patents
양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하는 피부 미백용, 피부 보습용 또는 피부주름 개선용 식품 또는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 양태반 식물 복합물을 함유하는 피부 미백용, 피부 보습용 및 피부 주름 개선용 식품 또는 화장료 조성물을 제공하는데, 본 발명의 가자 추출물, 암라 추출물, 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물과 양태반 분말로 조성된 양태반 식물 복합물은 양태반 분말 단일보다 피부 미백 효능, 피부 보습효능 및 피부 주름개선 효능이 더욱 우수하다.
Description
본 발명은 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하는 식품 또는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하여 우수한 피부 미백능, 피부 보습능 및 피부 주름 개선능 발휘하는 식품 또는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적 및 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피, 진피 및 피하조직으로 나누어진다.
사람의 피부색은 주로 피부 세포 속에 들어있는 멜라닌을 함유하는 멜라노좀(melanosome)의 숫자, 크기, 종류 및 분포도에 따라 다르게 나타난다. 멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 더 깊숙이 있는 세포들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주는 역할을 한다. 다만, 이러한 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 자외선 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 기미, 주근깨를 형성하고, 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.
멜라닌 형성과정에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 티로시나제(tyrosinase) 효소로 알려져 있으며, 이 효소는 조직 중에 존재하는 티로신(tyrosine)에 작용하여 도파(dopa)를 생성시키고, 다시 도파퀴논(dopaquinone)을 생성시키며, 이 도파퀴논으로부터 여러 단계의 자동 산화과정을 거쳐 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다.
피부 흑화의 원인과 기작이 밝혀지면서, 피부 흑화 과정에 관여하는 티로시나제(tyrosinase) 활성 저해효과를 갖는 물질들을 화장료에 배합하거나, 멜라닌 생성과정 중의 일부 반응을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 감소시키는 방법이 피부 흑화를 방지하기 위해 일반적으로 사용되고 있다.
이러한 목적으로 사용되고 있는 대표적인 물질로는 알부틴, 아스코르빈산, 히드로퀴논 및 상백피 추출물과 감초 추출물 등의 식물 추출물이 있다. 알부틴의 경우, 우수한 티로시나제 활성 저해작용을 갖는 반면, 화장품에 배합시 변색 및 경시변화에 따른 역가저하 등 안정성에 문제점이 있으며, 피부자극이 커 사용상 한계가 있다. 또한, 아스코르빈산은 티로시나제 활성저해 효과가 낮고, 분자 자체의 안정성이 낮아 멜라닌 생성 억제제로 적합하지 않은 문제가 있다. 또한, 히드로퀴논은 피부에 대한 자극이 높아 안전성 문제로 현재 화장품 배합시에 그 사용성이 제한되는 문제가 있다.
한편, 노화에 관해서는 현재까지도 많은 연구가 진행되고 있지만 다양한 현상과 복합적인 특징으로 인해 아직 정확한 기전은 규명되지 못하고 있다. 다만, 수많은 현상학적 연구를 통해 노화에 관한 몇 가지 가설이 제기되었는데, 그 중 대사과정에서 발생되는 활성산소가 노화의 원인이 된다는 것과 염색체 말단부분에 있는 텔로미어(telomere)가 세포분열을 거듭함에 따라 점차 소실되어 세포분열이 정지되고 결국 사멸에 이른다는 것이 중요하게 받아들여지고 있다(Harman, D., Free radical theory of aging: Role of free radicals in the origination and evolution of life, aging and disease processes, 3-49. Alan R Liss, New York (1986); Harley, C.B., Futcher, A.B., Greider, C.W. Telomeres shorten during aging of human fibroblasts. Nature, 345:458-460, (1990)).
또한, 정상적인 대사과정에서 부수적으로 생성되는 활성산소들은 세포내 산화적 스트레스를 증가시켜 각종 질병 및 노화의 원인이 되는 것으로 잘 알려져 있으며, 염색체를 보호하는 텔로미어의 길이가 짧아지면 더 이상 세포가 분열하지 못하고 정체기에 들어가 노화와 세포사멸에 이른다는 보고도 있다.
한편, 각질세포층에는 천연보습 인자(Natural Moisturizing Factor : NMF) 라고 하는 친수성의 수분 보유능을 가진 물질이 존재하여 피부의 보습에 중요한 역할을 담당한다. 각질세포층의 수분이 10 내지 30% 정도로 유지되면 피부는 매끄럽고 부드러우며, 신체 보호기능을 정상적으로 발휘하게 된다. 하지만, 각질세포층의 수분함량이 10% 이하가 되면 피부는 거칠어지고 신체의 보호기능을 잃게 되어 노화현상이 일어난다. 예를 들어, 건성피부의 경우에는 각질세포의 결집력이 약화되어 피부표면으로부터 비늘조각과 같이 각질세포가 허옇게 벗겨져 나오는 스케일링현상이 나타난다. 이와 같이 피부가 건성화되는 것은 각질세포층의 수분함량이 정상피부에 비해 적기 때문이다. 이외에, 건강한 피부라 할지라도 혹독한 외부환경 즉, 바람, 추운 날씨, 햇빛, 세안, 면도 등에 의해 수분 부족현상이 일어나 피부상태가 나빠지기도 한다.
따라서, 피부 각질세포층의 수분함량을 적절히 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용되었다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기가 3개 이상인 글리세린, 소르비톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느낄 수 있으며, 수산기가 2개인 프로필렌글리콜 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있다. 아미노산, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 보습능력에 한계가 있었다.
또한, 각질층의 수분을 보유할 수 있는 능력은 피지성분과 아미노산, 젖산, 요소 및 무기염 등으로 이루어진 천연보습인자(NMF)에 의해 조절되어 질 수 있는데, 피부 외용제에서 천연보습인자와 같이 안전하면서도 사용성이 우수하고, 보습 효과가 높은 물질을 개발하는 것이 화장품에서 중요한 연구과제 중 하나이다.
한편, 최근에는 화장품의 화학성분으로 인해 부작용이 발생하는 사례가 적지않게 알려지면서, 천연성분을 함유하여 제조되는 화장품에 대한 소비자의 관심이 갈수록 높아지고 있는 실정이다. 이에 따라, 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.
한편, 소득 수준의 향상과 선진국형 라이프 스타일의 변화로 웰빙(well-being)과 로하스(Lifestyles of health and sustainability)에 대한 관심의 증대와 2030년에는 고령인구가 23%를 초과하여 초고령화 사회에 넘어가는 등 매년 증가하여, 이에 따라, 소비자들의 건강을 위한 제품 선호 현상과 아름다운 피부와 아름다움을 유지하고자 하는 현상이 두드러지고 있다. 최근에는 아름다움을 위해 얼굴에 바르는 화장품이 아닌 피부의 체질 자체를 개선하는 먹는 화장품(이너뷰티, inner beauty) 시장의 성장세가 꾸준히 이어지고 있다.
화장품은 바르는 것이라는 고정관념을 깨는 제품들이 속속 출시되면서, 먹는 화장품을 바르는 화장품의 보완재 혹은 피부 미용에 더 효과적인 제품으로 인식하는 소비자들이 늘고 있다. 건강기능식품의 영역에 포함되는 피부 미용 분야는 특히, 다른 건강기능식품(면역, 고혈압, 당뇨, 성기능 등)에 비해 시장성이 큰 것으로 기대되는데 이는 피부 미용을 위한 건강기능 식품 소재는 기능성 화장품 소재로의 개발도 가능하기 때문이다. 10여 년 전인 2002년 국내에 처음 등장하여 2010년을 전후로 급속한 성장을 보이고 있으며, 매년 15%대의 성장률로 2013년엔 건강기능식품 시장의 약 20%인 약 3000억원의 시장을 형성하였다. 이러한 피부건강 기능 식품에 사용되는 소재는 크게 비타민, 무기질, 단백질과 아미노산, 불포화지방산, 식물추출물, 그 외의 기능성 단일물질로 크게 분류할 수 있고, 이들 소재들은 각각의 피부관련 기능 및 효능을 지니고 있다.
본 발명은 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하여 피부 미백, 피부 보습 및 피부주름 개선에 매우 탁월한 효능을 발휘하는 식품 또는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물과 양태반 분말로 조성된 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 복합물은, 바람직하게 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물 20~40중량%와 양태반 분말 60~80중량%로 조성되는 것이 좋다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 피부 미백용인 것이 좋다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 피부 주름개선용인 것이 좋다.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 상기 식품 조성물은, 바람직하게 피부 보습용인 것이 좋다.
한편, 본 발명은 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물과 양태반 분말로 조성된 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 복합물은, 바람직하게 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물 20~40중량%와 양태반 분말 60~80중량%로 조성되는 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 미백용인 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 주름개선용인 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 바람직하게 피부 보습용인 것이 좋다.
본 발명은 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하는 피부 미백용, 피부 보습용 및 피부 주름 개선용 식품 또는 화장료 조성물을 제공하는데, 본 발명의 양태반 분말과 가자 추출물, 암라 추출물, 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물로 조성된 양태반 식물 복합물은 양태반 분말을 단일로 조성한 것보다 피부 미백 효능, 피부 보습효능 및 피부 주름개선 효능이 더욱 우수하다.
도 1은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 멜라닌 감소효과를 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 2는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 3은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 4는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 피부각질세포의 세포 생존율을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 5는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-6 생성량을 확인한 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 6은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-1β 생성량을 확인한 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 7은 양태반 분말과 식물 복합물의 멜라닌 감소효과를 측정하기 위한 쥐의 등조직 사진이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 8은 쥐의 등조직에 Fontana-Masson염색을 하여 멜라닌 합성정도를 나타낸 사진이다. (A)는 정상대조군, (B)는 자외선 조사군, (C)는 양태반 분말 섭취군, (D)는 양태반 가자 복합물, (E)는 양태반 암라 복합물, (F)는 양태반 구아바 복합물을 나타낸다.
도 9의 (a)는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이고, 도 9의 (b)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스)을 통해 측정한 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 10의 (a)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스) 통해 UVB처리에 의한 MMP-9의 유전자변화량을 측정한 결과 그래프이고, 도 10의 (b)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스)을 통해 측정한 UVB처리에 의해 MAPK8의 유전자 변화량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 11은 실험동물(hairless HRM-2 마우스)의 등조직에 UVB조사한 후, H&E 염색하여 표피와 진피의 변화를 관찰한 사진이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 2는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 3은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 4는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 피부각질세포의 세포 생존율을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 5는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-6 생성량을 확인한 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 6은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-1β 생성량을 확인한 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 7은 양태반 분말과 식물 복합물의 멜라닌 감소효과를 측정하기 위한 쥐의 등조직 사진이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 8은 쥐의 등조직에 Fontana-Masson염색을 하여 멜라닌 합성정도를 나타낸 사진이다. (A)는 정상대조군, (B)는 자외선 조사군, (C)는 양태반 분말 섭취군, (D)는 양태반 가자 복합물, (E)는 양태반 암라 복합물, (F)는 양태반 구아바 복합물을 나타낸다.
도 9의 (a)는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이고, 도 9의 (b)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스)을 통해 측정한 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 10의 (a)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스) 통해 UVB처리에 의한 MMP-9의 유전자변화량을 측정한 결과 그래프이고, 도 10의 (b)는 실험동물(hairless HRM-2 마우스)을 통해 측정한 UVB처리에 의해 MAPK8의 유전자 변화량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
도 11은 실험동물(hairless HRM-2 마우스)의 등조직에 UVB조사한 후, H&E 염색하여 표피와 진피의 변화를 관찰한 사진이다. 'NC'는 정상대조군(Nomal control), 'C'는 자외선 조사군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
본 발명은 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물과 양태반 분말로 조성된 복합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 양태반은 양의 태반으로 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산, 비타민 등 피부 미용에 유용한 성분들이 다량 함유되어 있으며, 피부 세포를 건강하게 유지해주는 기능이 있어 최근 화장품 소재로 각광받고 있다. 하지만, 아직까지 양태반 분말과 식물 소재를 함께 조성하여 양태반 분말 단일보다 더욱 우수한 피부 개선효과를 발휘하는 복합물에 대한 연구는 거의 없었다. 본 발명에서는 상기와 같은 특징이 있는 양태반을 분말화하여 사용한다.
본 발명에서 사용하는 가자나무열매는 사군자과(Combfreetaceae)에 속하는 가자나무(Terminalia chebula Retz.)의 성숙한 열매이다. 이를 말린 가자(訶子, medicinal Terminalia fruit)는 가려늑, 가리늑, 수풍자, 가리, 가려라고 해서 아시아에서 약용으로 사용되고 있다. 한의학에서는 삽한 맛과 온한약성을 가지며 수렴, 지혈, 만성 후두염, 후두결핵, 장출혈, 만성자궁염, 이질 등의 치료에 많이 쓰이고 있다. 가자나무열매추출물은 항암활성, 항당뇨활성, 항돌연변이활성, 항균활성, 충치 예방효과 등 다양한 생리활성을 가지고 있음이 알려져 있다(J. Ethnopharmacol. 2002. 81:327-336; Food Chem. Toxicol. 2002.40:527-534; Int. J. Antimicrob. Ag. 2001. 18:85-88).
또한, 가자나무열매는 인도 고대 의학서인 아유르베다 의학에서도 매우 중요하게 다루어지는 식물이다. 맛은 쓰고 시고 떫으며 짜고 달고, 성질은 따뜻하여, 아유르베다의 6가지 맛 중 5가지를 포함하고 있는데 그 중 특히 쓴맛을 지니고 있다. 또한, 인도에서 널리 사용되는 약재인 트리팔라(Triphala)의 세가지 성분 중 하나로서 하리타키(Haritaki)라 불리며, 하제로서의 효능이 가장 강한 것으로 알려져 있다. 열매, 잎, 줄기를 모두 약재로 이용하나 주로 가을에 성숙한 과실을 채취하여 말려 사용한다. 한방에서 가자는 장청과라 하여 인후염, 폐렴 등에 쓰는데, 얼굴과 가슴에 있는 기를 내리며, 오래된 담을 삭히고, 소화를 돕고 설사를 멎게 한다. 열매를 그대로 복용하거나 밀기울에 볶거나 술에 담갔다가 쪄서 살만 발라 약한 불에 말려 쓰기도 한다(경전 속 불교식물. 2011.5.9. 이담북스).
그리고, 가자에는 항산화, 항균, 상처치료 등의 효능을 가진 것으로 알려진 탄닌(tannins), 엘라그산(ellagic acid), 푸니칼라진(punicalagin), 플라보노이드(flavonoids), 갈산(gallic acid), 케불린산(chebulinic acid), 케불라그산(chebulagic acid) 등이 함유되어 있다(Inter. J. Fres. Pharm. Biomed. Sci.2012. 3(2):679-683).
본 발명에서 사용하는 암라( Phyllanthus emblica Linn.)는 일반적으로 인디안 구스베리로 알려져 있는 대극과 낙엽교목이다. 중국, 인도, 인도네시아, 대만 등 열대·아열대기후 국가에 널리 분포되어 있으며, 비타민 C, 미네랄, 아미노산, 탄닌, 필램블릭산, 루틴, 커큐미노이드, 엠블리콜, 페놀릭 화합물들을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다 (Zhang YJ et al., J Nat Prod, 63: 1507-1510, 2000). 암라는 오렌지보다 20배 많은 비타민 C를 함유하고 있는데, 열에 대단히 안정적이어서 고온에 장시간 노출되어 있더라도 나무에서 갓 수확했을 때처럼 비타민이 거의 파괴되지 않는다. 암라의 비타민 C 내구성 및 내열성은 함께 들어있는 탄닌 성분에서 비롯된 것으로 여겨지는데, 암라 열매 추출물의 항산화, 항종양, 항염증 활성은 고함유 비타민 C와 폴리페놀 성분들의 향으로 알려져 있다 (Scartezzini P et al., J Ethnopharmacology, 104: 113-118, 2006).
또한, 본 발명에서 사용하는 구아바( Psidium guajava )는 아메리카 열대지방이 원산지인 재배식물로 아열대지방까지 널리 전파되어 열대 및 아열대 나라의 주된 음식이자 항염증, 항경련, 설사, 이질, 위장 및 호흡장애 등의 민간 의약품으로 사용되어 왔다. 구아바에는 식이섬유와 엽산, 비타민 A, 비타민 C 등의 양성분이 풍부한 것으로 알려져 있으며, 구아바 잎에는 (+)-갈로카테킨, 류코시아니딘 등의 폴리페놀 성분들과 구리, 셀레늄, 아연 등과 같은 미네랄 성분이 풍부하며, 특히 아연이 2% 이상 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있다 (Seshadri TR et al., Phytochemistry, 4:989-992, 1965).
본 발명에서는 상기 가자, 암라, 구아바 추출물을 사용하는데, 상기 가자나무열매추출물, 암라추출물 및 구아바추출물은 물 또는 탄소수가 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출 용매로 하여 추출된 것이 좋다. 또한, 가자나무열매추출물, 암라추출물 및 구아바 추출물의 추출방법으로써 일 예로, 열수 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출 또는 초음파 추출을 이용하여 추출된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 추출물은 추출 후 여과하여 감압 농축 또는 진공 농축하여 수득된 농축물을 포함하며, 동결 건조 또는 열풍 건조하여 수득된 분말 형태일 수 있다.
한편, 본 발명에서는 종래에 피부 개선 효과가 있다고 알려진 양태반 분말을 활용하여 더욱 우수한 피부 개선 효과를 발휘하는 소재를 개발하고자 양태반 분말과 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물을 조성하여 양태반 식물 복합물을 제조하였다. 본 실험예 의하면, 양태반 분말과 가자 추출물로 조성된 복합물('양태반 가자 복합물'), 양태반 분말과 암라 추출물로 조성된 복합물('양태반 암라 복합물'), 양태반 분말과 구아바 추출물로 조성된 복합물 ('양태반 구아바 복합물')은 양태반 분말 단일보다 더욱 증진된 피부 개선능을 발휘함을 확인할 수 있었다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 실험예에 의하면, 본 발명의 양태반 분말과 식물의 복합물은 양태반 분말 단일보다 멜라닌 함량 감소 효과가 우수하여 피부의 색소 생성을 억제하여 더욱 우수한 피부 미백효과를 발휘함을 알 수 있었다.
한편, 히알루론산은 수분과 결합하여 피부장벽기능 조절과 세포외 기질을 수화시켜 조직 내 수분의 항상성을 유지시키는 것으로 알려져 있는데, 프로콜라겐은 콜라겐의 구성성분이며 피부의 보습으로 인한 결합력 및 탄력성에 연관이 있다. 본 발명의 양태반 식물 복합물은 양태반 분말 단일보다 히알루론산을 합성하는 효소인 HAS2 유전자 및 프로콜라겐의 발현량을 더욱 증가시켜 더욱 우수한 피부 보습 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
한편, 자외선으로 인해 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β은 피부의 탄력을 감소시키는데, 본 발명의 양태반 식물 복합물은 양태반 분말 단일보다 피부 세포 보호효과가 우수하며, IL-6, IL-1β 생성량을 감소시켜 더욱 우수한 피부 주름 개선 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
한편, 본 발명의 식품 또는 화장료 조성물에 있어서, 상기 복합물은, 바람직하게 가자 추출물, 암라 추출물 및 구아바 추출물 중 선택되는 어느 하나의 추출물 20~40중량%과 양태반 분말 60~80중량%로 조성되는 것이 좋다. 상기 중량%의 범위로 조성될 경우 더욱 우수한 피부 개선효과를 발휘할 수 있기 때문이다.
한편, 본 발명의 식품 조성물은, 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반 음료, 젤리, 면류, 검류, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 식품 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형체 및 희석제는 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케니트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 톨리돈, 물, 꿀, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤저에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 일 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중검제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에도 천연 과일 쥬스 및 과일 음료 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 제형은 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 '양태반 분말과 식물의 복합물' 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
한편, 본 발명의 실험은 사회과학을 위한 통계 패키지 (Statistical package for social science version 23.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 사용하였다. 각 실험군의 측정 항목의 결과는 평균±표준편차 (mean±SD)로 표시하였으며, 실험군 간 평균 차이를 one-way ANOVA로 확인한 후 그룹 간의 통계적 유의성을 던컨의 다중검정 (Duncan's multiple range test)을 실시하였다. 실험군 간에 유의성을 p<0.05 수준에서 검정하였다.
[실시예 1: 양태반 분말의 제조]
냉동된 양태반 1 kg을 파편으로 잘게 절단하고 가염과 가온 후 발생한 액체층을 제거한 고형물만을 110℃에서 3시간 동안 건조시킨 후 조분쇄하였다. 최종물의 5%(w/w)가 되도록 말토덱스트린의 첨가 및 미세분쇄 후 살균공정을 거쳐 양태반 분말을 제조하였다.
[실시예 2: 양태반 가자 복합물의 제조]
건조된 가자나무열매 1 kg을 집기병에 담은 후 물 5 L를 넣고 40℃에서 3시간 추출하였다. 그 후, 10 mesh의 거름망으로 거른 다음, 최종 분말의 10%가 되도록 말토덱스트린을 첨가한 후 분무 건조하여 본 발명에서 사용할 가자나무열매추출분말을 제조하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 제조된 양태반 분말과 가자 추출물을 7 : 3의 중량비로 혼합하여 양태반 가자 복합물을 제조하였다.
[실시예 3: 양태반 암라 복합물의 제조]
암라 열매 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후 물 3 L를 넣고 60℃에서 6시간으로 3회 반복 추출하여 암라열매추출물을 수득하였다. 그 후, 여과지(whatman No.1, England)로 감압 여과한 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압 농축한 다음, 분무 건조하여, 본 발명에서 사용할 암라추출분말을 제조하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 제조된 양태반 분말과 암라 추출물을 7 : 3의 중량비로 혼합하여 양태반 암라 복합물을 제조하였다.
[실시예 4: 양태반 구아바 복합물의 제조]
구아바 잎 1 kg을 건조 후, 마쇄하여 얻은 분말 300 g을 집기병에 담은 후 물 3 L를 넣고 90℃에서 열수 추출하여 구아바 잎 추출물을 수득하였다. 그 후, 진공회전농축기로 60℃에서 감압 농축한 다음, 분무건조하여 본 발명에서 사용할 구아바 잎 추출분말을 제조하였다. 그 후, 상기 실시예 1에서 제조된 양태반 분말과 구아바 추출물을 7 : 3의 중량비로 혼합하여 양태반 구아바 복합물을 제조하였다.
[실험예 1: 양태반 분말, 양태반 식물 복합물의 피부 미백효과 확인-멜라닌 생성 억제능 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 양태반 분말(P), 상기 실시예 2에서 제조한 양태반 가자 복합물(PZ), 실시예 3에서 제조한 양태반 암라 복합물(PA), 상기 실시예 4에서 제조한 양태반 구아바 복합물(PG)의 피부 미백효과를 확인하고자 B16F10 멜라닌 생성 세포 내의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다.
본 실험예에서 사용된 B16F10은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Cultured Collection, ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 실험하였다. 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/mL가 함유된 하이 글루코스 둘베코수정이글배지 (High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium)를 사용하였고, 37℃, 5% 이산화탄소 (CO2), 95% 습한 공기 (humid air)로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다.
B16F10 세포를 배양하여 웰 플레이트 (24 well plate)에 5×104 cells/well에 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 분화시약인 3-이소부틸-1-메틸산틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 250 μM 투여하여 멜라닌 생성을 유도하였다. 그 다음, 각 웰에 양태반 분말(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)을 200 ㎍/mL 농도로 분화시약과 투여하여 72시간 배양하였으며, 24시간마다 배지를 교체하였다. 72시간 배양한 후, 각 웰을 둘베코 인산완충생리식염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS)로 세척하고 CelLyticTM MT 세포 분쇄 리간드 버퍼 (Cell lysis reagent buffer, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 125 ㎕를 분주하여 세포를 분리하였다. 그 후, 새로운 튜브에 옮겨 원심분리(14000 rpm, 4℃, 10분)하였다. 상층액을 분리하여 브래드퍼드 염색 리간드(Bradford Dye Reagent)로 단백질을 정량하고, 세포에 1N 수산화 나트륨 (NaOH)에 10% 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)가 함유된 용액을 300 ㎕를 첨가하여 100℃에서 10분 동안 용해시켜 ELISA 리더 (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
멜라닌 생성 억제능 측정 결과, IBMX 처리에 의해 멜라닌 생성을 유도한 대조군에서 높은 멜라닌 함량이 확인되었고, 양태반 분말(P)을 처리했을 때 대조군과 비교하여 멜라닌 함량이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)은 양태반 분말(P)보다 멜라닌 함량 감소 효과가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 1).
이러한 결과로부터, 양태반 분말 단일보다 양태반 식물 복합물이 더욱 우수한 피부 미백 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
도 1은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 멜라닌 감소효과를 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
[실험예 2: 양태반 분말, 양태반 식물 복합물의 피부 보습효과 확인-히알루론산 합성 효소(Hyaluronic acid synthesis 2, HAS2) 유전자 발현량 및 프로콜라겐(Procollagen) 유전자 발현량 확인]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 양태반 분말(P), 상기 실시예 2에서 제조한 양태반 가자 복합물(PZ), 실시예 3에서 제조한 양태반 암라 복합물(PA), 상기 실시예 4에서 제조한 양태반 구아바 복합물(PG)의 피부 보습효과를 확인하고자 히알루론산 합성 효소(Hyaluronic acid synthesis 2, HAS2) 유전자 발현량 및 프로콜라겐(Procollagen) 유전자 발현량을 확인하였다.
본 실험에 사용된 피부각질세포(HaCaT)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Cultured Collection, ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 실험하였다. 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/mL이 함유된 하이 글루코스 둘베코수정이글배지 (High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium)를 사용하였고 37℃, 5% 이산화탄소 CO2, 95% 습한 공기 (humid air)로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다.
인간 각질형성세포주 (HaCaT)를 배양하여 6 well plate에 1×106 cells/well 분주한 후 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척하고 UVB lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사한 후 양태반 분말(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)을 200 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양한 HaCaT 세포의 RNA 추출은 RNeasy 미니 키트 (RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 추출하였다. iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 합성하였다.
유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 Real-Time PCR (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)을 이용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머(primer)의 염기서열은 다음과 같았다. GAPDH forward primer 5'-CCCCACACACATGCACTTACC-3', reverse primer 5'-TTGCCAAGTTGCCTGTCCTT-3'; HAS2 forward primer 5'-CAGGCGGAGTATGAGATAA-3', reverse primer 5'-AAGACTCAGCAGAACCCAGGAA-3'; procollagen forward primer 5'-TCACTGTCTGTTCCTCT C-3', reverse primer 5'-CCTACTTACTCTTGCTCCA-3'. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2X SYBR mix, 2 μL cDNA, 1 μL씩 프라이머 (primer) 각각 100 pmol/μL를 첨가하였고 나머지 볼륨은 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)로 채워주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭은 40 사이클을 실시하였다.
한편, 핫스타트 (Hot start)를 위해 95℃에서 10분, 변성 (Denaturation)을 95℃에서 15초, 어닐링 (annealing)을 52℃에서 30초, 익스텐션 (extension)을 72℃에서 30초간 반복하며 각 사이클 (cycle)의 익스텐션 (extension) 후에 값이 기록되었다. 모든 사이클이 완료된 후 프라이머 (primer)의 특이성을 확인하기 위해 용융곡선 (melting curve) 분석을 실시하였다. mRNA의 상대적인 함량은 자외선 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타내었다.
히알루론산 합성 효소(Hyaluronic acid synthesis 2, HAS2) 유전자 발현량 측정 결과, UVB 처리에 의해 감소된 HAS2 유전자 발현량이 양태반 분말(P) 처리에 의해 UVB를 처리하지 않았을 때만큼 발현량이 증가하였다. 또한, 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 추출물(PA), 양태반 구아바 추출물(PG)은 양태반 분말(P)보다 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량 증가가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 2).
또한, 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과, UVB 처리에 의해 감소된 프로콜라겐 유전자 발현량이 양태반 분말(P) 처리에 의해 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)은 양태반 분말(P)보다 프로콜라겐 유전자 발현량 증가가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 3).
도 2는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 히알루론산 합성 효소 (HAS2) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이고, 도 3은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 프로콜라겐 (procollagen) 유전자 발현량을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)을 의미한다.
이러한 결과로부터, 양태반 분말 단일보다 양태반 식물 복합물이 더욱 우수한 피부 보습 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
[실험예 3: 양태반 분말, 양태반 식물 복합물의 피부 주름 개선효과 확인-UVB 자외선 조사 후 세포 생존율 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 양태반 분말(P), 상기 실시예 2에서 제조한 양태반 가자 복합물(PZ), 실시예 3에서 제조한 양태반 암라 복합물(PA), 상기 실시예 4에서 제조한 양태반 구아바 복합물(PG)의 피부 주름 개선효과를 확인하고자 세포 생존율을 측정하였다.
본 실험에 사용된 피부각질세포(HaCaT)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Cultured Collection, ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 실험하였다. 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/mL이 함유된 하이 글루코스 둘베코수정이글배지 (High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium)를 사용하였고 37℃, 5% 이산화탄소 CO2, 95% 습한 공기 (humid air)로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다.
피부각질세포 (HaCaT)를 배양하여 웰플레이트 (96 well plate)에 1×104 cells/well 분주한 후 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후, 둘베코인산완충생리식염수 (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS)로 세척하고 UVB lamp(5 Sankyo Denki G5T5 lamps, Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 50 mJ/cm2 조사한 후 양태반 분말(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)을 200 ㎍/mL 농도로 처리하였다.
24시간 동안 배양시킨 후 세포 생존율을 측정하기 위하여 디메틸 티아졸(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2), 디페닐테트라졸리윰 브롬화물 (5-diphenyl-tetrazolium bromide) (MTT)를 수행하였고 자외선에 의한 변화를 관찰하였다. MTT 용액(500 ㎍/mL)을 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. 배양한 후, 배지를 제거하고 다이메틸설폭시화물 (dimethyl sulfoxide, DMSO) 200 ㎕를 첨가하여 배양기에서 용해시켰으며 ELISA 리더 (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정결과, UVB 처리에 의해 피부각질세포의 세포 생존율이 감소하였고, 양태반 분말 처리에 의해 세포 생존율이 증가하였다. 또한, 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)은 양태반 분말(P)보다 세포 생존율 증가가 더욱 우수함을 확인할 수 있었다 (도 4).
도 4는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 피부각질세포의 세포 생존율을 측정한 결과 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
이러한 결과로부터, 양태반 분말 단일보다 양태반 식물 복합물이 더욱 우수한 피부 주름 개선 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
[실험예 4: 양태반 분말, 양태반 식물 복합물의 피부 주름 개선효과 확인-인터루킨-6 및 인터루킨-1β 분비량 측정]
본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 양태반 분말(P), 상기 실시예 2에서 제조한 양태반 가자 복합물(PZ), 실시예 3에서 제조한 양태반 암라 복합물(PA), 상기 실시예 4에서 제조한 양태반 구아바 복합물(PG)의 피부 주름 개선효과를 확인하고자 인터루킨-6 및 인터루킨-1β 분비량을 측정하였다.
본 실험에 사용된 피부각질세포(HaCaT)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Cultured Collection, ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 실험하였다. 10% 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 100 units/mL이 함유된 하이 글루코스 둘베코수정이글배지 (High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium)를 사용하였고 37℃, 5% 이산화탄소 CO2, 95% 습한 공기 (humid air)로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다.
사이토카인 IL-6, IL-1β를 측정하기 위해 Duoset ELISA 키트 (R&D system, USA)를 이용하였다. 96 웰 플레이트(well plate)에 포획 항체(Capture Antibody)를 PBS로 희석 후 100 μL 분주하여 오버나이트(overnight) 하였다. 그 후, 세척완충액(0.05% tween 20 in PBS)으로 3번 씻어낸 후 블락킹 버퍼(blocking buffer)를 300 μL 분주하여 1시간 동안 상온에서 처리하였다. 그 후, 세척완충액으로 3번 씻어낸 후 표준곡선을 그리기 위한 용액과 HaCaT 세포의 상층액 100 ㎕를 분주하여 2시간 동안 상온에서 처리하였다. 세척완충액으로 3번 씻어낸 후 검출 항체 (etection antibody)를 희석된 시약 (Reagent diluent; 1% Bovine Serum Albumin in PBS)로 희석하여 100 μL 분주하여 2시간 동안 상온에서 처리하였다. 세척완충액으로 3번 씻어낸 후 SAv-HRP'를 희석시켜 준비한 후 100 ㎕씩 분주하고, 30분 동안 처리하였다. 처리 후, 세척완충액을 이용해 3번 씻어내고, 발색을 도와주는 기질(substrate)시약을 100 μL씩 넣어 반응시킨 후, ELISA 리더 (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 655 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선(standard curve)을 이용해 세포에서 생성된 사이토카인의 양을 계산하였다.
IL-6, IL-1β의 분비량 측정결과, UVB 처리에 의해 사이토카인 IL-6, IL-1β의 생성이 증가되었으나, 양태반 분말 처리에 의해 그 양이 감소된 것을 확인하였다. 또한, 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)은 양태반 분말(P)보다 IL-6, IL-1β의 생성량이 더욱 감소됨을 확인할 수 있었다 (도 5 및 도 6).
이러한 결과로부터, 양태반 분말 단일보다 양태반 식물 복합물이 더욱 우수한 피부 주름 개선 효과를 발휘함을 알 수 있었다.
도 5는 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-6 생성량을 확인한 그래프이고, 도 6은 양태반 분말과 양태반 식물 복합물의 IL-1β 생성량을 확인한 그래프이다. 'NC'는 정상군(Nomal control), 'C'는 대조군(Control), 'P'는 양태반 분말(Placenta), 'PZ'는 양태반 가자 복합물(Placenta+Gaza), 'PA'는 양태반 암라 복합물(Placenta+Amla), 'PG'는 양태반 구아바 복합물(Placenta+Guava)를 의미한다.
[실험예 5: 실험 동물 처리 및 식이 조성]
본 실험에서는 ㈜새론바이오(Uiwang-si, Korea)에서 20 g 내외의 4주령 수컷 hairless HRM-2 마우스를 공급받았다. 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23℃, 상대습도는 50%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 적응기간 동안 AIN-93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 체중을 측정하여 평균체중에 가까운 개체를 무작위 법으로 6마리씩 6군으로 분리하였다. 실험동물은 12시간 절식 시킨 후 마취시켜 개복하여 복대동맥을 통해 채혈하였다. 채혈 전 주사기와 튜브(tube)에 10% EDTA 용액을 충분히 적셔 혈액응고를 방지하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(KHUASP(GC)-17-032).
본 실험에서 사용한 양태반 분말의 농도는 진행 중인 양태반 분말의 임상실험 농도인 500 mg/day를 기준으로 하였을 때, 성인기준 용량에 마우스 컨버젼 팩터(mouse conversion factor) (12.33)을 계산한 값인 100 mg/kg b.w. 동물실험 농도로 진행하였다. AIN-93G 식이를 기본으로 하여 각 군당 시료를 첨가하여 식이를 제작하여 6주간 제공하였다. 본 실험에서 사용한 마우스 식이 조성은 하기 표 1에 나타내었다.
정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)을 의미한다.
| Experimental design animals (n=6/group) | ||
| Groups | UVB | Dietary administration |
| NC | - | AIN 93G diet |
| C | + | AIN 93G diet |
| P | + | AIN 93G diet + Placenta 100 mg/kg b.w. |
| PZ | + | AIN 93G diet + (Placenta:Gaza=7:3) 100 mg/kg b.w. |
| PA | + | AIN 93G diet + (Placenta:Amla=7:3) 100 mg/kg b.w. |
| PG | + | AIN 93G die + (Placenta:Guava=7:3) 100 mg/kg b.w. |
[실험예 6: 실험동물의 체중변화와 식이효율 결과]
상기 실험예 5에서 제조한 양태반 단일물 및 복합물을 식이로 투여한 마우스의 체중변화와 식이효율 결과를 측정하였다. 정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)을 의미한다.
| 그룹 | 체중 증가량 (g) | 식이 섭취량 (g) | FER |
| NC | 5.25±0.52a | 3.75±0.47ns | 4.69±0.35a |
| C | 3.86±0.98b | 3.96±0.60 | 2.91±0.66b |
| P | 4.07±0.75ab | 3.78±0.42 | 3.53±0.65ab |
| PZ | 3.51±1.11b | 3.88±0.45 |
3.05±0.97b |
| PA | 3.45±1.31b | 3.83±0.39 |
3.26±1.30b |
| PG | 4.10±0.63ab |
3.77±0.62 |
3.56±0.55ab |
양태반 분말을 식이로 투여한 후 체중변화와 식이효율을 확인한 결과, 상기 표 2에서 보듯이, 체중증가량 및 식이효율(FER)은 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)에서 유의적으로 감소하였음을 확인하였지만 군간의 유의적 차이는 없었다. 식이섭취량의 결과, 정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG) 모든 군에서 군간 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
[실험예 7: 실험 동물의 피부미백 효능]
상기 실험예 5에서 확립한 정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)로 구성된 마우스 그룹을 피부미백 효능을 알아보기 위하여 실험하였다.
자외선 조사는 UVB 램프(5 Sankyo Denky G5T5 lamps,Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 최소 홍반량(minimal erythromal dose, MED)을 150 mJ/cm2으로하여 1주일에 3회씩 마우스의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED (150 mJ/cm2), 2주는 2MED (300 mJ/cm2), 3주는 3MED (450 mJ/cm2), 4주부터 6주까지 4MED (600 mJ/cm2) 로 조사하여 멜라닌 합성을 유도하였다. 6주의 시험 종료 후 각 군의 시험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.
조직 준비를 위해 마우스를 희생시킨 후 등 쪽 피부를 떼어내어 필터페이퍼(filter paper)에 편평하게 부착한 후, 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용해 4 μm의 두께로 절단한 다음, 폴리라이신(polylysine)으로 코팅(coating)된 슬라이드(slide)에 붙였다. 조직절편은 자일렌(xylene)을 이용하여 파라핀(paraffin)을 제거하고 알코올(alcohol)과 증류수로 10분간 함수시켜 증류수로 세척한 후, 피부조직의 멜라닌(melanin)의 합성 정도를 파악하기 위해 멜라닌 색소(melanin pigment) 염색법인 'Fontana Masson Staining'염색을 실시하였다.
본 연구는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 22 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 Duncan’multiple range test를 실시하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
실험결과, 도 7에서 보듯이, 자외선이 표피층에 조사되면 직접적인 방법과 간접적인 방법으로 멜라닌이 합성되는데, 자외선 조사에 의해 세포내 cAMP가 증가하여 L-티로신(L-tyrosine)에서 L-DOPA로 가는 기전을 촉진하고 티로시나아제(tyrosinase)활성이 증가하여 멜라닌생성세포가 멜라닌 합성을 증가하게 된다.
자외선을 조사하지 않은 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)은 육안으로 확인 하였을때, 멜라닌 합성이 진행되어 피부가 거칠어 보이고 등조직이 어둡게 변한 것을 확인할 수 있었다. 자외선조사군(C)에 비해 양태반 분말을 섭취한 군(P)에서 등조직이 덜 어둡게 변했다는 것을 확인 할 수 있었으며, 양태반 단일물보다 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)에서 멜라닌 감소효과가 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
한편, 자외선에 의해 멜라닌 합성이 증가되면서 표피에 존재하는 각질형성세포에서 α-MSH를 분비하여 멜라닌생성세포로 신호전달하여 멜라닌합성이 진행된다고 알려져 있다. 멜라닌은 'Fontana-Masson'염색법에 의해 염색이 가능하다. 정상 피부표피 또는 표피 바닥층에 한줄로 배열되어 있는 기저층의 세포질 내에서 과립형태의 멜라닌이 흑갈색으로 관찰된다. 이러한 조직변화를 관찰하기 위해 등 부위의 피부조직을 'Fontana-Masson'염색을 하여 멜라닌 합성정도의 변화를 관찰하였다.
도 8에서 보듯이, 정상대조군(A)에서는 멜라닌 색소를 찾을 수가 없었으며, 자외선 조사군(B)에서는 화살표로 표시한 것과 같이 군집형태로 염색된 멜라닌을 확인할 수 있었다. 자외선 조사군(B)에 비해 양태반 분말 섭취군(C)에서 멜라닌의 군집형태가 감소하였음을 육안으로도 확인 할 수 있었으며, 양태반 단일물보다 양태반 가자 복합물(D), 양태반 암라 복합물(E), 양태반 구아바 복합물(F)에서 멜라닌 감소효과가 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
[실험예 8: 실험 동물의 피부보습 효능]
상기 실험예 5에서 확립한 정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)로 구성된 마우스 그룹의 피부보습 효능을 알아보기 위하여 프로콜라겐(Procollagen)의 유전자 발현량 및 HAS2의 유전자 발현량을 확인하기 위한 실험을 하기와 같이 수행하였다.
자외선 조사는 UVB 램프(5 Sankyo Denky G5T5 lamps,Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 최소 홍반량(minimal erythromal dose, MED)을 150 mJ/cm2으로하여 1주일에 3회씩 마우스의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED (150 mJ/cm2), 2주는 2MED (300 mJ/cm2), 3주는 3MED (450 mJ/cm2), 4주부터 6주까지 4MED (600 mJ/cm2)로 조사하여 보습저하를 유도하였다. 6주의 시험 종료 후 각 군의 시험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.
피부조직으로부터 총 RNA의 추출은 TRIzolⓡ(Life Technologies, Inc., Rockville, MD, USA)의 제조사에서 제공하는 방법을 이용하여 추출하였다. cDNA 합성은 각 시료에 대하여 1 μL의 RNA를 이용하여 'iScript cDNA Synthesis kit' (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 'SYBR Green' (iQSYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR(real time quantitative PCR)을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 모든 유전자의 PCR산물의 크기는 100 bp 내외로 하였고, Tm (melting temperature)값도 54℃ 부근으로 디자인하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머의 염기서열은 하기 표 3에 표시하였다.
Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2X SYBR mix, 2 μL cDNA, 1 μL씩 프라이머 각각 100 pmol/μL를 첨가하였고 나머지 볼륨은 뉴클레아제프리워터(nuclease free water)로 채워주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 사이클(cycle)은 40 사이클(cycle)을 실시하였다. 핫스타트(Hot start)를 위해 95 ℃에서 10분, 변성(Denaturation)을 95 ℃에서 15초, 어닐링(annealing)을 52 ℃에서 30초, 익스텐션(extension)을 72 ℃에서 30초간 반복하며 각 사이클(cycle)의 익스텐션(extension) 후에 값이 기록되었다. 모든 사이클(cycle)이 완료된 후, 프라이머(primer)의 특이성을 확인하기 위해 멜팅커브(melting curve) 분석을 실시하였다. mRNA의 상대적인 함량은 자외선 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타내었다.
| Primer set sequence used for Real-Time PCR | ||
| Sequence Name |
Forward Sequence | Reverse Sequence |
| GAPDH | CATGGCCTTCCGTGTTCCTA | GCGGCACGTCAGATCCA |
| Prcollagen Type I | TTACGTGGCAAGTGAGGGTTT | TGTCCAGATGCACTTCTTGTTTG |
| HAS2 | TGGCTGTGTCCAGTGCATAAG | CACAAATTCATGCAGCAAGGA |
본 연구는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 22 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 Duncan’multiple range test를 실시하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
프로콜라겐(Procollagen)의 유전자 발현량 확인 결과, 도 9의 (a)에서 보듯이, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)에서 유의적으로 발현량이 감소하였으며, 양태반 분말 섭취에 의해 발현량이 증가되었다. 또한, 양태반 가자 복합물, 양태반 암라 복합물, 양태반 구아바 복합물의 경우 모두 양태반 단일물 보다 프로콜라겐(procollagen) 발현량 증가가 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
HAS2의 유전자 발현량 확인 결과, 도 9의 (b)에서 보듯이, UVB 처리에 의해 감소된 HAS2 발현량이 양태반 분말 섭취군에서 증가되었다. 또한 양태반 가자 복합물, 양태반 암라 복합물, 양태반 구아바 복합물의 경우 모두 양태반 단일물 보다 HAS2 발현량 증가가 더욱 우수한 것으로 확인 되었다.
[실험예 9: 실험 동물의 피부주름 효능]
상기 실험예 5에서 확립한 정상대조군(NC), 자외선 조사군(C), 양태반 단일물 섭취군(P), 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)로 구성된 마우스 그룹을 피부주름 효능을 알아보기 위하여 MMP9 유전자 및 MAPK8 유전자의 발현량 변화를 확인하는 실험하였다.
자외선 조사는 UVB 램프(5 Sankyo Denky G5T5 lamps,Sankyo Denki Co., Yokohama, Japan)를 이용하여 최소 홍반량(minimal erythromal dose, MED)을 150 mJ/cm2으로하여 1주일에 3회씩 마우스의 등 부위에 조사하였으며, 1주는 1MED (150 mJ/cm2), 2주는 2MED (300 mJ/cm2), 3주는 3MED (450 mJ/cm2), 4주부터 6주까지 4MED (600 mJ/cm2) 로 조사하여 주름생성을 유도하였다. 6주의 시험 종료 후 각 군의 시험동물을 희생시켜 혈액과 피부 조직을 얻었다.
피부조직으로부터 총 RNA의 추출은 TRIzolⓡ(Life Technologies, Inc., Rockville, MD, USA)의 제조사에서 제공하는 방법을 이용하여 추출하였다. cDNA 합성은 각 시료에 대하여 1 μL의 RNA를 이용하여 'iScript cDNA Synthesis kit' (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 'SYBR Green' (iQSYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR(real time quantitative PCR)을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 모든 유전자의 PCR산물의 크기는 100 bp 내외로 하였고, Tm (melting temperature)값도 54℃ 부근으로 디자인하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머의 염기서열은 하기 표 4에 표시하였다. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 10 μL의 2X SYBR mix, 2 μL cDNA, 1 μL씩 프라이머 각각 100 pmol/μL를 첨가하였고 나머지 볼륨은 뉴클레아제프리워터(nuclease free water)로 채워주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 사이클(cycle)은 40 사이클(cycle)을 실시하였다. 핫스타트(Hot start)를 위해 95 ℃에서 10분, 변성(denaturation)을 95 ℃에서 15초, 어닐링(annealing)을 52 ℃에서 30초, 익스텐션(extension)을 72 ℃에서 30초간 반복하며 각 사이클(cycle)의 익스텐션(extension) 후에 값이 기록되었다. 모든 사이클(cycle)이 완료된 후 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 멜팅커브(melting curve) 분석을 실시하였다. mRNA의 상대적인 함량은 자외선 처리를 하지 않은 군에 대한 상대적인 양으로 나타내었다.
| Primer set sequence used for Real-Time PCR | ||
| Sequence Name |
Forward Sequence | Reverse Sequence |
| GAPDH | CATGGCCTTCCGTGTTCCTA | GCGGCACGTCAGATCCA |
| MMP9 | TGGTGACATGATCCCTCTCTCTT | CCAGGGTGTCCCAGATGTG |
| MAPK8 (JNK) |
AGGGAATGCTGGGATCGTTA | ACCCAGTGGTGCATGTTGAA |
조직 준비를 위해 마우스를 희생시킨 후 등 쪽 피부를 떼어내어 필터페이퍼(filter paper)에 편평하게 부착한 후 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용해 4 μm의 두께로 절단한 다음 폴리라이신(polylYsine)으로 코팅( coating)된 슬라이드(slide)에 붙였다. 조직절편은 자일렌(xylene)을 이용하여 파라핀(paraffin)을 제거하고 알코올(alcohol)과 증류수로 10분간 함수시켜 증류수로 세척한 후, 피부조직의 변화양상을 관찰하기 위하여 H&E (Hemaoxylin & Eosin)염색을 실시하였다.
본 연구는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 22 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 Duncan’multiple range test를 실시하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
자외선을 조사한 피부에서는 표피의 각질형성세포와 진피의 섬유아세포 표면에 있는 성장인자나 시토카인(cytokine) 수용체를 활성화시켜 MAPK(Mitoen-Activated protein kinase)를 활성화시키는데 NK-kB pathway를 거쳐 AP(activator protein)-1의 DNA 바인딩(binding)을 촉진시킨다. 이는 결과적으로 세포외적 성분과 기저막 성분을 분해하는 능력이 있는 MMPs(MMP-1, MMP-3, MMP-9)의 유전자 전사를 증가시켜 주름을 유발한다.
실험 결과, 도 10의 (a)에서 보듯이, UVB처리에 의해 MMP-9의 유전자변화량이 증가하였는데, 양태반 분말 섭취에 의해 감소하였다. 또한 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)의 경우 모두 양태반 단일물 보다 MMP-9의 유전자 발현량이 더욱 감소한 것을 확인하였다.
한편, 도 10의 (b)에서 보듯이, UVB처리에 의해 MAPK8의 유전자 변화량이 증가하였는데, 양태반 분말 섭취에 의해 감소하였다. 또한 양태반 가자 복합물(PZ), 양태반 암라 복합물(PA), 양태반 구아바 복합물(PG)의 경우 모두 양태반 단일물보다 MAPK8의 유전자 발현량이 더욱 감소한 것을 확인하였다.
UVB조사에 의해 표피의 두께가 두꺼워지며 각질세포의 배열이 불규칙해지거나 세포의 모양이 비정상적으로 변화한다. 진피에서는 교원질의 양이 심하게 감소되고 상부 진피에 비정상적인 탄력섬유물질이 광범위하게 침착되면서 피부주름살, 탄력감소 등이 더욱 심하게 나타나게 된다.
또한, 실험동물의 등 부위의 피부조직을 H&E 염색하여 표피와 진피의 변화를 관찰하였다.
도 11에서 보듯이, 정상대조군(NC)에 비해 자외선 조사군(C)에서 표피가 두꺼워지며 표피층이 균등하지 않고 거칠어 졌음을 육안으로 확인하였다. 양태반 분말을 섭취한군(P)은 자외선 조사군(C)보다 표피의 두께가 감소하였음을 확인하였으며, 양태반 가자 복합물, 양태반 암라 복합물, 양태반 구아바 복합물의 경우 모두 양태반 단일물섭취군 보다 표피두께 감소 및 피부조직 배열이 규칙적으로 변화되었음을 확인하였다.
Claims (10)
- 구아바 잎 추출분말 30 중량% 및 양태반 분말 70 중량%로 조성된 양태반 구아바 복합물을 함유하며,
상기 양태반 분말은 양태반에 가염 및 가온 후 발생한 액체층을 제거한 고형물만 건조하고 조분쇄한 후, 말토덱스트린을 첨가하고 미세분쇄하여 수득한 것이며,
상기 양태반 구아바 복합물은 피부 미백 효과, 피부 보습 효과 및 피부 주름 개선 효과를 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
- 삭제
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- 삭제
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- 구아바 잎 추출분말 30 중량% 및 양태반 분말 70 중량%로 조성된 양태반 구아바 복합물을 함유하며,
상기 양태반 분말은 양태반에 가염 및 가온 후 발생한 액체층을 제거한 고형물만 건조하고 조분쇄한 후, 말토덱스트린을 첨가하고 미세분쇄하여 수득한 것이며,
상기 양태반 구아바 복합물은 피부 미백 효과, 피부 보습 효과 및 피부 주름 개선 효과를 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 삭제
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| Publication number | Publication date |
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| WO2019098468A1 (ko) | 2019-05-23 |
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