KR101628834B1 - 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 조성물, 키트 및 진단방법 - Google Patents

베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 조성물, 키트 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베크위드-위드만 (BeckwithWiedemann) 증후군 또는 실버 러셀 Silver-Russel) 증후군 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 조성물, 키트 및 진단방법에 관한 것이다. 이에 본 발명은 메칠화 특이적 프라이머를 사용하여 파이로염기서열분석을 통해 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군을 각각 97%, 70%로 검출율을 높이는 효과가 있는바, 이는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군의 유전학적 진단율을 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트, 이를 포함한 진단용 조성물, 키트 및 진단방법은 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 조성물, 키트 및 진단방법 {Primer set for diagnosis of BeckwithWiedemann syndrome or Silver-Russel syndrome, Kit comprising the same, and Method of diagnosis using the same}
본 발명은 베크위드-위드만 (BeckwithWiedemann) 증후군 또는 실버 러셀 (Silver-Russel) 증후군 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단용 조성물, 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
베크위드-위드만 증후군(BeckwithWiedemann syndrome, BWS)은 1963년 Beckwith JB와 1964년 Wiedemann HR에 의해 처음보고 된 질환으로, 거구증 (macrosomia), 대설증 (macroglossia), 배꼽탈장 (omphalocele), 귀 접힙증 (ear creases), 신장이나 간 등의 비대증 (viceromeglay), 배아 종양 (embryonal tumor), 헤마하이퍼플라지아 (hemihyperplasia), 부신피질세포거대증 (adrenocortical cytomegaly), 및 저혈당증 등의 주요 증상을 특징으로 한다.
베크위드-위드만 증후군은 11번 염색체에서의 유전체 각인 (genomic imprinting)의 이상에 의해 발생되며, 11p15 위치에 있는 H19 DMR (differentially methylated region)로 알려진 BIC1과 KCNQ1 DMR로 알려진 BWSIC2인 두 개의 각인중심 (imprinting center)이 연관되어 있다. BWSIC1은 종양억제기능을 가지는 비코딩 (non-coding)RNA에 대한 유전자인 H19와 IGF2 (insulin-like growth factor2)유전자의 발현 조절에 관여하는 메칠화 군집으로 부계로부터 유래된 대립형질 (allele)이 메칠화 되어 있다. BWSIC2는 전위의존성 칼륨 통로 (voltage-gated potassium channel) 유전자인 KCNQ1의 LIT1 (Long QT intronic transcript 1, 또는 KCNQ1OT1)에서의 메칠화된 군집으로 모계로부터 유래된 대립형질 (allele)이 메칠화되어 존재한다.
베크위드-위드만 증후군 환자의 약 40 %는 BWSIC2에서 메칠화 이상을 보이며, 이는 가장 흔한 빈도를 보이는 유전적 이상이다. 베크위드-위드만 증후군 환자의 20-25 %는 11p15부위에서 부계 유래의 단위생식 이염색체 (uni-parental disomy -UPD)를 보이고, 약 10% 의 BWS환자는 BWSIC1의 돌연변이에 의한H19 및 IGF2의 비정상적 메칠화를 보이며, 나머지 약 30% 의 환자는 정상 메칠화 양상을 보인다
실버-러셀 증후군 (Silver-Russel syndrome)은 Silver 등과 Russell에 의해 보고된 질환으로, 출생 시 저체중, 역삼각형의 안모, 뾰족한 턱, 신체의 비대칭, 출생 후 저성장, 정상 범주의 두부 둘레 크기, 고전적인 안모의 특징, 골격적 비대칭, 만지증, 굴지증, 편측성비대, 요도하혈, 후부요도판막증, 탈장 등의 주요 증상을 특징으로 한다.
실버-러셀 증후군은 임상적, 유전적으로 이형성 질환으로 상염색체 우성, 상염색체 열성, X염색체 연관 유전 모형 모두가 보고되어 있다. 유전학적으로 상당히 복잡한 양상을 보이는 질환으로, 다양한 유전자가 원인으로 지목되어 왔다. 가장 주목 받아온 유전자는 7번 염색체이다. 출생 전 후 성장 지연이 나타난 환자에서 7번 염색체의 모계 단위생식 이염색체 (maternal uniparentaldisomy)가 발견되었으며, 이에 따라 이 염색체에 위치한 성장조절유전자가 성장억제의 원인으로 지목되었다. Kobayashi 등은 쥐의 Peg1/Mest 유전자의 사람에서의 상동유전자를 러셀-실버 증후군의 원인으로 제안한바 있으며, Joyce 등은 실버-러셀 증후군의 일부 증상만을 보이는 모녀의 증례에서 7p13p12.1의 말단이 단축되어 있는 것을 보고하였다.
또한 11번 염색체의 11p15.5 영역에 위치하는 각인중심부위 (imprinting centre region, ICR)이 러셀-실버 증후군과 형질적으로 반대의 증상을 보이는 베크위드-위드만 증후군의 원인 요소라는 보고가 이루어져 왔으며, 러셀-실버 증후군을 가진 환자 9명 중 5명에서 이 영역의 메칠화가 관찰됨으로써 러셀 실버 증후군의 원인 요소 중 하나로 주목 받고있다.
따라서, 11번 염색체의 메칠화 양상을 확인함으로써 베크위드-위드만 증후군환자와 실버 러셀 증후군환자에 대한 유전적 진단이 가능하다. 바이설파이트처리를 이용한 MS-PCR RFLP방법으로 베크위드-위드만 증후군환자의 경우 83%, 실버 러셀 증후군환자의 경우 50% 유전적 진단이 가능하다. 하지만, 본 방법으로는 부분적 메칠화 이상을 발견할 수는 없었으며, 진단 양성률을 높이기 위한 방법의 도입이 필요하다고 판단된다
이에, 본 발명자는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군의 진단 양성률을 높이기 위하여 예의 노력한 결과, 파이로 염기서열 분석법을 이용하는 메칠화 정량분석의 진단기술의 효과를 화인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군의 유전학적 진단율을 높이기 위해 연구하였고, 파이로염기서열 분석법을 이용한 메칠화 정량분석의 분자 진단기술을 조사하였다. 그 결과 파이로염기서열 분석법을 이용하는 경우 부분적인 메칠화 정도를 정량화할 수 있음을 규명하였다. 이러한 실험을 기초로 파이로염기서열분석법을 이용한 메칠화 정량분석의 분자 진단기술이 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군 질병에 대한 정확한 진단에 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 양상은 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군에서 공통적으로 보이는 염색체내의 메칠화 이상을 파이로염기서열 분석법을 이용하여 정량적인 방법으로 측정함으로써 질병에 대한 정확한 진단을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군 질병 진단에 사용되는 프라이머 세트, 조성물 및 진단용 키트를 제공한다
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 및 2의 염기서열 또는 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진, 베크위드-위드만 증후군 또는 실버 러셀 증후군 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 베크위드-위드만 증후군 또는 실버 러셀 증후군 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 베크위드-위드만 증후군이란, 거구증 (macrosomia), 대설증 (macroglossia), 배꼽탈장 (omphalocele), 귀 접힙증 (ear creases), 신장이나 간 등의 비대증 (viceromeglay), 배아 종양 (embryonal tumor), 헤마하이퍼플라지아 (hemihyperplasia), 부신피질세포거대증 (adrenocortical cytomegaly), 및 저혈당증 등의 주요 증상을 특징으로 한다.
본 발명에서 실버 러셀 증후군이란, 출생 시 저체중, 역삼각형의 안모, 뾰족한 턱, 신체의 비대칭, 출생 후 저성장, 정상 범주의 두부 둘레 크기, 고전적인 안모의 특징, 골격적 비대칭, 만지증, 굴지증, 편측성비대, 요도하혈, 후부요도판막증, 탈장 등의 주요 증상을 특징으로 한다.
본 발명에서 진단이란 질병 유무, 질병의 상태 및 질병의 예후를 확인하는 것을 포함하며, 질병상태 및 결정을 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 말한다.
본 발명에서 프라이머는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는?것으로, 핵산쇄 (주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP,dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다.
본 발명에서 프라이머는 '프라이머' 또는 '시발체'라고 한다.
본 발명에서 프라이머는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군에 관련된 11p15부위의 H19DMP, KvDMR에 대한 메칠화 특이적 프라이머이다. 이는 PSQ assay (Qiagen, hilden, Germany) 소프트웨어를 이용하여 고안한 것이다. 표적으로 한 DMR 부위와 바이설파이트 변성 특이 염기서열 프라이머는 하기와 같다.
Figure 112014000639298-pat00001
상기 표의 프라이머는 5’ 비오틴이 부착된 염기서열이며, H19-DMR 및 CTCF binding domain의 뉴클레오티드 위치는 AF087017, LIT1-DMR은 NT_009237.18, GRB10-DMR은 NT_033968.6, SGCE-DMR은 NT_007933.15에서 선택된 것이다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기와 같이 고안된 바이설파이트 변성 특이 염기서열 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 유전자절편을 증폭시킨다. 중합효소 연쇄반응은 85 ℃ 내지 95 ℃ 20초 내지 40 초, 45 ℃ 내지 60 ℃ 20초 내지 40초, 62 ℃ 내지 82 ℃ 20초 내지 40초로 이 과정을 30회 내지 55회 반복하여 유전자 절편을 증폭 시킨다.
본 발명에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA)(19) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제 (self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR),임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트 (hotstart) PCR, 네스티드 (nested) PCR 및 부스터 (booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간 (real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR (differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNAends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응 (inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트 (vectorette) PCR, TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
상기 조성물은 서열번호 3 또는 6의 시발체를 더 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1 및 2 염기서열의 프라이머를 포함하는 경우, 서열번호 3 염기서열의 시발체가 더 포함될 수 있으며, 서열번호 4 및 5 염기서열의 프라이머를 포함하는 경우, 서열번호 6 염기서열의 시발체를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물을 이용하는 경우, 베크위드-위드만 증후군 및 러셀 실버 증후군을 동시에 진단할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 (a) 청구항 1의 프라이머 세트로 시료의 유전자를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 증폭된 유전자절편을 파이로염기서열분석법을 통하여 메칠화를 정량화는 단계;를 포함하는 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군의 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서 파이로염기서열 분석은 중합효소 연쇄반응으로 증폭 산물을 만들어 이를 이용한다.
본 발명에서 증폭 산물은 게놈 DNA를 바이설파이트용액 (2.5 M 나트륨 (sodium) 바이설파이트를 1 N NaOH와 20mM 하이드로퀴논 (Hydroquinone)이 혼합된 액체에 녹인 용액)으로 50 ℃에서 밤새 변성시킨 후, 바이설파이트 성분을 제거하고 DNA를 회수하기 위해, 칼럼 방식의 DNA를 회수하고, 회수된 바이설파이트 변성 DNA 20ng로 바이설파이트 변성 특이 염기서열 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 만드는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 증폭산물을 이용하여 pyroGold kit와 PyroMark ID96장치 (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 파이로염기서열분석을 한다.
본 발명에서 메칠화란 CpG 영역(site)의 시토신(cytosine)이 메칠화되어 5-메틸시토신(5-methylcytosine)이 되는 것을 의미한다. 게놈의 염기서열에서 시토신(C)과 구아닌(G)이 나란히 존재하는 것을 CpG 라고 하는데 이 배열에서 시토신이 메칠화되는 경향이 있다. 인간게놈의 경우, 전체 시토신 중 3-4%는 메칠화되어 있으며 CpG의 메칠화 정도와 패턴은 포유동물의 종 및 조직에 따라 매우 특이적인 양상을 보인다. 포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 CpG 섬 (island)이라는 부위가 존재하는데 이 CpG 섬은 유전자의 전사과정을 조절하는 프로모터 부근에 위치하여 유전자의 발현을 조절한다. 즉, CpG 섬이 메칠화되면 이 부위에서 메틸기 결합 단백질들이 유도되고 이들은 다시 히스톤 탈아세틸효소등과 결합하여 복합체를 형성하여 전사인자의 인식을 방해함으로써 유전자의 발현을 억제한다. 부모에게서 물려받은 한 쌍의 유전자 중에서 어느 하나만 발현되어 두 유전자가 모두 발현될 경우 발생하는 유전이상을 방지하는 현상을 유전체 각인 (genomic imprinting)이라고 하는데 이러한 각인 현상이 가능한 이유도 수정란의 발생단계에서 해당 유전자의 CpG 섬이 선택적으로 메칠화되어 한쪽 유전자의 발현을 억제하기 때문이다. 또한, CpG의 메칠화는 외부에서 유입되는 트랜스포손과 같은 이동성 유전자들의 발현을 억제하는 방어기작으로 작용하기도 하고 메칠화 이상이 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군과 관련이 있다. 따라서 이를 이용하여 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군을 진단하는데 사용한다.
포유류의 경우, CpG 섬은 40% 이상이 반복서열 (repetitive elements)에 존재하고 있다 (Szyf, M., 2003. Drug Resist Updat., 6, pp341-345, 2003). 기존에 알려진 메칠화된 DNA의 탐색 기술로는 DNA 메칠화 (methylation) 과정에 영향을 주는 DNMT1 (DNA methyltransferase1), S-아데노실-메티오닌 (S-adenosyl-methionine), 호모시스테인 (homocysteine) 등을 이용한 탐색 기술이 있으나 이러한 방법들은 질병 또는 증상에 따라 메칠화에 관여하는 특정 유전자의 시퀀스를 각각 따로 이용해야 하는 단점이 있다. 최근에는 특정 유전자의 프로모터를 이용하여 CpG 섬의 메칠화 정도를 측정하는 방법이 개발된 바 있으나 이는 특정 유전자가 관여하는 상황에 대해서만 메칠화를 분석할 수 있다(Christman, J.K., Oncogene, 21, pp5483-5495, 2002).
이에 따라, 메칠화에 관여하는 특정 유전자를 필요로 하지 않고 보편적으로 이용될 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 서열번호 1 및 2의 염기서열 또는 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 및, 중합효소연쇄반응과 파이로염기서열분석법 (pyrosequencing)을 수행하여 특정 유전자의 메칠화 정도에 대한 정보를 필요로 하지 않고 게놈의 메칠화 정도를 보다 빠르고 정확하게 측정할 수 있는 DNA 메칠화 (methylation) 측정방법을 개발하고 이를 이용하여 베크위드-위드만 증후군 또는 실버 러셀 증후군을 진단하는 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서의 파이로염기서열분석은 전통적인 생어 (Sanger)법에 의한 염기서열분석과는 다르게, DNA 합성에 의하여 염기서열을 분석하는 방법으로, 뉴클레오타이드가 중합되면서 방출되는 피로인산 (pyrophosphate)을 검출하는 방법으로, 중합반응 (Polymerization)시 ４개의 디옥시뉴클레오티드 3인산염 (dNTP)을 한번에 하나씩 순차적으로 넣어서 반응시킨다. 중합되는 dNTP에 붙어 있는 PPi는 효소반응으로 빛을 발생하고, 발생된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 dNTP의 반응 순서대로 시그널 피크를 나타내고, 그 피크는 각각의 dNTP가 반응한 수에 비례하여 높아지고 낮아지는 패턴을 나타내게 되어, 염기서열을 결정할 수 있게 하는 기술을 말한다. (Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007).
본 발명에서 메칠화 정량화를 위한 대조군의 메칠화 정도는 %mC (메칠화 시토신의 percentage)로 표시하였다. 이는 파이로염기서열분석 상에서 나온 시토신의 백분율로 구한다. 정상대조군의 정량적 범위는 평균값과 이중 표준편차 값을 이용하여 계산한다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호1 및 2의 염기서열 또는 서열번호 3및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 포함하는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군을 진단용 조성물 및 키트 (Kit)를 제공한다.
본 발명은 메칠화 특이적 프라이머를 사용한 파이로염기서열분석을 통하여 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군을 각각 97%, 70%로 검출율을 높이는 효과가 있는바, 이는 베크위드-위드만 증후군과 실버 러셀 증후군의 유전학적 진단율을 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트, 이를 포함한 조성물, 키트 및 진단방법은 베크위드-위드만 증후군 와 실버 러셀 증후군을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 메칠화정도를 확인 하기 위한 중합효소 연쇄반응용 프라이머의 염기서열이다.
도 2는 파이로염기서열분석 결과물의 예시이다.
도 3은 정량분석을 위한 정상대조군의 정략적 범위를 측정한 결과표이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 메칠화 정량을 위한 바이설파이트 변성 특이염기서열의 프라이머 제작
H19DMR 및 KvDMR 메칠화 정량화를 위한 바이설파이트 변성 특이 염기서열의 프라이머를 제작하기 위하여 실험을 수행하였다.
H19DMR은 염색체 11p15 의 일 부위이며 베크위드-위드만 증후군의 경우 고메칠화현상이 10% 정도 차지하며, 30%의 베크위드-위드만 증후군은 정상메칠화를 보인다. 실버 러셀 증후군의 경우 30%이상의 메칠화 이상을 차지한다.
KvDMR은 염색체 11p15의 일 부위이며, 베크위드-위드만 증후군의 경우 고메칠화의 현상이 50% 차지한다. 실버 러셀 증후군의 경우 30% 이상을 차지한다.
프라이머를 고안하기 위하여 PSQ assay (Qiagen, Hilden, Germany) 소프트웨어를 사용하여 고안화하였다.
표적으로 한 DMR 부위와 바이설파이트 변성 특이 염기서열 프라이머는 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
Genomic region Sequences (5’ a 3’) a CpG sites b 서열
번호
H19-DMR forward: TGAGGTGAATTTTAGGGATTGTAG
Reverse: TAAACRACCTCACAAACTCTCC
Sequencing: TTATTTTATTTTTAATYGTGGTGTT		 nt.7613; nt.7615 1
2
3
Kv-DMR forward: GGTYGYGGGGTATATAGTTTATTTTAGTAA
Reverse: AATACRATTCTCCCAAACTC
Sequencing: TTTATTTTAGTAAYGTTAGTGATTAT		 nt.58813; nt.58818; nt.58820; nt.58823; nt.28827 4
5
6
SGCE- DMR forward: AGGATGGGGTTTTATATTTGAGTTA
Reverse: ACAACCTATATAAAACTCACAATCTAC
Sequencing: TTTTATTGGGTGTTTAGTAGT		 nt.32247143; nt.32247150; nt.32247161 7
8
9
GRB10-DMR forward: GGTGGTTTATTTAAAGTTTTAAGTAGT
Reverse: CTCRTTAAAATATTACCAACATTATAT
Sequencing: ATAAACCCTAATCAACTCC		 nt.248561 10
11
12
CTCF binding site forward: TGGGTATTTTTGGAGGTTTTTTT
Reverse: TCCTATAAATATCCTATTCCCAAA
Sequencing: TTTGGATGGTAYGGAA		 nt.6180; nt.6190; nt.6192; nt.6194; nt.6197 13
14
15
실시예 2: 중합효소 연쇄 반응을 통한 유전자절편의 증폭
염기서열분석을 위하여 실시예 1에서 제작된 프라이머의 유전자절편을 증폭하는 중합효소연쇄반응 실험을 수행하였다.
H19DMR을 위한 중합효소 연쇄반응은 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 이 과정을 45회 반복하여 유전자 절편을 증폭 시키는 것으로 하였다. KvDMR은 95 ℃ 30초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ .30초로 이 과정을 45회 반복하여 유전자 절편을 증폭 시키는 것으로 하였다. SGCE-DMR은 95 ℃ 30초, 55 ℃ 30초, 72 ℃ .30초로 이 과정을 45회 반복하여 유전자 절편을 증폭 시키는 것으로 하였다
실시예 3: 파이로염기서열분석법을 통한 메칠화 이상 측정
메칠화 이상을 정량적으로 측정하기 위하여 파이로염기서열분석법을 이용한 실험을 수행하였다.
게놈 DNA를 바이설파이트용액 2.5M sodium 바이설파이트를 1N NaOH와 20mM 하이드로퀴논 (hydroquinone)이 혼합된 액체에 녹인 용액)으로 50 ℃에서 밤새 변성시킨 후, 바이설파이트성분을 제거하고 DNA를 회수하기 위해 칼럼 방식의 DNA분리장치 (GeneAll kit, Generalbiosystems. Seoul .Korea)를 이용해 DNA를 회수하였다. 이 후 회수된 바이설파이트 변성 DNA 20ng로 바이설파이트 변성 특이 염기서열 프라이머 (실시예 1) 를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭 산물을 만들었다. 증폭된 산물을 이용하여 PyroGold kit 와 PyroMark ID96 장치 (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 파이로염기서열 분석을 하였다..
정략적인 수치는 도 2에서 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, (가)는 정상군에서 보여질 수 있는 pyrogram으로 약 50%mC 수준을 보였다. (나)는 저메칠화에 의한 실버 러셀 증후군환자에게서 보여지는 pyrogram의 예시로서 50 %mC 미만의 수준을 보였다. (다)는 고메칠화에 의한 베크위드-위드만 증후군 환자에게서 보여지는 예시로 50 %mC보다 높은 수준의 메칠화 양상을 보였다.
실시예 4: 메칠화 정량화를 위하여 대조군의 결정
메칠화 정량화를 위하여 대조군을 결정하고, 그 수치는 시토신의 백분율로 구하였다.
메칠화 정도는 %mC로 표시하였으며, 정상대조군의 정량적인 범위는 평균값과 이중 표준편차 값을 이용하여 계산하였다.
정량분석을 위한 정상 대조군의 정략적범위를 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3은 H19-DMR부분을 위한 14명의 정상대조군의 메칠화비율을 조사하였다. Pyrosequencing을 이용하여 분석된 pyrogram의 높이에 따라 제공되는 수치를 근거로 하여 정량하였으며, 도 3의 경우, KvDMR에 대한 14명의 대조군의 pyrogram을 예로 명시하였다. 최종적인 정상대조군의 정량적인 범위는 H19-DMR의 경우, 50±5.0 %mC (n=20) 이다. KvDMR의 경우, 43.9±6.02 %mC (n+20) 이며, SCGE-DMR의 경우 60.1±4.0 %mC (n=20)이다. 본 수치는 평균 ±이중표준편차 값으로 구하였다.
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Primer set for diagnosis of BeckwithWiedemann syndrome or Silver-Russel syndrome, Kit comprising the same, and Method of diagnosis using the same <130> 78p <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H19-DMR Forward <400> 1 tgaggtgaat tttagggatt gtag 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H19-DMR Reverse <400> 2 taaacracct cacaaactct cc 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H19-DMR Sequencing <400> 3 ttattttatt tttaatygtg gtgtt 25 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv-DMR Forward <400> 4 ggtygygggg tatatagttt attttagtaa 30 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv-DMR Reverse <400> 5 aatacrattc tcccaaactc 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kv-DMR Sequencing <400> 6 tttattttag taaygttagt gattat 26 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGCE-DMR Foward <400> 7 aggatggggt tttatatttg agtta 25 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGCE-DMR Reverse <400> 8 acaacctata taaaactcac aatctac 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGCE-DMR Sequencing <400> 9 ttttattggg tgtttagtag t 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRB10-DMR Forward <400> 10 ggtggtttat ttaaagtttt aagtagt 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRB10-DMR Reverse <400> 11 ctcrttaaaa tattaccaac attatat 27 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRB10-DMR Sequencing <400> 12 ataaacccta atcaactcc 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCF binding site Forward <400> 13 tgggtatttt tggaggtttt ttt 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCF binding site Reverse <400> 14 tcctataaat atcctattcc caaa 24 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTCF binding site Sequencing <400> 15 tttggatggt ayggaa 16

Claims (11)

  1. H19 DMR (differentially methylated region)을 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 증폭산물의 시퀀싱을 위한 서열번호 3의 시퀀싱 시발체; 또는
    Kv DMR (differentially methylated region)을 증폭하기 위한 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트 및 증폭산물의 시퀀싱을 위한 서열번호 6의 시퀀싱 시발체;을 포함하는, 파이로시퀀싱용 베크위드-위드만 증후군 또는 실버 러셀 증후군 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 진단용 조성물은 베크위드-위드만 증후군 및 러셀 실버 증후군을 동시에 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  5. 청구항 1의 조성물을 포함하는, 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군 진단 키트.
  6. (a) 프라이머 세트로 시료의 H19 DMR (differentially methylated region) 또는 Kv DMR (differentially methylated region)를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 증폭된 유전자절편을 파이로염기서열분석법을 통하여 메칠화를 정량화는 단계;를 포함하는 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군의 진단에 필요한 정보제공방법으로서,
    H19 DMR (differentially methylated region)의 경우, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 증폭되고, 서열번호 3의 시퀀싱 시발체로 파이로염기서열분석법이 수행되며,
    Kv DMR (differentially methylated region)의 경우, 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트로 증폭되고, 서열번호 6의 시퀀싱 시발체로 파이로염기서열분석법이 수행되는 것인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단계 (b) 후, 단계 (b)에서 정량화 된 수치와 정상군의 수치를 비교하는 단계;를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군의 진단에 필요한 정보제공방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 수치가 정상군에 비하여 높은 경우 베크위드-위드만 증후군으로,
    상기 수치가 정상군에 비하여 낮은 경우 실버 러셀 증후군으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군의 진단에 필요한 정보제공방법.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 유전자 증폭은 중합효소연쇄반응, 역전사-중합효소 연쇄반응, 리가아제 연쇄반응, 복구연쇄반응, 전자-중재증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 폴리뉴클레오티드염기서열의 선택적 증폭, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄반응, 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응, 염기서열기반 증폭, 가닥치환증폭 및 고리-중재 항온성 증폭 중 어느 하나에 의하는 것을 특징으로 하는, 베크위드-위드만 증후군 또는 러셀 실버 증후군의 진단에 필요한 정보제공방법.
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