KR101641196B1 - 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 이를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 이를 포함하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체(heteroarylisoquinoline derivatives) 및 그의 염에 관한 것이다. 본 발명의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 화합물은 암 세포에 대한 사멸(apoptosis) 효과가 있으며, 종래의 항암 치료제인 독소루비신(DOX)와 비교하여 정상 세포에 대한 독성이 현저히 낮다. 본 발명의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 화합물은 암 세포에 대한 세포독성(cytotoxicity) 효과 및 토포아이소머라아제(topoisomerases, topos)에 대한 억제 활성이 우수하다. 또한, 종래의 항암제와 비교하여 암세포에 대한 저해농도(IC50)가 낮아 저용량 투여만으로도 암세포에 대한 세포 독성 효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있으며, 특히 본 발명의 화합물은 다양한 암세포 중 특히 유방암 또는 대장암에 대한 세포 독성 효과가 뛰어나다.

Description

헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 이를 포함하는 항암 조성물{Heteroarylisoquinoline Derivatives and Compositions for Treatment of Cancer Comprising the Same}
본 발명은 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 이를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.
초나선(supercoils), 매듭(knots) 및 사슬화(catenation)와 같은 DNA 위상 구조(topological consequences)는 빠르게 성장, 분열 중인 세포의 전사, 복제, 재조합 및 염색체 응축 및 분리와 같은 세포 과정 중에 나타난다[1-3]. 이러한 문제들은 세포 활력에 대하여 언급할 필요가 있다. 실질적으로, 자연은 DNA 초나선 및 복잡한 구조(entanglement)에 관련되는 토포아이소머라아제(topoisomerases, topos)라는 특수한 효소를 가지고 있다. 인간의 지놈은 6 가지 topos를 코딩한다[4,5]. 이들 중, topo I 및 topo II (α, β)는 항암 치료에서의 중요한 타겟이다. topos의 효소적 기능에는 DNA 가닥의 절단, DNA 회전고리/가닥의 이동(passage), 손상된 가닥의 재접합(religation)이 포함된다. DNA 절단(scission) 및 재접합(resealing)은 topos의 티로실 유닛 및 DNA 인산기 간의 가역적인 에스테르 결합전이반응(transesterification)을 통하여 이루어진다. 이러한 과정동안,
분리되기 쉬운 말단을 가진 공유 결합성 topo-DNA 복합체, 즉 ‘토포아이소머라아제 절단 복합제(topoisomerase cleavage complex (topocc)’가 단시간(short-lived) 형성된다. topocc는 화학 물질에 의해 트랩되어(trapped) topos의 DNA 재접합 활성을 억제한다. topocc의 안정화는 영구적인 DNA 손상을 일으키고, 세포 사멸(apoptotic cell death)을 유발한다. 따라서 이러한 topo 억제제는 기능적인 topo를 세포의 치명적인 요소로 전환시킨다. 이와 별론으로, topo 억제제는 다른 단계에서 topos의 기능을 방해한다[5]. topo는 암에서 고발현된다. topo의 발현 증가는 직장, 전립선 및 유방암, 및 백혈병에서 보고되었다[6-8]. 정상 및 암 조직에서 topos의 발현 차이는 topos 억제제를 화학요법 치료제로서 신뢰할 수 있게 한다. Topos 억제제는 세포의 급격한 성장 및 분열에 필요한 필수적인 활성을 방해한다. 또한, 특히 topocc를 동결시키는 topos 억제제는 DNA 손상을 유발하고, 정상세포 대비 암 세포에 유해한 영향을 미친다. 따라서, topos를 타겟으로 한 항암제 개발이 집중적으로 연구되었다. 많은 수의 화학적 유형 중, topos 억제제, 즉 3-아릴이소퀴놀린아민-기반 화합물이 가장 유망하다(도 1).
6-아미노-치환된 벤조[c]페나트리딘(1)은 3-아릴이소퀴놀린아민의 제한된 형태를 나타낸다. 벤조[c]페나트리딘-6-일아민은 기본적으로 자연 알칼로이드인 파가로닌(fagaronine) 및 니티딘(nitidine)의 수용성 유도체[9]이다. 모 화합물과는 달리, 이들은 몇몇 케이스에서 급성 독성 및 낮은 항암활성을 나타내는 요인인 이미늄(iminium) 전하가 없다. 아미노 치환된 니티딘(1)은 세포독성 및 topo I 및 Ⅱ에 대한 억제 효과를 나타낸다. 마찬가지로, 3-아릴이소퀴놀린아민 스캐폴드를 가진 수용성 비-캄프토테신(camptothecin, CPT) topo I 억제제를 개발하는 본 발명자들의 연구 중 일부로서, 테트라사이클릭 평면 스캐폴드 및 topo I 억제에 필요한 C11 케토 그룹을 보존하기 위해 주로 5-아미노-치환된 인데노[1,2-c]이소퀴놀린(2)로 디자인되었고, 물에 대한 용해성 향상시키기 위한 아미노 알킬 말단 또는 헤테로사이클릭 아민을 포함하도록 디자인되었다[10,11]. 견고화된 이소퀴놀린아민과 함께, topo I 억제 활성 및 경구투여에 적합한 물리화학적 특성 및 약동학적 프로파일을 가진 3-아릴이소퀴놀린아민(3)이 잠재적인 세포독성 화합물로 밝혀졌다[12-15]. 이와 달리, 본 발명자들은 또한 이소퀴놀린 고리 내에 추가적인 N을 포함하는 4-아미노-2-페닐퀴나졸린(4)을 합성하였다(도 2)[16].
퀴나졸린에 의한 이소퀴놀린 고리의 대체(replacement)는 DNA 염기 사이에 삽입되는 평면구조를 이루는 트리사리클릭 화합물로서의 장점이 있다. 이를 고려하면, 3-피롤- 및 3-티오펜-치환된 이소퀴놀린아민(5)은 평면 구조를 이루며 topos 억제제로서의 기능이 있을 것이라 예측할 수 있다. 이러한 이유에 근거하여, 본 발명자들은 topos 억제제의 신규한 류(class)로서 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 합성 및 체계적 평가에 대하여 연구하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래의 이소퀴놀린아민 유도체 화합물보다 우수한 항암활성을 나타내는 화합물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 유도체 및 이의 염산염을 합성하였고, 이들의 세포독성, 토포아이소머라아제 (topos) 억제 활성 및 세포 주기 억제효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 그의 염을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 그의 염을 유효성분으로서 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체(heteroarylisoquinoline derivatives)로서 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염(salts)을 제공한다:
화학식 1
Figure 112014088734481-pat00001
상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐 또는 C1-10 알콕시이고, R은 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알킬, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알케닐, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C3-10 헤테로아릴, C1-10 아민, C1-10 아미드, 니트로, 니트록시, 아조 또는 아자이드이다.
본 발명자들은 종래의 이소퀴놀린아민 유도체 화합물보다 우수한 항암활성을 나타내는 화합물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 유도체 및 이의 염산염을 합성하였고, 이들의 세포독성, 토포아이소머라아제 (topos) 억제 활성 및 세포 주기 억제효과를 확인하였다.
본 발명의 이소퀴놀린 유도체(indazole derivatives) 화합물 및 그의 염은 종래에 알려진 바 없는 신규한 화합물로서, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 이소퀴놀린(isoquinoline)을 모핵으로 하여 화학적으로 합성된다.
본 명세서에서, 화학식 1의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체를 정의하기 위하여 사용되는 용어 “히드록시”는 -OH 작용기를 의미한다.
용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 트리데실, 펜타데실 및 헵타데실 등을 포함한다. C1 -10 알킬은 탄소수 1 내지 10의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1 -10 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에 따르면, 화학식 1의 알킬은 C1 -10 알킬이고, 바람직하게는 C1 -5 알킬이다. 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 화학식 1에서 알킬은 메틸 또는 에틸이다.
용어 “알케닐”은 지정된 탄소수를 가지는 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 불포화 탄화수소기를 나타내며, 예컨대, 에테닐, 비닐, 프로페닐, 알릴, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, t-부테닐, n-펜테닐 및 n-헥세닐을 포함한다. C2 -10 알케닐은 탄소수 2 내지 10의 알케닐 유니트를 가지는 알케닐기를 의미하며, C2 -10 알케닐이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에 따르면, 화학식 1의 알케닐은 C2 -10 알케닐이고, 바람직하게는 C2 -5 알케닐이다.
용어 “알콕시”는 1 개의 산소원자와 결합된 알킬기 또는 아릴을 의미한다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로톡시, 아릴옥시 등을 포함한다. C1 -10 알콕시는 탄소수 1 내지 10의 알콕시 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1 -10 알콕시가 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
용어 “헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 헤테로사이클로알킬”은 탄소와 수소 그리고 최소 하나의 헤테로원자(질소, 산소 또는 황)를 포함하는 비-방향족성 사이클릭 탄화수소기를 의미한다. 상기 헤테로원자는 바람직하게는 질소 또는 산소이고, 가장 바람직하게는 질소이다. 본 발명에 따르면, 헤테로원자의 개수는 1-4개, 1-3개, 또는 1-2개이다. C2 -30 헤테로사이클로알킬은 링 구조를 형성하는 탄소의 개수가 1-10인 헤테로사이클로알킬을 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 헤테로사이클로알킬은 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알킬이고, 바람직하게는 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -5 헤테로사이클로알킬이다. 한편, 상기 헤테로사이클로알킬은 전체적으로 또는 부분적으로 치환 또는 비치환된 탄소 고리로서, 상기 헤테로사이클로알킬은 C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다.
용어 “헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 헤테로사이클로알케닐”은 탄소와 수소 그리고 최소 하나의 헤테로원자(질소, 산소 또는 황) 및 최소 하나의 이중결합을 포함하는 비-방향족성 사이클릭 탄화수소기를 의미한다. 상기 헤테로원자는 바람직하게는 산소 또는 질소이고, 가장 바람직하게는 질소이다. 본 발명에 따르면, 헤테로원자의 개수는 1-4개, 1-3개, 또는 1-2개이다. C2 -10 헤테로사이클로알케닐은 링 구조를 형성하는 탄소의 개수가 2-10인 헤테로사이클로케닐을 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 헤테로사이클로알케닐은 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알케닐이고, 바람직하게는 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -5 헤테로사이클로알케닐이다. 한편, 상기 헤테로사이클로알케닐은 전체적으로 또는 부분적으로 치환 또는 비치환된 탄소 고리로서, 상기 헤테로사이클로알케닐은 C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다.
용어 “헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 헤테로아릴”은 탄소와 수소 그리고 최소 하나의 헤테로원자(질소, 산소 또는 황)를 포함하며, 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미한다. C3 -10 헤테로아릴은 탄소수 3 내지 10의 탄소 고리 원자를 가지는 헤테로아릴기를 의미하며, C3 -10 아릴이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 한편, 상기 헤테로아릴은 전체적으로 또는 부분적으로 치환 또는 비치환된 탄소 고리로서, 상기 헤테로아릴은 C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다.
용어 “아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미한다. C6 -30 아릴은 탄소수 6 내지 30의 탄소 고리 원자를 가지는 아릴기를 의미하며, C6 -30 아릴이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 바람직하게는 아릴은 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으며, 예컨대, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C1-C5 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, C1-C5 직쇄 또는 가지쇄 알케닐 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다. 특히 바람직한 아릴 부위는 페닐, 벤질, 나프틸, 피로일, 피로리디닐, 피리디닐, 피리미디닐, 푸리닐, 퀴노리닐, 이소퀴노리닐, 푸릴, 티오페닐, 이미다조릴, 옥사조릴, 티아조릴, 피라조릴 및 티에닐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 “아민(amine)”은 비결합 페어(lone pair)를 갖는 염기성 질소 원자를 포함하는 작용기를 의미한다. C1 -10 아민은 -NH2 또는 탄소수 1 내지 10의 아민 유니트를 가지는 아민기를 의미하며, C1 -10 아민이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에 따르면, 화학식 1에서 C1 -10 아민은 C1 -5 아민 또는 -NH2 이다. 한편, 상기 아민은 C1 -10 아릴, C1 -10 아릴알킬, C1 -10 사이클로알킬 또는 C1 -10 사이클로알케닐, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 아릴알킬은 벤질기이다.
용어 “아미드”는 질소 원자에 결합된 아실기로 구성된 작용기를 의미한다. C1 -10 아미드는 탄소수 1 내지 10의 아미드 유니트를 가지는 아미드기를 의미하며, C1 -10 아미드가 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 발명에 따르면, 화학식 1에서 C1 -10 아미드는 C1 -5 아미드 또는 R-CO-NH-R'이다.
용어 “니트로”는 질소 작용기로서, 1 또는 그 이상의 -NO2를 포함하는 작용기를 의미한다.
용어 “니트록시”는 -O-N=O 작용기를 의미한다.
용어 “아조”는 -N=N-R 작용기를 의미한다. R은 C1 -10 아릴 또는 C1 -10 알킬기이다.
용어 “아자이드(azide)”는 -N3 작용기를 의미한다.
본 발명에 따르면, 상기 화학식 1에서 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1 -5 알킬, C2-5 알케닐 또는 C1 -5 알콕시이이며, 보다 바람직하게는 각각 독립적으로 수소 또는 C1 -2 알킬이다. 본 발명의 일 예에 따르면, 상기 화학식 1에서 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 또는 메틸이다.
본 발명에 따르면, 상기 화학식 1에서 R은 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -5 헤테로사이클로알킬, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -55 헤테로사이클로알케닐, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C3-5 아릴, C1 -5 아민, C1 -5 아미드 또는 아자이드이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 R은
Figure 112014088734481-pat00002
,
Figure 112014088734481-pat00003
,
Figure 112014088734481-pat00004
,
Figure 112014088734481-pat00005
,
Figure 112014088734481-pat00006
,
Figure 112014088734481-pat00007
, -NHBn, -N3 또는 -NH2이다.
본 발명의 화학식 1에서 R의 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알케닐 또는 아릴은 C1 -5 알킬, C2-5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있으며, R의 아민은 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C1 -5 알콕시, 히드록시, 할로 또는 이들의 조합에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화학식 1에서 상기 헤테로원자는 질소 또는 산소이다.
본 발명에서 합성되는 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 및 그의 염은 1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1-일-아민, 1-아자이도-5-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 벤질-(6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1-일)-아민, 7-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-7-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-[1,4]디아제판-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 벤질-[3-(1,5-디메틸-1H-피롤-2-일)-5-메틸이소퀴놀린-1-일]-아민 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure 112014088734481-pat00008
상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1 -10 알킬, C2 -10 알케닐 또는 C1-10 알콕시이고, R은 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알킬, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C2 -10 헤테로사이클로알케닐, 헤테로원자로서 질소, 산소 또는 황을 포함하는 C3 -10 헤테로아릴, C1 -10 아민, C1 -10 아미드, 니트로, 니트록시, 아조 또는 아자이드이다.
본 발명의 화합물은 토포아이소머라아제 억제제(topoisomerases inhibitors)로서 암을 예방하거나 치료하는데 매우 유효하다. 특히, 본 발명의 몇몇의 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 비-암성(non-cancerous) 인간 유방 상피세포(MCF-10A) 및 전립선암 세포(DU145) 보다 인간 유관 상피 종양 세포(ductal breast epithelial tumor cell)인 T47D에 대하여 선택적인 세포독성을 나타내었다. 인간 대장 선암(HCT-15)에서 이들 화합물의 유도체 대부분은 캠토테신(CPT), 데토포사이드 및 독소루비신(DOX)보다 높은 세포독성을 나타내었다. 일반적으로, 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 topo Ⅱ보다 topo Ⅰ에 대하여 높은 친화력을 나타내며, 높은 topo Ⅰ 억제 효과를 가진 본 발명의 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 강한 세포독성을 나타내었다. 강한 topo I 및 보통의 topo Ⅱ 활성을 가진 피페라진-치환된 유도체, 5b는 DNA 염기 사이에 삽입되어 H-결합을 통하여 도킹(docking) 모델의 DNA 절단 부에서 topos와 상호작용한다. 게다가, 유세포 분석에서 세포독성의 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 세포사멸(apoptosis) 전 세포 주기의 서로 다른 단계(phase)에서 인간 자궁경부암 세포(HeLa)의 축적을 일으킨다고 나타났다. 이로써 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 topos와 관련된 강한 세포독성 및 세포 주기 억제 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
본 발명자들은 신규한 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 유도체를 디자인 및 합성한 후 상술한 이들의 항암활성과 관련된 체계적 평가를 통하여 topos 억제제로서의 새로운 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다. 본 발명의 암 ?방 또는 치료용 조성물은 상술한 본 발명의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 화합물을 이용한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물은 암 세포에 대한 사멸(apoptosis) 효과가 있으며, 종래의 유방암 화학치료제인 독소루비신(DOX)와 비교하여 정상 세포에 대한 독성이 낮다. 예컨대, 본 발명의 화합물 피페리딘 (5a, 5h 및 5n), 모르폴린 (5e, 5l 및 5r), -NHBn (5m) 및 -NH2 (5f) 치환된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 및 이들의 염산염은 유방암 세포에 대하여 선택적인 세포독성을 나타내었으며, 정상 유선세포에서는 독성을 나타내지 않았다.
한편, 본 발명의 N4-비치환된 피페라지닐 이소퀴놀린(5b, 5i 및 5o) 및 이들의 염은 유방암 세포 및 전립선암 세포에서 강한 독성을 나타내었으며, 특히 화합물 5p·HCl 및 5q·HCl는 유방암 세포에 대하여 가장 강력한 세포 독성 효과를 나타내는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민으로 나타났다. 본 발명의 화합물 5s는 유방암 세포에서 강한 독성을 나타내었다.
본 발명의 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 대장암 세포에서도 강한 세포 독성을 나타낸다. 예컨대, 피페리딘(5a, 5h 및 5n), N4-비치환된 피페라진 (5b, 5i 및 5o), N4-메틸 피페라진 (5c, 5j 및 5p), N4-에틸 피페라진 (5k 및 5q), 호모피페라진 (5s) 및 -NH2 (5f) 치환된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 또는 이들의 염산염은 종래의 항암제인 캠토테신(CPT), 에토포사이드 및 DOX보다 강한 세포독성을 나타내었다(표 4 참조).
본 발명의 조성물은 암 세포에 대한 세포독성 효과 외에 토포아이소머라아제(topoisomerases, topos)의 활성을 억제하는 기능이 있으며, topo Ⅰ 및 topo Ⅱ 중 특히 topo Ⅰ에 대한 억제 활성이 우수하다. 예컨대, 본 발명의 화합물 5b, 5c, 5i, 5n, 5q, 5r 및 이들의 염산염과 같은 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 CPT와 유사한 또는 이보다 우수한 topo Ⅰ 억제 활성을 나타내었다. 화합물 5a, 5h·HCl, 5l·HCl 및 5m은 중간 정도의 topo I 또는 II 억제 활성을 가지지만 강력한 세포 독성 효과를 나타내는 화합물이다. 이들 화합물은 세포 사멸과 관련하여 topos 외에 다른 타겟이 있을 것으로 예상된다.
본 발명자들은 topo Ⅰ 및 topo Ⅱ 억제 활성을 나타내는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민
본 발명자들은 topos 억제에 관련된 가능한 상호작용을 이해하기 위하여, 분자 도킹 툴(molecular docking tools)을 이용하여 DNA-topo I/Ⅱ 복합체 및 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 가상의 결합 모델을 구축하였다. 이를 통하여, 본 발명의 화합물 5b의 이소퀴놀린 N은 수소 결합에 의해 topo I의 Arg364와 연관되어 있음을 밝혔다.
본 발명의 조성물이 암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암이란 특별히 한정되지 않으며, 예컨대 본 발명의 조성물은 유방암, 대장암, 전립선암, 자궁경부암, 위암, 피부암, 입암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 식도암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 기관지암, 결장암 또는 난소암의 예방 또는 치료용 조성물로 적용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체(heteroarylisoquinoline derivatives) 및 그의 염에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 화합물은 암 세포에 대한 사멸(apoptosis) 효과가 있으며, 종래의 항암 치료제인 독소루비신(DOX)와 비교하여 정상 세포에 대한 독성이 현저히 낮다.
(c) 본 발명의 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체 화합물은 암 세포에 대한 세포독성(cytotoxicity) 효과 및 토포아이소머라아제(topoisomerases, topos)에 대한 억제 활성이 우수하다.
(d) 또한, 본 발명의 화합물은 종래의 항암제와 비교하여 암세포에 대한 저해농도(IC50)가 낮아 저용량 투여만으로도 암세포에 대한 세포 독성 효과를 나타낼 수 있다는 장점이 있으며, 특히 본 발명의 화합물은 다양한 암세포 중 특히 유방암 또는 대장암에 대한 세포 독성 효과가 뛰어나다.
도 1은 3-아릴이소퀴놀린아민-기반(based) topos 억제제를 나타낸다: 6-아미노-치환된 벤조[c] 펜안트리딘 (1), 5-아미노-치환된 인데노[1,2-c]이소퀴놀린 (2) 및 3-아릴이소퀴놀린아민(3).
도 2는 4-아미노-2-페닐퀴나졸린 (4) 및 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민(5)을 나타낸다.
도 3은 3-피롤릴이소퀴놀린아민 5t를 나타낸다.
도 4는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5 및 그의 염산염의 토포아이소머라아제 I 억제 활성을 나타낸다. Lane D: pBR322 only, lane T: pBR322 + topo I, lane C: pBR322 + topo I + CPT, 나머지 lane: pBR322 + topo I + 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 및 그의 염.
도 5는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5 및 그의 염산염의 토포아이소머라아제 Ⅱ 억제 활성을 나타낸다. Lane D: pBR322 only, lane T: pBR322 + topo Ⅱ, lane E: pBR322 + topo Ⅱ + etoposide, 나머지 lane: pBR322 + topo Ⅱ + 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 및 그의 염산염.
도 6a 내지 도 6d는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5b와 DNA-topo I(A 및 C) 또는 DNA-topo Ⅱb (B 및 D) 복합체의 가상 결합 모델을 나타낸다. 탄소 유닛은 녹색, 뉴클레오타이드는 보라색, 아미노산은 회색으로 나타내었다. 수소결합은 황색 점선으로 표시된다.
도 7a 내지 도 7e는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 처리에 대한 (A) 유방선암 세포(MCF-7), 위암 세포(MKN-28), (C) 폐선암 상피세포(A549), 자궁경부암세포(HeLa) 및 (D) 마우스 흑색종 세포(B16)의 세포 생존율을 나타낸다. 세포 생존율(Cell viability)은 MTT 어세이를 이용하여 48시간 후에 측정하였다. CPT는 양성 대조군으로서, 0.04 μM, 0.4 μM 및 4 μM으로 처리하였다. DOX 또한 양성 대조군으로서, 0.1 μM, 1 μM 및 10 μM로 처리하였다. 각 컬럼은 2회 실험에 대한 평균 수치를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 자궁경부암 세포인 HeLa 세포에서의 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민(5b, 5b·HCl, 5d, 5d·HCl 5f 및 5f·HCl)의 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 효과를 나타낸다. M1, 사멸세포(sub-G0/G1); M2, G0/G1기 세포; M3, S기 세포; M4, G2/M기 세포.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
합성예
합성 모식도 1
Figure 112014088734481-pat00009
* 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5의 합성 - 시약 및 조건: (i) n-BuLi, dry THF, -78℃; (ⅱ) POCl3, 50℃; (ⅲ) 아민, K2CO3, DMF, 110℃; (ⅳ) NaN3, DMF, 100℃; (ⅴ) c-HCl, 아세톤.
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5 는 종래 보고된 합성단계에 따라 주로 합성되었다[13]. 합성은 3-헤테로아릴이소퀴놀론 8을 얻기 위하여, 리튬화된(lithiated) 톨루아미드 6 및 헤테로아릴니트릴 7의 고리화 부가반응(cycloaddition)에 의해 시작된다(합성모식도 1). 이어, 포스포러스 옥시클로라이드(POCl3)에 의해 이소퀴놀론 8을 이소퀴놀리닐 클로라이드 9로 aromatized 하였다. 최종적으로, 이민 클로라이드 9와 헤테로사이클릭 (피페리딘, 피페라진, 모르폴린 및 호모피페라진) 및 지방족(벤질) 아민의 1-아미노화는 이소퀴놀린아민 5a-5e 및 5h-5t를 생성하였다(표 1 및 도 3). 피페리디닐, 피페라지닐 및 몰폴리닐 유도체를 농축된 염산으로 처리하여 염산염을 생성하였다. 9b에 소듐 아자이드를 처리하여 아자이도이소퀴놀린 5g를 생성하였다. 초기 이소퀴놀린 아민 5f는 NaHCO3 및 DMF 존재 하에서, 이소퀴놀리닐 클로라이드 9a에 암모니아를 처리하고 가열하여 수득하였다(합성모식도 2).
3-티오페닐이소퀴놀린아민 5a-s의 합성
Figure 112014088734481-pat00010
Figure 112014088734481-pat00011
합성 모식도 2
Figure 112014088734481-pat00012

* 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5f의 합성 - 시약 및 조건: (i) NH4OH, NaHCO3, DMF, 50℃; (ⅱ) LiNMe2, HMPA, dry THF, -78℃; (ⅲ) c-HCl, 아세톤.
한편, 화합물 5f는 헥사메틸포스포그아미드(HMPA) 존재 하 리듐화된 톨루니트릴 7c 및 티오펜니트릴 7a의 커플링 반응에 의해서도 수득할 수 있다.
화학반응
녹는점은 MEL-TEMP모세관 녹는점 측정기구를 사용하여 모세관 방법에 의해 결정되었다. IR 스펙트럼은 KBr 펠렛을 사용하여 JASCO FT/IR 300E 퓨리에 변환 적외선 분광기에서 측정하였다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 한국기초과학지원연구원에서 Varian Unity Plus 300 MHz 및 Varian Unity Inova 500 MHz 분광기로 측정하였다. 화학적 이동(shift)은 백만분의 1 (ppm) 다운필드로서 경두개자기자극술(TMS)로 측정하였다(δ = 0). 커플링 상수 J는 Hertz로 주어졌다. 데이터는 다음의 순서로 기록되었다: 화학적 이동(chemical shift), 다양성(multiplicity), 커플링상수(coupling constant), 및 양성자 수. 양성자 시그널의 다양성은 각각 s: singlet, d: doublet, t: triplet, q: quartet, m: multiplet 및 dd: double doublet으로 기록되었다. 질량스펙트럼은 전자 스프레이 이온화(ESI) 방법을 사용하는 Shimadzu LCMS-2010 EV 액체 크로마토그래피 질량 분석기로 측정하였다. 고해상 질량 스펙트럼은 Waters Synapt HDMS 질량 분석기로 측정하였다. 성분 분석은 Thermo Fischer Flash 2000 성분분석기를 사용하였으며, 수치는 이론상 수치의 ±0.4% 이내로 나타났다. 컬럼 크로마토그래피는 Merck 실리카겔 60 (70-230 메쉬)로 수행하였다. TLC는 실리카겔 60 F254 (Merck)로 코팅된 플레이트를 사용하였다. 화학 시약은 Sigma-Aldrich 및 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.에서 구입하였으며, 추가적인 정제없이 사용하였다. 용매는 사용 전 증류하였다: THF는 소듐/벤조페논으로 증류하였다. 모든 반응은 자석 스터링(stirring)되는 오븐-건조된 유리용기에서 질소공기 하에서 수행하였다.
3-티오펜-2-일-2H-이소퀴놀린-1-온 (8a)
-78℃에서, 건조 THF (5 mL) 존재 하 N,N-디에틸-2-메틸-벤즈아미드 6a 및 (955 mg, 5 mmol) 및 티오펜-2-카보니트릴 7a (681 mg g, 6.25 mmol) 용액에, 건조 THF (20 mL) 존재 하 n-부틸리튬(7.5 mL, 헥산 존재 하 1.6 M, 12 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 같은 온도에서 6시간동안 혼합하였다. 물을 첨가하여 반응을 중단시키고, 에틸 아세테이트로 농축하였다. 유기막은 브린으로 세척하였고, 진공상태에서 소듐 설페이트로 건조시켜 농축하였다. 크루드 생성물을 n-헥산-에틸 아세테이트를 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체인 화합물 8a를 수득하였다(400 mg, 35%). Mp: 198-200 ℃. IR (cm-1): 3451 (N-H), 1647 (C=O). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 11.16 (s, 1H, NH), 8.42 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 8-H), 7.86 (d, J = 3.6 Hz, 1H, Ar), 7.66 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Ar), 7.56 (d, J = 7.5 Hz, 1H, Ar), 7.48 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Ar), 7.39 (d, J = 5.1 Hz, 1H, Ar), 7.19 (t, J = 5.1 Hz, 1H, Ar), 6.82 (s, 1H, 4-H).
5- 메틸 -3-티오펜-2-일-2H-이소퀴놀린-1-온 (8b)
화합물 8a의 합성과정을 이용하여, 건조 THF 하에서, N,N-디에틸-2,3-디메틸-벤트아미드 6b(2.05 g, 10 mmol), 티오펜-2-카보니트닐 7a (1.36 g, 12.5 mmol), 및 n-부틸리튬 (헥산 존재 하 2.5M, 9.6 mL, 24 mmol)을 이용하여 8b를 합성하였다(1.3 g, 54%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δd (ppm): 11.85 (s, 1H, NH), 8.28 (d, J ¼ 7.8 Hz, 1H, 8-H), 7.98 (d, J = 2.7 Hz, 1H, Ar), 7.48-7.46 (m, 1H, Ar), 7.38-7.32 (m, 2H, Ar), 7.20-7.17 (m, 1H, Ar), 6.89 (s, 1H, 4-H), 2.56(s, 1H, 5-CH3).
6- 메틸 -3-티오펜-2-일-2H-이소퀴놀린-1-온 (8c)
화합물 8a의 합성과정을 이용하여, 건조 THF (50 mL) 하, N,N-디에틸-2,4-디메틸-벤즈아미드 1e (4.52 g, 22 mmol), 티오펜-2-카보니트릴 7a (3 g, 27.5 mmol) 및 n-부틸리튬 (헥산 존재 하 1.6M, 33 mL, 52.9 mmol)을 이용하여 황색 고체 화합물 8c를 합성하였다(2.14 g, 40%). Mp: 224-225℃. IR (cm-1): 3434(N-H), 1652 (C=O). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 10.8 (s, 1H, NH), 8.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 8-H), 7.80-7.79 (m, 1H, Ar), 7.39-7.35(m, 2H, Ar), 7.30 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar), 7.19-7.16 (m, 1H, Ar), 6.75 (s, 1H, 4-H), 2.49 (s, 3H, 6-CH3).
7- 메틸 -3-티오펜-2-일-2H-이소퀴놀린-1-온 (8d)
화합물 8a의 합성과정을 이용하여, 건조 THF (50 mL) 하, N,N-디에틸-2,5-디메틸-벤즈아미드 6d (5.27 g, 25.7 mmol), 티오펜-2-카보니트릴 7a (3.5 g, 32.1 mmol) 및 n-부틸리튬(헥산 존재 하 1.6 M, 39 mL, 61.7 mmol)을 이용하여 황색 고체 화합물 8d를 합성하였다(3.18 g, 50%). Mp: 219-222 ℃. IR(cm-1): 3439 (N-H), 1639 (C=O). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 10.78 (s, 1H, NH), 8.21 (s, 1H, 8-H), 7.77-7.75 (m, 1H, Ar), 7.51-7.45 (m, 2H, Ar), 7.37 (dd, J = 5.1, 1.2 Hz, 1H, Ar), 7.19-7.16 (m, 1H, Ar), 6.79 (s, 1H, 4-H), 2.50 (s, 3H, 7-CH3).
3-(1,5-디메틸-1H-피롤-2-일)-5- 메틸 -2H-이소퀴놀린-1-온 (8e)
화합물 8a의 합성과정을 이용하여, 건조 THF 하, N,N-디에틸-2,3-디메틸-벤즈아미드 6b (1.02 g, 4.99 mmol), 1,5-디메틸1H-피롤-2-카보니트릴 7b (750 mg, 6.24 mmol) 및 n-부틸리튬 (헥산 존재 하 2.5 M, 5 mL, 12 mmol)를 이용하여, 화합물 8e (1 g, 79%)를 합성하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 10.12 (s, 1H, NH), 8.24 (d, J = 8.1 Hz, 1H, 8-H), 7.47 (d, J = 6.9 Hz, 1H, 6-H), 7.32 (t, J = 7.8 Hz, 1H, 7-H), 6.58 (s, 1H, 4-H), 6.45 (d, J = 3.6 Hz, 1H, 3-H), 6.02 (dd, J = 3.6, 0.6 Hz, 1H, 4-H), 3.66 (s, 3H, NCH3), 2.53 (s, 3H, 5-CH3), 2.32 (s, 3H, 5-CH3).
1- 클로로 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (9a)
화합물 8a (300 mg, 1.32 mmol) 및 POCl3 (10 mL)을 50℃에서 overnight으로 혼합하였다. 과량의 POCl3 및 휘발성 부산물은 진공증류법으로 제거하였다. 잔류물을 아이스워터로 처리한 후, 포화 NaHCO3 용액으로 중화시키고 에틸아세테이트로 농축하였다. 유기막은 브린으로 세척하고 Na2SO4 하에서 건조시킨 후 진공 하에서 농축하였다. 크루드 생산물을 n-헥산-에틸 아세테이트을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후 황색 고체 화합물인 9a를 수득하였다(213 mg, 66%). Mp: 106-107 ℃. IR (cm-1): 3030 (Ar--H). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar), 7.83-7.78 (m, 2H, Ar), 7.71-7.66 (m, 2H, Ar), 7.61-7.55 (m, 1H, Ar), 7.40-7.38 (m, 1H, Ar), 7.14-7.11 (m, 1H, Ar).
1- 클로로 -5- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (9b)
화합물 9a의 합성과정을 이용하여, 화합물 8b (1.1 g, 4.55 mmol) 및 POCl3을 이용하여 화합물 9b를 합성하였다(800 mg, 67%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.99 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar), 7.78 (s, 1H, 4-H), 7.62 (d, J = 3.7 Hz, 1H, Ar), 7.40-7.32 (m, 3H, Ar), 7.07 (dd, J = 4.9, 3.7 Hz, 1H, Ar), 2.57 (s, 3H, 5-CH3).
1- 클로로 -6- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (9c)
화합물 9a의 합성과정을 이용하여, 화합물 8c (2 g, 8.3 mmol) 및 POCl3 (20 mL)를 이용하여 황색 고체 화합물 9c를 합성하였다(1.9 g, 88%). Mp: 88-89 ℃. IR (cm-1): 3023 (Ar--H). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar), 7.75 (s, 1H, Ar), 7.68 (dd, J = 4.8, 1.2 Hz, 1H, Ar), 7.55 (s, 1H, Ar), 7.42-7.37 (m, 2H, Ar), 7.14-7.11 (m, 1H, Ar), 2.53 (s, 3H, 6-CH3).
1- 클로로 -7- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (9d)
화합물 9a의 합성과정을 이용하여, 화합물 8d (2 g, 8.3 mmol) 및 POCl3 (20 mL)를 이용하여 황색 고체 화합물 9d를 합성하였다(1.95 g, 85%). Mp: 90-92 ℃. IR (cm-1): 3048 (Ar--H). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1H NMR (300 MHz, CDCl3) d: 8.02-8.01 (m, 1H, Ar), 7.79 (s, 1H, Ar), 7.70-7.65 (m, 2H, Ar), 7.51 (dd, J = 9.4, 1.6 Hz, 1H, Ar), 7.37 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.13-7.10 (m, 1H, Ar), 2.54 (s, 3H, 7-CH3).
1- 클로로 -3-(1,5-디메틸-1H-피롤-2-일)-5- 메틸이소퀴놀린 (9e)
화합물 9a의 합성과정을 이용하여, 화합물 8e (1 g, 3.96 mmol) 및 POCl3으로 화합물 9e를 합성하였다(600 mg, 55%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.08 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar), 7.79 (s, 1H, 4-H), 7.45-7.36 (m, 2H, Ar), 6.51 (d, J = 3.6 Hz, 1H, 3-H), 5.98 (dd, J = 3.5, 0.6 Hz, 1H, 4-H), 3.84 (s, 3H, NCH3), 2.61 (s, 3H, 5-CH3), 2.29 (s, 3H, 5-CH3).
1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5a)
DMF 존재 하, 화합물 9a (100 mg, 0.4 mmol), 피페리딘 (52 mg, 0.6 mmol) 및 포타슘 카보네이트 (283 g, 2.05 mmol)의 혼합물을 overnight으로 환류시켰다. 반응혼합물을 실온에서 냉각시킨 후 물로 희석하고 에틸아세테이트로 농축하였다. 유기막은 브린으로 세척하고, Na2SO4 하에서 건조시킨 후 진공 하에서 농축하였다. 크루드 생성물은 CH2Cl2-MeOH (15:1)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 암녹색의 고체 화합물 5a를 수득하였다(95 mg, 79%). 프리 베이스를 아세톤에 용해시켜 농축 염산처리하였다. 이어 고상 화합물을 필터링하여 5a 염산염을 수득하였다(밝은 갈색 고체). Mp: 84-85 ℃. IR (cm-1): 3071 (Ar--H), 2927, 2846. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.98 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.69-7.66 (m, 1H, Ar), 7.62 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.56-7.48 (m, 2H, Ar), 7.40-7.35 (m, 1H, Ar), 7.30 (dd, J = 1.1, 5.1 Hz, 1H, Ar), 7.09-7.06 (m, 1H, Ar), 3.46-3.42 (m, 4H, N(CH2)2), 1.86-1.79 (m, 4H, 3-CH2, 5-CH2), 1.77-1.65 (m, 2H, 4-CH2). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 161.5 (1-C), 146.3 (3-C), 143.9 (2-C), 138.9 (4a-C), 129.6 (6-C), 127.8, 127.2, 126.2, 125.8, 125.2, 123.2, 120.8 (8a-C), 108.6 (4-C), 52.4 (2-C, 6-C), 26.1 (3-C, 5-C), 24.9 (4-C). 13C NMR (5a·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.2 (1-C),145.0 (3-C), 142.9 (2-C), 138.6 (4a-C), 130.5 (6-C), 128.4, 127.5, 127.3, 126.1, 125.5, 124.0, 119.8 (8a-C), 108.9 (4-C), 52.2 (2-C, 6-C), 25.4 (3-C, 5-C), 24.2 (4-C). MS (ESI) m/z 295 (M+H)þ. Anal. Calcd. for C18H18N2S : 0.1C4H8O2: C, 72.88; H, 6.25; N, 9.24; S, 10.57. Found C, 73.29; H, 6.09; N, 9.40; S, 10.17.
1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5b)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9a (270 mg, 1.1 mmol), 피페라진 (142 mg, 1.6 mmol) 및 K2CO3 (761 mg, 5.5 mmol)을 이용하여 아이보리 고체 화합물 5b를 합성하였다(236 mg, 72%). 프리베이스를 5b 염산염으로 변화시켰다(갈색 고체). Mp: 152-154 ℃. IR (cm-1): 3403 (N-H), 3066(Ar--H), 2947, 2832. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.02 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar), 7.74 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar), 7.65 (d, J = 2.8 Hz, 1H, Ar), 7.59-7.54 (m, 2H, Ar), 7.46-7.43 (m, 1H, Ar), 7.35-7.33 (m, 1H, Ar), 7.12-7.09 (m, 1H, Ar), 3.61-3.48 (m, 4H, 10-N(CH2)2), 3.22-3.20 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.96 (s, 1H, NH). 13C NMR (5b·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.3 (1-C), 144.9 (3-C), 143.1 (2-C), 138.6 (4a-C), 130.7 (6-C), 128.5, 127.5, 127.4, 126.5, 125.4, 124.0, 119.6 (8a-C), 109.7 (4-C), 47.6 (2-C, 6-C), 42.5 (3-C, 5-C). MS (ESI) m/z 296 (M+H)+. Anal. Calcd. for C17H17N3S · 0.45CH2Cl2: C, 62.82; H, 5.41; N, 12.6. Found C, 62.86; H, 5.45; N, 12.64.
1-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5c)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9a (500 mg, 2.04 mmol), N-메틸피페라진 (306 mg, 3.06 mmol) 및 K2CO3 (1.4 g, 10.2 mmol)을 이용하여 갈색 고체 화합물 5c를 합성하였다(600 mg, 95%). 프리베이스는 5c ·염산염으로 변화시켰다(황갈색 고체). Mp: 64-66 ℃. IR (cm-1): 3050 (Ar--H), 2969, 2885, 2931, 2832. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.02 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.64 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.55-7.52 (m, 2H, Ar), 7.44-7.39 (m, 1H, Ar), 7.33 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.10 (dd, J = 5.1, 3.7 Hz, 1H, Ar), 3.58-3.55 (m, 4H, 10-N(CH2)2), 2.72-2.68 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.40 (s, 3H, NCH3). 13C NMR (5c·HCl) (125 MHz, DMSO d6) δ (ppm): 158.8 (1-C), 144.9 (3-C), 143.1 (2-C), 138.6 (4a-C), 130.7 (6-C), 128.5, 127.6, 127.4, 126.5, 125.3, 124.1, 119.5 (8a-C),109.7 (4-C), 52.1 (3-C, 5-C), 47.5 (2-C, 6-C), 42.2 (4-NCH3). MS (ESI) m/z 310 (M+H)+. Anal. Calcd. for C18H19N3S · 0.1C4H8O2 · 0.1H2O: C, 69.05; H, 6.30; N, 13.13; S, 10.02. Found C, 69.01; H, 6.16; N, 13.13; S, 10.10.
1-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5d)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9a (250 mg, 1.02 mmol), 1-에틸피페라진 (175 mg, 1.53 mmol) 및 K2CO3 (704 mg, 5.1 mmol)을 이용하여 암녹색 액상 화합물 5d를 합성하였다(260 mg, 79%). 프리베이스는 5d·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.01 (s, 1H, Ar), 7.74-7.72 (m, 1H, Ar), 7.64 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz,1H, Ar), 7.58-7.53 (m, 2H, Ar), 7.44-7.39 (m,1H, Ar), 7.33 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.10 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 3.58 (t, J = 4.7 Hz, 4H, 10-N(CH2)2), 2.74 (t, J = 4.7 Hz, 4H, 4-N(CH2)2), 2.54 (q, J = 7.2 Hz, 2H, NCH2CH3), 1.17 (t, J = 7.2 Hz, 3H, NCH2CH3). 13C NMR (5d·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 158.9 (1-C), 144.9 (3-C), 143.1 (2-C), 138.6 (4a-C), 130.7 (6-C), 128.5, 127.6, 127.4, 126.5, 125.3, 124.1, 119.5 (8a-C), 109.7 (4-C), 50.7 (3-C, 5-C), 50.0 (4-NCH2CH3), 47.5 (2-C, 6-C), 8.8 (4-NCH2CH3). MS (ESI) m/z 324 (M+H)+.
1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5e)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9a (400 mg, 1.6 mmol), 모르폴린 (428 mg, 4.9 mmol) 및 K2CO3 (1.1 g, 8.2 mmol)을 이용하여 회색 고체 화합물 5e를 합성하였다(386 mg, 80%). 프리베이스는 5e·염산염으로 변화시켰다(밝은 황색 고체). Mp: 125-126 ℃. IR (cm-1): 3063 (ArH), 2955, 2844. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.03 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar), 7.75 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar), 7.65 (dd, J = 3.7, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.60-7.53 (m, 2H, Ar), 7.44 (t, J = 7.6 Hz, 1H, Ar), 7.34 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.12 (dd, J = 5.0, 3.7 Hz, 1H, Ar), 4.00-3.97 (m, 4H, O(CH2)2), 3.53-3.50 (m, 4H, N(CH2)2). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) d: 160.3 (1-C), 145.9 (3-C), 143.9 (2-C), 138.9 (4A-C), 129.9 (6-C), 127.9, 127.4, 126.4, 125.6, 125.4, 123.4, 120.4 (8a-C), 109.4 (4-C), 66.9 (3-C, 5-C), 51.6 (2-C, 6-C). 13C NMR (5e·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.9 (1-C), 145.2 (3-C), 143.2 (2-C),138.6 (4a-C),130.4 (6-C), 128.4, 127.5, 127.3, 126.2, 125.4, 123.9, 119.6 (8a-C), 109.1 (4-C), 66.1 (3-C, 5-C), 51.4 (2-C, 6-C). MS (ESI) m/z 297 (M+H)+. Anal. Calcd. for C17H16N2OS: C, 68.89; H, 5.44; N, 9.45; S, 10.82. Found C, 68.72; H, 5.48; N, 9.36; S, 10.74.
3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1- 일아민 (5f)
화합물 9a (100 mg, 0.4 mmol), 암모튬 히드록사이드 (28% NH3 함량, 77 mg) 및 소듐 바이카보네이트 (172 mg, 2.04 mmol)의 혼합물을 50℃에서 48 시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 후 에틸아세테이트로 농축하였다. 유기막을 브린으로 세척하여, 소듐 설페이트로 건조시킨 후 진공에서 농축하였다. 크루드 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 어두운 semi-고체 화합물 5f를 수득하였다(23 mg, 24%). 프리베이스는 5f·염산염으로 변화시켰다(아이보리 고체).
또는, -78℃에서, 건조 THF 존재 하 LiNMe2 (5 mL, 3.3 mmol) 및 헥사메틸포스포아미드(596 mg, 3.3 mmol)의 혼합물에 건조 THF 존재 하 o-톨루니트릴 (351 mg, 3 mmol) 및 티오펜-2-카보니트릴 (654 mg, 6 mmol)의 용액을 점적한다. 같은 온도에서 하루동안 반응을 유지시켰다. 이후 물을 첨가하여 반응을 중지시키고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기막은 브린으로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조시킨 후 진공에서 농축하였다. 크루드 생성물은 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 어두운 semi-고체 화합물인 5f를 수득하였다(140 mg, 20%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.64-7.58 (m, 3H, Ar), 7.49 (m, 1H, Ar), 7.35 (s, 1H, 4-H), 7.30-7.28 (m, 2H, Ar), 7.06 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 5.35 (s, 2H, NH2). 13C NMR (5f·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 155.6 (1-C), 137.2 (3-C), 134.9 (2-C), 132.5 (4a-C), 129.3, 128.7, 128.2, 127.8, 127.7, 125.5, 116.6 (8a-C), 107.0 (4-C). MS (ESI) m/z 268 (M+CH3CN+H)+, 227 (M+H)+.
1- 아자이도 -5- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5g)
DMF 존재 하 화합물 9b (500 mg, 1.92 mmol) 용액에, 소듐 아자이드 (187 mg, 2.88 mmol)를 첨가한 후, 상기 혼합물을 100℃에서 overnight으로 가열하였다. 이어, 반응혼합물을 냉각시키고, 물로 희석한 뒤 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기막은 브린으로 세척하고, 소듐 설페이트 하에서 건조시킨 후 진공에서 농축시켰다. 크루드 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 아이보리 고체 화합물 5g를 수득하였다(450 mg, 87%). Mp: 172-174 ℃. IR (cm-1): 3104 (ArH), 2972, 2863. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.62-8.59 (m, 1H, Ar), 8.31 (dd, J = 3.8, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.77 (s, 1H, 4-H), 7.65-7.61 (m, 2H, Ar), 7.58 (dd, J = 5.1, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.28-7.25 (m, 1H, Ar), 2.76 (s, 3H, 5-CH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 148.5 (1-C), 134.7 (3-C), 132.5 (2-C), 132.4 (4a-C), 130.8, 130.1, 128.8, 128.5, 128.4, 128.2, 122.8, 118.5, 110.5 (4-C), 19.5 (5-CCH3). Anal. Calcd. for C14H10N4S: C, 63.14; H, 3.78; N, 21.04; S, 12.04. Found C, 62.94; H, 3.87; N, 20.74; S, 12.28.
6- 메틸 -1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5h)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9c (600 mg, 2.3 mmol), 피페리딘 (587 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 밝은 황색 고체 화합물 5h를 합성하였다(632 mg, 89%). 프리베이스는 5h· 염산염으로 변화시켰다(밝은 황색 고체). Mp: 106-108 ℃. IR (cm-1): 3062 (ArH), 2927, 2853. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 7.62 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.48-7.45 (m, 2H, Ar), 7.31 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.25-7.22 (m, 1H, Ar), 7.11-7.08 (m, 1H, Ar), 3.46-3.43 (m, 4H, N(CH2)2), 2.48 (s, 3H, 6-CH3), 1.87-1.80 (m, 4H, 3-CH2, 4-CH2), 1.74-1.67 (m, 2H, 4-CH2). 13C NMR (5h·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.0 (1-C), 144.9 (3-C), 142.8 (2-C), 140.4 (6-C), 138.9 (4a-C), 128.3, 128.1, 127.2, 126.3, 125.4, 123.9, 118.0 (8a-C), 108.6 (4-C), 52.2 (2-C, 6-C), 25.4 (3-C, 5-C), 24.2 (4-C), 21.3 (6-CCH3). MS (ESI) m/z 309 (M+H)+. Anal. Calcd. for C19H20N2S: C, 73.99; H, 6.54; N, 9.08. Found C, 73.86; H, 6.44; N, 9.45.
6- 메틸 -1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5i)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9c (600 mg, 2.3 mmol), 피페라진 (594 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 녹갈색 고체 화합물 5i를 합성하였다(495 mg, 70%). 프리베이스는 5i·염산염으로 변화시켰다(밝은 황색). Mp: 72-74 ℃. IR (cm-1): 3418 (N-H), 3067(ArH), 2933, 2836. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 7.63 (dd, J = 3.6, 1.0 Hz, 1H, Ar), 7.51-7.49 (m, 2H, Ar), 7.32 (dd, J = 5.0, 1.0 Hz, 1H, Ar), 7.25 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 1H, Ar), 7.10 (dd, J = 5.0, 3.7 Hz, 1H, Ar), 3.51-3.47 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 3.19-3.16 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.59 (s, 1H, NH), 2.49 (s, 3H, 6-CH3). 13C NMR (5i·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.1 (1-C), 145.0 (3-C), 143.2 (2-C), 140.5 (6-C), 138.9 (4a-C), 128.5, 128.4, 127.3, 126.4, 125.2, 123.9, 117.8 (8a-C), 109.4 (4-C), 47.5 (2-C, 6-C), 42.5 (3-C, 5-C), 21.4 (6-CCH3). MS (ESI) m/z 310 (M+H)+. Anal. Calcd. for C18H19N3S δ 0.85H2O: C, 66.58; H, 6.42; N, 12.94; S, 9.87. Found C, 66.28; H, 6.02; N, 12.67; S, 9.47.
6- 메틸 -1-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5j)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9c (600 mg, 2.3 mmol), N-메틸피페라진 (690 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3 (1.6 g, 11.5 mmol)을 이용하여 밝은 갈색 고체 화합물 5j를 합성하였다(592 mg, 80%). 프리베이스는 5j·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). Mp: 85-87 ℃. IR (cm-1): 3067 (Ar--H), 2969, 2882, 2935, 2839. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar), 7.63 (d, J = 3.7 Hz, 1H, Ar), 7.49-7.47 (m, 2H, Ar), 7.33-7.31 (m, 1H, Ar), 7.26-7.22 (m, 1H, Ar), 7.11-7.08 (m, 1H, Ar), 3.56 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 2.70-2.67 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.48 (s, 3H, 6-CH3), 2.40 (s, 3H, NCH3). 13C NMR (5j·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 158.7 (1-C), 145.0 (3-C), 143.2 (2-C), 140.5 (6-C), 138.9 (4a-C), 128.5, 128.4, 127.3, 126.5, 125.1, 124.0, 117.8 (8a-C), 109.4 (4-C), 52.1 (30-C, 50-C), 47.5 (2-C, 6-C), 42.2 (4-NCH3), 21.4 (6-CCH3). MS (ESI) m/z 324 (M+H)+. Anal. Calcd. for C19H21N3S · 0.05C4H8O2 · 0.05C3H7NO: C, 70.11; H, 6.61; N, 12.89; S, 9.67. Found C, 69.94; H, 6.58; N, 12.79; S, 9.82.
1-(4-에틸-피페라진-1-일)-6- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5k)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9c (600 mg, 2.3 mmol), 1-에틸피페라진 (787 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3 (1.6 g, 11.5 mmol)을 이용하여 암녹색 액상 화합물 5k를 합성하였다(700 mg, 90%). 프리베이스는 5k·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.90 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 7.62 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.48-7.46 (m, 2H, Ar), 7.31 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.23 (dd, J = 8.5,1.6 Hz, 1H, Ar), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 3.57-3.54 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 2.73-2.70 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.52 (q, J = 7.2 Hz, 2H, NCH2CH3), 2.47 (s, 3H, 6-CH3), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H, NCH2CH3). 13C NMR (5k·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 145.0 (1-C), 143.2 (3-C), 140.6 (200-C), 138.9 (6-C), 128.5 (4a-C), 128.4, 127.3, 126.5, 125.1, 124.0, 117.8 (8a-C), 109.4 (4-C), 50.7 (3-C, 5-C), 50.0 (4-NCH2CH3), 47.5 (2-C, 6-C), 21.4 (6-CCH3), 8.8 (4-NCH2CH3). MS (ESI) m/z 338 (M+H)+.
6- 메틸 -1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5l)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9c (600 mg, 2.3 mmol), 모르폴린 (600 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 흰색 고체 화합물 5l을 합성하였다(460 mg, 64%). 프리베이스는 5l·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). Mp: 117-119 ℃. IR (cm-1): 3066 (Ar--H), 2965, 2878, 2910, 2828. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.91 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar), 7.64-7.62 (m, 1H, Ar), 7.52-7.51 (m, 2H, Ar), 7.33 (dd, J = 3.9, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.27-7.25 (m, 1H, Ar), 7.12-7.09 (m, 1H, Ar), 3.99-3.96 (m, 4H, O(CH2)2), 3.52-3.48 (m, 4H, N(CH2)2), 2.50 (s, 3H, 6-CH3). 13C NMR (5l·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.8 (1-C), 145.2 (3-C), 143.1 (2-C), 140.3 (6-C), 138.9 (4a-C), 128.3, 128.2, 127.2 (8a-C), 126.4 (4-C), 125.3, 123.9, 117.9, 108.8, 66.1 (3-C, 5-C), 51.4 (2-C, 6-C), 21.3 (6-CCH3). MS (ESI) m/z 311 (M+H)+. Anal. Calcd. for C18H18N2OS: C, 69.65; H, 5.84; N, 9.02; S, 10.33. Found C, 70.22; H, 5.98; N, 9.02; S, 10.41.
벤질-(6- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1-일)-아민 (5m)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여m, DMF 존재 하 화합물 9c (1.4 g, 5.4 mmol), 벤질아민 (4.62 g, 43.2 mmol) 및 K2CO3 (3.72 g, 27 mmol)을 이용하여 회색 고체 화합물 5m을 합성하였다(1.4 g, 78%). Mp: 102-104 ℃. IR (cm-1): 3462 (N-H), 3064, 2914. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.73 (s, 1H, Ar), 7.61-7.59 (m, 2H, Ar), 7.51-7.40 (m, 6H, Ar), 7.36 (s, 1H, Ar), 7.22-7.16 (m, 2H, Ar), 5.49 (t, J = 4.8 Hz, 1H, NH), 4.99 (d, J = 5.1 Hz, 1H, NCH2), 2.50 (s, 3H, 6-CH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 154.1 (1-C), 146.5 (3-C), 144.5 (2-C), 139.99, 139.94, 138.1, 128.5, 128.2, 127.7, 127.3, 127.2, 126.6, 125.9, 122.9, 121.3, 115.4 (8a-C), 104.8 (4-C), 45.7 (NCH2), 21.6 (6-CCH3). MS (ESI) m/z 331 (M+H)+. Anal. Calcd. for C21H18N2S: C, 76.33; H, 5.49; N, 8.48; S, 9.70. Found C, 76.07; H, 5.53; N, 8.26; S, 9.85.
7- 메틸 -1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5n)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (600 mg, 2.3 mmol), 피페리딘 (587 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 밝은 황녹색 고체 화합물 5n을 합성하였다(528 mg, 74%). 프리베이스는 5n·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). Mp: 116-117 ℃. IR (cm-1): 3050 (ArH), 2924, 2845. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.79 (s, 1H, Ar), 7.64-7.60 (m, 2H, Ar), 7.50 (s, 1H, Ar), 7.38 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H, Ar), 7.30 (dd, J = 5.0,1.1 Hz, 1H, Ar), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 3.45-3.42 (m, 4H, N(CH2)2), 2.51 (s, 3H, 7-CH3), 1.89-1.81 (m, 4H, 3-CH2, 5-CH2), 1.74-1.68 (m, 2H, 4-CH2). 13C NMR (5n·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.6 (1-C),145.0 (3-C),142.1 (2-C),136.7 (4a-C),135.7 (7-C),132.5 (6-C), 128.3, 127.4, 127.0, 124.3, 123.7, 120.0 (8a-C), 109.1 (4-C), 52.2 (2-C, 6-C), 25.3 (3-C, 5-C), 24.1 (4-C), 21.6 (7-CCH3). MS (ESI) m/z 309 (M+H)+. Anal. Calcd. for C19H20N2S · 0.1C4H8O2 ·0.1H2O: C, 73.03; H, 6.63; N, 8.78; S, 10.05. Found C, 72.73; H, 6.53; N, 8.84; S, 10.32.
7- 메틸 -1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5o)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (600 mg, 2.3 mmol), 피페라진 (594 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여, 갈색 고체 화합물 5o를 합성하였다(545 mg, 76%). 프리베이스는 5o·염산염으로 변화시켰다. Mp: 128-130 ℃. IR (cm-1): 3418 (N-H), 3047 (ArH), 2979, 2843, 2910, 2817. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.80 (s, 1H, Ar), 7.67-7.61 (m, 2H, Ar), 7.54 (s, 1H, Ar), 7.41 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H, Ar), 7.32 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.10 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 3.48-3.45 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 3.19-3.15 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.52 (s, 3H, 7-CH3). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 160.1 (1-C), 145.6 (3-C),142.5 (2-C),136.6 (4a-C),135.5 (7-C),132.2 (6-C),128.2, 127.3, 126.8, 124.3, 123.3, 119.9 (8a-C), 108.6 (4-C), 52.2 (2-C, 6-C), 45.5 (3-C, 5-C), 21.6 (7-CCH3). MS (ESI) m/z 310 (M+H)+. Anal. Calcd. for C19H20N2S · 0.05C4H8O2 · 0.4H2O: C, 68.09; H, 6.34; N, 13.09; S, 9.99. Found C, 67.99; H, 6.14; N, 13.01; S, 10.15.
7- 메틸 -1-(4- 메틸 -피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5p)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (600 mg, 2.3 mmol), N-메틸피페라진 (690 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 어두운 고체 화합물 5p를 합성하였다(700 mg, 94%). 프리베이스는 5p·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). Mp: 78-80 ℃. IR (cm-1): 3047 (ArH), 2972, 2839, 2925, 2821. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.78 (s, 1H, Ar), 7.65-7.61 (m, 2H, Ar), 7.53 (s, 1H, Ar), 7.39 (dd, J = 8.4, 1.7 Hz, 1H, Ar), 7.31 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.09 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 3.55 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 2.72-2.69 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.51 (s, 3H, 7-CH3), 2.41 (s, 3H, NCH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 159.9 (1-C), 146.2 (3-C), 143.1 (2-C), 137.0 (4a-C), 135.3 (7-C), 131.8 (6-C), 127.8, 127.2, 126.0, 124.5, 123.0, 120.6 (8a-C), 109.1 (4-C), 55.0 (3-C, 5-C), 50.9 (2-C, 6-C), 46.2 (4-NCH3), 22.0 (7-CCH3). MS (ESI) m/z 324 (M+H)+. Anal. Calcd. for C19H21N3S · 0.2H2O: C, 69.78; H, 6.6; N, 12.85; S, 9.8. Found C, 69.70; H, 6.50; N, 12.75; S, 10.00.
1-(4-에틸-피페라진-1-일)-7- 메틸 -3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5q)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (600 mg, 2.3 mmol), 1-에틸피페라진 (787 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 갈색 고체 화합물 5q를 합성하였다(760 mg, 97%). 프리베이스는 5q·염산염으로 변화시켰다(황색 고체). Mp: 90-91℃. IR (cm-1): 3042 (ArH), 2972, 2832, 2914, 2815. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.78 (s, 1H, Ar), 7.62-7.59 (m, 2H, Ar), 7.50 (s, 1H, Ar), 7.37 (dd, J = 6.7, 1.7 1H, Ar), 7.30 (dd, J = 3.9, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.09-7.06 (m, 1H, Ar), 3.56-3.53 (m, 4H, 1-N(CH2)2), 2.74-2.71 (m, 4H, 4-N(CH2)2), 2.56-2.49 (m, 5H, NCH2CH3, 7-CH3), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 3H, NCH2CH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ(ppm): 159.9 (1-C), 146.3 (3-C), 143.2 (2-C), 137.0 (4a-C), 135.3 (7-C), 131.8 (6-C), 127.8, 127.2, 126.0, 124.5, 122.9, 120.7 (8a-C), 109.0 (4-C), 52.8 (3-C, 50-C), 52.5 (4-NCH2CH3), 50.9 (2-C, 6-C), 22.0 (7-CCH3), 12.0 (4-NCH2CH3). MS (ESI) m/z 338 (M+H)+. Anal. Calcd. for C20H23N3S: C, 71.18; H, 6.87; N, 12.45; S, 9.50. Found C, 70.84; H, 6.90; N, 12.34; S, 9.44.
7- 메틸 -1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5r)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (600 mg, 2.3 mmol), 모르폴린 (594 mg, 6.9 mmol) 및 K2CO3을 이용하여 회색 고체 화합물 5r을 합성하였다(590 mg, 82%). 프리베이스는 5r·염산염으로 변화시켰다(크림색 고체). Mp: 124-126 ℃. IR (cm-1): 3052 (ArH), 2965, 2862, 2911, 2833. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.80-7.79 (m, 1H, Ar), 7.67 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar), 7.63 (dd, J = 3.6, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.57 (s, 1H, Ar), 7.42 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H, Ar), 7.33 (dd, J = 5.0, 1.1 Hz, 1H, Ar), 7.11 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 4.01-3.98 (m, 4H, O(CH2)2), 3.52-3.48 (m, 4H, N(CH2)2), 2.52 (s, 3H, 7-CH3). 13C NMR (5r·HCl) (125 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 159.4 (1-C), 145.3 (3-C), 142.4 (2-C), 136.7 (4a-C), 135.8 (7-C), 132.4 (6-C), 128.3, 127.4, 126.9, 124.2, 123.5, 119.8 (8a-C), 109.1 (4-C), 66.1 (3-C, 5-C), 51.3 (2-C, 6-C), 21.5 (7-CCH3). MS (ESI): m/z 311 (M+H)+. HRMS (ESI): m/z 311.1218 (M+H)+ (calcd for C18H19N2OS, 311.1218).
7- 메틸 -1-(4- 메틸 -[1,4] 디아제판 -1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 (5s)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9d (550 mg, 2.1 mmol), 1-메틸호모피페라진(718 mg, 6.3 mmol) 및 K2CO3 (1.45 g, 10.5 mmol)를 이용하여 어두운 semi-고체 화합물 5s를 합성하였다(570 mg, 80%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.80 (s, 1H, Ar), 7.60-7.57 (m, 2H, Ar), 7.41 (s, 1H, Ar), 7.36 (dd, J = 8.4, 1.6 Hz, 1H, Ar), 7.30-7.28 (m, 1H, Ar), 7.08 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H, Ar), 3.92 (t, J = 4.8 Hz, 2H, 1-NCH2), 3.86 (t, J = 6.0 Hz, 2H, 1-NCH2), 2.92-2.89 (m, 2H, 4-NCH2), 2.76-2.72 (m, 2H, 4-NCH2), 2.48 (s, 3H, 7-CH3), 2.44 (s, 3H, NCH3), 2.16-2.08 (m, 2H, 6-CH3). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 159.4 (1-C), 146.3 (3-C), 142.4 (2-C), 137.4 (4a-C), 134.1 (7-C), 131.3 (6-C), 127.6, 126.9, 125.6, 124.9, 122.5 (8-C), 119.6 (8a-C), 107.1 (4-C), 57.8 (3-C), 57.3 (5-C), 51.8 (2-C), 51.2 (7-C), 46.2 (4-C), 27.7 (6-C), 21.8 (7-CCH3). MS (ESI) m/z 338 (M+H)+.
벤질-[3-(1,5-디메틸-1H-피롤-2-일)-5- 메틸이소퀴놀린 -1-일]-아민 (5t)
화합물 5a의 합성과정을 이용하여, DMF 존재 하 화합물 9e (500 mg, 1.84 mmol), 벤질아민 (990 mg, 9.23 mmol) 및 K2CO3 (1.27 g, 9.23 mmol)를 이용하여 암갈색 semi-고체 화합물 5t를 합성하였다(454 mg, 72%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar), 7.38-7.16 (m, 8H, Ar), 6.46 (d, J = 3.5 Hz, 1H, 3-H), 5.94 (dd, J = 3.5, 0.6 Hz, 1H, 4-H), 5.50 (s, 1H, NH), 4.83 (d, J = 5.3 Hz, 2H, NCH2), 3.64 (s, 3H, NCH3), 2.57 (s, 3H, 5-CH3), 2.23 (s, 3H, 5-CH3). 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ (ppm): 154.2 (1-C), 145.0 (3-C), 139.9, 137.3, 133.9, 133.4, 131.7, 130.0, 128.5, 127.5, 127.0, 124.3, 119.2, 115.7, 108.5, 106.3, 104.9 (4-C), 45.8 (NCH2), 32.3 (1-NCH3), 19.4 (5-CCH3), 12.7 (5-CCH3).
세포독성
4가지 암 세포주, MCF-10A, T47D, DU145 및 HCT-15는 제공사의 안내에 따라 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2-4 x 104개의 세포를 분주하고 10% 소태아 혈청 (Hyclone, USA)이 첨가된 배지 0.1 mL, 5% CO2 인큐베이터, 37 ℃ 하에서 하루 동안 배양하였다. 2일 째에, 각 웰의 배양 배지를 화합물을 농도 별로 포함하고 있는 배지 0.1 mL로 교체하였다. 4일 째에, 세포 계수 키트-8 용액(Dojindo, Japan) 5 mL을 각 웰에 첨가하고, 같은 조건하에서 추가적으로 4시간 더 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 자동 ELISA 리더 시스템 (Bio-Rad3550)을 이용하여 450 nm 파장에서 측정하였다. IC50을 결정하기 위하여, 450 nm 파장에서의 흡광수치는 4가지-파라미터 지수방정식에 대입하였다. 양성 대조군인 CPT, 에토포사이드 및 DOX는 Sigma에서 구입하였다.
토포아이소머라아제 억제
초나선 DNA pBR322의 풀림을 측정함으로써 Topo I 억제 활성을 분석하였다. pBR322 (100 ng) 및 재조합 인간 DNA topo I (0.4 units; Topo-GEN INC., USA)의 혼합물에, relaxation 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 150 mM NaCl, 0.1% bovine serum albumin, 1 mM 스퍼미딘, 5% 글리세롤] 하의 화합물을 처리 또는 무처리하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 5% 사르코실, 0.0025% 브로모페놀 블루 및 25% 글리세롤을 포함하고 있는 종결 용액 2.5 mL을 최종 부피 10 mL로 첨가하여 반응을 종결시켰다. running 버퍼로서 TAE (Tris-아세테이트-EDTA)을 사용하여, DNA 샘플을 1% 아가로스 젤에서 15 V로 7 시간동안 전기영동 하였다. 젤을 에티디움 브로마이드 용액(0.5 mg/mL)에서 30분간 염색하였다. DNA 밴드는 UV 광선을 이용하여 트랜스일루미네이션으로 관찰하였고, 초나선 DNA는 AlphaImager™ (Alpha Innotech Corporation)을 이용하여 정량하였다. 화합물의 DNA topo IIa 억제 활성은 다음 방법으로 측정하였다. 초나선 플라스미드 DNA pBR322 (200 ng) 및 인간 DNA topo IIa (1 unit; Usb Corp., USA)의 혼합물에 assay 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 7.9): 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM ATP, 및 15 mg/mL bovine serum albumin] 하 화합물을 30℃에서 30분간 처리 또는 무처리하였다. 상기 반응은 최종 부피 20 mL로 7 mM EDTA을 3 mL 첨가함으로써 종결시켰다. DNA 샘플은 running 버퍼로 TAE를 사용하여 1% 아가로스 젤에서 25 V, 4 시간동안 전기영동 하였다. 상기 젤을 에티디움 브로마이드 수용액(0.5 mg/mL)에서 30분간 염색하였다. DNA 밴드는 UV 광선을 이용하여 트랜스일루미네이션으로 관찰하였고, 초나선 DNA는 AlphaImager™ (Alpha Innotech Corporation)을 이용하여 정량하였다.
분자적 도킹( Molecular docking )
도킹 연구는 Surflex Dock 프로그램을 이용하여 Sybyl-X 2.0 (winnt_os5x)에서 수행하였다. topotecan-DNA-topo I의 구조는 Protein Data Bank (PDB: 1K4T)에서 다운로드하였다. topotecan의 Hg 원자, PEG 분자 및 열린 카복실레이트 형태를 제거하였다. 리간드(topotecan)를 추출하였다. 수소를 첨가하고, MMFF94 charge로 MMFF94s force field를 이용하여 최소화하였다. 컨쥬게이트 농도법, 거리-의존적 유전 상수를 이용하였고 0.01 kcal/mol·에 수렴하였다. 끊어지기 쉬운 DNA 가닥의 G11 뉴클레오타이드의 SH 기는 OH로 치환하였다. 결합 부위와 가능한 모든 상호작용을 가능케하는 리간드의 이상적인 표현인 프로토몰을 리간드 모드 기반 하에서 생성하였다. 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5b 및 토포테칸을 Sybyl 하에서 구축하였으며, MMFF94s force field 및 MMFF94로 에너지를 최소화하고, Sybyl database에 저장하였다. Sybyl database 하 화합물은 이전 구축된 프로토몰 기반에서 Surflex Dock에 의한 결합 부위에 도킹되었다. 추출된 토포테칸은 참조 분자로 사용되었다. 도킹 프로토콜은 추출된 토포테칸 중원자의 0.61 루트-평균-제곱 편차(rmsd)를 가진 결합 부위에서 토포테칸의 위치를 재생성할 수 있었다(메뉴얼에 따라 구축되고 Sybyl database에 저장되었다). 이와 유사하게, 암사크린-DNA-topo IIb의 구조는 Protein Data Bank (PDB: 4G0U)에서 다운로드 하였다. topo IIb 모노머, 모노머와 연관된 암사크린 분자 및 3 Mg2+를 제거하였다. 나머지 과정은 topo I에서 설명한 방법과 유사하게 수행하였다. 도킹 프로토콜은 추출된 암사크린 중원자의 0.61 rmsd인 결합부위에 매뉴얼에 따라 구축된 암사크린의 위치를 재생성할 수 있다.
세포 생존율
세포 생존분석은 MTT 분석법으로 수행하였다. MCF-7, MKN-28, A549, HeLa 및 B16 암 세포는 96-웰 플레이트에서 배양하였고, 화합물을 48시간동안 처리하였다. 최종적으로, 100 mL DMSO을 각 웰에 첨가하였으며, 30분 후 마이크로리더 분광기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 주기 억제
HeLa 세포의 세포 주기 분포 분석은 DNA 염색 후 유세포분석기로 수행하였다. 세포는 원시분리로 수확하기 전 다양한 농도의 화합물로 24 시간 처리하였다. 수확한 세포는 PBS로 2번 세척한 후, 얼음 상에서 하루동안 PBS 하 70% 에탄올로 고정하였고, 10 μg/mL 프로피디움 아이오다이드 (PI), 0.5 mg/mL RNase, 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 재현탁시켰다. 세포를 37℃ 암조건에서 30분간 배양한 후, 유세포 분석기(Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
실험결과
세포독성
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민(5)의 세포독성은 비-암성(인간 유방 상피세포, MCF-10A) 및 종양 세포(인간 유관 상피 암, T47D; 인간 전립선 암, DU145; 및 인간 직장 선암, HCT-15)에서 측정하였다[17]. 세포독성 결과는 표 3에 IC50 값으로서 정리하였으며, 헤테로사이클릭 아민-치환된 이소퀴놀린의 구조-세포독성 관계는 표 4에 정리하였다. 피페리딘 (5a, 5h 및 5n), 모르폴린 (5e, 5l 및 5r), -NHBn (5m) 및 -NH2 (5f) 치환된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 및 이들의 염산염은 T47D 세포에 대하여 선택적인 세포독성을 나타내었으며, 정상 MCF-10A 세포에서는 독성을 나타내지 않았다. 반면, 유방암의 어쥬번트 치료로서 승인된 화학치료제인 독소루비신(DOX)은 악성 및 비-악성 세포집단에서 모두 세포 독성을 나타내었다. 상기 언급된 화합물은 전립선 암세포인 DU145의 생존분석에서 어떠한 효과도 나타내지 않았다. MCF-10A 및 DU1453에 대하여 비활성인 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 중, 피페리딘 치환된 아날로그(5a, 5h, 5n 및 이들의 염산염)는 T47D에 대하여 가장 강한 활성을 나타내었다(IC50: 2.56 ± 0.12-8.03 ± 0.35 μM).
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5 및 이의 염산염의 Topos (Ⅰ 및 Ⅱ) 억제 활성
화합물 Topo Ⅰ (%) 억제 Topo Ⅱ (%) 억제
100 μM 20 μM 100 μM 20 μM
캠토테신 74.0/74.5a/ 35.5/23.8a/ - -
62.6b/72.3c 34.7b/41.7c - -
에토포사이드 - - 86.9/78.6a/ 31.1/49.9a/
- - 87.9b/86.2c 42.5b
독소루비신 - - - -
5a 0.0 ND 48.1 1.8
5a·HCl 0.0 ND 42.9 0.5
5b 73.0 0.6 3.7 ND
5b·HCl 100.0 4.8 56.0 0.0
5c 97.5 18.2 0.0 ND
5c·HCl 80.8 76.6 0.0 ND
5d 2.6 ND 9.1 ND
5d·HCl 15.0 ND 3.2 ND
5e 0.0 ND 21.8 0.0
5e·HCl 0.0 ND 61.3 0.0
5f 0.0 ND 14.6 ND
5f·HCl 0.0 ND 22.5 0.0
5g 2.1 ND 4.8 ND
5h 0.0 ND 42.8 1.1
5h·HCl 45.9 0.0 2.9 ND
5i 59.0 0.0 14.8 ND
5i·HCl 59.6 0.0 40.9 0.0
5j 11.2 ND 0.0 ND
5j·HCl 5.1 ND 0.0 ND
5k 0.0 ND 0.0 ND
5k·HCl 0.0 ND 0.0 ND
5l 0.0 ND 11.3 ND
5l·HCl 0.0 ND 66.3 1.7
5m 0.0 ND 68.9 1.1
5n 89.6 0.0 13.7 ND
5n·HCl 77.5 0.0 3.6 ND
5o 10.7 0.0 22.1 ND
5p 29.6 ND 0.0 ND
5p·HCl 35.9 0.0 0.0 ND
5q 22.8 ND 0.0 ND
5q·HCl 59.5 6.5 0.0 ND
5r 77.9 1.1 0.0 ND
5r·HCl 71.9 3.7 5.1 ND
5s 18.3 ND 8.0 ND
각 데이터는 3회 실험 후 평균 ± 표준편차로 나타냄.
ND: 검출되지 않음.
a 화합물 5g의 값
b 화합물 5h-m 및 이들의 염산염의 값
c 화합물 5n-s 및 이들의 염산염의 값
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 5 및 이의 염산염의 세포 독성(IC50)
화합물 IC50 (μM)
MCF-10A T47D DU145 HCT-15
캠토테신 0.27 ± 0.1 0.28 ± 0.01 4.01 ± 2.45 10.07 ± 0.58
에토포사이드 12.23 ± 1.47 2.57 ± 0.08 13.85 ± 1.75 9.45 ± 0.28
독소루비신 0.93 ± 0.03 0.84 ± 0.04 4.88 ± 0.12 3.76 ± 0.12
5a >50 3.22 ± 0.05 >50 3.61 ± 0.1
5a·HCl >50 7.26 ± 0.25 >50 1.04 ± 0.06
5b 44.12 ± 0.69 9.53 ± 0.44 17.6 ± 0.26 1.25 ± 0.04
5b·HCl 18.1 ± 0.46 4.51 ± 0.17 8.25 ± 0.01 5.45 ± 0.29
5c 18.1 ± 0.84 15.44 ± 0.43 40.25 ± 1.26 2.44 ± 0.09
5c·HCl 38.78 ± 0.22 16.08 ± 0.5 44.45 ± 0.61 7.9 ± 0.39
5d 49.01 ± 0.32 17.41 ± 0.42 >50 7.42 ± 0.23
5d·HCl 23.77 ± 0.15 8.08 ± 0.39 46.61 ± 0.08 9.29 ± 0.44
5e >50 24.41 ± 0.05 >50 21.26 ± 0.43
5e·HCl >50 14.77 ± 0.31 47.03 ± 0.82 14.74 ± 0.3
5f >50 7.93 ± 0.18 >50 1.2 ± 0.06
5f·HCl >50 17.48 ± 0.57 >50 24.39 ± 1.18
5g >50 >50 >50 >50
5h >50 2.56 ± 0.12 >50 5.45 ± 0.24
5h·HCl >50 8.03 ± 0.35 >50 1.88 ± 0.08
5i 7.25 ± 0.02 8.74 ± 0.29 8.31 ± 0.17 1.31 ± 0.06
5i·HCl 8.18 ± 0.05 7.57 ± 0.22 11.7 ± 0.27 0.94 ± 0.04
5j 13.29 ± 0.37 9.35 ± 0.08 32.97 ± 0.1 4.37 ± 0.23
5j·HCl 14.91 ± 0.2 18.38 ± 0.27 39.98 ± 0.36 3.19 ± 0.14
5k 33.94 ± 0.02 8.45 ± 0.22 17.21 ± 0.03 2.41 ± 0.14
5k·HCl 28.85 ± 0.25 17.74 ± 0.19 22.11 ± 0.27 4.4 ± 0.25
5l >50 6.76 ± 0.34 >50 7.58 ± 0.35
5l·HCl 48.7 ± 0.38 7.88 ± 0.14 >50 7.79 ± 0.39
5m >50 6.57 ± 0.35 >50 8.62 ± 0.14
5n >50 7.38 ± 0.25 >50 3.74 ± 0.18
5n·HCl >50 3.02 ± 0.05 >50 0.89 ± 0.07
5o 5.54 ± 0.17 1.14 ± 0.06 4.15 ± 0.08 1.29 ± 0.05
5p 11.58 ± 0.21 1.96 ± 0.06 16.25 ± 0.56 1.64 ± 0.02
5p·HCl 20.87 ± 0.02 1.02 ± 0.04 24.7 ± 0.17 1.04 ± 0.02
5q 43.14 ± 0.13 4.15 ± 0.14 29.4 ± 0.14 3.63 ± 0.13
5q·HCl 42.9 ± 0.06 2.84 ± 0.1 31.07 ± 0.02 7.71 ± 0.26
5r 35.62 ± 0.47 6.38 ± 0.32 47.32 ± 0.13 7.58 ± 0.2
5r·HCl 49.06 ± 1.38 7.63 ± 0.26 48.27 ± 0.11 9.52 ± 0.44
5s 20.59 ± 0.36 1.32 ± 0.02 14.69 ± 0.6 1.5 ± 0.05
각 데이터는 3회 실험 후 평균 ± 표준편차로 나타냄.
ND: 검출되지 않음.
d MCF-10A: 비-암성 인간 유방 상피 세포
e T47D: 인간 유관 상피 암세포
f DU145: 인간 전립선 암세포
g HCT-15: 인간 직장 선암세포
피페리딘-, 피페라진- 및 모르폴린- 치환된 3-티오페닐이소퀴놀린아민의 구조-세포독성 관계
Figure 112014088734481-pat00013
Figure 112014088734481-pat00014
a IC50 > 50 μM
b IC50 < 50 μM
c IC50 < 3.76 ± 0.12 μM (독소루비신의 IC50)
e IC50 >
3.76 ± 0.12 μM (독소루비신의 IC50)
반면, 피페라진- 및 호모피페라진-치환된 아날로그는 MCF-10A, T47D 및 DU145에 대하여 현저한 선택성이 결여되었다. N4-비치환된 피페라지닐 이소퀴놀린(5b, 5i 및 5o) 및 이들의 염은 MCF-10A, T47D 및 DU145에서 N4-알킬레이트 피페라진보다 강한 독성을 나타내었다. 피페라진 아날로그 중, 화합물 5p·HCl 및 5q·HCl는 MCF-10A 및 DU145에 대하여 보다 낮은 독성을 나타낸 것으로(IC50 > 20 μM) 언급할 가치가 있으며, T47D (IC50: 1.02 ± 0.04, 2.84 ± 0.1 μM)에 대하여 가장 강한 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민으로 나타났다. 이와 유사하게, 호모피페라진 유도체 5s는 MCF-10A 및 DU145에서 보다 T47D (IC50: 1.32 ± 0.02 μM)에서 보다 강한 독성을 나타내었다. 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 인간 직장 선암세포(HCT-15)에 대하여 강한 세포 독성을 나타내었다. 피페리딘(5a, 5h 및 5n), N4-비치환된 피페라진 (5b, 5i 및 5o), N4-메틸 피페라진 (5c, 5j 및 5p), N4-에틸 피페라진 (5k 및 5q), 호모피페라진 (5s) 및 -NH2 (5f) 치환된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민 또는 이들의 염산염은 CPT, 에토포사이드 및 DOX보다 강한 세포독성을 나타내었다(표 4). 양성 대조군 약물의 HCT-15에 대한 낮은 활성은 다양한 약물 저항성 때문이다. HCT-15에서 과발현된 약물 방출 막 수송체인 다약물 저항성 단백질 1 (MDR1; p-글리코단백질, P-gp 또는 ATP-결합 카세트 서브-패밀리 B 멤버 1, ABCB1)은 CPT, 에토포사이드 및 DOX의 세포로부터의 방출을 활성화시킴으로써 세포내 축적을 감소시킨다[4, 18-20]. 또한, 세포에 흡수된 약물(DOX) 분획은 시토크롬 P450 3A (CYP3A)에 의해 대사된다[19]. 이러한 난관에도 불구하고, 상기 언급된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 강력한 세포독성 프로파일은 이들이 MDR1 및 CYP3A의 기질일 가능성이 없음을 제시하고 있다. N4-에틸 피페라진 (5d), 모르폴린 (5l 및 5r) 및 벤질 (5m) 유도체 및 이들의 염산염은 HCT-15에서 DOX 보다 약한 세포 독성을 나타내었으며, CPT 및 에토포사이드보다 높은 또는 유사한 세포 독성을 나타내었다. 화합물 5e는 유의적인 세포 독성을 나타내지 않았다(IC50 = 21.26 ± 0.43 μM). 아자이드-치환된 유도체 5g는 모든 세포주에서 효과를 나타내지 않은 유일한 화합물이다.
토포아이소머라아제 억제
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 토포아이소머라아제 억제 활성은 ‘DNA relaxation assay’에 의해 측정되었다[17]. 염산염의 topos 억제 활성은 일반적으로 자유 아민(free amines)보다 높게 나타났으며, 이는 아마도 전기적 음성인 DNA에 대한 전기적 양성 화합물 종의 증가된 결합력 때문일 것이다(표 2, 도 4 내지 도 5). 3-티오페닐이소퀴놀린아민의 Topos 억제는 화학적 구조와 먼 패턴을 나타내었다(표 5). 활성은 주로 이소퀴놀린 고리 내 메틸 그룹의 위치 및 C1 위치의 헤테로 아민의 타입에 의존적이었다. 피페리딘-치환된 아날로그(5a, 5a·HCl)는 topo Ⅰ에 대하여 불활성이었으며, 반면 이들은 topo Ⅱ에 대하여 중간 정도의 활성을 나타내었다. 반면, 이들의 7-Me 유도체(5n, 5n·HCl)는 topo I에 대해서만 우수한 활성을 나타내었다. 피페리딘 유도체 5h 및 이의 염산염은 특이한 topos 억제 양상을 보였다. 화합물 5h는 topo Ⅱ에 대하여 선택적이었으며, 반면 이의 염산염의 선택성은 topo Ⅰ로 바뀌었다. N4-비치환된 피페라지닐 이소퀴놀린(5b·HCl 및 5i·HCl)은 topo Ⅰ에 대하여 우수한 활성 및 topo Ⅱ에 대하여 낮은 활성을 나타내었다. 그러나 7-Me 유도체 5o는 양 topos에 대하여 유의적인 활성을 나타내지 않았다. N4-메틸-치환된 피페라진 유도체는 topo Ⅱ에 대하여 불활성이었다. topo Ⅱ와 더불어, 이들의 서브세트(subset)인 6-Me 및 7-Me 유도체는 topo Ⅰ에 대하여 불활성 또는 아주 적은 활성을 나타내었다. 그러나, 5c·HCl는 100 μM 및 20 μM에서 높은 topo I 억제 활성을 보였다. N4-메틸-치환된 피페라진과 유사하게, N4-에틸-치환된 피페라진 또한 topo Ⅱ에 대하여 불활성이었다. 또한 화합물 5d, 5k 및 이들의 염산염은 topo Ⅰ에 대하여 최소한의 활성 또는 불활성을 나타내었다. 7-Me 아날로그 5q는 아주 낮은 topo Ⅰ 억제 활성을 나타내었으나, 5q·HCl는 100 μm에서 CPT와 유사한 활성을 나타내었다. 모르폴린 유도체 (5e·HCl 및 5l·HCl)는 topo Ⅰ에 대하여 불활성이었으나, topo Ⅱ에 대하여 중간 활성을 나타내었다. 7-Me 아날로그 5r 및 5r·HCl는 topo Ⅰ에 대하여 각각 CPT보다 우수한 및 유사한 활성을 나타내었다. 벤질아민-치환된 유도체(5m)는 topo Ⅱ에 대해서만 중간 활성을 나타내었다. 호모피페라진(5s), 아자이드 (5g) 및 -NH2 (5f) 유도체는 양 topos에 대하여 유의적인 활성을 나타내지 않았다.
피페리딘-, 피페라진- 및 모르폴린- 치환된 3-티오페닐이소퀴놀린아민의 구조-토포아이소머라아제 억제 관계
Figure 112014088734481-pat00015
Figure 112014088734481-pat00016
화합물 5b, 5c, 5i, 5n, 5q, 5r 및 이들의 염산염과 같은 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 CPT와 유사한 또는 이보다 우수한 topo Ⅰ 억제 활성을 나타내었으며, 이는 topo Ⅰ이 항암제의 주요 타겟이라는 것을 의미한다. 중간 정도의 topo I 또는 II 억제 활성을 가지지만 강력한 세포 독성 효과를 나타내는 화합물 5a, 5h·HCl, 5l·HCl 및 5m과 같은 화합물은 세포 사멸과 관련된 topos 외에 다른 타겟이 있음을 의미한다. 한편, 5d, 5f, 5j, 5k, 5o, 5p, 5s 및 이들의 염산염과 같은 화합물은 다른 메커니즘을 통하여 세포에 독성 효과를 미친다. 게다가, 중간적인 topo Ⅱ 억제 활성에도 불구하고 5e·HCl의 낮은 세포독성 효과는, 세포 침투를 억제하거나 세포 내 광범위한 분포를 유발하는 화합물의 이화학적(physiochemical) 특성 때문인 것으로 판단되며, 또는 화합물이 타겟에 도달하기 전에 분해시키는 세포 대사 인자 때문인 것으로 판단된다.
분자적 도킹( Molecular docking )
DNA-topo I/Ⅱ 복합체 및 강력한 topo Ⅰ 및 topo Ⅱ 억제 활성을 나타내는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민(5b 및 5b·HCl)의 가상의 결합 모델은 topos 억제에 관련된 가능한 상호작용을 이해하기 위한 분자 도킹 툴(molecular docking tools)에 의해 구축되었다. Sybyl-X 2.0 (winnt_os5x)에서 적용가능한 Surflex-Dock 프로그램은 topotecan-DNA-topo I (PDB: 1K4T) [21] 및 amsacrine-DNA-topo IIb (PDB: 4G0U)[22] ternary 복합체의 3D 크리스탈 구조로부터 리간드가 제거된 후 형성된 포켓에 선택된 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민에 도킹되도록 한다.
5b-DNA-topo I 도킹 모델은 분리되기 쉽지 않은(non-scissile) DNA 가닥의 아데닌 염기(A113)가 5b의 티오펜 고리에 오버래핑되었으며, 이는 방향족 고리 사이에 π-π 스태킹 상호작용이 가능함을 의미한다(도 6a 및 6c). 또한, 5b의 이소퀴놀린 N은 수소 결합에 의해 topo I의 Arg364와 연관되어 있다.
절단 부위에서 DNA 염기 쌍 사이에 화학종이 삽입되는 것은 topos 기능을 억제하는 주요 요인이다[21]. 이러한 topos 억제제는 다운스트림(-1) 염기의 반응성 -OH를 대체하며, 절단된 DNA 가닥과 결합하고 topos를 풀어주기 위해서 업스트림 염기(+1)의 포스포티로신 유닛과의 에스테르교환반응(transesterification)을 억제한다. 폴리사이클릭 topos 억제제 및 DNA 염기간의 적층 상호작용(stacking interaction)은 분산력(dispersion force), 정전기적 인력 및 전하이동 상호작용과 같은 다양한 요인에 의해 조절된다. 제 1 양자역학(MP2/6-31g(d) level of theory)에 의해 계산된 적층 상포작용 에너지는 절단 부위에서 CPT의 실질적인 결합 방향과 매우 높은 관련성이 있음을 나타내었다[23]. 따라서, 제 1 양자역학 계산법은 도킹 연구에 의해 생성된 화학종(예컨대, 화합물 5b)의 가상 분자 모델의 확인을 위한 유용한 도구가 될 것이다. 화합물 삽입에 더하여, topo I 의 Arg364 아미노산과 상호작용하는 수소결합은, CPT, 인데노이소퀴놀린(MJ238) 및 인돌로카바졸(SA315F) [24]에서 본 바와 같이, topo I 억제 활성에 있어 필수적인 것으로 판단된다. Arg364과의 접촉의 중요성은 Arg364His 돌연변이된 topo I에 대한 CPT 및 인돌로카바졸의 감소된 친화력에 의해 뒷받침된다. 이러한 결과들로 미루어보아, DNA-topo I 복합체와 화합물 5b의 도킹 모델은 이의 강력한 topo I 억제 활성을 뒷받침해준다.
DNA-topo I 복합체와 화합물 5b의 도킹 모델은 π-π 스태킹 및 수소결합 상호작용에 의해 화합물이 DNA 및 topo Ⅱb에 결합한 것으로 나타내었다. 5b의 방향성 고리는 절단 부위에서 평면 구조를 이루었고, DNA 염기 사이에 삽입되었으며, 염기들의 면과 평행을 이루었다(도 6b 및 6d). 피페라진 부위(moiety)는 마이너 그루브 쪽으로 돌출되었으며 수소 결합에 의해 Glu522와 연관되었다. DNA 및 topo Ⅱb간의 동일한 삽입 및 수소결합은 항암 약물인 암사크린(amsacrine) 및 미토산트론(mitoxantrone), 및 항암제인 아메탄트론(ametantrone)에 의해 나타났다[22]. 5b와 알려진 topo Ⅱb 억제제의 결합 모드에서의 유사성은 5b·HCl의 topo Ⅱ 억제 활성을 증명해준다.
세포 주기 억제
3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 세포독성에 대한 초기 메커니즘을 이해하기 위하여, 화합물에 의한 세포 주기 방해에 대하여 연구하였다. N4-비치환된 피페라지닐 이소퀴놀린(5b, 5b·HCl, 5i, 5i·HCl 및 5o), N4-에틸-치환된 피페라진(5d, 5d·HCl 및 5k) 및 기본적인 이소퀴놀린아민(5f 및 이의 염산염)은 인간 유방 선암(MCF-7), 인간 위암(MKN-28), 인간 폐 선암 상피(A549), 인간 자궁경부암(HeLa) 및 마우스 흑색종(B16) 세포에서의 상기 화합물들의 독성 효과에 기반한 세포 주기 분석을 위하여 선별되었다(도 7a-7e). 선별된 아날로그로 인해 적어도 2개 타입의 암세포에서의 세포 생존능은 50%이하 였다.
Hela 세포의 세포 주기에서 선별된 유도체의 서로 다른 농도에서의 효과는 유세포 분석에 의해 각 세포 주기에서의 세포 집단을 결정함으로써 측정하였다. G0/G1기의 세포 수는 화합물 5b를 5 μM, 10 μM 및 25 μM의 농도로 처리했을 때, 각각 2%, 4% 및 10% 증가하였다(도 8a-8c). 그러나, 50 μM 이상의 농도에서는 세포가 사멸하였다. 이와 비슷하게, 화합물 5b의 염산염은 G0/G1기에서 Hela 세포 축적을 나타내었다. 염산염은 세포 주기 억제 및 세포 사멸 유도에 있어 자유 염기(free base) 5b보다 우수한 효과를 나타내었다. G0/G1기 세포 수의 10% 증가는 10 μM에서 이루어 졌으며, 25 μM에서 sub-G0/G1기 세포의 85%(apoptotic debris)가 나타났다. 이와 유사하게, N4-비치환된 피페라진(5i, 5i·HCl 및 5o)은 세포 사멸 전 G0/G1기에서 약간의 세포를 축적시켰다(데이터 미기재). N4-에틸 피페라진 유도체 5d는 세포주기 억제에서 명확한 패턴을 나타내지 않았으나, 이의 염산염 및 5k는 25 μM 및 이보다 낮은 농도에서 S기의 축적을 나타내었다. 피페라진과 달리, topos 억제 활성이 결여된 이소퀴놀린아민 5f는 G2/M에서 세포 주기 억제가 나타났다. G2/M기 세포 수는 50 μM에서 43%까지 유의적으로 증가되었다. G2/M기에서 세포 축적 양은 농도-의존적이었으며, 대부분 G0/G1기의 비용으로 나타났다. 따라서, 사멸된 세포는 농도의존적으로 증가되었다. 종래 구조적으로 유사한 6,7-디메톡시-3-(3-메톡시페닐) 이소퀴놀린-1-aime (10, CWJ-082)에 대하여 유사한 연구가 행해졌다(도 9). 이들은 α-튜불린 중합을 유발하며, 유사분열 정지 및 이후의 카스파제-의존성 세포사멸을 유도한다[25]. 이러한 발견은 1차적인 이소퀴놀린아민 5f의 세포 독성 효과는 topos 보다 다른 타겟과 주로 관련되어 있음을 의미한다. 5f·HCl (50 μM) 또한 대조군과 비교하여 세포 수가 6% 증가함으로써 G2/M에서 세포 주기를 억제하였다.
3- 헤테로아릴이소퀴놀린아민의 3,4- 디아릴이소퀴놀린으로의 변환 및 이들의 세포 독성과 토포아이소머라아제 억제 활성-이소퀴놀린 시스템에서의 질소 대 산소 알킬화( Alkylation )
이소퀴놀린의 알킬화는 항암제에 기반한 다양한 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 개발 과정에서 일반적으로 행해질 수 있는 반응이다[1, 2]. 이는 염기로서 금속염의 존재 하에 알킬 할라이드와 이소퀴놀린간의 반응을 포함한다. 친핵치환반응동안, N- 및 O-알킬화된 생성물이 수득된다. N- 및 O-알킬화 정도는 금속염에 의존한다. N-알킬화는 다음의 Na>K>Ag 순서로 일어나며, O-알킬화는 반대 순서로 일어난다(표 6).
이소퀴놀린의 알킬화
R1 R2 RX 금속염 용매 N-알킬 (%) O-알킬 (%)
6-Me 2′-Me MeI NaH THF 90 -1
H H MeI NaH THF 82 12
H H MeI NaH DMF 69 26
H H CH2CHCH2Br K2CO3 DMF 36 53
H H BnCl K2CO3 DMF 25 57
4-Br, 6-Me 3′-Me MeI Ag2CO3 톨루엔 32 51
4-Br 4′-OMe MeI Ag2CO3 톨루엔 7 89
1 매우 경미한 정도(negligible)
결론
헤테로아로마틱 링이 topos 억제 활성에 필수적인 평면 구조를 보유하고 있다는 가정 하에 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 디자인되고 합성되었다. 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민의 세포 독성 효과는 C1에서 치환된 아민의 타입에 크게 의존하여 나타났다. 피페리딘, 모르폴린 및 벤질 아민-치환된 유도체는 T47D 세포에서 세포 독성을 나타내었으나, 비암성 유방 상피세포인 MCF-10A 및 전립선 암세포 DU145에서는 효과를 나타내지 않았다. 일반적으로, 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 양성 대조군으로 사용된 다른 항암 약물과 비교하여 인간 직장 선암 HCT-15 세포에 대하여 우수한 세포 독성을 나타내었다. 이러한 결과는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 유방암 치료를 위한 경구 투여 약물이 될 수 있음을 시사한다. topos 억제 활성은 또한 메틸 그룹의 위치 및 이소퀴놀린 고리에 치환된 아민의 종류에 따라 매우 달라질 수 있다. 염산염은 자유 염기보다 우수한 topos 억제 효과를 나타내었다. 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민은 topo Ⅱ보다 topo I에 대하여 보다 높은 억제 효과를 나타내었다. 화합물 5b와 topo I/Ⅱ-DNA의 가상 결합 모드는 화합물의 방향성 고리가 DNA 염기 사이에 삽입되며, 수소결합을 통하여 topo I 및 Ⅱ의 Arg364 및 Glu522 아미노산과 각각 연관되어 있음을 보여주었다. 세포 주기 억제 실험은 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 세포 주기를 정지시키고 세포 사멸을 유발함을 보여주었다. 이러한 모든 결과는 3-헤테로아릴이소퀴놀린아민이 암과 대항할 수 있는 새로운 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. 헤테로아릴이소퀴놀린계 유도체(heteroarylisoquinoline derivatives)로서 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염(salts):
    화학식 1
    Figure 112016056576268-pat00017

    상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1-10 알킬, C2-10 알케닐 또는 C1-10 알콕시이고, R은
    Figure 112016056576268-pat00048
    ,
    Figure 112016056576268-pat00049
    ,
    Figure 112016056576268-pat00050
    ,
    Figure 112016056576268-pat00051
    ,
    Figure 112016056576268-pat00052
    ,
    Figure 112016056576268-pat00053
    , 또는 -NHBn 이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐 또는 C1 -5 알콕시인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 또는 C1 -2 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
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  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 벤질-(6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1-일)-아민, 7-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-7-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-[1,4]디아제판-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    화학식 1
    Figure 112016056576268-pat00024

    상기 화학식 1에서, R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1-10 알킬, C2-10 알케닐 또는 C1-10 알콕시이고, R은
    Figure 112016056576268-pat00054
    ,
    Figure 112016056576268-pat00055
    ,
    Figure 112016056576268-pat00056
    ,
    Figure 112016056576268-pat00057
    ,
    Figure 112016056576268-pat00058
    ,
    Figure 112016056576268-pat00059
    , 또는 -NHBn 이다.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, 히드록시, C1-5 알킬, C2-5 알케닐 또는 C1-5 알콕시인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소 또는 C1-2 알킬인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 삭제
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  18. 제 10 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 6-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 벤질-(6-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린-1-일)-아민, 7-메틸-1-피페리딘-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-피페라진-1-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-피페라진-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 1-(4-에틸-피페라진-1-일)-7-메틸-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-모르폴린-4-일-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린, 7-메틸-1-(4-메틸-[1,4]디아제판-1-일)-3-티오펜-2-일-이소퀴놀린 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 토포아이소머라아제(topoisomerase)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제 10 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 전립선암, 자궁경부암, 위암, 피부암, 입암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 식도암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 기관지암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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US20060128702A1 (en) * 2004-11-23 2006-06-15 Manojit Pal Heterocyclic and bicyclic compounds, compositions and methods
WO2008063548A2 (en) * 2006-11-17 2008-05-29 Rexahn Pharmaceuticals, Inc. 5, 6, or 7-substituted-s- (hetero)arylisoquinolinamine derivatives as antitumor agents

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