KR101629921B1 - 면역분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 테스트 샘플에서 다중 항원-특이적 면역글로불린을 정량하는 방법을 제공하고, 이 방법은 다중 결합능 곡선을 작성하기 위하여 면역글로불린의 표준 샘플의 연속적인 희석액과 함께, 고체 지지체에 고정화된, 항-면역글로불린 항체, 그의 단편 또는 유도체의 연속적인 희석을 이용하는 것을 포함한다. 샘플에서 항원-특이적 면역글로불린의 보다 정확한 분석을 가능하게 하는 교정(calibration) 시스템을 제공하기 위하여, 이러한 결합능 곡선은 특이적 항원에 대해 알려진 반응성을 갖는 혈청 샘플을 이용하여 테스트되는 각 특이적 항원에 대하여 작성된 특이적 용량 반응 곡선에 연결(match)된다. 본 발명은 또한 고체 지지체에 고정화된 다중 항원 또는 그의 단편으로의 다중 항원-특이적 면역글로불린의 결합을 분석하기에 적합한 장치를 교정하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서 이용되는 다중-알레르겐 테스트 시스템 및 키트가 또한 제공된다.

Description

면역분석법{Immunoassay}
본 발명은 샘플 중 IgE 수준을 정량하는 면역분석 방법, 이러한 정량을 수행하기에 적합한 장치를 교정(calibrating)하는 방법 및 이러한 정량을 가능하게 하는 시스템에 관한 것이다.
면역분석법은 항체의 결합 능력을 활용하는 방법이다. 주로, 면역분석법은 샘플 내 특정 항원-특이적 항체의 존재를 분석하는데 사용된다. 이는 고체 지지체에 고정화된 특정 항원 위로 샘플을 흐르게 하고(wash), 뒤이어 다양한 기법을 이용하여 결합된 항체를 시각화하여 수행된다.
일반적으로, 면역분석법은 미지의 샘플에 대한 값이나 농도를 정하기 (assign) 위하여 교정기(calibrator)의 이용을 요구한다. 고전적인 면역분석법에서, 교정기의 세트가 실행되고, 신호 대 농도의 교정 곡선(calibration curve)이 플로팅되며(plotted) 미지의 샘플의 농도가 내삽법(interpolation)에 의해 결정된다.
알레르기 상태는 무해한 환경 항원에 대한 부적절하고 과다한 면역 반응을 특징으로 한다. 이러한 항원을 총칭하여 알레르겐(allergen)이라고 한다. 알레르겐에 대한 면역반응은 (i) 항원제시세포(APC)에 의한 알레르겐의 처리, (ii) APC에 의해 처리된 알레르겐의 T 헬퍼 0(Th0) 나이브(naive) 세포로의 제시, (iii) Th0 나이브 세포에서 Th2 세포로의 분화, 및 (iv) B 세포에 의한 알레르겐-특이적 IgE의 생성 및 분비를 초래하는, Th2에 의한 B 세포의 자극으로 이루어진 제 1 감작기(phase of sensitization)를 포함한다.
각각의 특이적 알레르겐은 그 알레르겐에 특이적인 IgE의 생성을 자극할 것이다. IgE 항체는 2개의 서로 다른 세포 타입과 상호작용할 수 있다; 히스타민-함유 과립을 포함하는, 비만세포(mast cell)와 호염기구(basophil)이다.
감작기를 유발한 것과 동일한 알레르겐이 체내로 다시 들어오고 적절한 비만세포 및 호염기구에 의해 인식될 때, "유발기(challenge phase)"로 알려진 알레르기 메커니즘의 제 2 기를 자극한다. 알레르겐은 비만세포 및 호염기구의 표면에 제시된 그의 특이적인 IgE에 결합하여, 궁극적으로 비만세포 및 호염기구의 탈과립화와 히스타민 분비에 이르는 메커니즘을 유발하며, 히스타민은 알레르기 반응의 전형적인 염증 반응의 원인이 된다. 이어지는 알레르기 반응의 중증도는 그 개체에서 알레르겐-특이적 IgE의 수준에 상응한다. 따라서, 알레르기(또는 아토피)가 있는 개체를 확인하고 그의 알레르기의 특성을 규명할 수 있도록 개체에서 특정 알레르겐에 대하여 생성된 IgE의 농도를 검출하고 정량하는 것이 중요하다.
알레르기 진단을 위한 정량적인 면역분석법은 그의 교정 시스템을 구축하기 위하여 세계보건기구(WHO) 국제 표준 제제(International Reference Preparation) 75/502를 일반적으로 이용하거나 참조한다. 이것은 지정된 IgE 반응성을 갖는 동결-건조 인간 혈청 샘플이다(Kontis K, et al (2006) Correlation of the Turbo-MP RIA with ImmunoCAP FEIA for Determination of Food Allergen-Specific Immunoglobulin-E. Ann Clin Lab Sci. 36(1): 79-87; Bousquet J et al (1990) Comparison between RAST and Pharmacia CAP system: A new automated specific IgE assay. J Allergy Clin Immunol. 85(6):1039-43; Reference for the product: http://www.nibsc.ac.uk/documents/ifu/75-502.pdf).
알레르겐-특이적 IgE 항체에 대한 측정된 반응 값은 일반적으로 총 IgE 교정 곡선에 대비하여 평가되고 리터 당 알레르겐 특이적 유닛의 농도(kUA/l)로서 표시된다. IgE 표준 곡선(IgE reference curve)은 테스트한 모든 알레르겐에 대한 용량-반응 곡선을 기술하기 위해 이용된다. 이는 IgE 및 알레르겐에 대한 용량-반응 곡선이 동일한 경향을 보이도록 면역분석법의 고체 지지체에 고정화된 알레르겐 성분의 농도가 최적화되는 것을 요구한다. 용량 반응 곡선을 위한 알레르겐 농도를 최적화하기 위하여, WHO 국제 표준 총 IgE 곡선을 이용하여 작성된 것과 모양과 기울기가 유사한 용량-반응 곡선을 제공하는 농도를 확인하기 위하여, 알레르겐의 상이한 농도가 알려진 반응성을 갖는 일련의 샘플(a panel of sample)에 대하여 테스트된다.
알레르기 질환의 진단을 위하여 현재 사용되는 면역분석법은 하기를 포함한다: 방사선알레르겐흡착검사(Radioallergosrbent Test, RAST), 효소-결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 및 ImmunoCAP.
RAST는 종이 디스크 고체 상(solid phase)에 알레르겐(또는 다른 항원)을 공유결합 커플링(covalently coupling)시키는 것을 포함한다. 종이 디스크는 그 후 알레르기 상태가 조사되는 환자의 혈청과 인큐베이션된다. 알레르겐에 대한 항체가 혈청 내 존재한다면, 항체는 접합된(conjugated) 알레르겐과 반응하고 결합은 방사성-표지된 항-IgE 항체에 의해 검출된다. 원래의 형태에서, 테스트 결과는 이종(heterologous) IgE 항-자작나무 화분 표준 곡선으로부터 내삽(interpolating)에 의해 클래스 또는 임의의 단위로 보고되었다. 종이 디스크에 커플링된 자작나무 알레르겐은 알려진 반응성을 갖는 혈청 샘플과 인큐베이션되고 알려진 IgE 농도에 대하여 얻어진 신호를 플롯팅(plotting)하여 표준 곡선(reference curve)이 작성된다. 앞서 설명한 WHO/NIBSC 국제 표준 IgE 제제가 일반적으로 자작나무 표준 시스템(birch reference system)의 교정에 사용된다.
마찬가지로, ELISA는 조사 대상 환자의 혈청과 함께 인큐베이션된 고체 상(일반적으로 플라스틱 다중-웰 플레이트)에 흡착된 알레르겐(또는 항원)을 포함한다. 샘플 내 IgE의 알레르겐으로의 결합은 효소-결합 항-IgE 항체와 고체 상에 흡착된 알레르기겐에 결합된 IgE를 인큐베이션하고 그 후 효소에 대한 적절한 기질을 첨가하는 것에 의해 밝힌다. 기질의 촉매작용은 플레이트 상의 색상 변화로 이어진다. 색상 강도의 측정은 표준 곡선에 대한 색상 신호의 내삽에 의하여 혈청 IgE의 정량을 가능하게 한다. 표준곡선은 포획용(capture) 항-인간 IgE 항체로 ELISA 웰(well)을 코팅하고 먼저 이들을 WHO/NIBSC 국제 표준 IgE 제제 기준과 인큐베이션하고, 뒤이어 적절한 기질을 효소-결합 항-IgE 항체에 첨가하는 것에 의해 작성된다. 포획용 항-IgE의 농도는 표준 웰(reference well)에서 일정하게 유지되고 표준 IgE 제제는 표준 곡선을 얻기 위하여 적정된다.
예를 들면, ALLERGOPHARMA가 생산한 ELISA RV-5 키트는 포획용 항-인간 IgE의 단일농도로 코팅된 디스크와 함께, 96-웰 플레이트의 바닥에 배치된 종이 디스크에 흡착된 알레르겐의 단일 농도로 구성된다. 알레르겐이 코팅된 디스크가 환자의 혈청과 인큐베이션되는 동안, 포획용 항-IgE가 코팅된 디스크는 WHO/NIBSC 국제 표준으로부터 유래된 인간 IgE 제제와 혼성화(hybridized) 된다. 그 후 표준곡선은 알려진 WHO/NIBSC IgE 농도에 대하여 포획용 항-IgE가 코팅된 웰로부터 얻은 신호 강도를 플롯팅하여 작성된다. 알레르기 테스트를 위한 HYCOR에 의해 활용되는 완전히 자동화된 효소 면역분석법(Enzyme Immunoassay, EIA)은 동일한 원리를 기반으로 한다.
CAP 시스템-PHADIA(표준 방법)는 고체 상 - ImmunoCAP의 성질에서 앞서 설명한 방법과 근본적으로 다르다. ImmunoCAP의 고체 상은 다른 기질과 비교하여 더 높은 결합능을 갖는 CNBr-활성화된 셀룰로오스 유도체이다(David W. (2006), The immunoassay handbook, Elsevier Ltd 출판). 목적 알레르겐(allergen of interest)은 캡슐 내에 넣어진 친수성 담체 중합체(hydrophilic carrier polymer)에 공유결합에 의해 커플링된다. 담체는 높은 단백질 결합 특성을 갖는 셀룰로오스 유도체로 구성된다. ImmunoCAP은 환자의 혈청 중 특이적 IgE와 반응할 수 있고 결합하지 않은 IgE를 세척에 의해 제거 후, 효소-표지된 항-IgE 항체가 첨가되어 복합체(complex)를 형성하고, 그 후 이 복합체가 형광 기질과 인큐베이션된다. ELISA 방법과 마찬가지로, 색상 강도는 교정에 사용된 이종의 총 혈청-IgE 용량-반응 곡선으로 내삽에 의해 혈청 내 알레르겐-특이적 IgE의 수준의 지표를 제공한다. 이 분석법은 IgE에 대한 WHO 기준에 대하여 교정되고 2세트의 교정기를 포함한다: 0.35-100 kUA/l(특이적 IgE 항체 및 낮은 범위의 총 IgE 용) 및 2-2000 kUA/l (넓은 범위의 총 IgE 용). 항-IgE는 용량 반응 곡선의 동일한 최초 기울기로 더 넓은 측정 범위를 허용하도록 설계된다. 모든 고체-상 알레르겐은 측정범위에서 상대적으로 능력(capacity) 및 반응을 최대화하고 백그라운드 노이즈를 낮추기 위하여 그 후 개별적으로 최적화된다.
PHADIA가 생산한 ImmunoCAP ISAC 키트는 알레르기 진단을 위한 마이크로어레이-기반 테스트이다. 이 키트는 현대적인 바이오칩 기술을 기반으로 한다. ImmunoCAP ISAC은 다수의 알레르겐 성분에 특이적인 IgE 항체의 다중 측정을 가능하게 하는 소형화된(miniaturized) 면역분석 플랫폼이다. 정제된 천연 또는 재조합 알레르겐(40개의 공통 알레르겐 소스)의 성분이 고체 지지체(바이오칩)에 고정화되어 있다. 이것은 2단계 분석법(assay)이다. 첫 번째로, 환자 혈청으로부터 IgE 항체가 고정화된 알레르겐 성분에 결합한다. 두 번째로, 짧은 세척 단계 후, 알레르겐이 결합된 IgE 항체는 형광-표지된 항-IgE 항체에 의해 검출된다. ImmunoCAP ISAC은 반-정량(semi-quantitative) 테스트이고 결과는 ISU(ISAC Standardized Unit)로 보고된다.
Deinhofer et al (2004) Method: 32: 249-254는 다중-알레르겐 테스트 시스템으로의 마이크로어레이 기술의 응용에 대하여 기술한다.
EP 1 322 960 B1는 마이크로어레이-기반 알레르겐 테스트 시스템을 기술한다.
본 명세서 중 명백하게 선행-공개된 문서의 목록 또는 논의는 반드시 그 문서가 종래 기술의 일부이거나 또는 공통된 일반적인 지식이라고 인정하는 것으로 받아들여서는 안된다.
본 발명은 전술된 면역분석법의 문제를 해결하고자 한다. 본 발명은 테스트 샘플에서 IgE 수준을 정량하기 위한 더 정확한 면역분석법을 제공한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 테스트 샘플에서 다중 항원-특이적 면역글로불린(multiple antigen-specific immunoglobulin)을 정량하는 방법을 제공한다;
(i) 제 1 고체 지지체에 고정화된 다중 재조합 또는 정제된 항원 성분 또는 그의 단편(fragment)에 대하여, 알려진 항원 반응성을 갖는 면역글로불린, 테스트 샘플의 것과 동일한 서브타입(subtype)인 면역글로불린을 포함하는 일련의 샘플, 예를 들면 혈청 샘플의 결합을 분석(assay)하는 단계,
(ii) 각 항원 성분 또는 그의 단편에 대한 용량 반응 곡선을 작성하기 위하여 단계 (i)의 결합 수준과 알려진 반응성을 비교하는 단계,
(iii) 제 1 고체 지지체, 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 항-면역글로불린 항체, 그의 단편, 또는 유도체의 연속적인 희석에 대하여, 알려진 총량의 면역글로불린을 갖는, 단계 (i)에서 사용된 것과 동일한 면역글로불린 서브타입 (subtype)의 표준(reference) 면역글로불린 샘플의 연속적인 희석의 결합을 분석하는 단계,
(iv) 각 항-면역글로불린 항체, 단편, 또는 유도체 희석에 대하여 결합능 곡선(binding capacity curve)을 작성하기 위하여 단계 (iii)의 결합 수준과 표준 면역글로불린의 알려진 총량을 비교하는 단계,
(v) 단계 (ii)에서 작성된 용량 반응 곡선과 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선을 비교하고, 각 항원 또는 그의 단편에 대한 용량-반응 곡선과 가장 가깝게 일치되는 결합능 곡선을 확인하고, 이에 기초하여 각 항원 또는 그의 단편에 대한 결합능 곡선을 지정(assign)하는 단계,
(vi) 제 1 고체 지지체, 제 2 고체 지지체, 또는 제 3 고체 지지체에 고정화된 재조합 또는 정제된 항원 성분 또는 그의 단편에 대하여, 테스트 샘플 중 항원-특이적 면역글로불린의 결합을 분석하는 단계, 및
(vii) 단계 (v)의 항원 또는 그의 단편에 지정된 결합능 곡선에, 각 개별 항원 또는 그의 단편의 단계 (vi)의 결합 수준을 비교하고 테스트 샘플에 존재하는 항원-특이적 면역글로불린의 수준을 정량하는 단계.
알려진 면역글로불린 반응성을 포함하는 샘플은 특정 항원에 대한 면역글로불린의 알려진 반응성을 포함하는 샘플일 수 있다. 샘플은 알려진 IgE 반응성을 포함하는 것이 바람직하다. 샘플의 반응성은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 적절한 면역분석법의 이용을 통해 본 발명의 방법에서 사용하기 전에 결정될 것이다. 예를 들면 ELISA와 같은 적절한 면역분석법의 예가 위에 제공된다. 샘플은 혈청 샘플, 예를 들면 인간 혈청 샘플이 바람직하다. 반응성은 밀리리터 당 IU (International Unit)(IU/ml)로 표시될 수 있다. 용량-반응 곡선은 예를 들면, IU/ml로 표현된 IgE 반응성에 대하여 면역분석법에서 얻은 형광(fluorophore) 신호 강도를 플로팅하여 작성된다.
단계 (i)에서 사용된 일련의 샘플은 샘플의 패널(a panel of sample)을 포함하기 위한 것이다; 각 샘플은 하나 이상의 고정화된 항원, 또는 기타 항원과 반응할 수 있다. 이 단계는 각 항원에 대하여 넓은 범위의 상이한 결합 수준을 제공하기 위하여, 각각 동일한 항원에 대한 반응성의 상이한 수준을 가질 수 있는, 상이한 샘플의 상이한 특성을 활용한다. 예를 들면, 샘플 1은 항원 A에 대하여 x 반응성을 가질 수 있고, 샘플 2는 항원 A에 대하여 y 반응성을 가질 수 있으며, 샘플 3은 항원 A에 대하여 z 반응성을 가질 수 있다. 항원 A에 대한 샘플 1 내지 3의 반응성이 곡선으로 플로팅될 때, 용량 반응 곡선이 작성된다. 따라서, 동일한 항원, 및 상이한 항원에 대해 상이한 반응성을 갖는 이러한 샘플은, 이 방법의 나중 단계에 이용되는 각 고정화된 항원에 대한 용량-반응 곡선 작성에 사용된다.
알려진 반응성의 샘플 및/또는 테스트 샘플은 환자, 예를 들면 인간 환자로부터 얻은 샘플이라고 고려된다. 이 샘플은 혈청 샘플, 전혈 샘플, 혈장 샘플, 림프 샘플, 뇌척수액 샘플, 골수 샘플, 폐 흡인물 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 타액 샘플, 객담 샘플, 조직 샘플, 또는 면역글로불린을 포함할 수 있는 기타 샘플일 수 있다. 샘플은 알려진 IgE 반응성을 포함하는 혈청 샘플이 바람직하다.
표준 면역글로불린 샘플은 테스트 샘플에서 검출하기로 의도된 면역글로불린 의 클래스에 따라 적절한 클래스의 면역글로불린을 포함한다. 예를 들면, 면역분석법이 테스트 샘플에서 IgE의 검출을 위한 것인 경우, 표준 면역글로불린 샘플은 알려진 총 IgE를 포함할 것이다. 표준 면역글로불린 샘플은 총 면역글로불린의 농도가 알려진 면역글로불린의 샘플일 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린이 IgE 일 때, 표준 IgE 샘플은 WHO/NIBSC 국제 표준일 수 있다. 총 IgE는 IU/ml로 표시될 수 있다.
면역글로불린이 IgG, IgA, 및/또는 IgM, 또는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 면역글로불린 서브클래스(subclass)인 것인 대체 배열(arrangement)이 고려된다. 면역글로불린의 이러한 상이한 클래스 각각에 대한 특이적 항원 결합능을 나타내는 결합능 곡선을 작성하기 위하여 적절한 항-면역글로불린이 제공될 것이다. 즉, 검출대상 면역글로불린 서브클래스가 IgA일 때, 표준 면역글로불린 및 알려진 반응성의 면역글로불린 샘플은 적절한 IgA를 포함할 것이고 항-면역글로불린 항체는 항-IgA일 것이다.
제 1 고체 지지체, 또는 추가적인 고체 지지체에 고정화된 제 1 양태의 단계 (iii)에서 제공된 항-면역글로불린 항체는 테스트 샘플에서 검출될 것이 의도된 항체 클래스에 관한 것이다. 예를 들면, 알레르겐-특이적 IgE 항체가 테스트 샘플에서 검출될 것이 의도된 경우, 혈청 샘플 및 표준 샘플은 각각 알려진 반응성의 IgE 및 알려진 총 IgE를 포함할 것이다. 따라서 항-면역글로불린 항체는 항-IgE 항체일 수 있다. 항-면역글로불린 항체의 항체 서브클래스는 일반적으로 IgG일 것이다. 따라서, 항-면역글로불린 항체는 항-IgE, IgG 항체일 수 있는 것으로 고려된다.
"항원(antigen)"은 면역글로불린에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프(epitope)를 포함하는 화합물을 의미한다. 따라서, 항원은 천연 추출물에서 유래될 수 있고, 재조합 단백질, 또는 천연 추출물 또는 기타 소스(source)에서 정제된 또 다른 단백질 또는 기타 분자(예를 들면 폴리사카라이드)일 수 있다. 항원은 알레르겐, 즉 개체와 접촉시 그 개체에서 알레르기 반응을 유발할 수 있는 것으로 인식되는 항원인 것이 바람직하다. 상기 항원은 특성이 규명된(characterised) 알레르겐 일 수 있고, 또는 특성이 규명되어야 하는 알레르겐이 될 수 있다. 항원은 IgE 분자에 의하여 특이적으로 인식되는 화합물일 수 있는 것으로 고려된다.
고체 지지체에 포함될 수 있는 알레르겐 성분의 예는 하기를 포함한다: Der p1 및 Der p2 - 먼지 진드기(Dust Mite)인 더마토파고이테스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus)의 주요 알레르겐 분자; Bet v1 및 Bet v2 - 자작나무 꽃가루의 주요 알레르겐 분자; Phl p1, Phl p5, Phl p2 및 Phl p6 - 티모시 잔디(Timothy Grass) 화분의 주요 알레르겐 분자.
전술된 제 1 양태의 단계 (ii)는 고체 지지체에 포함된 각 항원에 대한 용량 반응 곡선을 제공한다. 고체 지지체 상 항원 농도는 적절한 반응을 얻도록 최적화될 수 있다. 항원(예를 들면 알레르겐)은 단백질의 농도의 관점에서, 가장 적절한 버퍼에 의하여 최적화될 수 있다. 항원 농도 및 버퍼의 최적화는 본 발명의 방법을 수행하기 전에 수행된다. 최적화는 각 항원에 대하여, 주어진 항원에 대하여 알려진 반응성을 갖는 샘플과 비교할 때, 반응성의 측면에서 가장 높은 일치성을 주는, 가장 적절한 단백질의 농도 및 단백질을 희석하기에 가장 적절한 버퍼를 확인하여 수행된다. 고체 지지체에 고정화될 항원을 가용화하고 항원 농도를 최적화하는데 이용되는 적절한 버퍼의 예는 하기를 포함한다: 인산염 완충 염수(Phosphate buffer saline) pH 7.4; 트윈 20(Tween 20) 0.1g/l을 포함하는 인산염 완충 염수 pH 7.4; 및/또는 10% 글리세롤을 포함하는 인산염 완충 염수 pH 7.4.
제 1 양태의 단계 (i) 내지 (iv)를 완료한 후, 당업자는 각 고정화된 항원에 대한 용량 반응 곡선과 제 1 고체 지지체, 또는 추가적인 고체 지지체에 존재하는 항-면역글로불린 항체의 각 농도에 대한 결합능 곡선을 갖게 될 것이다. 따라서, 두 개의 그래프가 작성될 것이다: 첫 번째는 각 항원에 대한 결합 강도와 알려진 샘플에 존재하는 항원-특이적 면역글로불린의 반응성을 비교하는 것이고(IgE를 포함하는 샘플에 의한 이러한 곡선의 예로 도 1 참조); 두 번째는 항-면역글로불린 항체의 희석에 대한 결합 강도와 표준 샘플에 존재하는 총 면역글로불린의 증가하는 농도를 비교하는 것이다(IgE를 포함하는 샘플의 이러한 곡선의 예로 도 2a 참조).
제 1 양태의 단계 (v)는 각 항원에 대하여 작성된 곡선과 각 항-면역글로불린 항체 농도에 대하여 작성된 곡선을 연결(match)시키기 위한 이러한 두 그래프의 비교를 제공한다. 이러한 비교는 시각적으로 또는 컴퓨터 소프트웨어의 이용과 같은 기타 다른 수단에 의하여 수행될 수 있다.
각 항원 샘플이 특정 항-면역글로불린 농도와 연결되면, 그 면역글로불린의 농도가 그 항원에 지정되고 특정 항원의 결합능을 더 정확하게 기술하는, 그 항원에 대한 더 정확한 표준 곡선, 또는 교정 곡선으로 나중에 사용된다. 따라서, 테스트 샘플 중 그 항원에 특이적인 항체의 농도는 그 항원에 대하여 새롭게 지정된 결합능 교정 곡선의 이용을 통하여 더 정확하게 밝혀질 수 있다.
본 발명자들은 당 업계에서 표준으로 실시되는, 다중 항원, 특히 다중 알레르겐에 대한 면역분석법을 교정하기 위한 단일 표준 곡선의 이용이 상이한 알레르겐이 보여주는 상이한 결합능을 기술하기에 부적절하다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 상이한 알레르겐 추출물과 함께 인큐베이션된, 알려진 IgE 반응성을 갖는 혈청 샘플로 면역분석법을 수행하는 경우, 각 알레르겐에 대하여 작성된 데이터를 갖는 상이한 용량-반응 곡선을 얻는다는 것을 발견하였다. 이것이 도 1에 예시된다. 따라서, 알레르겐 테스트의 실시예에서, 다중 분석법(multiplex assay)에서 다중 알레르겐이 테스트되는 경우, 이전 알레르겐 면역분석법에서 이용한 교정 시스템은 혈청 샘플의 IgE 반응성에 대한 정확한 정량적 정보를 제공하기에 부적절했다.
본 발명자들은 이용가능한 면역분석법의 단점을 해결하고 더 정확한 정량적 면역분석법을 제공하는 교정 시스템을 제공하고자 하였다. 본 발명에서와 같이, 그들의 결합능에 기반하여 각 항원에 대한 상이한 표준 곡선을 지정하는 단계는, 테스트 샘플에서 특이적 면역글로불린을 더 정확하게 정량할 수 있게 한다. 알레르겐 테스트의 실시예에서, 본 발명은 기존의 분석법보다 더 정확한 방법으로 알레르겐의 용량-반응 행동을 기술한다.
결합능 곡선은 향후의 분석에 대한 기준으로 이용될 수 있도록 면역분석법의 분석 장비를 제어하는 소프트웨어 내에 로딩될 수 있다. 각 분석에 대한 내부 대조군(internal control)은 각 분석에서 미세한 환경적 차이를 보정하기 위해 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 알레르겐의 새로운 배치(batch)가 고체 지지체로의 적재를 위해 준비되는 경우, 분석의 정확성을 보장하기 위하여 결합능 곡선은 적절하게 조정될 수 있거나 또는 본 명세서에서 교시한 바와 같이, 새로운 결합능 곡선이 작성될 수 있다. 이러한 품질 관리 활동은 당업자에 의하여 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
제 1 양태의 단계 (vi) 및 (vii)은 테스트 샘플에서 항원-특이적 면역글로불린 수준을 정량하기 위하여 선행 단계에서 작성된 결합능 곡선을 이용한다. 이 방법을 수행하기 위하여 이용되는 분석 장비에 의하여 요구되는 바와 같이, 제 1 양태에서 기술된 모든 고정화된 성분은 동일하거나 또는 상이한 고체 지지체에 고정화될 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 항원, 포획용 면역글로불린과 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함한, 모든 적절한 고정화된 성분은 동일한 고체 지지체, 예를 들면 칩에 고정화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 각 샘플은 교차-오염을 방지하기 위하여 상이한 고체 지지체, 예를 들면 칩과 인큐베이션될 것으로 고려된다. 따라서, 다수의 고체 지지체, 예를 들면 칩이 각 분석에 사용될 것이다. 예를 들면, 50개의 혈청 샘플이 고체 지지체 상에서 인큐베이션되면, 적절한 항원/면역글로불린/대조군이 고정화된 50개의 별개의 고체 지지체가 사용될 수 있다. 마찬가지로, 각 표준 샘플은 교차 오염을 방지하기 위하여 상이한 고체 지지체 상에서 인큐베이션될 것이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 활용되는 분석 장비는 샘플 인큐베이션의 정확한 역학(mechanics)에 영향을 미칠 것이다.
바람직한 구체예에서, 표준 면역글로불린 샘플(예를 들면 WHO 국제 기준 IgE)은 0.1 내지 100 IU/ml 범위의 최종 면역글로불린 농도로 사용된다. 바람직하게는, 고체 지지체에 고정화되는 항-면역글로불린 항체(예를 들면 항-IgE 항체)는 30 내지 0.1 ㎍/ml 범위의 농도로 사용된다.
용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"은 본 명세서에서 용어 "항체(antibody)" 또는 "항체들(antibodies)"과 호환적으로 사용된다.
제 1 양태는 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선이 상이한 결합능 수준, 예를 들면 아주 강한 결합, 강한 결합, 중간 결합 및 약한 결합을 나타내는 대표 결합능 곡선으로 분류(cluster)되고, 상기 단계 (v)의 비교는 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선보다는, 대표 결합능 곡선과 단계 (ii)에서 작성된 용량-반응 곡선에 대해 수행되는 것인 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
보다 적은 통합된(consolidated) 결합능 곡선을 제공하는 이 추가적인 단계를 포함하는 것은 데이터 관리를 단순화할 수 있고, 따라서 교정 과정을 단순화할 수 있는 것이 고려된다. 도 2b에 예시된 바와 같이, 이러한 결합능 곡선은 샘플의 향후 분석을 위하여 면역분석법 분석기 장비의 소프트웨어에 저장될 수 있다.
"항-면역글로불린 항체, 그의 단편, 또는 유도체(anti-immunoglobulin antibody, fragment or derivative thereof)"에서 항체는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예를 들면 Fab-유사 분자; Fv 분자; VH 및 VL 파트너 도메인이 유연한 올리고펩티드에 연결된 것인 단일-쇄 Fv(ScFv) 분자, 및 단리된(isolated) V 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAbs)를 포함하는 것을 의미하나, 전술된 우선적인 결합 특성을 나타내는 다른 리간드일 수 있다.
제 2 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 고체 지지체에 고정화된 다중 항원 또는 그의 단편으로의 다중 항원-특이적 면역글로불린의 결합을 분석하기에 적합한 장치를 교정하는 방법을 제공한다:
(i) 제 1 고체 지지체에 고정화된 다중 재조합 또는 정제된 항원 성분 또는 그의 단편에 대하여, 알려진 항원 반응성을 갖는 면역글로불린을 포함하는 일련의 샘플, 예를 들면 혈장 샘플의 결합을 측정하는 단계,
(ii) 각 항원 성분 또는 그의 단편에 대한 용량 반응 곡선을 작성하기 위하여 단계 (i)의 결합 수준과 상기 알려진 반응성을 비교하는 단계,
(iii) 제 1 고체 지지체, 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 항-면역글로불린 항체, 그의 단편 또는 유도체의 연속적인 희석에 대하여 알려진 총량의 면역글로불린을 갖는, 단계 (i)에서 사용된 것과 동일한 서브타입의 표준 면역글로불린 샘플의 연속적인 희석의 결합을 분석하는 단계,
(iv) 각 항-면역글로불린 항체, 단편, 또는 유도체 희석에 대하여 결합능 곡선을 작성하기 위하여 단계 (iii)의 결합 수준과 상기 표준 면역글로불린의 알려진 총량을 비교하는 단계,
(v) 단계 (ii)에서 작성된 용량 반응 곡선과 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선을 비교하고, 각 항원 또는 그의 단편에 대한 용량-반응 곡선과 가장 가깝게 일치되는 결합능 곡선을 확인하고, 이에 기초하여 각 항원 또는 그의 단편에 대한 결합능 곡선을 지정하는 단계, 및
(vi) 각 항원에 대한 결합능 곡선이 그 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 미지의 양을 포함하는 샘플에서 생성된 신호에 의해 내삽(interpolated)될 수 있도록 상기 장치에 단계 (v)에서 작성된 결합능 곡선을 입력하는 단계.
제 2 양태는 단계 (iv)에서 작성된 상기 결합능 곡선이 결합능의 상이한 수준, 예를 들면 아주 강한 결합, 강한 결합, 중간 결합 및 약한 결합을 나타내는 대표 결합능 곡선으로 분류되고, 상기 단계 (v)의 비교는 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선보다는, 대표 결합능 곡선과 단계 (ii)에서 작성된 용량-반응 곡선에 대해 수행되는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.
이러한 장치가 제 2 양태의 방법을 이용하여 교정된 후에는, 테스트 샘플 중 항원-특이적 면역글로불린의 분석 및 정량에 활용될 수 있다.
예를 들면, 항체에 결합한 항원을 시각화하기 위한 적절한 처리 후 마이크로어레이 슬라이드(고체 지지체)는 ADAM 장비(Microtest Matrices Ltd)를 이용하여 판독될 수 있다. 용량-반응곡선을 계산하기 위하여 원 데이터(raw data)를 수집하고 이용한다. 장비의 출력물은 마이크로어레이의 모든 도트(dot)가 나열된 구조적 파일(textural file)이다; 도트는 마이크로어레이 상 각 도트에서 방출되는 광자 계수(photon count)의 위치 및 수치 값에 의하여 기술된다. Matlab과 유사한 수치 컴퓨팅 환경을 이용하여, 판독기에서 얻은 모든 데이터가 계산되고 용량-반응 곡선을 기술하는 인자의 집합(set of factors)이 생성된다. ADAM 장비는 구성 파일(configuration file)에 삽입된, 내부 표준 교정 곡선(Master Calibration Curve)을 구축하기 위하여 이러한 인자들을 이용한다.
제 1 및 제 2 양태의 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 알레르겐이고, 상기 면역글로불린은 IgE이며 상기 항-면역글로불린 항체는 항-IgE 항체이다. 따라서, 이러한 구체예에서, 이 방법은 고체 지지체에 고정화된 알레르겐 성분 또는 그의 단편에 대한 IgE 반응성에 대해 환자로부터 얻는 샘플을 분석하여 특정 알레르겐에 대한 환자에서 알레르겐의 검출에 이용될 수 있다. 이러한 정보는 특정 알레르겐에 대한 알레르기 진단에 도움이 될 수 있다.
고체 지지체에 고정화될 수 있는 알레르겐의 예는 표 1에 나열된 것을 포함한다.
표 1: 알레르겐 목록
알레르겐 목록
약물 F44 (딸기) M2 (Cladorporium erbarum)
C1 (Penicillin G) F45 (빵 효모) M3 (Aspergillus fumigatus)
C2 (Penicillin V) F46 (후추) M4 (Mucor racemosus)
C214 (Amoxicillin F49 (사과) M5 (Candida albicans )
진드기 M6 (Alternaria tenuis)
D1 (Dermatophagoides pteronyssinus) F74 (계란)(Hen's egg) M7 (Botrytis cinerea)
D2 (Dermatophagoides farinae) F76 (Alpha-Lactalbumin) M9 (Fusarium moniliforme)
D3 (Dermatophagoides microceras) F77 (β-Lactoglobulin) M13 (Phoma betae)
D70 (Acarus siro) M20 (Mucor mucedo)
D71 (Lepidoglyfus destructor) F83 (닭고기) 수목 화분( Tree pollens )
D72 (Tyrophagus putrescentiae) F84 (키위) T2 (Alder)
D73 (Glyciphagus domesticus) F85 (셀러리) T3 (Birch pollen)
동물 상피 F92 (바나나) T4 (Hazel)
E1 (Cat hair) F95 (복숭아) T5 (European beech)
E2 (Dog hair) 목초 화분( Grass pollen ) T6 (Mountain cedar)
E3 (Horse hair) G1 (Sweet vernal grass) T7 (Oak)
G2 (Bermuda grass/squitch) T9 (Olive)
E78 (Budgerigar feathers) G3 (Orchard grass) T11 (Plane)
E81 (Sheep epithelium) G4 (Meadow fescue) T14 (Poplar)
E82 (Rabbit epithelium) G5 (Ryegrass perennial) T901 (Ash)
음식 알레르겐 G6 (Timothy grass) T904 (Sallow)
F1 (계란 흰자) G8 (Bluegrass, June-Kentucky) 잡초 화분( Weed pollens)
F2 (우유) G12 (Rye cultivated) W1 (Ragweed common)
F3 (대구) G14 (Oats cultivated) W6 (Mugwort)
F4 (밀가루) G15 (Wheat) W8 (Dandelion)
F7 (귀리가루) G18 (Barley) W9 (English plantain)
F8 (옥수수가루) 곤충 W20 (Stinging nettle)
F13 (땅콩) I1 (Honeybee venom) W21 (Parietaria)
F14 (대두) I3 (Wasp venom) W32 (Rape)
F16 (호두) 정제된 단백질
F17 (헤이즐넛) I71 (Midge/Mosquito/Gnat) Bet v 1
F23 (새우) 직업성 알레르겐 (Occupational allergens ) Phl p 5 (G6-V)
K81 (Ficus benjamina) Phl p 1
F26 (돼지고기) K82 (Latex) Der p 1 (D1-I)
F27 (소고기) K87 (Alpha amylase) Der p 2 (D1-II)
F31 (당근) K905 (HSA) Bet v 2
F33 (오렌지) 균류( Mould ) Phl p 2
F35 (감자) M1 (Penicillium notatum) Phl p 6
제 3 양태에서, 본 발명은 고체 지지체에 고정화된 항-IgE 항체, 그의 단편 또는 유도체의 연속적인 희석을 포함하는 다중-알레르겐 테스트 시스템을 제공한다. 이러한 다중-알레르겐 테스트 시스템은 본 발명의 앞선 양태의 방법에서 사용될 수 있다.
제 3 양태의 구체예에서, 상기 시스템은 상기 고체 지지체 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 재조합 또는 정제된 알레르겐 성분 또는 그의 단편을 더 포함한다.
제 4 양태에서, 본 발명은 제 3 양태의 다중-알레르겐 테스트 시스템, 및 하기 중 하나 이상을 포함하고:
i) 표준 IgE 샘플;
ii) IgE에 결합하는 제 1 항체를 포함하는 제 1 항체 제제;
iii) 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체를 포함하는 제 2 항체 제제;
iv) 제 2 항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체를 포함하는 제 3 항체 제제;
상기 제 2 항체 또는 제 3 항체는 검출 마커에 접합되는 것인 부분의 키트(kit of part)를 제공한다.
제 4 양태의 구체예에서, 검출 마커는 효소, 예를 들면 당업자에 의해 이해될, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish Peroxidase, HRP) 또는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)일 수 있다. HRP에 대한 적절한 기질은 발색 기질(예를 들면 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)(TMB), 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-Diaminobenzidine)(DAB), 및 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid))(ABTS)) 및 화학발광 기질(예를 들면 SuperSignala 및 ECL)을 포함한다. 특히 바람직한 기질은 Alexa555 형광(fluorophore) 표지된 티라마이드(Tyramide)이다.
제 4 양태의 대안적인 실시예에서, 검출 마커는 화학발광 모이어티(예를 들면 아크리디늄 에스테르(acridinium ester) 화합물), 방사성 모이어티(예를 들면 32P), 또는 형광 모이어티(예를 들면 플루오레세인(Fluorescein)(FITC))일 수 있다. 기타 적절한 검출 표지(label) 및 이들의 검출 및 이들의 항체로의 접합 방법은 당업자에 잘 알려져 있을 것이다.
본 발명의 양태의 구체예에서, 고체 지지체는 마이크로어레이 칩일 수 있다. 적절한 마이크로어레이 칩은 하기와 같이 구성될 수 있다: 최적 버퍼에서(앞서 결정됨, 위 참조), 최종 최적 농도까지 단백질 원액(stock solution)을 희석하여 단백질 용액(즉, 알레르겐)을 먼저 제조한다. 개별 항원에 대해, 최종 농도는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 상이할 수 있다. 그 후 단백질 용액을 384-웰 플레이트에 로딩(loaded)한다. 플레이트 및 고체 지지체를 그 후 프린터, 예를 들면 비-접촉 압전(non-contact piezo-electric) 프린터에 넣는다. 프린터는 웰로부터 용액을 뽑아내고 이를 고체 기판(마이크로어레이) 상에 방울로 분배하는 수많은 노즐을 갖는다. 각 용액을 분배한 후, 노즐은 그 후 세척되고 다음 용액을 위해 준비된다. 프린터는 스트로보스코프(stroboscope)로 불리는 카메라를 가지며, 이것은 분배되는 방울의 사진을 찍어서 용액이 적절히 분배되는지 모니터링한다. 만약 용액이 적절히 분배되지 않는다면, 스트로보스코프는 이를 보고한다. 적합한 광학적 지지체가 마이크로어레이를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 유리 지지체, 또는 그와 유사한 것이 적당할 것이다. 이러한 다양한 지지체는 당업자에 잘 알려져 있을 것이다.
본 발명의 구체예는 하기의 도면을 참조하여 예시로서만 설명될 것이다:
도 1은 다중 알레르겐 용량-반응 곡선을 나타내는 그래프이다;
도 2a는 다중 결합능 곡선을 나타내는 그래프이다; 및
도 2b는 본 발명에 따른 통합 결합능(consolidated binding-capacity curve) 곡선을 나타내는 그래프이다.
실시예 1: 결합능 교정 시스템을 갖는 면역분석법
마이크로어레이-기반 면역분석법을 플랫폼으로 이용하여, 혈청 알레르겐-특이적 IgE를 정확하게 정량하기에 적합한 교정 시스템이 기술된다. 기술된 면역분석법은 약 100개의 상이한 알레르기의 패널을 커버하는 약 100개의 상이한 알레르겐 추출물(allergenic extract)을 포함한다.
기술된 교정 시스템은 100개의 알레르겐 추출물 모두의 용량-반응 행동을 신뢰할 수 있게 설명할 수 있다. 각 알레르겐 추출물은 상이한 IgE 결합능, 즉 상이한 용량-반응 기울기를 갖는 고유한 화합물이다. 본 교정 시스템은 샘플 중 알레르겐-특이적 IgE 수준을 측정하기 위한 정확한 시스템을 제공하기 위하여 이러한 상이한 결합능을 고려한다.
마이크로어레이 칩 실시예
본 명세서에 기술된 시스템은 약 103개까지의 알레르겐 측정을 위하여 설계된 소형화된 면역분석법을 이용하는 마이크로어레이-기반 테스트이다. 어레이(array)을 생성하기 위하여 화학적으로 활성화된 슬라이드글라스 위에 알레르겐 추출물을 고정화한다. 각 천연 알레르겐 추출물은 그의 최적 단백질 농도 및 버퍼(앞서 선택됨)에서 마이크로어레이상에 점으로 표시(spotted)된다. 또한, 마이크로어레이는 양의 대조군(예를 들면 염소 항-마우스 IgG) 및 음의 대조군(예를 들면 소 혈청 알부민과 같은, 비-특이적 단백질), 연속적인 희석에서 표시된 포획용 항-인간 IgE(다클론 염소 항-인간 IgE)를 포함한다.
항체 시각화 프로토콜 실시예
하기는 혈청 샘플 또는 표준 샘플 중 IgE의 본 명세서에 기재된 마이크로어레이로의 결합(잠재적인 환경적 변화를 제어하기 위해, 적절한 경우, 동시에, 동일한 시약으로 분석을 수행함)을 시각화하는데 이용될 수 있는 프로토콜의 실시예이다.
별개의 어레이를 먼저 IgE 샘플(혈청 또는 표준)과 인큐베이션하고 뒤이어 단클론 항-인간(또는 분석 샘플에 따라, 기타 적절한 항체) IgE 항체(예를 들면, 항-인간 IgE 마우스 IgG)와 인큐베이션하며, 만약 IgE가 존재하고 스팟팅된 알레르겐에 결합한다면, 이 IgE 항체는 혈청 또는 표준 샘플의 인간 IgE에 결합할 것이다. 그 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase)(HRP)와 접합한 염소 다클론 항-마우스 IgG 항체를 어레이에 첨가하고, 뒤이어 Alexa555 형광 표지된 티라마이드(Tyramide)를 첨가한다. 각 항체 인큐베이션 단계 사이에 적절한 세척 단계를 수행한다.
과산화수소(H2O2)의 존재시, HRP 효소는 티라마이드-Alexa555를 고 반응성이고, 짧은 수명을 갖는 티라마이드-Alexa555 라디칼로 전환시키고 이 라디칼은 HRP-표적 상호작용 부위 주변의 친핵성 잔기와 반응한다. 이는 특정 파장(555nm)에서 결합된 HRP 효소의 양에 비례하는 강도의 형광을 생성한다.
다클론 항체 및 HRP-티라마이드 시스템(비-선형 신호 증폭 시스템)의 이용은 마이크로어레이 면역분석법 테스트의 민감도를 크게 증가시킨다.
전술된 프로토콜은 IgE 수준을 정량하기 위하여 표준 곡선에 내삽되는 곡선을 제공하기 위하여 혈청 샘플 농도의 그래프에 플로팅되는 각 알레르겐의 스팟(spot)에 대한 형광 강도를 제공한다.
본 발명의 교정 방법
본 명세서에 기술된 교정 방법은 본 발명의 마이크로어레이 칩을 이용한 하기 단계에 의해 예시된다:
1. 각 항원에 대한 용량-반응 곡선의 확인. 알려진 IgE 반응성을 갖는 다수의 혈청 샘플을 마이크로어레이 칩 상에서 테스트한다. 알레르겐 용량-반응 곡선을 작성하기 위하여 알레르겐으로부터 얻어진 신호 강도를 수집하고 이용한다.
2. 결합능 곡선의 패널 생성. WHO/NIBSC 국제 표준 IgE 제제(0.1 내지 100 IU/ml)의 연속적인 희석을 칩 상에서 인큐베이션한다. IgE는 스팟팅된(spotted) 포획용-항-인간 IgE와 결합하고 생성된 신호 강도를 측정하고 이용하여 결합능 곡선의 패널을 구축한다. 각 곡선은 포획용 항-인간 IgE의 상이한 농도 중 하나에 해당하고, 칩의 인큐베이션에 이용된 WHO/NIBSC IgE 농도 대 그에 상응하는 얻어진 신호 강도를 플로팅하여 얻는다. 칩 위에 존재하는 포획용 항-인간 IgE의 상이한 스팟(spot)의 수에 따라 다수의 결합 곡선을 작성한다(각 곡선은 어레이에 점으로 스팟팅된(spotted) 포획용 항-인간 IgE의 상이한 농도 중 하나에 해당하고 WHO/NIBSC IgE 농도 대 그에 상응하는 얻어진 신호 강도를 플로팅하여 얻은 것인 도 2a참조).
3. 결합능 곡선의 분류(clustering). 그 후 결합능 곡선을 상이한 결합능 수준(예를 들면, 아주 강한, 강한, 중간 및 약한 결합 능력)으로 나타내는 그룹에서 분류한다. 분석기 장비의 소프트웨어에서 각 그룹에 대한 회귀 곡선을 작성하고 저장한다(그룹으로 분류된 결합능 곡선을 보여주는 도 2b 참조).
4. 알레르겐에 지정된 결합능 곡선. 1에서 기술한 바와 같이 얻은 알레르겐 용량-반응 곡선의 기울기 및 모양에 따라, 결합능 곡선 중 하나(표준 곡선)( Master Curve)를 각 알레르겐에 지정한다.
5. 알레르겐-특이적 IgE의 정량. 이 교정 시스템을 이용하여, 마이크로어레이 칩 위에 스팟팅된 특정 알레르겐으로부터 얻은 신호 강도를 구체적으로 지정된 결합능 곡선에 내삽하여 미지의 환자 혈청의 알레르겐-특이적 IgE를 측정한다. 알레르겐 반응성은 IU/ml 및/또는 클래스 점수(Class Score)로 표시한다.
6. 각 칩에 내부 대조군(internal control)(조정자, adjuster)을 이용하여, 이 시스템은 슬라이드의 저장 및 환경 조건을 고려하여 용량-반응 내부 곡선(dose-response Internal Curve)을 구축하고, 4에서 얻은 표준 곡선을 그에 따라 조정한다. 내부 교정은 조정자의 신호에 기초하여 표준 교정 곡선(Master Calibration Curve)을 이동시키기 위한 알고리즘의 실행으로 구성된다. 예를 들면, 기대값이 1000 유닛인 조정자의 신호가 950으로 나오면, 이 알고리즘은 표준 교정 곡선에서 5% 이동(shift)을 가져온다.
단일 교정 곡선을 이용하는 일반적인 알레르겐 면역분석법과 달리, 본 발명의 면역분석법 시스템은 각 알레르겐의 결합능의 차이를 고려한다. 본 발명의 면역분석법 시스템은 샘플 중 알레르겐-특이적 IgE 정량을 위한 훨씬 더 정확한 분석법(assay)을 제공한다.

Claims (13)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 테스트 샘플에서 다중 항원-특이적 면역글로불린(multiple antigen-specific immunoglobulin)을 정량하는 방법;
    (i) 제 1 고체 지지체에 고정화된 다중 항원 성분 또는 그의 단편(fragment)에 대하여, 알려진 항원 반응성을 갖는 면역글로불린을 포함하는 일련의 샘플의 결합을 분석(assay)하는 단계,
    (ii) 단계 (i)의 결합 수준과 상기 알려진 반응성을 비교하여, 각 항원 성분 또는 그의 단편에 대한 용량 반응 곡선을 작성하는 단계,
    (iii) 상기 제 1 고체 지지체, 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 항-면역글로불린 항체, 또는 그의 단편의 연속적인 희석물에 대하여, 알려진 총량의 면역글로불린을 갖는, 단계 (i)에서 사용된 것과 동일한 면역글로불린 서브타입 (subtype)의 표준(reference) 면역글로불린 샘플의 연속적인 희석물의 결합을 분석하는 단계,
    (iv) 단계 (iii)의 결합 수준과 상기 표준 면역글로불린의 알려진 총량을 비교하여, 각 항-면역글로불린 항체, 또는 그의 단편의 희석물에 대하여 결합능 곡선(binding capacity curve)을 작성하는 단계,
    (v) 단계 (ii)에서 작성된 용량 반응 곡선과 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선을 비교하고, 각 항원 또는 그의 단편에 대한 용량-반응 곡선과 가장 가깝게 일치되는 결합능 곡선을 확인하고, 확인된 결합능 곡선을 각 항원 또는 그의 단편에 대한 결합능 곡선으로 지정(assign)하는 단계,
    (vi) 상기 제 1 고체 지지체, 상기 제 2 고체 지지체, 또는 제 3 고체 지지체에 고정화된 항원 성분 또는 그의 단편에 대하여, 테스트 샘플 중 항원-특이적 면역글로불린의 결합을 분석하는 단계, 및
    (vii) 단계 (v)에서 지정된 각 항원 또는 그의 단편에 대한 결합능 곡선에, 각 개별 항원 또는 그의 단편의 단계 (vi)의 결합 수준을 비교하고 테스트 샘플에 존재하는 항원-특이적 면역글로불린의 수준을 정량하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (iv)는 단계 (iv)에서 작성된 상기 결합능 곡선을 결합능의 상이한 수준을 나타내는 대표 결합능 곡선으로 분류(cluster)하는 것을 더 포함하고, 상기 대표 결합능 곡선을 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선으로 이용하는 것인 방법.
  3. 하기의 단계를 포함하는, 고체 지지체에 고정화된 다중 항원 또는 그의 단편으로의 다중 항원-특이적 면역글로불린의 결합을 분석하는 장치를 교정하는 방법;
    (i) 제 1 고체 지지체에 고정화된 다중 항원 성분 또는 그의 단편에 대하여, 알려진 항원 반응성을 갖는 면역글로불린을 포함하는 일련의 샘플의 결합을 분석하는 단계,
    (ii) 단계 (i)의 결합 수준과 상기 알려진 반응성을 비교하여, 각 항원 성분 또는 그의 단편에 대한 용량 반응 곡선을 작성하는 단계,
    (iii) 상기 제 1 고체 지지체, 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 항-면역글로불린 항체, 또는 그의 단편의 연속적인 희석물에 대하여, 알려진 총량의 면역글로불린을 갖는, 단계 (i)에서 사용된 것과 동일한 서브타입의 표준 면역글로불린 샘플의 연속적인 희석물의 결합을 분석하는 단계,
    (iv) 단계 (iii)의 결합 수준과 상기 표준 면역글로불린의 알려진 총량을 비교하여, 각 항-면역글로불린 항체, 또는 그의 단편의 희석물에 대하여 결합능 곡선을 작성하는 단계,
    (v) 단계 (ii)에서 작성된 용량 반응 곡선과 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선을 비교하고, 각 항원 또는 그의 단편에 대한 용량-반응 곡선과 가장 가깝게 일치되는 결합능 곡선을 확인하고, 확인된 결합능 곡선을 각 항원 또는 그의 단편에 대한 결합능 곡선으로 지정하는 단계, 및
    (vi) 각 항원에 대한 결합능 곡선이 그 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 미지의 양을 포함하는 샘플에서 생성된 신호에 의해 내삽(interpolated)될 수 있도록 상기 장치에 단계 (v)에서 작성된 결합능 곡선을 입력하는 단계.
  4. 청구항 3에 있어서, 단계 (iv)는 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선을 상이한 결합능의 수준의 대표 결합능 곡선으로 분류하는 것을 더 포함하고, 상기 대표 결합능 곡선을 단계 (iv)에서 작성된 결합능 곡선으로 이용하는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 재조합 항원 또는 천연 추출물로부터 유래된 항원, 또는 이들의 조합물인 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 알레르겐(allergen)이고, 상기 면역글로불린은 IgE이고, 상기 항-면역글로불린 항체는 항-IgE 항체인 것인 방법.
  7. a) 제1 고체 지지체에 고정화된 항-IgE 항체, 또는 그의 단편의 연속적인 희석물, 및 상기 제 1 고체 지지체, 또는 제 2 고체 지지체에 고정화된 알레르겐 성분, 또는 그의 단편, 및 상기 제 1 고체 지지체, 상기 제 2 고체 지지체, 또는 제 3 고체 지지체에 고정화된 양성 및 음성 대조군을 포함하는 다중-알레르겐 테스트 시스템; 및
    b) 하기 중 하나 이상을 포함하는 키트로서:
    i) 표준 IgE 샘플;
    ii) IgE에 결합하는 제 1 항체를 포함하는 제 1 항체 제제;
    iii) 상기 제 1 항체에 특이적으로 결합하는 제 2 항체를 포함하는 제 2 항체 제제; 및
    iv) 상기 제 2 항체에 특이적으로 결합하는 제 3 항체를 포함하는 제 3 항체 제제;
    상기 제 2 항체 또는 제 3 항체는 검출 마커에 접합되는 것인 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 항원은 재조합 항원 또는 천연 추출물로부터 유래된 항원, 또는 이들의 조합물인 것인 키트.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 검출 마커는 효소인 것인 키트.
  10. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 검출 마커는 화학발광 모이어티(moiety), 방사성 모이어티, 또는 형광 모이어티인 것인 키트.
  11. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로어레이 칩(microarray chip)인 것인 방법.
  12. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 고체 지지체는 마이크로어레이 칩(microarray chip)인 것인 키트.
  13. 청구항 2 또는 4에 있어서, 상기 대표 결합능 곡선은 아주 강한 결합능, 강한 결합능, 중간 결합능 및 약한 결합능 곡선으로 분류되는 것인 방법.
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