KR101609113B1 - 신부전증 진단용 키트 및 그 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신부전증 진단용 키트 및 그 방법에 관한 것이다.

Description

신부전증 진단용 키트 및 그 방법{A kit for diagnosing renal failure and method using the same}

본 발명은 신부전증 진단용 키트 및 그 방법에 관한 것이다.

현대인의 대표적인 성인병으로 당뇨병과 고혈압은 흔히 많이 발병되는 질병이다. 이 질병들은 여러 가지 합병증을 동반하며, 그 중 신부전증이 가장 많이 발생하는 합병증이다.

이러한 신부전증(Renal failure)은 신장 기능이 제대로 이루어지지 않아 몸 안에 노폐물이 쌓여서 신체의 여러 가지 기능이 제대로 수행되지 않는 상태를 말한다. 이는 급성신부전증(acute renal failure)과, 만성신부전증(chronic renal failure)으로 나뉘며, 급성신부전증은 신장내의 혈류이상, 신장 주변의 세포이상, 전립선, 방광, 신장결석 그리고 종양의 원인으로 인하여 신장 기능이 수시간에서 수일에 걸쳐 급격하게 저하되는 것을 말한다. 만성신부전증은 당뇨병성 신장질환, 고혈압, 다낭성 신질환과 기타 요로질환으로 인하여 3개월 이상 신장이 손상되어 있거나 신장 기능 감소가 지속적으로 나타나는 것을 말한다.

이러한 신부전증의 진단방법으로는 복부 초음파 검사, 혈액검사, 소변검사가 있다. 복부 초음파 검사와 혈액검사는 어느 정도 발병이 진행된 후 확진 검사에 이용되는 진단이며, 소변검사는 뇨 중 마이크로알부민(Microalbumin)과 크레아티닌(Creatinine)의 비율을 검사하는 방법으로, 확진 검사 이전에 간단히 할 수 있는 진단이다.

확진이 결정된 신부전증의 치료는 신장이식, 복막투석, 혈액투석 등으로 치료 과정이 어려운 질병이며, 조기 진단으로 질병의 발병을 차단하는 것이 중요하게 여겨진다. 이는 조기 발견이 되어 신속하게 치료가 이루어지면, 정상 신장 기능으로 회복될 수 있는 가능성이 높기 때문에 조기 진단이 중요시 되는 질병이다.

[선행 특허문헌]

대한민국 특허공개번호 제10-2012-0123056

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 쉽고 간편하게 신부전증 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 쉽고 간편하게 신부전증 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 마이크로알부민 스트립과 크레아티닌 스트립을 유효성분으로 포함하는 신부전증 초기진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 마이크로알부민뇨의 비율을 반정량적으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 마이크로알부민 스트립과 크레아티닌 스트립에 처리하고, 상기 스트립의 색상변화를 시험지 전체의 반사율을 스캔하는 방법으로 측정하는 단계를 포함하며,

마이크로알부민뇨의 비율은 아래의 식에 의하여 측정되며, 그 비율이 <30mg/g일 경우는 정상소변, 30-300mg/g인 경우는 알부민뇨, >300mg/g인 경우 단백뇨로 판단하는 것을 특징으로 하는 신부전증과 관련된 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 측정은 마이크로알부민은 0.5 mg% 농도별로 크레아티닌은 1 mg% 농도별로 측정하여 수치화하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 증류수에 구연산 버퍼를 용해하여, 용액의 pH를 6.0~6.5로 제조하고, 여기에 염료인 설포네프탈레인(Sulfonephthalein)을 가하고 폴리머와 계면활성제를 가하여 모액을 제조한 후, 이를 이용하여 마이크로알부민 스트립을 제조하며, 본 발명의 일 구현예에서 상기 폴리머로 polypropylene glycol를 사용하였으며, 상기 계면활성제는 Tween 80을 사용하였으나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 마이크로알부민 시험지의 경우, 일반 시험지에 사용되는 종이를 사용하는 것이 아니라, cotton 재질의 종이를 사용하여야 시험지의 발색이 고르게 나타나는 현상이 있어서 코튼 재질의 종이를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 증류수에 구연산과 인산 버퍼를 가하여 pH6.0~6.5로 제조한 후 여기에 황산 구리를 가하여 1차 모액을 제조하고,메탄올에 퍼옥사이드와 벤지딘(Benzidine) 류 염료를 가한 후, 1-아릴세미카바자이드(arylsemicarbazide), 폴리머 및 퀴놀린(quinoline)을 가하여 2차 모액을 제조한 후, 상기 제조된 1,2차 모액을 이용하여 크레아티닌 스트립을 제조하는 단계를 포함하는 마이크로알부민 스트립과 크레아티닌 스트립 제조방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 폴리머는 Polyvinylpyrrolidone을 사용하였으나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서 ACR 시험지는 마이크로알부민 시험지와 크레아티닌 시험지로 개별 구성되어있다.

마이크로알부민 시험지는 특정 염료를 사용하는데, 이는 권리가간이 만료된 특허의 물질과 시험지에 적용되는 조건들을 사용하여 개발을 하였다.

또한 크레아티닌 시험지의 경우에도 개발에 사용된 각각의 기술들이 논문들을 통하여 알려져 있긴 하지만, 이를 조합하여 크레아티닌의 측정에 이용하였다.

본 발명은 마이크로알부민(Albumin)/크레아티닌(Creatinine)의 비율을 아래와 같은 식으로 측정하여이 수치의 결과 값을 활용하여 진단에 사용된다.

표준방법으로 24시간 뇨를 받아서 마이크로알부민을 측정해야 하는데, 검체 수집에 어려움을 있어서 1회 뇨를 받아 측정하게 된다. 24시간 뇨와 1회 뇨의 오차를 줄이기 위하여 크레아티닌의 측정값으로 뇨의 농도를 보정해 주는 역할을 하게 한다.

마이크로알부민뇨의 비율이 <30mg/g일 경우는 정상소변, 30-300mg/g인 경우는 알부민뇨, >300mg/g인 경우 단백뇨로 분리를 한다.

본 발명의 ACR 시험지는 마이크로알부민과 크레아티닌의 농도를 시험지의 색상변화로 알려준다. 이를 육안으로 확인하고 비율을 측정하여 진단에 이용할 수 있다. 하지만 본 출원인이 개발한 분석기기인 New optima에 시험지를 적용시켜 육안 확인보다 더 정확한 결과값을 나타낼 수 있다.

이러한 효과를 가지고 올 수 있는 것은 기존에 사용되고 있는 분석기기들은 시험지의 색상 변화를 직접 비율을 결정하는 색상의 흡광도 또는 반사율을 일정한 부분 (one-point)을 측정하여 이를 수치화하여 나타내는 것에 반하여, 본 출원인의 분석기기 New optima는 색상 변화를 시험지 전체의 반사율을 스캔하는 방법으로 측정하고, 자체 개발한 소프트웨어를 이용으로 비율을 마이크로수치화 즉, 마이크로알부민은 0.5 mg% 농도별로 크레아티닌은 1 mg% 농도별로 측정하여 수치화함으로써 정확한 색상변화를 정량화할 수 있도록 개선ㆍ개발하였다.

결론적으로 본 발명의 ACR 시험지와 분석기기를 이용하여 ACR의 수치를 더 정확하게 구현함으로써 더욱 정확한 조기검진을 할 수 있다.

본 발명에서는 보편적으로 사용되는 Routine Urinalysis 검사를 통해 쉽고 간편하게 신부전증 진단에 이용할 수 있는 ACR 시험지를 개발하였고, 이를 통해 일반인들은 자신의 신장기능을 체크할 수 있으며 당뇨병, 고혈압 환자들은 합병증인 신부전증을 조기 진단함으로써 신부전증의 치료율을 높일 수 있는 임상적 효과를 갖는다.

도 1은 마이크로알부민과 높은 친화력을 가진 Sulfonephtalein dye을 이용한 dye binding methods를 이용하여 뇨 중 알부민을 측정하는 방법에 대한 그림.
도 2는 요화학분석기 UriScan Optima의 측정방법에 대한 개략도.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: ACR strip 의 제조

마이크로알부민과 높은 친화력을 가진 Sulfonephtalein dye을 이용한 dye binding methods를 이용하여 뇨 중 알부민을 측정하였다(도 1).

이는 마이크로알부민 측정 시험지에 설정된 특정 pH에서 알부민과 dye가 만나 시험지의 색상이 파란색으로 발색하게 된다. 이때 마이크로알부민의 농도에 따라서 시험지의 색이 aqua blue에서 pale green으로 변화하게 되고, 이 변화 정도에 따라서 알부민의 농도를 측정할 수 있다.

마이크로알부민 검사 시험지의 민감도를 높이기 위하여 시험지 종이의 재질을 cotton 재질인 Ahlstrom grade 237를 사용하였다. 이는 시험지 종이 자체의 흡착력을 높여, 시험지를 구성하는 시약이 더욱 시험지 종이에 흡착을 잘하게 하고, 염료의 발색이 고르게 하는 역할을 하도록 한다. 이와 더불어 시험지 자체의 흡수력을 높여주기 위하여 계면활성제의 종류를 가하였고, 염료의 발색을 증가시키기 위하여 polymer 종류를 시험지에 첨가하였다. 시험지 자체의 버퍼력을 높이기 위하여 polybasic corboxyl acid를 가하여, 마이크로알부민 검사 시험지의 민감도가 향상된 시험지를 제작하였다.

알부민 검사 시험지 제조에 사용된 원료 및 시약은 다음과 같다.

증류수에 sodium citrate 0.8mM과 Citric acid 3mM을 가하여 용액의 pH가 6.0~6.5가 되도록 한다. 여기에 염료인 sulfonephtalein 1M을 가하고, polypropylene glycol 3%, Tween 80 40mM을 가하여 모액을 제조한다. 이렇게 제조한 모액에 Ahlstrom grade 237 종이를 적신 후, 오븐 80℃에서 20분간 건조시킨다. 이렇게 모액을 침적시킨 종이를 완전히 건조 시킨 후 양면테이프를 한쪽 면에 접착한다. 이를 롤 형태로 재단하여, 양면테이프를 이용하여 PVC 필름에 접착 시키고 이를 다시 재단하여 미량알부민 검사 시험지가 붙은 시험막대를 얻는다.

크레아티닌 스트립

크레아티닌은 Metal complex method에 의해서 금속 이온과 complex를 이루는 성질을 가지고 있다. 크레아티닌과 구리이온이 만나 complex를 이루고, 이 complex가 가진 peroxidase-like activity 성질을 이용하여 뇨 중 크레아티닌을 측정한다.

즉 크레아티닌과 구리이온의 complex가 peroxide 와 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)의 반응을 촉진시키게 되고, 그 결과 크레아티닌의 농도에 따라서 시험지의 색이 노란색에서 파란색을 통하여 녹색으로 변화하게 된다.

크레아티닌 검사 시험지의 민감도를 높이기 위해서 새로운 구성요소를 첨가하여 시험지를 개발하였다. Peroxide의 종류를 2,5-dihydroperoxy-2,5-dimethylhexane를 사용하고, peroxide와 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)와의 반응을 증가하기 위하여 1-arylsemicardazide 유도체 종류를 시험지에 가하여 크레아티닌 검사 시험지의 민감도가 향상된 시험지를 제작하였다.

크레아티닌 검사 시험지의 제조방법은 다음과 같다.

크레아티닌 검사 시험지의 제조는 1차 모액과 2차 모액으로 나눠서 제조를 한다. 1차 모액은 증류수에 citrate 30mM과 glycerol-2-phosphate 1M을 가하여 용액의 pH를 6.0~6.5로 제조한다. 여기에 copper sulfate 0.5mM을 가하여 1차 모액을 제조한다. 2차 모액은 Methyl alcohol에 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 40mM, 2,5-dihydroperoxy-2,5-dimethylhexane 0.3M, polyvinylpyrrolidone 2%, 4-hydroxyl-2-methylquinoline 30mM, 1-phenylsemicardazide 0.1mM를 가하여 모액을 제조한다. 이렇게 제조한 1차 모액을 3MM 종이에 적신 후, 오분 100℃에서 15분간 건조시킨다. 이 종이를 다시 2차 모액에 적신 후 80℃에서 건조시킨다. 이렇게 건조한 종이에 양면테이프를 한쪽 면에 접착 후, 롤 형태로 재단한. 이를 양면테이프를 이용하여 PVC필름에 접착시키고, 이를 재단하여 크레아티닌 검사 시험지가 붙어 있는 시험막대를 제작한다.

실험예 1: Semi - quantitative 분석방법

요화학분석기 UriScan Optima의 측정방법은 다음과 같다.

뇨 중에 있는 각 성분이 뇨검사 시험지 부분에 소변과 함께 흡수된 후 화학반응이 일어나고, 그 결과 발색이 일어나기 된다. 이때의 발색 정도는 뇨 중 각 성분의 농도에 비례하여 나타나는데, CCD는 이러한 발색 정도를 측정하여 알려주는 역할을 하게 된다. 즉, CCD란 빛의 3원색의 구성 비율을 분석하여 뇨검사 시험지의 발색 정도를 정확한 값으로 판독하는 최첨단 광학 소자이다. 이는 일반적으로 LED를 사용한 광전반사법에 의한 색의 농도 측정 방식보다 정확하고 객관적이며 일관된 결과를 얻게 된다. 이렇게 얻게 된 시험지의 발색정도를 수치화하여 R% 값을 얻고, 이를 농도에 따른 결과값으로 나타내준다(도 2).

미량알부민과 크레아티닌 시험지는 반정량 시험지기 때문에 농도범위에 따라서 그에 대한 대표값이 설정되며, 이를 농도값은 다음과 같이 나타낸다. 미량알부민 농도값 -로 대표값은 0mg/L이고 농도범위는 0~20mg/L, +로 대표값은 30mg/L이고 농도범위는 21~55mg/L, ++로 대표값은 80mg/L로 농도범위는 56~115mg/L, +++로 대표값은 150mg/L는 농도범위는 116mg/L이상으로 한다. 크레아티닌 농도값 ±으로 대표값은 10mg/dL으로 농도범위는 0~29mg/dL, +으로 대표값은 50mg/dL으로 농도범위는 30~80mg/dL, ++으로 대표값은 100mg/dL으로 농도범위는 81~180mg/dL, +++으로 대표값으로 200mg/dL으로 농도범위는 181~280mg/dL, ++++으로 대표값으로 300mg/dL으로 농도범위는 281mg/dL이상으로 한다.

시험지의 발색정도를 수치화하여 얻은 값을 R%라 하며, 마이크로알부민과 크레아티닌의 R%정도는 농도에 따라 다음과 같이 표기한다. 마이크로알부민과 크레아티닌의 농도범위에 따라서 R%값이 설정되고, 이에 대한 값은 다음과 같다. 마이크로알부민 -(0mg/L)는 R% 범위는 0~20, +(30mg/L)는 21~35, ++(80mg/L)는 36~50, +++(150mg/L)는 51이상의 R%값을 갖는다. 크레아티닌의 경우 ±(10mg/dL)은 0~31, +(50mg/dL)는 32~57, ++(100mg/dL)는 58~100, +++(200mg/dL)는 101~115, ++++(300mg/dL)는 116이상의 R%값을 갖는다.

실 예로서 미량알부민과 크레아티닌의 농도에 따른 R%정도는 다음과 같이 측정한다. 각 시험지에 대한 대표 농도값으로 미량알부민은 -(0mg/L), +(30mg/L), ++(80mg/L), +++(150mg/L)이고, 크레아티닌의 대표 농도값으로 ±(10mg/dL), +(50mg/dL), ++(100mg/dL), +++(200mg/dL), ++++(300mg/dL)으로 하여 측정한다. 이 대표 농도값으로 측정했을 때, 측정되는 R%값은 마이크로알부민 농도 -(0mg/L)에서는 10, +(30mg/L)에서는 28, ++(80mg/L)에서는 42, +++(150mg/L)에서는 70의 값을 얻었다. 크레아티닌 농도 ±(10mg/dL)에서는 20, +(50mg/dL)에서는 40, ++(100mg/dL)에서는 80, +++(200mg/dL)에서는 108, ++++(300mg/dL)에서는 128의 R%값을 얻었다.

이렇게 얻은 마이크로알부민과 크레아티닌의 결과값을 이용하여 ACR(Albumin:Creatinine Ratio)에 대한 값을 기기의 수식을 이용하여 결과값을 얻는다. ACR에 대한 결과값은 <30/g, 30~300/g, >300/g으로 얻는다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 증류수에 구연산 버퍼를 용해하여, 용액의 pH를 6.0~6.5로 제조하고, 여기에 염료인 설포네프탈레인(Sulfon ephthalein)을 가하고 폴리머와 계면활성제을 가하여 모액을 제조한 후, 이를 이용하여 마이크로알부민 스트립(strip)을 제조하며,
   증류수에 구연산과 인산 버퍼를 가하여 pH6.0~6.5로 제조한 후 여기 에 황산 구리를 가하여 1차 모액을 제조하고,
   메탄올에 퍼옥사이드와 벤지딘(Benzidine) 류 염료를 가 한 후, 1-아릴세미카바자이드(arylsemicarbazide), 폴리머 및 퀴놀린(quinoline)을 가하여 2차 모액을 제조 한 후, 상기 제조된 1,2차 모액을 이용하여 크레아티닌 스트립(strip)을 제조하는 단계를 포함하는 마이크로알부민 스트립과 크레아티닌 스트립 제조방법.
   
   

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