KR101650051B1 - 과투과성을 억제 및 치료하는 방법 - Google Patents

과투과성을 억제 및 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 7∼17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고 헥사머 TX1EX2X3E를 포함하는 펩티드가 기재되고, 여기서, X1, X2 및 X3은 자연적 또는 비자연적 아미노산 중 어느 하나일 수 있고, 상기 펩티드는 TNF 수용기 결합 활성을 갖지 않고 고리화되어 상피세포 및 내피세포의 과투과성을 억제 및 치료한다.

Description

과투과성을 억제 및 치료하는 방법{METHOD FOR PREVENTING AND TREATING HYPERPERMEABILITY}
본 발명은 내피세포 및 상피세포에서 과투과성을 억제 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
내피세포 및 상피세포는 인간 및 동물체의 모든 조직 및 장기에서 결정적인 역할을 하고 있다.
상기 내피는 내피세포의 박층으로 이루어진다. 특히, 내피세포의 층은 정맥 및 모세혈관 등의 혈관의 내부면 및 상기 혈액과 혈관의 외벽 사이에 배리어를 형성한다. 내피세포는 큰 혈관으로부터 가장 작은 모세혈관까지 전체 혈관 시스템을 싸고 있다. 상피세포는 단층 또는 다층의 세포층을 형성하여 인간 및 동물 장기의 모든 내부 및 외부체 표면을 덮고 있다. 상피세포는 서로 가까이 근접해 있어 세포 접촉의 경우가 많다. 상피세포에 대해서, 특징은 외부, 외부측 또는 루멘(lumen)을 향하여 직면해 있는 혀끝측 및 바닥측에 제조될 수 있다. 또한, 상피세포는 부착 복합제(접착 복합체)를 갖고 폐쇄대(밀착 결합), 접착대(접착 결합) 및 데스모솜(접착반)으로 이루어지고, 한편으로는 물리화학적 배리어를 나타내고 다른 한편으로는 인접한 상피세포와 상호접촉을 나타낸다.
모든 동물 및 인간 장기와 세포 소기관의 생리학적 기능에 대해서, 특히, 제한된 세포 및 세포층에 손상시키지 않는 경우가 매우 중요하다. 예컨대, 내피세포의 손상 또는 혈관 내피의 손상이 있는 경우, 액체는 각각 상기 혈관으로부터 멀어져 상기 전체 유기체의 활력에 거대한 방해를 야기한다.
예컨대, 상피세포의 손상 또는 장기 상피의 손상이 있는 경우, 액체는 각각 상기 장기로부터 멀어지거나 또는 스며들어 상기 장기의 기능성에 심각한 피해를 줄 수 있다.
상기 내피 및 상피의 손상은 소위, 과투과성, 즉, 혈관으로부터 바이탈 장기 및 조직으로 액체의 통과를 제어하지 못하는 경우가 발생할 수 있다.
기계적인 경우와 비교하여, 독소의 감염 및 영향은 과투과성을 야기할 수 있다. 미생물 독소는 콜레스테롤과 결합하여 포어를 형성하는 분자이고, 그람 양성균이다. 독소의 영향 때문에, 첫번째 포어가 세포 멤브레인에 형성된 후에, 마이크로 포어로 형성된다. 따라서, 세포층은 액체 및 그 안에 함유된 물질에 대해 투과할 수 있다.
특히, 공지의 독소는 리스테리아균으로부터 리스테리오리신 또는 폐렴연쇄구균으로부터 폐렴구균용 혈소이다. 이들 독소는 상기 세포에서 활성산소 분자의 형성을 야기할 수 있다. 상기 활성산소 분자는 독소에 의해 발생된 후에, 특히, 상기 세포의 배리어 기능에 피해를 주는 사실에 의해서 내피 및 상피에 피해를 준다.
내피세포층 및 상피세포층의 배리어 기능을 유지하기 위해서, 상기 세포는 단백질 섬유를 통하여 서로 연결된다. 이러한 단백질 섬유의 성분은 예컨대, 미오신 경쇄이다. 그러나, 상기 미오신 경쇄의 인산화 때문에, 상기 세포 및 세포-세포 연결에 스트레스가 발생되어 세포간 갭을 형성함으로써, 액체가 침투할 수 있고 또한, 제어되지 않은 방식으로 누출될 수 있다.
상기 상피세포 및 내피세포의 배리어 기능의 조절에 있어서의 다른 성분은 단백질 키나아제 C이다. 단백질 키나아제 C에 대해서, 몇몇의 동질효소 예컨대, 단백질 키나아제 알파 및 제타가 공지되어 있다. 이들 단백질 키나아제 C 동질효소는 활성산소 분자, 과산화수소, 폐렴구균용 혈소와 리스테리오리신 등의 미생물 독소 및 친수성 코로나바이러스 단백질로 활성화된다. 활성화된 단백질 키나아제 C는 상피 나트륨 채널(ENaC)의 발현의 감소를 부가적으로 야기하여 상피세포에서 상기 나트륨과 액체 수송에 대한 책임이 있고, 따라서, 활성화된 단백질 키나아제 C는 과투과성의 발생에 본질적으로 기여한다.
또한, 폐에서 과투과성이 발생하는 이유는 예컨대, 인플루엔자 바이러스 등의 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군과 관련된 코로나바이러스(SARS-CoV) 또는 호흡기 세포융합 바이러스이고, 상기 내피 및 상피의 과투과성 또는 비정형 폐렴을 야기할 수 있다. 상기 단백질 키나아제 C 이소폼의 활성에 의한 SARS-CoV 단백질은 상기 상피 나트륨 채널의 활성 및 사이즈의 감소를 야기하여 과투과성의 발생을 촉진시키는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 폐의 이들 바이러스 질병에 대해서, 빈번하게 사용되는 베타-2 아드레날린 작용물질은 효과를 나타내지 않는 것이 알려져 있다.
따라서, 전체로서, 미생물 독소는 내피 및 상피세포에서 활성산소 분자의 증가된 레벨을 야기하는 것이 알려져 있다. 이것은 상기 미오신 경쇄의 인산화를 발생시켜 상기 세포-세포 상호작용의 방해 및 과투과성의 발생을 다시 야기한다.
미생물 독소, 활성산소 분자 또는 바이러스성 단백질은 단백질 키나아제 C 동질효소의 활성화를 야기한다. 그 후에, 단백질 키나아제 C의 활성화는 상기 상피 나트륨 채널(ENaC)의 발현의 감소 및 그것의 활성의 억제를 야기한다. 또한, 이들 매커니즘은 상기 내피 및 상피에서 과투과성의 발생을 야기한다.
폐조직의 과투과성은 상기 폐의 각종 질병 예컨대, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 폐렴의 본질적인 성분이다. 일반적으로, 상기 내피 및 상피의 과투과성을 치료하는 기본적인 치료법은 없다.
US 2003/0185791　A1, EP 2 009　023　A1, WO　2006/013183　A1, EP 1　264　559　A1 및 Marquardt et al.(J. Pept. Sci. 13(2007): 803-810)에는 부종을 치료하는 TNF-유래된 펩티드가 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 치료에 본질적인 역할을 행하는 상피 세포 및 내피세포의 과투과성을 예방하기 위해서, 질병에 의한 특히, 급성 폐손상 등의 폐 질병, ARDS 또는 바이러스성 폐 질병을 억제 또는 치료할 수 있는 수단 및 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 내피 및 상피의 과투과성을 억제 및 치료하고 급성 폐장해 및 폐렴의 결과를 억제 및 치료하기 위해서 생물학적으로 효과적인 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 7∼17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고 헥사머 TX1EX2X3E를 포함하는 펩티드에 관한 것이고, 여기서, X1, X2 및 X3은 자연적 또는 비자연적 아미노산 중 어느 하나일 수 있고, 상기 펩티드는 TNF 수용기 결합 활성을 갖지 않고 고리화되어 상피세포 및 내피세포의 과투과성을 억제 및 치료한다.
바람직하게는, 본 발명은 7∼17개의 인접한 아미노산으로 이루어지고 헥사머 TPEGAE(SEQ ID No.4)를 포함하는 펩티드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩티드는 TNF 수용기 결합 활성을 갖지 않고 고리화되어 상피세포 및 내피세포의 과투과성을 억제 및 치료한다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태 중 하나는 이하로 이루어지는 군으로부터 선택된 일련의 아미노산의 서열 및 그것의 적어도 7개의 아미노산 프레그먼트로 이루어지는 고리화된 펩티드에 관한 것이고, 상기 프레그먼트는 상기 헥사머 TPEGAE를 포함하여 상피세포 및 내피세포의 과투과성을 억제 및 치료하는 약물을 제조한다.
- QRETPEGAEAKPWY(SEQ ID No.5)
- PKDTPEGAELKPWY(SEQ ID No.6)
- CGQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID No.1) 및
- CGPKDTPEGAELKPWYC(SEQ ID No.7)
본 발명에 따른 펩티드는 폐렴, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 또는 박테리아 또는 바이러스성 폐 질병 특히, 리스테리아균, 폐렴 연쇄구균, 인플루엔자 바이러스, SARS 또는 RSV에 의한 감염의 발생을 억제 또는 치료하기 위해서 바람직하게 사용된다. 본 발명에 따라서 치료되거나 억제할 수 있는 폐렴의 원인은 폐렴의 원인과 관계없고 급성 또는 만성 염증의 여부와 관계없다. 따라서, 본 발명에 의해서는 박테리아, 바이러스, 마이코플라즈마, 원생동물, 벌레 또는 균류에 의한 감염에 의해 발생된 폐렴을 치료하는데 바람직하지만, 유독성(예컨대, 독성 물질의 흡입에 의해) 또는 면역적으로 발생된 폐렴 또는 방사선(예컨대, X-선, 암 환자에게 방사선 치료)에 의해 발생된 이러한 경우에는 치료할 수 없다. 특히, 독성 물질의 흡입 또는 방사선에 의해 발생된 폐렴에 대해서, 본 발명의 예방 형태는 환자 특히, 노인에 대해서 또는 HIV 환자 또는 이식 환자 등의 면역력이 약화된 사람에 대해서도 부분적으로 필요하다. 특히, 본 발명에 따라서, 손상이 X-선 상으로 아직 확인되지 않는 경우에, 폐렴은 한번만 치료하거나 예방할 수 있다.
1차 폐렴의 병원균은 폐렴구균, 포도상구균, 헤모필루스 인플루엔자, 마이코 플라즈마, 클라미디아, 레지오넬라(레지오넬라병) 및 플루 바이러스, 아데노 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 등의 바이러스이다. 2차 폐렴에 대해서, 병원균의 스펙트럼은 헤르페스 바이러스(CMV, HSV), 균류, 주페포자충, 원생동물(톡소플라스마증) 또는 혐기성 세균으로 이동된다. 특히, 폐렴은 이들 병원균에 의해 발생되고, 본 발명에 따라서, 각각 치료할 수 있고(특히, 2차 폐렴에 대해) 또는 예방할 수 있는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 펩티드는 예컨대, 유럽특허 EP 1 264 599 B1에 알려져 있고, 액체 축적(폐 부종)의 치료 및 특히, 이들 액체축적의 재흡수에 대한 기술 분야에 제안되어 있고, 여기서, 부종액은 폐조직의 폐포로부터 모세혈관으로 되돌아가고 즉, 상기 폐포의 밖으로 펌핑된다.
그러나 본 발명에 따르면, 다른 방식으로서, 이들 펩티드는 모세혈관의 내피를 통하여 폐의 상피로 가는 정반대의 액체 흐름에 영향을 준다는 것이 완전히 놀랍게도 증명되었다: 부종을 치료하는 동안에, 액체의 외부로의 수송은, 개방되고 완전히 활성인 펌핑 매커니즘이 요구되는 반면, 본 발명에 따르면, 폐포로 가는 액체의 통과가 중지된다; 따라서, 애초에 유입이 억제된다. 그러므로, EP 1 264 599 B1에 있어서의 펩티드에 의한 부종 재흡수의 활성화는, 본 발명과는 정반대의 방향 및 조절 방식으로 기능하는 완전히 상이한 메커니즘 -본 발명에서와 같이, 내피 및 상피 층의 손상에 기초한 과투과성을 감소시켜 폐포로 가는 액체 이동을 막음으로써 부종이 예방되는 것과는 전혀 다른 메커니즘- 에 기초한다고 생각된다. 따라서, 본 발명에 의해서, 상기 펩티드에 대해 EP 1 264 599 B1에서의 부종 치료 이외의 완전히 새롭고 놀라운 적응증에 대한 길이 열렸다. (상기 질병 과정의 이후 단계에서만 나타냄).
따라서, 본 발명은 상기 상황에 기초한 것이며, 본 발명의 연구과정에 따르면, 본 발명 및 EP 1 264 599 B1에 기재된 펩티드는, 독소, 활성산소 분자, 단백질 키나아제 C의 활성화, 미오신 경쇄의 인산화 및 상피 나트륨 채널의 발현의 효과에 영향을 주는 것도 발견되었다. 이것은 이들 펩티드에 대해 공지된 지식에 기초하여 예상할 수 없었던 것이다.
본 발명에 따라서 매우 바람직한 펩티드는 아미노산 서열 CGQRETPEGAEAKPWYC로 이루어지고 C 잔기(1 및 17 위치에서)를 통하여 고리화된다.
본 발명에 따른 펩티드의 고리화는 N 및 C 말단에서 2개의 C 잔기 사이에 디설파이드 가교에 의한 직접 고리화를 통하여 달성되거나 또는 캐리어 물질에 시스테인 둘 모두를 통하여 상기 펩티드와 커플링함으로써 달성되어도 좋다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드에 있어서, 시스테인 잔기는 분자의 시작과 끝에서 바람직하게 제공된다. 상기 펩티드의 고리화를 달성하는 다른 관능기는 예컨대, 아민 또는 알콜에 의한 아미드 또는 에스테르 폐환으로 야기된 산성기를 사용할 수도 있다(예컨대, 상기 아미노산 아스파르트산 및 글루탐산은 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 또는 리신에 의해 분자내에서 고리화되는 것이 바람직함). 따라서, 본 발명에 따라서 더욱 바람직한 펩티드는 예컨대, CGQKETPEGAEAKPWYC(SEQ ID No.8), CGQRETPEGAEARPWYC(SEQ ID No.9), CGQRETPEGAEAKPC(SEQ ID No.10), CQRETPEGAEAKPWYC(SEQ ID No.11) 또는 CGQRETPEGAEAKFWYC(SEQ ID No.12)이다.
캐리어 물질로서, 임의로 통상의 약학적으로 허용할 수 있는 물질은 예컨대, 상기 시스테인의 SH기와 공유 결합의 형태로 사용할 수 있고, 여기서, 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH) 등의 통상의 캐리어 단백질, 파상풍 독소 등이 특히 적합하다. 인접한 이기능 잔기도 상기 캐리어로서 제공되어도 좋다(예컨대, 아민 또는 알콜기 옆의 산성기). 이런 이유로, "고리화"는 분자내에서 폐환 또는 캐리어의 통합을 포함하는 것이 중요하고(연결된 펩티드 돌출로부터(상기 펩티드의 N 및 C 말단은 상기 캐리어와 연결됨), 여기서, 이러한 방법으로 고리화된 펩티드는 상기 환상 3차 구조를 나타내고 각각 안정하다.
본 발명에 따른 펩티드는 활성산소 분자 또는 박테리아 독소에 의해 발생된 과투과성에 대항하여 상피세포 및 내피세포를 보호하는데 바람직하게 사용해도 좋다.
본 발명에 따른 펩티드는 단백질 키나아제 C의 활성을 억제 또는 상피 나트륨 채널의 발현을 증가시키기 위해서, 미오신 경쇄의 인산화를 억제하는데 사용해도 좋다.
즉, 본 발명에 따른 펩티드는 활성산소 분자, 미생물 독소, 그람 양성 미생물 또는 폐 바이러스 감염에 의해 발생된 과투과성을 치료하는데 사용할 수 있다.
또한 실시형태에 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 함유하는 약학적 조성물(본 발명에 따른 각종 펩티드의 혼합물) 및 약학적 캐리어에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 이 약학적 조성물은 상술한 바와 같이, 과투과성을 억제 및 치료 특히, 폐렴, 급성 폐손상, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 바이러스성 폐 질병, 특히, 리스테리아균, 폐렴연쇄구균, SARS, RSV 또는 인플루엔자 바이러스, 특히, 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염을 억제 및 치료하는데 사용된다. 상기 용어 "약학적 조성물"은 상술한 바와 같이 펩티드를 포함하는 임의의 조성물을 말하고, 본 명세서에 기재된 질환을 억제, 개선 또는 치료한다. 특히, 상기 용어 "약학적 조성물"은 상술한 바와 같이 펩티드, 및 약학적으로 허용할 수 있는 캐리어 또는 부형제를 갖는 조성물을 말한다(용어 둘 모두는 교환하여 사용해도 좋음). 전문가에 의해 알려진 적합한 캐리어 또는 부형제는 생리 식염수, 링거액, 덱스트로오스액, 행크액, 고정유(fixed oil), 에틸 올리에이트, 생리 식염수에 5% 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 개선시키는 물질, 버퍼 및 방부제이다. 또한, 적당한 캐리어는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산 및 아미노산 코폴리머 등의 조성물을 개별적으로 수용하는데 유해하고 스스로 항체의 제조를 유도하지 않는 임의의 캐리어를 포함한다. 즉, 본 발명에 따른 펩티드는 직접 공유 결합을 통하여 이들 캐리어와 고리화되어도 좋다. 이 약학적 조성물(약물과 같은)은 전문가에 의해 알려진 임의의 적절한 방법을 사용하여 투여되어도 좋다. 바람직한 투여 경로는 비경구이고, 특히, 흡입(에어로졸에 의한) 또는 정맥 투여이다. 비경구 투여에 대해서, 본 발명의 약물은 상술한 약학적으로 허용가능한 부형제와 관련된 용액, 현탁액 또는 에멀션 등의 주사가능한 단위의 복용량 형태로 처방된다. 그러나, 투여의 복용량 및 형태는 개인에 따라 다르다. 일반적으로, 상기 약물을 투여하면, 본 발명의 펩티드는 1㎍/kg 및 10㎍/kg 사이의 복용량으로 투여되고, 보다 바람직하게는 10㎍/kg 및 5㎎/kg 사이, 더욱 바람직하게는 0.1 및 2㎎/kg 사이이다. 바람직하게는 주사에 의해 투여된다. 지속적으로 투입되어도 좋다. 이 경우에 있어서, 상기 약물은 5 및 20㎍/kg/분 사이의 복용량으로 투여되어도 좋고, 보다 바람직하게는 7 및 15㎍/kg/분 사이이다.
본 발명에 따라서, 본 발명에 따라서 특히 바람직한 펩티드는 이하의 아미노산 서열을 갖는다: SEQ ID No.1 (NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH)
폐의 배양된 내피세포에서 활성산소 분자의 농도 측정은 21%(정상산소 가스 혼합물)의 정상적인 산소 함량하에서 상기 내피세포의 배양시에 나타나고, 활성산소 분자의 낮은 형성만이 있다. 그러나, 산소의 결핍에 대하여(산소의 0.1%, 저산소 가스 혼합물), 활성산소 분자의 3-폴드 증가된 형성이다. 그러나, 본 발명에 따른 펩티드가 특히, 펩티드 SEQ ID No.1이 산소의 결핍(산소 함량 0.1%, 저산소 가스 혼합물)하에서 배양된 내피세포에 첨가되는 경우, 놀랍게도 활성산소 분자는 내피세포에 의해 형성되지 않는다.
또한, 실험은 미생물 독소 폐렴구균용 혈소 및 리스테리오리신의 첨가 전, 중간 및 후에 전기 셀-기질 임피던스 분석에 의해 인간 내피 및 상피세포의 세포층의 전기 저항을 측정한다. 상기 실험은 배양된 인간 내피세포에 리스테리오리신의 125ng/ml 및 250ng/ml의 첨가에 의해 과투과성의 발생이 억제되는 것을 나타낸다. 이 프로세스는 리스테리오리신의 250ng/ml의 독소 농도에 의해 계속해서 향상된다. 또한, 배양된 인간 내피세포에 폐렴구균용 혈소의 62.5ng/ml의 첨가는 과투과성의 발생을 야기한다. 이 프로세스는 페렴구균용 혈소의 125ng/ml의 독소 농도에 의해 계속해서 향상된다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 펩티드의 첨가 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml에 의해서 상기 폐렴구균용 혈소 또는 리스테리오리신으로 유도된 과투과성은 억제된다.
또한, 실험은 과투과성이 미생물 독소에 의해 인간 상피세포에 유도되는 것을 알았다. 따라서, 리스테리오리신의 1㎍/ml에 의한 인간 상피세포의 배양은 분명하게 과투과성을 야기한다. 그러나, 놀랍게도, 상기 과투과성은 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가에 의해 억제된다.
또한, 실험은 인간 내피 폐세포에 독소 리스테리오리신의 125ng/ml의 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 대하여 증가되는 것을 나타낸다. 이 효과는 리스테리오리신의 250ng/ml의 독소 농도에 의해 계속해서 향상된다. 또한, 인간 내피 폐세포에 상기 독소 폐렴구균용 혈소의 62.5ng/ml의 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량에 대하여 증가를 야기한다. 이 효과는 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml의 독소 농도에 의해 계속해서 향상된다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml는 독소 리스테리오리신 및 폐렴구균용 혈소에 의해 발생된 미오신 경쇄의 인산화를 억제한다.
또한, 실험은 마우스에서 독소의 기관내 적용에 의해서 마우스 폐의 과투과성은 트리거되어 상기 혈관으로부터 상기 폐조직으로 에반스 블루(Evans blue) 염료를 통과시킨다는 사실을 확인했다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍의 기관내 적용에 의해서 독소에 의해 발생된 과투과성이 억제되는 것을 발견했다.
또한, 실험은 마우스의 폐에서 트리거된 과투과성에 의해서 독소 예컨대, 폐렴구균용 혈소의 250g의 기관내 적용에 의해서 트리거되는 것을 나타내고, 기관지 폐포액에서 백혈수의 수를 증가시키는 것을 나타냈다. 그러나, 놀랍게도, 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍의 기관내 적용에 의해서 독소와 관련된 과투과성의 발생이 억제되어 더 적은 백혈구가 마우스의 폐에서 기관지 폐포액에 존재하는 것을 분명히 발견했다.
또한, 실험은 박테리아 독소는 폐의 인간 내피세포에서 활성화된 단백질 키나아제 C 알파의 함량에 대하여 실질적인 증가를 야기하는 것을 증명했다. 그러나, 놀랍게도 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 첨가는 이 독소 매개 효과를 억제하여 상피 나트륨 채널의 발현의 증가를 야기하는 것을 발견했다. 놀랍게도, 인간 상피세포에 본 발명에 따른 펩티드 특히, 펩티드 SEQ ID No.1의 첨가는 상피 나트륨 채널(ENaC)의 발현에 대하여 실질적인 증가를 야기하는 것을 발견했다. 본 발명은 이하의 실시예 및 도에 기초하여 더욱 상세하게 설명하지만 이들로 제한되지 않는다.
도 1a는 아미노산 서열 SEQ ID No.1을 가진 단백질의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 단위: Y축은 "mAU에 대한 흡수"; X축은 "분에 대한 시간"
도 1b는 아미노산 서열 SEQ ID No.2를 가진 단백질의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 단위: Y축은 "mAU에 대한 흡수"; X축은 "분에 대한 시간"
도 1c는 아미노산 서열 SEQ ID No.3을 가진 단백질의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 단위: Y축은 "mAU에 대한 흡수"; X축은 "분에 대한 시간"
도 2a는 각각 펩티드 SEQ ID No.1 또는 펩티드 SEQ ID No.3의 첨가 및 첨가없이 21% 산소(정상산소 가스 혼합물) 또는 0.1% 산소(저산소 가스 혼합물) 중 어느 하나에서 배양된 내피세포의 전자 상자성 공명(EPR) 스펙트라를 나타낸다.
도 2b는 각각 펩티드 SEQ ID No.1의 첨가 및 첨가없이 21% 산소(정상산소 가스 혼합물) 또는 0.1% 산소(저산소 가스 혼합물), 또는 펩티드 SEQ ID No.3의 첨가 및 첨가없이 0.1% 산소(저산소 가스 혼합물) 중 어느 하나에서 배양된 내피세포에서 활성산소 분자(초과산화물)의 상대 함량을 나타낸다.
도 3a는 독소 리스테리오리신의 첨가없이 또한 리스테리오리신의 125ng/ml 첨가(125ng/ml LLO) 및 리스테리오리신의 500ng/ml 첨가(500ng/ml LLO)에 의한 폐의 인간 상피세포의 전기 저항의 과정을 나타낸다.
도 3b는 독소 폐렴구균용 혈소의 첨가없이 또한 폐렴구균용 혈소의 62.5ng/ml 첨가(62.5ng/ml PLY) 및 폐렴구균용 혈소의 250ng/ml 첨가(PLY의 250ng/ml)에 의한 폐의 인간 상피세포의 전기 저항의 과정을 나타낸다.
도 3c는 독소 리스테리오리신/펩티드 SEQ ID No.1의 첨가없이(대조군) 또한 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml 첨가(125ng/ml PLY) 또한 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml / 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml(125ng/ml PLY / 50㎍/ml 펩티드 SEQ ID No.1)에 의한 폐의 인간 상피세포의 전기 저항의 과정을 나타낸다.
도 3d는 독소 리스테리오리신/펩티드 SEQ ID No.1의 첨가없이(대조군) 또한 리스테리오리신의 500ng/ml 첨가(500ng/ml LLO) 또한 리스테리오리신의 500ng/ml / 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml(500ng/ml LLO / 50㎍/ml 펩티드 SEQ ID No.1)에 의한 폐의 인간 상피세포의 전기 저항의 과정을 나타낸다.
도 3e는 독소 리스테리오리신/펩티드 SEQ ID No.1의 첨가없이(대조군) 또한 리스테리오리신의 1㎍/ml 첨가(1㎍/ml LLO) 또한 리스테리오리신의 1㎍/ml / 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml(1㎍/ml LLO / 50㎍/ml 펩티드 SEQ ID No.1)에 의한 폐의 인간 상피세포의 전기 저항의 과정을 나타낸다.
도 4a는 독소 리스테리오리신의 농도에 따라서 폐의 인간 내피세포에서 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량을 나타낸다(125ng/ml LLO, 250ng/ml LLO, 500ng/ml LLO).
도 4b는 독소 폐렴구균용 혈소의 농도에 따라서 폐의 인간 내피세포에서 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량을 나타낸다(125ng/ml LLO, 250ng/ml LLO, 500ng/ml LLO).
도 4c는 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml, 독소 리스테리오리신(LLO)의 250ng/ml, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml / 독소 리스테리오리신(LLO)의 250ng/ml, 펩티드 SEQ ID No.3의 50㎍/ml / 독소 리스테리오리신(LLO)의 250ng/ml의 첨가에 따라서 폐의 인간 내피세포에서 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량을 나타낸다.
도 4d는 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml, 독소 폐렴구균용 혈소(PLY)의 125ng/ml, 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml / 독소 폐렴구균용 혈소(PLY)의 125ng/ml, 펩티드 SEQ ID No.3의 50㎍/ml / 독소 폐렴구균용 혈소(PLY)의 250ng/ml의 첨가에 따라서 폐의 인간 내피세포에서 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량을 나타낸다.
도 5a는 마우스당 폐렴구균용 혈소의 250ng 투여량으로 독소 폐렴구균용 혈소(PLY의 250ng) 및 마우스당 폐렴구균용 혈소의 500ng(500ng LLO)을 기관내 투여하여 5.5시간 동안 마우스의 폐조직에서 에반스 블루 염료의 함량을 나타낸다.
도 5b는 마우스당 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng의 기관내 투여하고, 또한 마우스당 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng 및 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍을 기관내 투여하여 5.5시간 동안 마우스의 폐조직에서 에반스 블루 염료의 함량을 나타낸다.
도 5c는 마우스당 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng을 기관내 투여하고, 또한 마우스당 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng 및 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍을 기관내 투여하여 5.5시간 동안 마우스의 폐조직의 기관지 폐포액에서 백혈구의 함량을 나타낸다.
도 6은 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng/ml(250ng/ml PLY) 및 독소 폐렴구균용 혈소의 250ng/ml와 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 혼합물(250ng/ml PLY / 50㎍/ml 펩티드 SEQ ID No.1)에 의한 인간 내피 폐세포의 배양에 따라서, 전체 단백질 키나아제 C 알파에 대하여 활성화된 단백질 키나아제 D 알파의 함량을 나타낸다.
도 7은 세포 배양 조건없이 및 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가 또한 펩티드 SEQ ID No.3의 50㎍/ml의 첨가와 비교하여 인간 상피 폐세포에서 상피 나트륨 채널(ENaC)의 발현을 나타낸다. ENaC에 대한 mRNS의 함량은 "real-time PCR"을 사용하여 측정했다.
도 8은 바이러스성 폐렴에 의한 시험 동물의 체중 변화를 나타낸다(1그룹: 네가티브 대조군(PBS); 2그룹: 포지티브 대조군(코를 통한 인플루엔자 A); 3그룹: 코를 통한 인플루엔자 A + 기관내 펩티드 SEQ ID No.1의 10㎍).
도 9는 이들 1∼3그룹의 시험 동물의 체온 변화를 나타낸다.
도 10은 이들 1∼3그룹의 시험 동물의 생존율을 나타낸다.
실시예 1A: 아미노산 서열 SEQ ID No.1을 가진 펩티드의 합성
아미노산 서열 SEQ ID No.1을 가진 펩티드는 이하의 단계로 Fmoc 고상 합성을 사용하여 충분히 자동적으로 합성되었다.
Figure 112011069142817-pct00001
이어서, 상기 펩티드 SEQ ID No.1은 상기 아미노산 시스테인(1 위치)과 시스테인(17 위치)의 측쇄 사이에 디설파이드 가교의 산화적 형성에 의해 고리화되었다.
이어서, 상기 펩티드는 역상 HPLC를 사용하여 실험하여 표 1A에 나타낸 결과를 얻었다. 상기 펩티드 SEQ ID No.1의 순도는 95%보다 높았다.
실시예 1B: 아미노산 서열 SEQ ID No.2를 가진 펩티드의 합성
SEQ ID No.2
(NH2)Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu(COOH)
여기서, 아미드 결합은 리신(Lys(1))의 측쇄의 아미노기와 글루탐산(Glu(19))의 측쇄의 카르복실기 사이에 형성되었다.
아미노산 서열 SEQ ID No.2를 가진 펩티드는 이하의 단계로 Fmoc 고상 합성을 사용하여 충분히 자동적으로 합성되었다.
Figure 112011069142817-pct00002
상기 고리화는 아미노 결합을 형성하는 글루탐산(위치 19)의 감마 카르복실기와 리신(위치 1)의 엡실론 아미노기의 접촉에 의해 발생되었다. 예컨대, 이것은 디시클로헥실카르보디이미드(DHC)에 의해 활성 에스테르로 글루타민기의 감마 카르복실기를 이동시킴으로써 달성되고, 이어서, 활성 에스테르는 상기 펩티드에 패환을 형성하는 리신의 엡실론 아미노기와 자연스럽게 반응했다.
이어서, 상기 펩티드는 역상 HPLC를 사용하여 실험하여 도 1b에 나타낸 결과를 얻었다. 상기 펩티드 SEQ ID No.2의 순도는 95%보다 높았다.
실시예 1C: 아미노산 서열 SEQ ID No.3을 가진 펩티드의 합성
SEQ ID No.3
(NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH)
(NH2)Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys(COOH)
상기 아미노산 서열 SEQ ID No.3을 가진 펩티드는 이하의 단계로 Fmoc 고상 합성을 사용하여 충분히 자동적으로 합성되었다.
Figure 112011069142817-pct00003
이어서, 상기 펩티드 SEQ ID No.3은 상기 아미노산 시스테인(1 위치)과 시스테인(17 위치)의 측쇄 사이에 디설파이드 가교의 산화적 형성에 의해 고리화되었다.
이어서, 상기 펩티드는 역상 HPLC를 사용하여 실험하여 표 1C에 나타낸 결과를 얻었다. 상기 펩티드 SEQ ID No.3의 순도는 95%보다 높았다.
펩티드 SEQ ID No.3과 펩티드 SEQ ID No.1의 차이는 펩티드 SEQ ID No.1로부터 아미노산 Thr(6), Glu(8) 및 Glu(11)이 펩티드 SEQ ID No.3의 Ala(6), Ala(8) 및 Ala(11)로 교체된다는 사실로 이루어진다.
실시예 2: 활성산소 분자 상에 펩티드 SEQ ID No.1의 영향
내피세포의 세포배양
내피세포의 세포배양은 각각 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가 및 첨가없이, 또는 펩티드 SEQ ID No.3의 50㎍/ml의 첨가 및 첨가없이 행했다.
활성산소 분자를 발생시키기 위해서, 동맥 내피세포는 0.1% 산소, 5% 일산화탄소 및 94.9% 질소(저산소 가스 혼합물)의 산소-부족 가스 혼합물에서 배양했다. 대조군 실험에 있어서, 상기 가스 농도는 21% 산소, 5% 일산화탄소 및 74% 질소(정산산소 가스 혼합물)이었다.
산소-부족 가스 조건하에서 90분 후에, 상기 내피세포는 21% 산소에서 30분 동안 더 배양했다. 그 후에, 20μM 1-히드록시-3-메톡시카르보닐-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘 HCl(CHM), 20μM DPBS, 25μM 디스페리옥사민 및 5μM 디에틸디티오카르바메이트로 이루어지는 용액의 20μM, 또한 DMSO의 2μM를 상기 세포에 첨가했다.
세포의 트립신치료
세포배양 후에, 상기 세포에 트립신 용액을 첨가함으로써 실험실에서의 통상적인 방법으로 개별화시켰다. 상기 내피세포는 DPBS로 이루어지는 용액의 35㎕ 및 25μM 디스페라옥사민 및 5μM 디에틸디티오카르바메이트로 세정하고 현탁시켰다.
전자 상자성 공명(EPR)의 측정
전자 상자성 공명(EPR)의 측정은 소위, 전자 스핀 공명이라고 불리고, 상자성 물질의 조사 예컨대, 활성산소 분자에서 홀전자의 검출(산소의 라디칼)을 제공했다.
이 때문에, 미리 치료된 세포는 50㎕ 모세혈관에 놓여 40nW 마이크로파, 3000mG 진폭 변조, 100kHz 변조 주파수에서 Magnettech(Berlin, Germany)의 MiniScope MS200 ESR로 실험했다.
도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 21%의 정상 산소 농도에서 활성산소 분자의 형성은 낮았다. 산소 결핍(0.1% 산소, 저산소 가스 혼합물)하에서, 활성상소 분자의 3-폴드 높게 형성되었다. 그러나, 상기 펩티드 SEQ ID No.1를 산소 결핍(산소 함량 0.1%, 저산소 가스 혼합물)하에서 배양된 내피세포에 첨가하는 경우, 그 후에, 활성산소 분자는 상기 내피세포에 의해 형성되지 않았다.
펩티드 SEQ ID No.1과 다르게, 산소 결핍(산소 함량 0.1%, 저산소 가스 혼합물)하에서 배양된 내피세포에 펩티드 SEQ ID No.3의 첨가는 상기 내피세포에 의해 활성산소 분자의 형성을 억제시키는 것을 야기하지 않았다.
펩티드 SEQ ID NO.3과 펩티드 SEQ ID No.1의 차이는 펩티드 SEQ ID No.1의 아미노산 Thr(6), Glu(8) 및 Glu(11)이 펩티드 SEQ ID No.3의 Ala(6), Ala(8) 및 Ala(11)로 교체된 것이다.
실시예 3: 펩티드 SEQ ID no.1에 의한 내피세포 및 상피세포에서 과투과성 억제
물질
H441형의 폐의 인간 상피세포는 ATTC로부터 구했다.
폐의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 상피세포는 Lonza로부터 구했다.
미생물 독소 리스테리오리신(LLO) 및 폐렴구균용 혈소(PLY)는 University of Giessen로부터 구했다.
세포배양
폐의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 내피세포는 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양했다.
H441형의 폐의 상피세포는 2mML-글루타민, 탄산나트륨의 1.5g/l, 글루코오스의 4.5g/l, 10mM HEPES 버퍼 pH 7.4, 10% 소 혈청 등의 첨가제로 시판의 RPMI 1640 매개에서 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양했다. 상기 ECIS 실험은 혈청이 없는 매개에서 행했다.
과투과성
과투과성을 발생시키기 위해서, 즉, 내피세포 및 상피세포의 손상, 폐의 인간 상피세포, 또한 폐의 인간 내피세포는 연속적인 세포층이 형성될 때까지 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양하고, 이어서, 각각 상기 독소 리스테리오리신 또는 폐렴구균용 혈소를 첨가했다.
경내피 저항의 측정
미생물 독소 폐렴구균용 혈소 및 리스테리오리신을 인간 내피세포에 첨가하기 전, 중간 및 후에, 상기 세포층의 전기 저항(경내피 저항)은 전기적 세포-기질 임피던스 분석에 의해 측정했다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 상기 전기적 저항은 배양된 인간 내피세포에 리스테리오리신의 125ng/ml 첨가에 의해 감소했다. 과투과성은 나타났다. 이 효과는 리스테리오리신의 500ng/ml의 과량에 의해서도 더욱 의미있다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 전기적 저항은 배양된 인간 내피세포에 폐렴구균용 혈소의 62.5ng/ml 첨가에 의해 감소했다. 과투과성은 나타났다. 이 효과는 폐렴구균용 혈소의 500ng/ml의 과량에 의해서도 더욱 의미있다.
도 3c에 나타낸 바와 같이, 상기 전기적 저항은 배양된 인간 내피세포에 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml 첨가에 의해 감소했다. 과투과성은 나타났다. 그러나, 독소 폐렴구균용 혈소의 첨가에 의해 발생된 상기 과투과성은 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가에 의해 억제되었다.
도 3d에 나타낸 바와 같이, 상기 전기적 저항은 배양된 인간 내피세포에 리스테리오리신 500ng/ml 첨가에 의해 감소했다. 과투과성은 나타났다. 그러나, 독소 리스테리오리신의 첨가에 의해 발생된 상기 과투과성은 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가에 의해 억제되었다.
도 3e에 나타낸 바와 같이, 상기 전기적 저항은 배양된 인간 상피세포에 리스테리오리신 1㎍/ml 첨가에 의해 감소했다. 과투과성은 나타났다. 그러나, 독소 리스테리오리신의 첨가에 의해 발생된 상기 과투과성은 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml의 첨가에 의해 억제되었다.
실시예 4: 펩티드 SEQ ID No.1에 의한 미오신 경쇄의 인산화 억제
물질
폐의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 내피세포는 Lonza로부터 구했다.
미생물 독소 리스테리오리신(LLO) 및 폐렴구균용 혈소(PLY)는 University of Giessen로부터 구했다.
세포배양
페의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 내피세포는 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양했다.
미오신 경쇄의 인산화의 측정
미오신 경쇄의 인산화 및 인산화에서 펩티드 SEQ ID No.1의 영향을 측정하기 위해서, 미리 배양된 폐의 인간 내피세포는 1mM 오쏘바나데이트를 함유하는 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 세정했다. 상기 세포 내용물은 20mM 트리스 버퍼(pH 7.4), NaCl의 150 mM 몰/l, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1 % Triton X-100, 2.5mM 피로인산나트륨, 1mM 베타-글리세로인산, 1mM 소듐 바나데이트, 류펩틴의 1㎍/ml, 1mM 페닐메틸술포닐플루오라이드의 용액으로 상기 세포의 배양에 의해 용해되었다. 또한, 상기 세포는 초음파로 분리되었다. 상기 세포 용해물은 가용성 성분을 얻기 위해서 원심분리되었다. 이어서, 상기 가용성 세포 용해물은 실험실에서의 통상적인 방법으로 변성한 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 적용시켜 그들의 질량에 따라서 상기 단백질을 분리했다. 그 후에, 상기 단백질은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 운송되었다. 상기 단백질 블롯은 실험실에서 통상적인 방법으로 0.1% Tween 20 및 5% 건조 분유의 용액에서 1시간 동안 치료했다. 이어서, 상기 단백질 블롯은 상기 미오신 경쇄 또는 인산화된 미오신 경쇄 중 어느 하나와 직접 대항하는 항체로 배양되었다.
상기 미오신 경쇄 또는 인산화된 미오신 경쇄 중 어느 하나를 가시적으로 제조하기 위해서, 상기 항체는 실험실에서의 통상적인 방법으로 화학발광을 사용하는 진단 필름 상에 가시적으로 제조되었다. 상기 신호 강도는 농도계로 측정하고 인산화된 미오신 경쇄에 대한 미오신 경쇄의 비율을 측정했다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 인간 내피 폐세포에 독소 리스테리오리신의 125ng/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량에 대하여 증가를 야기한다. 이 효과는 리스테리오리신 250ng/ml의 독소 농도에 의해 향샹되었다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, 인간 내피 폐세포에 독소 폐렴구균용 혈소의 62.5ng/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량에 대하여 증가를 야기한다. 이 효과는 페렴구균용 혈소 125ng/ml의 독소 농도에 의해 향샹되었다.
도 4c에 나타낸 바와 같이, 인간 내피 폐세포에 독소 리스테리오리신의 125ng/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량에 대하여 증가를 야기한다. 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 대해 영향을 주지 않는다. 독소 리스테리오리신 250ng/ml에 의해서 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 있어서의 증가는 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가에 의해 억제되었다. 펩티드 SEQ ID No.3은 상기 독소 리스테리오리신에 의해서 매개된 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 대해 영향을 주지 않는다.
도 4d에 나타낸 바와 같이, 인간 내피 폐세포에 독소 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 상대 함량에 대하여 증가를 야기한다. 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가는 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 대해 영향을 주지 않는다. 독소 폐렴구균용 혈소의 125ng/ml에 의해서 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 있어서의 증가는 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가에 의해 억제되었다. 펩티드 SEQ ID No.3은 상기 독소 폐렴구균용 혈소에 의해서 매개된 인산화된 미오신 경쇄의 함량에 대해 영향을 주지 않는다.
펩티드 SEQ Id No.3과 펩티드 SEQ ID No.1의 차이는 펩티드 SEQ ID No.1의 아미노산 Thr(6), Glu(8) 및 Glu(11)가 SEQ ID No.3의 Ala(6), Ala(8) 및 Ala(11)로 교체되는 것이다.
실시예 5: 과투과성 및 동물 모델에서 급성 폐장해에 대한 펩티드 SEQ ID No.1의 영향
마우스에서 과투과성의 유도
실험용 마우스는 폐의 제조 전에 이소플루란/산소의 혼합물, 또한 마우스당 케타민/럼푼(1.33:1)의 혼합물 100㎕을 기관내로 치료했다. 마취 후에, 정맥내 카테터를 상기 마우스에 주입했다. 이어서, 상기 폐의 과투과성을 유도하기 위해서, 액체의 25㎕를 미세 시린지를 사용하여 상기 폐로 분무했다. 상기 액체는 0.9% 생리 식염수, 또는 독소 폐렴구균용 혈소의 250g 또는 폐렴구균용 혈소의 250ng/ml /펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 중 어느 하나를 함유한다.
에반스 블루에 의한 과투과성의 가시화
상기 독소 폐렴구균용 혈소의 투여 5.5시간 후에, 0.9% 생리 식염수에 용해된 에반스 블루를 마우스 중량의 100mg/kg에서 상기 마우스에 정맥내로 적용시켰다. 30분 후에, 혈액은 심장 구멍에 의해 상기 동물로부터 움추려졌다. 이어서, 상기 폐를 제거하고, EDTA 인산화 버퍼(pH 7.4)의 1ml로 세정하고 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. 상기 폐조직에서 에반스 블루 염료의 함량을 측정하기 위해서, 상기 폐는 차가운 인산화 버퍼(폐조직의 100mg당 1ml의 버퍼)에서 균질화시킨 후에, 18시간 동안 프로말린 용액에서 배양시키고, 이어서, 원심분리했다(5,000×g, 30분). 상청액에 있어서, 620nm 및 740nm에서 광도계로 상기 흡수를 측정했다. 상기 폐조직에서 에반스 블루 염료의 함량은 포르말린 용액에서 용해된 에반스 블루 염료에 대한 래퍼런스 곡선을 기초로 하여 측정하고 해모글로빈 피그멘트의 함량을 감했다. 상기 독소 폐렴구균용 혈소에 의해서 유도된 과투과성에 때문에, 모세혈관으로부터 상기 폐조직으로 에반스 블루 염료의 배출은 상기 혈관 혈청에서 염료의 양과 비교했다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 마우스당 250ng 및 500ng의 양으로 독소 폐렴구균용 혈소의 기관내 적용은 과투과성을 야기하고, 폐 모세혈관으로부터 상기 폐조직으로 통과한 에반스 블루 염료를 가진 혈액에 의해 측정되고 상기 폐조직에서 확인할 수 있었다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, 마우스당 250ng의 양으로 독소 폐렴구균용 혈소의 기관내 적용은 과투과성을 야기하고, 폐 모세혈관으로부터 상기 폐조직으로 통과한 에반스 블루 염료를 가진 혈액에 의해 측정되고 상기 폐조직에서 확인할 수 있었다. 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍의 기관내 적용으로, 과투과성의 독소-매개 발생은 억제되었다.
도 5c에 나타낸 바와 같이, 마우스당 250ng의 양으로 독소 폐렴구균용 혈소의 기관내 적용은 과투과성의 발생 때문에, 마우스에서 폐의 기관지 폐포액에서 백혈구의 수의 증가를 야기했다. 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍의 기관내 적용으로, 과투과성의 독소-매개 발생은 억제되어 마우스 폐의 기관지 폐포액에서 백혈구의 수는 명확하게 감소했다.
실시예 6: 펩티드 SEQ ID No.1에 의한 단백질 키나아제 C의 활성 억제
물질
폐의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 내피세포는 Lonza로부터 구했다.
미생물 독소 폐렴구균용 혈소(PLY)는 University of Giessen으로부터 구했다.
세포배양
폐의 모세혈관으로부터 분리된 폐의 인간 내피세포는 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양했다. 세포배양 중에, 상기 독소 폐렴구균용 혈소는 250ng/ml의 농도, 또는 250ng/ml의 농도를 가진 독소 폐렴구균용 혈소 및 50㎍/ml의 농도를 가진 펩티드 SEQ ID No.1을 첨가했다.
활성화된 단백질 키나아제 C 알파의 측정
활성화된 단백질 키나아제 C 알파의 함량은 상기 활성화된 단백질 키나아제 C 알파(포스포-트레오닌 638 단백질 키나아제 C 알파)와 직접 대항하는 항체를 사용하여 ELISA 측정에 의해 측정했다. 이어서, 단백질 키나아제 C 알파의 전체 함량은 시판의 ELISA 분석을 사용하여 측정했다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 독소 폐렴구균용 혈소의 효과 때문에, 단백질 키나아제 C 알파의 전체 함량과 비교하여 활성화된 단백질 키나아제 C 알파의 함량은 현저하게 증가했다. 펩티드 SEQ Id No.1의 첨가에 의해서 단백질 키나아제 C 알파의 활성화는 억제되었다.
실시예 7: 펩티드 SEQ Id No.1에 의한 상피세포에서 상피 나트륨 채널(ENaC)의 발현 증가
물질
H441형의 폐의 인간 상피세포는 ATTC로부터 구했다.
세포배양
H441형의 폐의 상피세포는 2mM L-글루타민, 탄산나트륨의 1.5g/l, 글루코오스의 4.5g/l, 10mM HEPEs 버퍼 pH 7.4, 10% 소 혈청 등의 첨가제로 시판의 RPMI 1640 매개에서 실험실에서의 통상적인 방법으로 배양했다.
상피 나트륨 채털의 발현 확인
상기 배양된 상피세포에 있어서, 나트륨 채널(ENaC)의 발현은 "real-time PCR"에 의해 측정되었다. 이들 측정은 세포에 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/l를 첨가 및 첨가없이, 또한 펩티드 SEQ ID No.3의 50㎍/ml 첨가를 행했다.
실험 7에 나타낸 바와 같이, 상기 폐의 상피세포에 펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가에 의해서 상기 나트륨 채널(ENac)의 발현은 3배가 되었다.
펩티드 SEQ ID No.1의 50㎍/ml 첨가에 의해서 상기 나트륨 채널(ENaC)의 발현은 현저히 증가하지 않았다.
펩티드 SEQ ID No.3과 펩티드 SEQ ID No.1의 차이는 펩티드 SEQ ID No.1로부터 아미노산 Thr(6), Glu(8) 및 Glu(11)이 펩티드 SEQ ID No.3의 Ala(6), Ala(8) 및 Ala(11)로 교체되는 사실로 이루어진다.
실시예 8: 바이러스성 폐 감염에 의한 마우스의 질병 과정에서 펩티드 SEQ ID No.1의 효과
이하의 동물 조사군dmf 바이러스성 폐 감염에서 펩티드 SEQ ID No.1의 효과에 대해서 평가했다.
1그룹: 네가티브 대조군(코를 통한 PBS)
2그룹: 포지티브 대조군(코를 통하여 인플루엔자 A 바이러스의 약 2,000 단위로 감염)
3그룹: 시험군(코를 통하여 인플루엔자 A 바이러스의 약 2,000 단위로 감염, 또한 펩티드 SEQ ID No.1의 10㎍/ml 기관내 투여)
각각의 군에 있어서, 6 BALB/c 마우스를 사용했다.
이하의 치료 스킴을 행했다.
치료 일수 0:
1그룹: 코를 통하여 PBS 투여
2그룹: 코를 통하여 인플루엔자 바이러스 A에 의한 마우스의 감염
3그룹: 코를 통하여 인플루엔자 바이러스 A의 감염 및 펩티드 SEQ ID No.1의 투여
치료 일수 0, 2, 4, 6, 8:
1그룹: PBS의 기관내 투여
2그룹: PBS의 기관내 투여
3그룹: 펩티드 SEQ ID No.1의 기관내 투여
치료 일수 0∼10:
상기 시험군의 체온, 체중 및 생존율을 날마다 관찰했다.
상기 실험은 바이러스성 폐 감염을 가진 시험 동물(2그룹)은 10일내에 그들의 체온의 약 20%가 감소하는 것을 확인했다.
그것과 비교하여, 상기 시험 동물의 체중은 상기 펩티드 SEQ ID No.1이 투여되는 경우에(3그룹) 약 10%만이 감소되었다.
결과는 도 8에 나타냈다.
상기 실험은 바이러스성 폐 감염에 의한 시험 동물(2그룹)에 있어서, 상기 체온은 7일 후에 37.5℃에서 33℃로 감소하는 것을 더욱 확인했다. 이어서, 상기 체온은 35℃로 증가했다.
그것과 비교하여, 펩티드 SEQ ID No.1의 투여에 의한 시험 동물(3그룹)에 있어서, 7일 후에 35℃로 감소되었다. 이어서, 상기 체온은 다시 37℃로 증가했다.
결과는 도 9에 나타냈다.
상기 실험은 바이러스성 폐 감염 10일 후에, 2그룹의 시험 동물의 2/3는 죽었다.
그것과 비교하여, 10일 후에 펩티드 SEQ ID No.1의 투여에 의한 시험 동물(3그룹)의 사망률은 1/3이었다.
그 결과는 도 10에 나타냈다.
전체로서, 바이러스성 폐 감염에 의한 시험 동물의 실험에 있어서, 펩티드 SEQ ID No.1의 투여는 체중이 낮을수록 감소하고 체온이 낮을수록 감소하면 명백하게 증가된 생존율을 나타냈다.
실시예 9: 세척 유도된 큰 동물 ARDS 모델에서 펩티드 SEQ ID No.1("AP301")의 적용
물질 및 방법: 상기 관할 동물 보호 위원회의 동의에 의해서 폐장해는 계면활성제 감소에 의한 일반적인 마취하에서 2마리의 돼지(25kg)로부터 유도되었다(4배의 기관지폐포 세척, 각각의 30ml/kg의 체중). 이어서, 체중 AP301의 1mg/kg(펩티드 SEQ ID No.1)을 기관내에 적용시켰다. 동물1(1)은 전체량의 피하 기관 주입을 수용하고 반면에, 동물2(2)에 대해서는 30분에 걸쳐서 동일한 양의 분무를 행했다. 그 후에, 5시간 동안 환기시켰다. 동맥 산소 부분압(paO2)은 미리 확인된 내부 대동맥의 리얼 타임 측정 프로브(intra-aortic real-time measuring probe)(FOXY, Ocean Optics, USA)를 사용하여 기록했다. 폐활량 및 혈액 동력학은 영구적으로 기록되고, 또한 PiCCO 기술에 의한 측정을 30분 간격으로 행했다.
결과: 상기 약물의 적용 중에, 소망하지 않은 혈액 동력학 효과는 확인되지 않았다. 환기 설정은 치료 효과를 억제하기 위해서 비보호 범위(Pmax 40mbar, 호흡량 ≥ 체중당 10ml/kg, PEEP ≤ 10mbar, 빈도 25∼35/분)로 지속적으로 유지시켰다. 동물 둘 모두는 각각 최대값 162.8mMHg(1) 또는 224.6mMHg(2)로 증가된 paO2에 의해 약 1.5시간으로 제한하여 산소화의 지속적인 향상을 나타냈다. AP301의 분부에 의해서 피하 치료 적용과 비교하여 지체되는 것이 나타나지만, 더욱 명백했다. 가스 교환의 향상과 동시에, 초기값과 비교하여 15.8∼52.5%로 혈관밖 폐액의 감소는 이하의 계면활성제 감소를 기록할 수 있었다.
이들 결과는 본 발명에 따른 ARDS를 치료하기 위해서 접근하여 새로운 약학적 효과를 나타내고, 또한 ARDS의 치료에 대해 승인된 큰 동물에 효율적인 것을 알았다.
상기 서열 요약
SEQ ID No.1 CGQRETPEGAEAKPWYC
SEQ ID No.2 KSPGGQRETPEGAEAKPWYE
SEQ ID No.3 CGQREAPAGAAAKPWYC
SEQ ID No.4 TPEGAE
SEQ ID No.5 QRETPEGAEAKPWY
SEQ ID No.6 PKDTPEGAELKPWY
SEQ ID No.7 CGPKDTPEGAELKPWYC
SEQ ID No.8 CGQKETPEGAEAKPWYC
SEQ ID No.9 CGQRETPEGAEARPWYC
SEQ ID No.10 CGQRETPEGAEAKPC
SEQ ID No.11 CQRETPEGAEAKPWYC
SEQ ID NO.12 CGQRETPEGAEAKFWYC
SEQUENCE LISTING <110> Apeptico Forschung und Entwicklung GmbH <120> Methods for preventing and treating hyperpermeability <130> R 55450 <150> A 359/2009 <151> 2009-03-05 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Lys Ser Pro Gly Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 1 5 10 15 Pro Trp Tyr Glu 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Cys Gly Gln Arg Glu Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Thr Pro Glu Gly Ala Glu 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Cys Gly Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Cys Gly Gln Lys Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Arg Pro Trp Tyr 1 5 10 15 Cys <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Cys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 11 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Cys Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Phe Trp Tyr 1 5 10 15 Cys

Claims (13)

  1. 세포 손상에 기인한 내피세포 또는 상피세포의 과투과성을 감소시켜 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 환자에 있어서의 부종을 예방하기 위한 약학적 조성물로서,
    아미노산 서열 CGQRETPEGAEAKPWYC로 이루어지고 C 잔기를 통하여 고리화된 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩티드는 C 잔기 사이에 디설파이드 가교를 통하여 고리화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 활성산소 분자에 의해 트리거된 과투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 박테리아 독소에 의해 트리거된 과투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 미오신 경쇄의 인산화를 억제함으로써 과투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 단백질 키나아제 C의 활성을 억제함으로써 과투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 상피 나트륨 채널의 발현을 증가시킴으로써 과투과성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
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