KR101670099B1

KR101670099B1 - 조직 폐색제

Info

Publication number: KR101670099B1
Application number: KR1020117010281A
Authority: KR
Inventors: 겐따로 다까무라; 사또시 고조; 사또루 고바야시
Original assignee: 가부시끼가이샤 쓰리디 매트릭스
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2016-10-27
Also published as: EP2345433A4; RU2011118341A; US20200222496A1; JP6492137B2; WO2010041636A1; US20110201541A1; US20220193184A1; JP2018033954A; EP4183425A1; EP3800197B1; US10576123B2; PH12019502295A1; US20140038909A1; JP5922749B2; KR20110083648A; PH12017501278B1; JP2015077416A; US10596225B2; JP2016174912A; BRPI0920030B1

Abstract

본 발명은, 인간을 포함하는 대형 포유 동물에게 적용 가능한 생체 흡수성의 펩티드 조직 폐색제이며, 바이러스 등의 감염성의 염려가 없는 인공 합성에 의한 펩티드 조직 폐색제를 제공한다. 구체적으로는, 펩티드를 함유하는 조직 폐색제이며, 상기 펩티드가 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교대로 결합하고, 아미노산 잔기 8 내지 200을 갖는 양친매성의 펩티드이고, 생리적 pH 및/또는 양이온의 존재하 수용액 중에서 β 구조를 나타내는 자기 조직화 펩티드인 조직 폐색제에 관한 것이다.

Description

조직 폐색제{TISSUE PLUG}

본 발명은 자기 조직화 펩티드 히드로겔을 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 폐색제에 관한 것이다.

생체의 조직 손상에 의한 체액(혈액, 조직액 등) 누출을 막는 조직 폐색은 수술 등의 임상상 중요한 의미를 갖는다. 손상부로부터의 체액 누출을 효과적으로 억제하는 것은, 환자의 수술 중의 생명 유지, 수술 후의 생활의 질(QOL)의 향상으로 이어진다.

임상에 있어서 지혈이 중요시되는 이유로서 이하를 들 수 있다.

1. 실혈은 사망의 큰 요인의 하나로서, 실혈 요인에는 위독한 외상, 동맥혹, 식도나 위에서의 궤양, 및 식도 정맥 혹의 파열 등이 있다. 특히, 긴급히 지혈 치료를 받을 수 없는 경우에는 사망의 가능성이 높아진다.

2. 수술 시에 있어서의 출혈은 수술에 있어서의 큰 걱정의 하나로서, 출혈에 의해 전신 감염증이나 장기의 기능 부전이 생긴다. 또한, 출혈은 수술 시계(수술 부위)를 방해할 뿐만아니라, 출혈한 혈액의 제거는 수술의 지연으로 이어진다.

3. 출혈은, 최소 침습 수술(복강경하 수술 등)을 행하고 있는 경우에도 문제가 되어, 출혈을 충분히 억제할 수 없는 경우, 절개 수술로 변경하지 않을 수 없는 경우도 있다.

기존의 지혈 방법으로서는 이하를 들 수 있다.

1. 출혈부의 혈관에 바로 압박하는 방법(압박 지혈). 이 지혈법의 결점은 시간과 수고를 들여 압력을 유지하여 둘 필요가 있는 점, 또한 환자에게 혈종이 생길 우려가 있는 점이다.

2. 그 밖의 물리적 수단에 의한 지혈 방법으로서, 출혈부 근방을 클램프, 클립하는 방법, 출혈부에 플러그나 스폰지와 같은 것을 얹는 방법이 있다. 이들 지혈법의 결점은 다수의 미소 혈관으로부터 출혈하고 있는 경우에 취급이 곤란하다는 점이다.

3. 열에 의해서 혈액을 응고시켜, 출혈하고 있는 혈관을 소작(燒灼)하는 방법(전기 메스). 이 방법의 결점은 주위 조직을 열 손상시켜 환자에게 대한 침습(侵襲)이 크다는 점, 의료용 기구가 필요하고 전문성을 요한다는 점이다(의료 기관 이외에서는 사용할 수 없음).

기존의 지혈재로서는 이하를 들 수 있다.

1. 알긴산

2. 젤라틴 스폰지

3. 콜라겐 섬유

4. 피브린 풀.

상기한 것 중 콜라겐 섬유와 피브린 풀이 효과적인 지혈재로서 임상에서 종종 이용되고 있지만, 이들의 결점은 (1) 젤라틴과 콜라겐 섬유는 동물성 콜라겐, 피브린 풀은 혈액 제제와 소 유래 트롬빈을 사용한 동물 유래 제품이기 때문에, 감염증의 위험성이 있고, (2) 투명하지 않기 때문에 수술 시계의 방해가 되는 점을 들 수 있다.

수술에 있어서 환자의 혈액 응고능을 인위적으로 저하시킨, 헤파린혈 상태로 하는 경우가 있다. 인공심폐를 사용하는 수술에 있어서는, 혈액 응고를 억제하기 위해서 헤파린을 사용한다. 인공심폐 장치는 생체에 있어서 이물질로서, 혈액을 그대로 인공심폐 장치에 흘리면, 곧 혈액이 응고하여 회로가 막혀 버리기 때문에, 체외 순환을 행하기 전에 헤파린을 혈액에 투여한다.

콜라겐 섬유, 피브린 풀은, 생체의 혈액 응고계를 이용하여 지혈하기 때문에, 헤파린혈 상태에서는 지혈 효과가 저하된다. 지혈 효과가 저하되면 출혈량이 많아지기 때문에 수혈이 필요하게 되기 쉽고, 또한 체외 순환 종료 후의 완전 지혈에도 장시간을 요한다. 따라서, 헤파린혈 상태에서도 성능이 저하하지 않는 혈액 응고 작용을 이용하지 않는 지혈재가 요구되고 있다.

혈관 봉합은 심장·혈관계 수술뿐만아니라, 일반적인 복강내 수술 시에도 필요하게 되는 경우가 있다. 수술 후, 혈관 봉합부로부터 약간의 혈액 누출이 있기 때문에, 그것을 지속적으로 억제하는 지혈재가 요구되고 있다.

담즙루·췌액루는, 담도계 수술, 췌염이나 췌장 수술 등에 의해서 담즙, 췌액이 누설되어, 다른 장기에 악영향을 미치는 증상이다. 현재, 담즙이나 췌액의 누출을 효과적으로 억제하고, 또한 임상 사용 가능한 물질은 알려져있지 않아, 안전하고 또한 효과적으로 담즙루·췌액루를 막는 방법이 요구되고 있다.

폐에 있어서, 폐포의 낭포가 찢어지는 자연 기흉이나, 늑골 골절이나 카테터천자 등의 외상성 기흉 등에 의해 공기가 누출하는 병상이 알려져 있다. 증상에 따라서는 자연 치유를 기다릴 수 밖에 없고, 환부에 상층으로서 덮는 것만으로 폐 조직과 접착하여, 낭포의 구멍을 막는 것이 가능한 방법은 기흉을 치료하는 수단으로서, 간편하고 또한 안전성이 높은 방법의 하나라고 생각된다.

내시경 기술의 발달에 따라, 병변부를 내시경적으로 절제하는 기술이 개발되어 있다. 특히 식도, 위 또는 장을 포함하는 소화관의 폴립이나 조기 암(림프절 전이가 없다고 생각되고 있는 표층암) 등의 병변부를 내시경적으로 절제하는 수술법이 확립되어 있다. 내시경적 점막 절제술로서는, 일반적으로 병변부를 포함하는 점막 하층에 고장식염수 등을 주입하여 병변부를 융기시키고, 절제 부분을 파지하면서 전기 메스 등에 의해 병변부를 포함하는 조직의 절제를 행한다.

상기 기술에 있어서, 병변부와 고유근층을 떼어놓기 위해서 점막 하층에 고장식염수 등의 용액을 주입하는데, 식염수 등의 점성이 낮은 용액에서는 병변부의 융기를 수술 중 유지할 수 없다는 문제점이 있어, 환부의 융기를 수술 중 유지 가능한 주입액이 요망되고 있다.

또한, 병변부 절제부로부터의 출혈을 트롬빈 등의 혈관 수축제를 카테터를 이용하여 투여함으로써 출혈을 억제하는 방법이 이용되는데, 완전히 출혈을 멈추는 효과적인 처치법은 확립되어 있지 않아, 절제 후의 출혈을 빠르게 멈추는 방법도 동시에 요구되고 있다.

카테터 요법의 발달에 의해, 종양이나 근종 등의 혈류 지배를 받는 병변부에 유입하는 동맥을 폐색시킴으로써 종양이나 근종 등을 사멸시키는 수술 방법이 확립되어 있다. 구체적으로는, 간장맥 폐색술, 자궁동맥 폐색술, 뇌동맥 폐색술 등을 들 수 있다.

상기 기술에 있어서, 동맥을 폐색시키기 위해서, 이종 동물로부터 추출된 콜라겐이나 에틸렌비닐알코올 등의 액체를 주입하는데, 감염의 위험성이나 생체 독성이 염려되고 있다. 따라서, 감염의 위험성이 없고, 또한 생체 독성이 낮은 주입액의 개발이 요망되고 있다.

또한, 주입액은 항암제나 조영제의 첨가가 가능할 것도 요구되고 있다.

자기 조직화 펩티드는 그의 아미노산 서열에 의해 다수의 펩티드 분자가 규칙에 맞게 배열된 자기 회합체를 형성하는 특성을 갖는다. 최근 들어, 그의 물리적, 화학적, 생물학적 성질로 인하여 신규 재료로서 주목을 받고 있다.

자기 조직화 펩티드는 전하를 띤 친수성 아미노산과 전기적으로 중성인 소수성 아미노산이 교대로 배열하고, 플러스 전하와 마이너스 전하가 교대로 분포하는 구조를 갖고, 생리적인 pH와 염 농도에서 β 구조를 취한다.

친수성 아미노산으로서는, 아스파르트산, 글루탐산으로부터 선택되는 산성 아미노산, 및 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴으로부터 선택되는 염기성 아미노산을 사용할 수 있다. 소수성 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌, 글리신을 사용할 수 있다.

해당 펩티드의 자기 조직화는 이하의 조건하에서 생긴다.

(1) 수용액 중에서 펩티드 분자가 β 구조를 취함으로써 전하를 갖는 친수성 아미노산과 전기적으로 중성인 소수성 아미노산이 펩티드 분자의 2면에 편재한다.

(2) β 구조를 취하였을 때, 이웃 분자와 상보적인 전화 분포가 된다.

(3) β 구조를 취하였을 때, 이웃 분자와 충분한 소수 결합을 형성한다.

(4) 1가의 무기염에 의해 아미노산 측쇄의 전하가 스크리닝된다.

(5) 펩티드의 등전점 가까이에서 분자가 정전적으로 중성이 된다.

상술한 조건이 갖추어졌을 때, 이하의 순서로 자기 조직화가 진행한다고 생각되고 있다.

(1) 교대로 분포하는 펩티드 분자의 플러스 전하와 마이너스 전하에 의해서 분자끼리가 서로 끌어 당겨 근접한다.

(2) 이웃 분자의 중성 아미노산 측쇄 사이에서 소수 결합이 형성된다.

(3) 정부의 전화 분포에 의해 이웃 분자끼리의 상대적인 배치가 갖추어져서, 분자 사이의 회합력이 강해진다.

(4) 분자의 집합체가 서서히 신장하여, 나노파이버를 형성한다.

나노파이버는 굵기 10 nm 내지 20 nm 정도의 극세 섬유로 메쉬 상에 집합하여 거시적으로는 겔상을 나타내는 것이 보고되어 있다.

겔의 메쉬 구조는 파이버 사이즈 및 기공 사이즈 등이 천연의 세포외 매트릭스(ECM)와 매우 닮아 있어, 세포 배양의 발판으로서의 이용이 연구되어 있다.

이 펩티드 히드로겔은 생분해성이고, 분해 산물이 조직에 악영향을 제공하지 않고, 생체 흡수성이 높은 점에서, 세포의 생착이나 증식에 적합하다.

자기 조직화 펩티드는 고상 합성법에 의한 화학 합성품이고 동물 유래의 감염증 등의 걱정이 없기 때문에, 최근 광우병 등, 동물로부터의 바이러스나 그 밖에 미지의 감염증에 대한 염려가 높아졌기 때문에, 콜라겐 등의 대체품으로서 더욱 주목받고 있다.

자기 조직화 펩티드의 지혈에 대한 응용은 특허문헌 1에 기술되어 있는데, 실시예에 인용된 논문의 간장 절개부에서의 지혈 비디오 영상에서는, 절개부 말단에서 지속적인 혈액 누출이 보여서, 보고되어 있는 완전 지혈이 되어있지 않다. 지혈이 불완전한 이유는 자기 조직화 펩티드겔과 조직의 접착이 불충분하기 때문이라고 추측된다. 따라서, 자기 조직화 펩티드의 지혈 효과를 임상 응용 가능한 레벨로까지 인출하기 위해서는, 한층더 개량이 필요하다.

국제 공개 제2006-116524호 공보

본 발명의 목적은 인간을 포함하는 대형 포유 동물에 있어서 조직의 손상부를 효과적으로 폐색할 수 있고, 또한 바이러스 등의 감염성의 걱정이 없는 자기 조직화 펩티드 조직 폐색제와 그의 사용 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 세포 배양의 발판으로서 이용되고 있는 자기 조직화 펩티드 히드로겔을 조직 폐색에 적용함으로써, 기존 조직 폐색제와 동등 이상의 조직 폐색 효과를 나타내는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다. 또한, 펩티드 수용액을 체액 누출부에 단순히 적응하는 것 만으로는 충분한 조직 폐색 효과를 얻을 수 없다는 과제가 있었다. 따라서, 예의 연구의 결과, 체액 누출부로부터 잉여 체액을 제거함으로써 충분한 조직 폐색 효과와 생체 안전성을 얻을 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 펩티드를 함유하는 조직 폐색제이며, 상기 펩티드가 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교대로 결합하고, 아미노산 잔기 8 내지 200을 갖는 양친매성의 펩티드이고, 생리적 pH 및/또는 양이온의 존재하 수용액 중에서 β 구조를 나타내는 자기 조직화 펩티드인 조직 폐색제에 관한 것이다.

상기 조직 폐색제에 있어서, 상기 펩티드가 아르기닌, 알라닌, 아스파르트산 및 알라닌으로 구성되는 배열, 이소류신, 글루탐산, 이소류신 및 리신으로 구성되는 배열, 또는 리신, 류신, 아스파르트산 및 류신으로 구성되는 배열의 반복 배열을 갖는 자기 조직화 펩티드인 것이 바람직하고, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열로 구성되는 자기 조직화 펩티드인 것이 보다 바람직하다.

상기 조직 폐색제는 용혈, 염증, 감염증을 막기 위해서 저분자 약제를 추가로 함유하는 것이 바람직하다.

상기 저분자 약제는, 바람직하게는, 포도당, 백당, 정제 백당, 젖당, 맥아당, 트레할로오스, 덱스트란, 요오드, 염화리소자임, 디메틸이소프로필아줄렌, 트레티노인 토코페릴, 포비돈 요오드, 알프로스타딜 알파덱스, 아니스알코올, 살리실산이소아밀, α,α-디메틸페닐에틸알코올, 박다놀, 헬리오날, 술파진 은, 부클라데신 나트륨, 알프로스타딜 알파덱스, 황산겐타마이신, 염산테트라사이클린, 후시딘산나트륨, 무피로신 칼슘 수화물 및 벤조산 이소아밀로 이루어지는 군에서 선택된다.

본 발명은 상기한 조직 폐색제를 포함하는, 항응고제가 첨가되어 응고 능력이 저하된 혈액의 출혈의 지혈제, 실질 장기의 출혈창면의 지혈제, 동맥성 출혈 및 정맥성 출혈의 지혈제, 담낭 또는 담관으로부터의 담즙 누출의 방지제, 폐로부터의 출혈 또는 공기 누출의 방지제, 내시경적 점막 절제술에 있어서의 경카테터적(transcatheter) 적용이 가능한 지혈제 및 절제 부분을 융기시키기 위한 점막 조직에의 주입제, 점막 조직에 액체를 주입함으로써 융기된 점막 조직 부분을 절제하는 방법에 있어서의 절제 부분으로부터의 출혈 및 체액 누출의 방지제, 또는 동정맥 폐색술에서의 동정맥 폐색제 또는 정맥혹 경화 요법에서의 정맥혹 경화제에도 관한 것이다. 이 동정맥 폐색제 또는 정맥혹 경화제에는 항암제 및/또는 조영제를 첨가할 수도 있다.

본 발명의 조직 폐색제는 그 주요 성분인 자기 조직화 펩티드가 폐색제로서의 역할 이외에도, 유주세포의 발판이 될 수 있어, 단순히 폐색하기만 한 것보다도, 수술 후에 의해 높은 치유 효과를 가져올 수 있다. 또한, 본 발명의 조직 폐색제는 체액 누출부로부터 잉여 체액을 제거한 경우(예를 들면 출혈을 멈춘 상태에서 지혈부에 적용한 경우), 조직과의 접착성이 향상하여, 충분한 조직 폐색 효과와 생체 안전성을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 조직 폐색제의 주요 성분인 자기 조직화 펩티드는 합성에 의해 제조할 수 있기 때문에, 종래의 생체 유래 재료와 비교하여 바이러스 등의 감염의 위험도 없는 데다가, 그것 자신은 생체 흡수성이기 때문에, 염증 등을 걱정할 필요도 없다.

도 1은 복부 대동맥 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과의 비교. (a) 대동맥 천자 후의 출혈의 확인, 혈관 주위에 출혈이 보임(화살표 선단부; 1％ 펩티드 수용액 처리군), (b) 펩티드 수용액의 도포(1％ 펩티드 수용액 처리군), (c) 차단 해제 후, 재출혈에 의한 혈액에 의해 혈관을 확인하기 어려움(화살표 선단부; 1％ 펩티드 수용액 처리군), (d) 대동맥 천자 후의 출혈의 확인, 혈관 주위에 출혈이 보임(화살표 선단부; 3％ 펩티드 수용액 처리군), (e) 펩티드 수용액의 도포(3％ 펩티드 수용액 처리군), (f) 생리 식염수에 의한 세정 후, 사진 중앙부에 완전 지혈된 혈관을 확인할 수 있음(화살표 선단부; 3％ 펩티드 수용액 처리군).
도 2는 간장 부분 절제 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과의 비교. (a) 간장 절제 후의 출혈의 확인(1％ 펩티드 수용액 처리군), (b) 펩티드 수용액의 도포(1％ 펩티드 수용액 처리군), (c) 생리 식염수에 의한 세정 후, 절단면으로부터 출혈이 보이지 않음(화살표 선단부; 1％ 펩티드 수용액 처리군), (d) 간장 절제 후의 출혈의 확인(3％ 펩티드 수용액 처리군), (e) 펩티드 수용액의 도포(3％ 펩티드 수용액 처리군), (f) 생리 식염수에 의한 세정 후 절단면으로부터 출혈이 보임(화살표 선단부; 3％ 펩티드 수용액 처리군).
도 3은 펩티드 수용액에 의해서 지혈한 간장과 대조군(생리 식염수)의 간장의 절단면의 병리 조직학적 비교. (a) 혈관내 조직상( 펩티드 수용액 처치군), (b) 혈관내 조직상(생리 식염수처치군), (c) 혈관내 조직상( 펩티드 수용액 처치군), (d) 혈관내 조직상( 펩티드 수용액 처치군), (e) 혈관내 조직상( 펩티드 수용액 처치군), (f) 혈관내 조직상( 펩티드 수용액 처치군).
도 4는 혈액 응고능 저하 토끼의 복부 대동맥 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과. (a) 대동맥 천자 전의 양태, (b) 대동맥 천자 후, 혈관 주위에 출혈이 보임(화살표 선단부), (c) 펩티드 수용액의 도포, (d) 차단 해제 후, (b)와 같은 출혈이 혈관 주위에 보이지 않음(화살표 선단부).
도 5는 복부 대동맥 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 백당 함유 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과. (a) 대동맥 천자 전의 양태, (b) 대동맥 천자 후, 혈관 주위에 출혈이 보임(화살표 선단부), (c) 펩티드 수용액의 도포, (d) 차단 해제 후, (b)와 같은 출혈이 혈관 주위에 보이지 않음(화살표 선단부).
도 6은 폐 누출 모델에 있어서의 백당 함유 3％ 펩티드 수용액과 생리 식염수의 지혈 효과 및 폐 누출 폐색 효과의 비교. (a) 폐의 출혈 확인(화살표 선단부; 백당 함유 3％ 펩티드 수용액 처리군), (b) 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부; 백당 함유 3％ 펩티드 수용액 처리군), (c) 공기 누출 확인을 위해 생리 식염수에 손상부를 가라앉힌 바, 공기 누출, 출혈의 어느 쪽도 보이지 않았음(화살표 선단부; 백당 함유 3％ 펩티드 수용액 처리군), (d) 폐의 출혈의 확인(화살표 선단부; 생리 식염수 처리군), (e) 생리 식염수의 도포(화살표 선단부; 생리 식염수 처리군), (f) 공기 누출 확인을 위해 생리 식염수 중에 가라앉혔기 때문에 출혈이 판연하지 않지만, 지속적인 출혈이 보임(화살표 선단부; 생리 식염수 처리군).
도 7은 담관벽 천공 모델에 있어서의 3％ 펩티드 수용액의 담관벽 폐색 효과. (a) 담관 천자 전의 양태, (b) 담관 천자 후의 담즙 누출 확인(화살표 선단부), (c) 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부), (d) 생리 식염수에 의한 세정 후, (b)와 같은 담관 주위로의 담즙 누출이 보이지 않음(화살표 선단부).
도 8은 방광 내 종양에 있어서의 3％ 펩티드 수용액에 의한 점막 융기 형성과 지혈 효과. (a) 펩티드 수용액 주입 전, (b) 펩티드 수용액의 주입 후의 환부의 융기 확인, (c) 전기 메스에 의한 종양 절제 중, 절제부에 출혈은 보이지 않음, (d) 전기 메스에 의한 종양 절제 후, 절제부에 출혈은 보이지 않음.
도 9는 위점막 절개 모델에 있어서의 2％ 펩티드 수용액의 지혈 효과. (a) 간장 절개 후의 출혈의 확인(화살표 선단부), (b) 2％ 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부), (c) 생리 식염수에 의한 세정 후, 절개부로부터 출혈이 보이지 않음(화살표 선단부).
도 10은 간장 횡절개 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액의 지혈 효과. (a) 간장 절개 후의 출혈의 확인(화살표 선단부), (b) 1％ IEIK9 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부), (c) 생리 식염수에 의한 세정 후, 절개부로부터 출혈이 보임(화살표 선단부), (d) 간장 절개 후의 출혈의 확인(화살표 선단부), (e) 1％ IEIK13 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부), (f) 생리 식염수에 의한 세정 후, 절개부로부터 출혈이 보이지 않음(화살표 선단부), (g) 간장 절개 후의 출혈의 확인(화살표 선단부), (h) 1％ KLD 펩티드 수용액의 도포(화살표 선단부), (i) 생리 식염수에 의한 세정 후, 절개부로부터 출혈이 보이지 않음(화살표 선단부).
도 11은 담즙에 의한 1.5％ 펩티드 수용액의 자기 조직화의 확인. (a) 자기 조직화 전의 1.5％ 퓨어매트릭스(PuraMatrix) 펩티드 수용액, (b) 담즙 도포 후의 1.5％ 퓨어매트릭스 펩티드 수용액, (c) 담즙을 제거하고, 자기 조직화를 확인, (d) 물리적인 충격을 제공하여 자기 조직화겔을 파괴, (e) 자기 조직화 전의 1％ IEIK9 펩티드 수용액, (f) 담즙 도포 후의 1％ IEIK9 펩티드 수용액, (g) 담즙을 제거 후, 거의 자기 조직화를 확인할 수 없음, (h) 물리적인 충격을 제공하여 자기 조직화겔을 파괴, (i) 자기 조직화 전의 1％ IEIK13 펩티드 수용액, (j) 담즙 도포 후의 1％ IEIK13 펩티드 수용액, (k) 담즙을 제거하고, 자기 조직화를 확인, (l) 물리적인 충격을 제공하고 자기 조직화겔을 파괴, (m) 자기 조직화 전의 1％ KLD 펩티드 수용액, (n) 담즙 도포 후의 1％ KLD 펩티드 수용액, (o) 담즙을 제거하고, 자기 조직화를 확인, (p) 물리적인 충격을 제공하여 자기 조직화겔을 파괴.
도 12는 3％ 펩티드 수용액에 의한 문맥 색전 효과의 확인. (a), (b) 문맥의 색전을 확인(화살표 선단부).
도 13은 이오파미돌 함유 펩티드 수용액의 자기 조직화의 확인. (a) 자기 조직화 전의 이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액, (b) 세포 배양용 배지 도포 후의 이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액, (c) 세포 배양용 배지를 제거하고, 자기 조직화를 확인, (d) 자기 조직화 전의 이오파미돌 함유 0.0468％ 펩티드 수용액, (e) 세포 배양용 배지 도포 후의 이오파미돌 함유 0.0468％ 펩티드 수용액, (f) 세포 배양용 배지를 제거하고, 자기 조직화를 확인.
도 14는 이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액의 카테터 통과 후의 자기 조직화의 확인(화살표 선단부).

이하, 본 발명의 조직 폐색제에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명의 조직 폐색제는 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교대로 결합하고, 아미노산 잔기 8 내지 200을 갖는 양친매성의 펩티드이고, 생리적 pH 및/또는 양이온의 존재하 수용액 중에서 β 구조를 나타내는 자기 조직화 펩티드를 주요 성분으로 한다.

본 발명에서, 생리적 pH는 pH 6 내지 pH 8, 바람직하게는, pH 6.5 내지 pH 7.5,더욱 바람직하게는, pH 7.3 내지 pH 7.5이다. 또한, 본 발명에서 양이온이란 예를 들면, 5 mM 내지 5 M의 나트륨 이온 또는 칼륨 이온이다.

본 발명에서 이용되는 자기 조직화 펩티드는, 예를 들면, 이하의 4개의 화학식으로 표시할 수 있다.

((XY)_l-(ZY)_m)_n (I)

((YX)_l-(YZ)_m)_n (II)

((ZY)_l-(XY)_m)_n (III)

((YZ)_l-(YX)_m)_n (IV)

(화학식 (I) 내지 (IV) 중, X는 산성 아미노산, Y는 소수성 아미노산, Z는 염기성 아미노산을 나타내고, l, m 및 n은 모두 정수(n×(l+m)<200)임)

또한, 그의 N 말단은 아세틸화되어 있을 수도 있고, C 말단은 아미드화되어 있을 수도 있다.

여기서, 친수성 아미노산으로서는, 아스파르트산, 글루탐산으로부터 선택되는 산성 아미노산 및 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴으로부터 선택되는 염기성 아미노산을 사용할 수 있다. 소수성 아미노산으로서는, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 세린, 트레오닌 또는 글리신을 사용할 수 있다.

이들 자기 조직화 펩티드 중에서도, 아르기닌, 알라닌, 아스파르트산 및 알라닌(RADA)의 반복 배열을 갖는 자기 조직화 펩티드를 바람직하게 사용할 수 있고, 그와 같은 펩티드의 배열은, Ac-(RADA)_p-CONH₂(p=2 내지 50)로 표시된다. 또 이소류신, 글루탐산, 이소류신 및 리신(IEIK)의 반복 배열을 갖는 자기 조직화 펩티드도 바람직하게 사용할 수 있고, 그와 같은 펩티드의 배열은, Ac-(IEIK) pI-CONH₂(p=2 내지 50)으로 표시된다. 또한 리신, 류신, 아스파르트산 및 류신(KLDL)의 반복 배열을 갖는 자기 조직화 펩티드도 바람직하게 사용할 수 있으며, 그와 같은 펩티드의 배열은, Ac-(KLDL)_p-CONH₂(p=2 내지 50)으로 표시된다. 이들 자기 조직화 펩티드는 8 내지 200의 아미노산 잔기수로 구성할 수 있는데, 그 중에서도 8 내지 32 잔기의 자기 조직화 펩티드가 바람직하고, 또한 잔기수 12 내지 16의 자기 조직화 펩티드가 보다 바람직하다.

본 발명에서의 자기 조직화 펩티드의 바람직한 구체예로서는, (Ac-(RADA)₄-CONH₂) 배열(서열번호: 1)를 갖는 펩티드 RAD16-I, (Ac-(IEIK)₃I-CONH₂) 배열(서열번호: 2)를 갖는 펩티드 IEIK13, (Ac-(KLDL)₃-CONH₂) 배열(서열번호: 3)를 갖는 펩티드 KLD를 들 수 있고, RAD16-I는, 퓨어매트릭스(등록상표)로서 그의 1％ 수용액이 가부시끼가이샤 3D 매트릭스로부터 제품화되어 있다. 퓨어매트릭스(등록상표)에는, 1％의 (Ac-(RADA)₄-CONH₂) 배열(서열번호: 1)를 갖는 펩티드 외에, 수소 이온, 염화물이온이 포함된다.

퓨어매트릭스(등록상표), IEIK13 및 KLD는 아미노산 12 내지 16 잔기로 길이가 약 5 nm인 올리고펩티드로서, 그의 용액은 산성 pH이면 액상을 나타내지만, 중성 pH로 변화시킴으로써 펩티드의 자기 조직화가 생겨, 직경 10 nm 정도의 나노파이버를 형성하여, 결과적으로 펩티드 용액은 겔화한다.

퓨어매트릭스(등록상표)는 친수성 아미노산으로서 플러스 전하를 띤 아르기닌과 마이너스 전하를 띤 아스파르트산, 소수성 아미노산으로서 알라닌의 잔기가 교대로 반복하는 아미노산 서열을 갖는 양친매성 펩티드이고, IEIK13은 친수성 아미노산으로서 플러스 전하를 띤 리신과 마이너스 전하를 띤 글루탐산, 소수성 아미노산으로서 이소류신 잔기가 교대로 반복하는 아미노산 서열을 갖는 양친매성 펩티드이고, KLD는 친수성 아미노산으로서 플러스 전하를 띤 리신과 마이너스 전하를 띤 아스파르트산, 소수성 아미노산으로서 류신의 잔기가 교대로 반복하는 아미노산 서열을 갖는 양친매성 펩티드이고, 펩티드의 자기 조직화는 펩티드를 구성하는 아미노산에 의한 펩티드 분자 사이의 수소 결합과 소수 결합에 기인한다.

본 발명에 이용하는 자기 조직화 펩티드에 있어서, 평균하여 나노파이버는 직경 10 내지 20 nm, 기공 사이즈는 5 내지 200 nm이다. 이 수치 범위는 천연의 세포외 매트릭스인 콜라겐과 거의 동일 크기이다.

본 발명에 이용하는 자기 조직화 펩티드의 자기 조직화 조건에는, 생리적 조건의 pH 및 염 농도를 들 수 있다. 특히 1가의 알칼리 금속 이온의 존재가 중요하다. 즉, 생체 내에 다량으로 존재하는 나트륨 이온 및 칼륨 이온이 겔화의 촉진에 기여한다. 한번 겔화하면 통상의 단백질의 변성 조건, 예를 들면 고온, 산, 알칼리, 단백질 분해 효소, 요소, 구아니딘염산염 등의 변성제를 이용하더라도 겔은 분해되지 않는다.

퓨어매트릭스(등록상표) 등의 이들 자기 조직화 펩티드는 분명한 생리 활성 모티프를 갖지 않는 펩티드 배열이기 때문에, 본래의 세포 기능이 손상될 염려가 없다. 생리 활성 모티프는 전사 등 많은 세포내 현상의 제어에 관여하고 있고, 생리 활성 모티프가 존재하면, 그 모티프를 인식하는 효소에 의해 세포질 내나 세포 표면의 단백질은 인산화된다. 펩티드 조직 폐색제에 생리 활성 모티프가 존재하면, 각종 기능 단백질의 전사 활성이 활성화 또는 억제화될 가능성이 있다. 생리 활성 모티프를 갖지 않는 퓨어매트릭스(등록상표) 등의 자기 조직화 펩티드에서는 이러한 염려가 없다.

본 발명에 이용하는 자기 조직화 펩티드는 화학 합성에 의해 제조되기 때문에, 동물 유래 세포외 매트릭스에 기인하는 미지 성분을 포함하지 않는다. 이 성질은 BSE를 비롯한 감염의 우려가 없어, 의료용으로서도 높은 안전성을 갖는 것을 나타낸다.

천연 아미노산으로 구성되는 자기 조직화 펩티드는 생체적 합성 및 생체내 분해성도 양호하기 때문에, 예를 들면 마우스의 심근에 퓨어매트릭스(등록상표)를 주입하면, 주입한 퓨어매트릭스(등록상표)에 세포가 침윤하여, 정상 조직이 형성되는 것이 보고되어 있다. 분해 시간은 주입 장소 등의 조건에 따라서 다르지만, 주입 후 대략 2 내지 8주간에 파이버가 분해되어 배출된다.

본 발명의 조직 폐색제에는 저분자 약제를 추가로 혼합시킬 수 있다. 그와 같은 저분자 약제로서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 포도당, 백당, 정제 백당, 젖당, 맥아당, 트레할로오스, 덱스트란, 요오드, 염화리소자임, 디메틸이소프로필아줄렌, 트레티노인 토코페릴, 포비돈 요오드, 알프로스타딜 알파덱스, 아니스알코올, 살리실산이소아밀, α,α-디메틸페닐에틸알코올, 박다놀, 헬리오날, 술파진 은, 부클라데신 나트륨, 알프로스타딜 알파덱스, 황산겐타마이신, 염산테트라사이클린, 후시딘산나트륨, 무피로신 칼슘 수화물 및 벤조산 이소아밀을 들 수 있다.

본 발명의 조직 폐색제는, 당을 첨가함으로써 조직 폐색 효과를 저하시키지 않고서 용액의 침투압을 저장(低張)으로부터 등장(等張)으로 개선 가능하여, 보다 생체 안전성을 높일 수 있다.

본 발명의 조직 폐색제의 형태로서는, 분말, 용액, 겔 등을 들 수 있다. 자기 조직화 펩티드는, 용액의 pH와 염 농도의 변화에 따라 겔화하기 때문에, 적용 시에 생체와 접촉시킴으로써 겔화하는 액제로서 유통시킬 수 있다.

임상 사용에 있어서의 양태로서는, 자기 조직화 펩티드 등의 성분을 포함하는 약액이 실린더가 있는 시린지나 피펫에 미리 충전되어 있다(프리필드 시린지 형태 등), 또는 시린지나 피펫 칩의 개구부로부터 성분을 보급하는 수단(흡인구나 밸브)에 의해서 시린지나 피펫 칩에 약액을 공급하고, 방출부로부터 환부에 적용하는 방법이 있다. 시린지, 피펫은 2개 이상으로부터 구성되는 경우도 있다.

성분은 스텐트나 카테터 등 기구의 코팅으로서 이용함으로써 체액 누출을 억제할 수 있다.

또한, 이 분야에서 통상 이용되는 거즈, 붕대 등의 지지체나 보강재 상에 성분을 고정하는 것도 가능하다. 또한 성분을 스폰지에 스며들게 하여 사용할 수도 있다.

그외, 성분의 분말 또는 용액을 충전한 분무식 스프레이를 제작할 수 있다. 이러한 스프레이는 환부에 분무하면 생체와의 접촉에 의해 pH와 염 농도가 상승하여, 겔화하기 때문에, 겔의 상태에서 취급하는 것보다도 다양한 부위나 상태에 적용할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명의 조직 폐색제를 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 그 취지와 적용 범위를 일탈하지 않은 한 이것에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

토끼 복부 대동맥·문맥 본간 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과

혈류 차단하에서 토끼 복부 대동맥, 문맥 본간의 주사 바늘 천공 모델을 제작하고, 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과의 평가를 행하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조; 농도: 중량/부피)

2. 3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조; 농도: 중량/부피)

·동물

일본 백색종 토끼(3.0-4.0 kg, 재팬 화이트, 컨벤셔널, 가부시끼가이샤 후나바시 팜사로부터 구입). 실온 25℃, 습도 65％, 조명 시간 12시간(7:00-19:00)으로 제어된 사육실 내에서 사육용 펠릿(JA 도우니찌 구미아이 시류 가부시끼가이샤)을 먹이 공급하고, 급수병의 자유 섭수로 사육하였다. 절식은 시험 당일의 아침만 으로 하고, 급수는 자유로 하였다.

<방법>

·토끼는 셀락타르(Celactar) 2％ 주사액(100 mL 중에 자일라진으로서 2.0 g 함유, 바이엘사 제조)을 피하내 투여한 후(3 mg/kg), 케타민(1 mL 중에 케타민으로서 50 mg 함유, 후지 케미컬 고교 가부시끼가이샤 제조)을 정맥내 투여(10 mg/kg)함으로써 마취하였다.

·토끼는 정중 절개에 의해 개복하였다. 복부 대동맥, 문맥 본간을 약 10 cm 노출하고, 각 혈관을 주위 조직으로부터 박리하고, 복부 대동맥은 23G 주사 바늘(데루모사 제조)로 혈관 천자를 행하고, 문맥 본간은 26G 주사 바늘(데루모사 제조)로 혈관 천자를 행하였다.

·출혈 확인 후, 말초측과 중추측을 혈관 차단 겸자에 의해 혈류 차단하고, 출혈한 혈액을 생리 식염수, 거즈에 의해서 제거한 후, 즉시 펩티드 수용액으로 처치를 하였다.

·처치 후 1 내지 2분 후에 혈류를 재개하고, 천자부로부터의 출혈의 유무를 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 1에 있어서, 본 실시예의 혈관으로부터의 출혈에 대한 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 복부 대동맥 천공 모델로서는 3％ 펩티드 수용액으로 2예 중 2예의 완전 지혈이 보였다. 그러나, 1％ 펩티드 수용액으로는 2예 중 모두 혈류 차단 해제 후에 분출성의 출혈이 보이고, 지혈되지 않았다. 또한, 문맥 본간 천공 모델에서도 마찬가지로 3％ 펩티드 수용액에서는 2예 중 2예에서 완전 지혈 효과가 보였지만, 1％ 펩티드 수용액으로는 지속적인 정맥성 출혈이 보였다.

실시예 2

토끼 간장 절제 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과

토끼 간장 부분 절제 출혈 모델을 제작하고, 1％ 펩티드 수용액과 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과를 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

2. 3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 셀락타르 2％ 주사액(100 mL 중에 자일라진으로서 2.0 g 함유, 바이엘사 제조)을 피하내 투여한 후(3 mg/kg), 케타민(1 mL 중에 케타민으로서 50 mg 함유, 후지 케미컬 고교 가부시끼가이샤 제조)을 정맥내 투여(10 mg/kg)함으로써 마취하였다.

·토끼는 정중 절개로 개복하고, 간장 좌엽 또는 우엽을 전인(剪刃)으로 예리하게 근연으로부터 가로: 약 5 cm×세로: 약 3 cm의 크기로 절제하여 간 분리면을 형성하였다.

·분리면으로부터의 분출성 출혈을 확인한 후, 동맥, 문맥, 정맥을 포함하는 간 실질의 용수적(用手的)인 압박 지혈에 의해 혈류를 즉시 차단하고, 출혈한 혈액을 생리 식염수, 거즈에 의해서 제거한 후, 제작한 간 분리면을 펩티드 수용액으로 처치하였다.

·처치 후 1 내지 2분 후에 혈류를 재개하고, 생리 식염수로 겔화한 펩티드 수용액을 제거하고, 간 분리면으로부터의 출혈의 유무를 육안적으로 확인하였다.

·지혈 효과를 본 간 분리면을 20％ 포르말린으로 고정하고, HE 염색에 의한 병리 조직학적 평가를 행하였다.

<결과>

도 2에 있어서, 본 실시예의 간 분리면으로부터의 출혈에 대한 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 1％ 펩티드 수용액으로는 2예 중 2예에서 완전 지혈 효과가 보였지만, 3％ 펩티드 수용액으로는 4예 중 1예에서 완전 지혈 효과가 보일 뿐이었다. 또한 병리 조직 세그먼트 관찰에 있어서, 겔화한 펩티드 수용액이 간 분리면 조직에 밀착한 것에 의한 혈관 천부 내의 혈관 폐색이 확인되었다(도 3).

실시예 3

혈액 응고능 저하 토끼 복부 대동맥 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 펩티드 수용액의 지혈 효과

항응고제(헤파린)을 투여한 토끼에 있어서, 펩티드 수용액의 지혈 효과를 복부 대동맥 주사 바늘 천자 모델에 의해 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·헤파린(노보 헤파린 주(注), 모찌다 세이야꾸 5000 단위) 1,000 단위를 하대정맥으로부터 투여하여, 혈액 응고능을 인위적으로 저하시켰다.

·토끼는 정중 절개에 의해 개복하였다. 복부 대동맥을 약 10 cm 노출하고, 혈관을 주위 조직으로부터 박리하고, 26G, 25G, 23G 주사 바늘(데루모사 제조)로 혈관 천자를 행하였다.

·출혈 확인 후, 말초측과 중추측을 혈관 차단 겸자에 의해 혈류 차단하고, 출혈한 혈액을 생리 식염수, 거즈에 의해서 제거한 후, 즉시 펩티드 수용액으로 처치하였다.

·처치 후 1 내지 2분 후에 혈류를 재개하고, 출혈의 유무를 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 4에 있어서, 본 실시예의 혈액 응고능이 저하된 토끼에 있어서의 복부 대동맥으로부터의 출혈에 대한 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. 표 3으로부터 분명한 바와 같이, 26G, 25G, 23G의 주사 바늘 천공 모델에 있어서 3％ 펩티드 수용액으로 완전 지혈이 보였다.

실시예 4

토끼 복부 대동맥·문맥 본간 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 당 함유 펩티드 수용액의 지혈 효과

당 함유 펩티드 수용액의 지혈 효과를, 복부 대동맥, 문맥 본간의 주사 바늘 천공 모델에 의해 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 백당 함유 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조, 농도 2％ 및 3％; 백당: 와꼬 쥰야꾸사 제조, 농도 10％)

2. 글루코오스 함유 2％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조; 글루코오스: 와꼬 쥰야꾸사 제조, 농도 5％)

3. 트레할로오스 함유 2％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조; 트레할로오스: 와꼬 쥰야꾸사 제조, 농도 5％)

4. 3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

5. 2％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 정중 절개에 의해 개복하였다. 복부 대동맥, 문맥 본간을 약 10 cm 노출하고, 각 혈관을 주위 조직으로부터 박리하고, 복부 대동맥은 26G, 25G, 23G 주사 바늘(데루모사 제조)로 혈관 천자를 행하고, 문맥 본간은 26G 주사 바늘(데루모사 제조)로 혈관 천자를 행하였다.

<결과>

도 5에 있어서, 본 실시예에 있어서의 당 함유 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. 표 4에 도시한 바와 같이, 복부 대동맥 23G, 25G, 26G 주사 바늘 천공 모델에 있어서, 3％ 펩티드 수용액과 백당 함유 3％ 펩티드 수용액의 지혈 효과는 동등하였다.

표 5에 도시한 바와 같이, 문맥 본간 26G 주사 바늘 천공 모델에 있어서, 2％ 펩티드 수용액, 백당 함유 2％ 펩티드 수용액, 글루코오스 함유 2％ 펩티드 수용액, 트레할로오스 함유 2％ 펩티드 수용액의 지혈 효과는 동등하였다.

실시예 5

토끼 폐 누출 모델에 있어서의 백당 함유 펩티드 수용액의 폐 누출 폐쇄 효과

토끼 폐 누출 모델을 제작하고, 백당 함유 3％ 펩티드 수용액과 생리 식염수의 폐 누출 폐쇄 효과를 비교하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 백당 함유 3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조; 백당: 와꼬 쥰야꾸사 제조, 농도 10％)

2. 생리 식염수(가부시끼가이샤 오쯔카 세이야꾸 고우죠 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 인공 호흡기에 의한 호흡 보조하에서 개흉하였다. 폐를 노출하고, 폐를 섭자로 무디게 상처를 입혀, 출혈을 수반하는 폐 누설을 형성하였다.

·출혈한 혈액을 생리 식염수, 거즈에 의해서 제거한 후, 출혈면을 백당 함유 3％ 펩티드 수용액, 생리 식염수로 처치하였다.

·처치 후, 약 30초 후, 폐 누설로부터의 출혈 및 공기 누출의 유무를 생리 식염수 내에서 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 6에 의해, 본 실시예에 있어서의 백당 함유 펩티드 수용액에 의한 폐 누출 폐쇄 효과를 나타낸다. 표 6에 도시한 바와 같이, 백당 함유 3％ 펩티드 수용액으로는 완전 지혈과 폐 누출 폐쇄가 확인되었지만, 생리 식염수로는 지속적인 폐 누설로부터의 출혈과 공기 누출이 보였다.

실시예 6

토끼 담관 주사 바늘 천공 모델에 있어서의 펩티드 수용액의 담관벽 폐색 효과

토끼 주사 바늘 담관 천공 모델을 제작하고, 펩티드 수용액의 담관벽 폐색 효과를 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

·동물

<방법>

·토끼는 정중 절개에 의해 개복하였다. 담관을 약 10 cm 노출하고, 주위 조직으로부터 박리한 후, 26G 주사 바늘로 담관 천자를 행하였다.

·담즙을 유출시켜, 담즙 유출이 멈추지 않는 것을 확인 후, 혈관 차단 겸자로써 담즙류를 차단하였다.

·누출한 담즙을 생리 식염수, 거즈에 의해서 제거한 후, 3％ 펩티드 수용액으로 처치하였다.

·처치 후 2분 후에 담즙류 차단을 해제하고, 천공 부위로부터의 담즙 유출의 유무를 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 7에 있어서, 본 실시예에 있어서의 펩티드 수용액에 의한 담관벽 폐색 효과를 나타낸다. 표 7에 도시한 바와 같이, 3％ 펩티드 수용액으로 완전히 담관벽 폐색 효과가 보였다.

실시예 7

개 방광 내 종양 적출술에 있어서의 펩티드 수용액에 의한 절제부의 융기 유지 효과 및 지혈 효과

개 방광 내 종양 적출술에 있어서 펩티드 수용액을 방광 점막 하에 주입하고, 펩티드 수용액에 의한 절제부의 융기 유지 효과 및 지혈 효과의 평가를 행하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

·동물

개(수컷)

<방법>

전신 마취 관리 하에서, 개 방광 내 종양 적출술을 이하의 절차로 실시하였다.

·전기 메스(에르베사 제조)에 의한 하복부 절개 후, 전기 메스를 이용하여 방광을 절개하여 방광 내의 종양을 노출시켰다(방광 점막으로부터 융기하는 기초부 직경이 0.5 cm 정도인 유경성 종양).

·3％ 펩티드 수용액을 0.5 mL 씩 4회로 나누어 종양 기부 주위의 점막 하에 주입하고, 점막 상의 종양이 융기하는 것을 확인하였다.

·종양을 융기시킨 후, 전기 메스로 종양을 절제하였다.

·펩티드 수용액 주입으로부터 종양 절제 완료까지의 시간은 약 2분이었다.

<결과>

도 8에 도시한 바와 같이, 펩티드 수용액의 방광 점막 하 주입에 의해 종양을 융기시키고, 절제 중에도 융기 상태를 유지 가능하였다. 또한, 종양 절제 중 및 절제 후에 출혈은 보이지 않았다.

실시예 8

토끼 위 점막 절개 모델에 있어서의 2％ 펩티드 수용액의 지혈 효과

토끼 위 점막 절개 출혈 모델을 제작하고, 2％ 펩티드 수용액의 지혈 효과를 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 2％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 정중 절개로 개복하고, 위를 절개한 후, 위점막을 노출하여 전인으로 예리하게 약 1 cm 절개하여 출혈창을 형성하였다.

·절개창으로부터의 삼출성(渗出性)의 출혈을 확인 후, 가능한 한 혈액을 거즈로 제거한 후, 제작한 위점막 절개창을 펩티드 수용액으로 처치하였다.

·처치 후 1분 후에 생리 식염수로 겔화한 펩티드 수용액을 제거하고, 위점막 절개창로부터의 출혈의 유무를 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 9에 있어서, 본 실시예의 위점막 절개창로부터의 출혈에 대한 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. 펩티드 수용액 도포 후에 출혈은 확인되지 않았다.

실시예 9

토끼 간장 횡절개 모델에 있어서의 1％ 펩티드 수용액의 지혈 효과

토끼 간장 횡절개 출혈 모델을 제작하고, 1％ 펩티드 수용액의 지혈 효과를 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: IEIK9(서열번호 4), CPC Scientific, Inc사 제조)

2. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: IEIK13, CPC Scientific, Inc사 제조)

3. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: KLD, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 정중 절개로 개복하고, 간장 좌엽을 전인으로 예리하게 약 1 cm 횡절개하여 출혈창을 형성하였다.

·절개창로부터의 삼출성의 출혈을 확인 후, 가능한 한 혈액을 거즈로 제거한 후, 제작한 간 절개창을 펩티드 수용액으로 처치하였다.

·처치 후 1분 후에 생리 식염수로 겔화한 펩티드 수용액을 제거하고, 간 절개창로부터의 출혈의 유무를 육안적으로 확인하였다.

<결과>

도 10에 있어서, 본 실시예의 간 절개창로부터의 출혈에 대한 펩티드 수용액의 지혈 효과의 예를 도시한다. IEIK9 펩티드 수용액을 출혈창면의 상층으로 한 바 전혀 겔화하지 않고 지혈 효과가 보이지 않았지만, IEIK13 펩티드 수용액과 KLD 펩티드 수용액은 도포 후 겔화하여, 출혈은 확인되지 않았다.

실시예 10

토끼 담즙에 의한 펩티드 수용액의 자기 조직화의 확인

토끼 담즙에 의한 펩티드 수용액의 자기 조직화를 각종 펩티드 수용액으로 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

1. 1.5％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

2. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: IEIK9, CPC Scientific, Inc사 제조)

3. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: IEIK13, CPC Scientific, Inc사 제조)

4. 1％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: KLD, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

<방법>

·토끼는 정중 절개로 개복하고, 23G 주사 바늘(데루모사 제조)에 의해 담낭으로부터 담즙을 채취하였다.

·자기 조직화 전의 각 펩티드 수용액의 액적을 형성하고(직경 약 5-8 mm 정도), 그 펩티드 수용액을 덮도록 조심스럽게 채취한 담즙을 위로부터 흘렸다.

·약 30초 후에 담즙을 제거하고, 자기 조직화를 확인한 후, 23G 주사 바늘에 의해 물리적으로 자기 조직화겔을 파쇄하였다.

<결과>

도 11에 있어서, 본 실시예의 각 펩티드 수용액의 담즙에 의한 자기 조직화의 예를 도시한다. IEIK9를 제외하는 모든 펩티드 수용액에 있어서 담즙에 의한 자기 조직화가 확인되었다.

실시예 11

래트 문맥 색전술에 있어서의 3％ 펩티드 수용액의 혈관 색전 효과의 확인

래트 문맥으로부터 3％ 펩티드 수용액을 주입하고, 혈관 색전 효과를 평가하였다.

<재료>

·3％ 펩티드 수용액(펩티드 배열: Ac-(RADA)₄-NH₂, CPC Scientific, Inc사 제조)

·동물

SD 래트(250 g, 수컷, 닛본 SLC 가부시끼가이샤로부터 구입)를 온도·습도: 22±3℃, 50±20％, 환기 횟수: 10 내지 15회/시간, 조명 시간: 인공 조명 12시간(8:00 내지 20:00)으로 제어된 사육실 내에서 사육하고, 고형 사료, CRF-1(오리엔탈 고우보 고교 가부시끼가이샤)를 금속제 먹이 공급기를 이용하여 자유롭게 섭취시키고, 수돗물을 자동 급수 장치를 이용하여 자유롭게 섭취시켰다.

<방법>

·래트는 디에틸에테르(키시다 가가꾸 가부시끼가이샤 제조)로 흡입 마취하였다.

·래트는 정중 절개로 개복하고, 문맥을 노출하였다.

·문맥 본간으로부터 26G 주사 바늘(데루모사 제조)로 펩티드 수용액을 4 mL 주입하고, 즉시 천자 부위로부터의 출혈을 펩티드 수용액으로 지혈하였다.

·주입 후, 5분 후에 간장을 적출하고, 즉시 10％ 포르말린(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤 제조)으로 고정하였다.

·조직은 1주간 고정한 후, 해마톡실린 에오신(HE) 염색을 하였다.

<결과>

도 12에 도시한 바와 같이, 펩티드 수용액에 의한 문맥 색전이 확인되었다.

실시예 12

이오파미돌을 용해한 펩티드 수용액의 자기 조직화의 확인

이오파미돌을 용해한 펩티드 수용액의 자기 조직화능을 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

·세포 배양용 배지(Dulbecco' s Modified Eagle Medium, GIBCO사 제조)

·이오파미돌(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤 제조)

<방법>

·3％ 펩티드 수용액 1 ml에 대하여 이오파미돌 306.2 mg을 용해하였다.

·이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액을 MilliQ 물로 희석하여, 0.0468％ 펩티드 수용액을 제조하였다. 3％ 이오파미돌 함유 펩티드 수용액 및 0.0468％ 이오파미돌 함유 펩티드 수용액 100 μl에 300 μl의 세포 배양용 배지를 50 μl씩 6회로 나누어, 3％ 이오파미돌 함유 펩티드 수용액 및 0.0468％ 이오파미돌 함유 펩티드 수용액의 주위에 첨가하도록 하여 닿게 하였다. 배지 첨가 후 15분 지나면, 주위의 배지를 제거하고, 겔화를 육안으로 확인하였다.

<결과>

도 13에 도시한 바와 같이, 이오파미돌 함유 펩티드 수용액의 자기 조직화가 확인되었다.

실시예 13

이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액의 마이크로카테터 통과 후의 자기 조직화의 확인

이오파미돌을 용해한 3％ 펩티드 수용액의 자기 조직화능을 평가하였다.

<재료>

·펩티드 수용액

·세포 배양용 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO사 제조)

·이오파미돌(와코 준야꾸 고교 가부시끼가이샤 제조)

·마이크로카테터(2.4 Fr, 150/20, Boston Scientific사 제조)

<방법>

·이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액을 거쳐 마이크로카테터적으로 세포 배양용 배지 중에 토출하였다.

<결과>

도 14에 도시한 바와 같이, 이오파미돌 함유 3％ 펩티드 수용액의 자기 조직화가 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> 3-D Matrix, Ltd. <120> Tissue-occluding agent <130> FP3240PCT <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 1 Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 2 Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> desigend peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 3 Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> designed peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <400> 4 Ile Glu Ile Lys Ile Glu Ile Lys Ile 1 5

Claims

펩티드를 함유하는 조직 폐색제이며, 상기 펩티드가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖고, 상기 조직 폐색제는 포유 동물의 조직 손상 부위를 폐색하는 기능을 갖는 것을 특징으로 하고, 상기 조직 폐색제는 1가의 알칼리 이온의 존재 하에 생리적 pH에서 β-시트 구조로 자기 조직화에 의해 겔화되는 것인 조직 폐색제.
제1항에 있어서, 저분자 약제를 추가로 함유하는 조직 폐색제.
제2항에 있어서, 상기 저분자 약제가 포도당, 백당, 정제 백당, 젖당, 맥아당, 트레할로오스, 덱스트란, 요오드, 염화리소자임, 디메틸이소프로필아줄렌, 트레티노인 토코페릴, 포비돈 요오드, 알프로스타딜 알파덱스, 아니스알코올, 살리실산이소아밀, α,α-디메틸페닐에틸알코올, 박다놀, 헬리오날, 술파진 은, 부클라데신 나트륨, 알프로스타딜 알파덱스, 황산겐타마이신, 염산테트라사이클린, 후시딘산나트륨, 무피로신 칼슘 수화물 및 벤조산 이소아밀로 이루어지는 군에서 선택되는, 조직 폐색제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 항응고제가 첨가되어 응고 능력이 저하된 혈액의 출혈의 지혈제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 실질 장기의 출혈 창면의 지혈제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 동맥성 출혈 및 정맥성 출혈의 지혈제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 담낭 또는 담관으로부터의 담즙 누출의 방지제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 폐로부터의 출혈 또는 공기 누출의 방지제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 내시경적 점막 절제술에서의 절제 부분을 융기시키기 위한 점막 조직에의 주입제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 점막 조직에 액체를 주입함으로써 융기된 점막 조직 부분을 절제하는 방법에서의 절제 부분으로부터의 출혈 및 체액 누출의 방지제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 내시경적 점막 절제술에서의 절제부로부터의 출혈을 지혈하는 경카테터적으로(transcatheter) 적용 가능한 지혈제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 동정맥 폐색술에서의 동정맥 폐색제.
제12항에 있어서, 항암제 또는 조영제, 또는 양자 모두를 추가로 포함하는, 동정맥 폐색술에서의 동정맥 폐색제.
제1항에 기재된 조직 폐색제를 포함하는, 정맥혹 경화 요법에서의 정맥혹 경화제.
제14항에 있어서, 항암제 또는 조영제, 또는 양자 모두를 추가로 포함하는, 정맥혹 경화 요법에서의 정맥혹 경화제.