KR101601024B1

KR101601024B1 - 소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR101601024B1
Application number: KR1020090033750A
Authority: KR
Inventors: 김수정; 노호식; 김은주; 문은정; 조가영; 박혜윤; 김지성; 김덕희; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2016-03-09
Also published as: JP2012519164A; CN102316849B; CN102316849A; US20130129849A1; US8828456B2; KR20100098258A; JP5856847B2; US20120021081A1

Abstract

본 발명은 유효성분으로 소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 유효성분으로 소나무 뿌리 추출물을 함유하여 우수한 자유라디칼 소거, 자외선 조사에 의한 세포막 손상 보호, 자외선 조사에 의한 활성산소종 생성억제, 자외선 조사에 의한 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; superoxide dismutase) 및 카탈라아제(catalase) 발현 감소의 회복, HSP70 생성 촉진을 통한 세포 보호, 자외선 조사에 의한 MMP-2 생합성 억제, DNA 손상을 복구하는 SIRT1 유전자 발현 유도 및 핵막의 구조를 유지하는 LMNA1 유전자 발현 유도 등의 효과를 나타냄으로써 궁극적으로 피부의 노화를 방지한다.

소나무 뿌리, 노화방지, MMP-2, 세포보호, SIRT1 유전자, LMNA1 유전자

Description

소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{Composition for skin external application containing the extract of red pine roots}

피부 조직에는 피부를 보호하기 위한 다양한 항산화체계와 보호인자, 예를 들어 열충격 단백질(HSP: heat shock protein) 등을 구축하고 있으나, 내인성 노화 나 광노화에 의해 발생되는 활성감소로 피부세포의 손상이 일어나고 피부조직을 분해하는 효소인 기질 단백분해효소(MMPs: matrix metalloproteinases)의 생합성이 증가하고, 콜라겐의 생합성이 감소하여 주름살이 생기고 탄력이 감소하여 피부의 노화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한 노화에 따라 DNA 손상과 핵막의 구조가 무너지는데, 손상된 DNA를 복구, 핵막의 구조를 유지시키는 것은 노화 방지에 중요한 요소이다. 따라서, 피부 세포를 보호할 수 있는 항산화 물질, 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라겐을 분해하는 MMPs 생합성을 억제할 수 있는 물질, 피부세포의 손상을 막아주는 물질, 세포 내 DNA 손상 복구 단백질 및 핵막 구조 유지 구조 단백질 등의 생성을 유도하는 물질이 피부노화를 완화시키는 것으로 밝혀져 있다.

이러한 피부노화를 완화시키는 물질 중에서 현재는 피부노화 현상을 한방원료를 이용하여 예방 또는 해결하고자 이에 대한 기능성 한방소재의 연구개발이 꾸준히 이루어지고 있다. 한방 피부미용에 있어서 가장 큰 특징은 인체를 전체적인 관점에서 보아 피부 노화를 일으키는 원인을 파악하고 전신적인 증상을 개선할 뿐만 아니라, 피부 문제를 일으키는 원인을 근본적으로 개선하여 그 재발을 방지하는 근본적인 치료에 역점을 두고 있다.

예로부터 소나무는 무병장수하여 신선이 되게 한다고 하였으며, 우리 민족의 절개와 인내 등을 상징해 왔다. 소나무(Pinus densiflora Sieb. et Zucc.)의 다른 이름은 적송(赤松)으로서 부위마다 다른 효능으로 병증에 사용해 왔다.

소나무는 가지와 줄기의 마디를 송절(松節), 어린 뿌리 또는 근백피를 송근(松根), 어린가지 또는 어린 가지 선단을 송필두(松筆頭), 잎을 송엽(松葉), 꽃가 루를 송화분(松花粉), 둥근 열매를 송구(松球), 및 나무껍질을 송목피(松木皮) 등으로 다르게 부르면서 약용한다.

그 중 특히 뿌리는 봄철에 캐어 말려서 사용해 왔는데, 한의학적으로 맛은 쓰며 성질은 따뜻하고 독이 없다고 알려져 있다. 효능 성분으로는 α-피넨 75%, 캄펜, 디펜텐, α-테르피네올, 캠퍼 및 p-멘탄올 등이 있다.

한의학적으로는 오로(오장의 피로, 五勞)를 보양하고, 타박어혈동통, 근골통, 토혈 및 충치통을 치료하는데 사용해 왔다. 그러나, 피부노화와 관련한 체계적인 연구는 이루어지지 않고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 유효성분으로 한방 생약 성분 중 소나무 뿌리 추출물을 함유하여 우수한 피부 노화방지 효과를 나타내는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 소나무 뿌리 추출물을 포함한다.

또한, 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 피부노화 방지용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 자외선 조사에 의한 세포막 손상 보호용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 피부 외용제 조성물은 HSP70 단백질의 생성을 촉진하는 세포 보호용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 피부 외용제 조성물은 자외선 조사에 의한 MMP-2의 생합성 억제용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 피부 외용제 조성물은 DNA 손상을 복구하는 SIRT1 유전자의 발현을 유도하고, 핵막의 구조를 유지하는 LMNA1 유전자의 발현 유도하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 피부 외용제 조성물은 피부 주름 개선용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 상기 피부 외용제 조성물은 피부재생 촉진용인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 피부노화 방지용 피부 외용제 조성물은 소나무 뿌리추출물을 함유하여 자외선 조사에 의한 광노화를 억제하는 효능이 있으며, 세포에서 과도한 내인성 또는 외인성 스트레스에 저항하기 위한 조절물질을 분비시켜 차후 발생할 수 있는 세포손상을 미연에 방지할 수 있는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 피부 항노화 지표인 MMPs 활성억제 효과가 우수하였다. 또한 DNA 손상을 복구하는 SIRT1 유전자 발현 유도하고, 핵막의 구조를 유지하는 LMNA1 유전자 발현 유도하는 효과가 우수하였다. 따라서, 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물이 함유된 피부 외용제 조성물은 피부의 주름을 완화시켜 피부의 노화를 억제하였다.

본 발명에서 사용되는 적송(赤松)은 소나무과 소나무(pinus densiflora Siebold et Zuccarini)로서, 맛은 쓰지만 성질은 따뜻하고 독은 없으며, 예로부터 심경(心經)과 비경(脾經)에 작용하여 풍습창(風濕滄), 완선(頑癬), 감창(疳滄), 대풍나창(大風癩滄) 및 역절창(歷節滄) 등의 증상 치료에 사용되어 왔다.

본 발명에 사용된 소나무 뿌리 추출물은 상기 적송의 뿌리 부분을 에탄올 수 용액 등의 용매에 넣고 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법으로 추출하거나, 소나무 뿌리의 수액을 직접 사용할 수도 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 상기의 소나무 뿌리 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼99 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 화장품학 및 피부과학적으로 허용 가능한 매질 및/또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 폼의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 등을 함유할 수 있다. 이들 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 함량으로 도 입된다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 소나무 뿌리(적송근) 추출물의 제조

소나무 뿌리 1 kg을 수거하여 80% 에탄올 수용액 5 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 소나무 뿌리 추출물 173 g을 얻었다.

[비교예 1] 적송엽 추출물의 제조

적송엽 1 kg을 수거하여 80% 에탄올 수용액 0.5ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 다음, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 적송엽 추출물 0.1 g을 얻었다.

[시험예 1] 자유라디칼 소거 활성 측정

항산화력을 측정하기 위해 사용된 방법은 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라질(1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl)(DPPH) 방법으로 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 에탄올에 농도별(0, 50, 100, 200, 300, 400 ㎍/mL)로 희석하여 10씩 96웰 플레이트에 넣고, 5 mM 에탄올 용액으로 제조된 DPPH를 총 부피가 200가 되도록 넣어 37℃에서 30분간 방치한 후 520 nm ELISA 판독기(DI biotech, Korea)로 흡광도를 측정하여 자유라디칼 소거 활성을 하기 수학식 1에 따라 판정하였다. 이때, 양성대조군으로 항산화력이 우수하다고 널리 알려진 비타민 C를 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

처리농도	라디칼 소거 활성(%)
처리농도	실시예 1	비교예 1	비타민 C
0 ㎍/mL	0	0	0
50 ㎍/mL	24	10	30
100 ㎍/mL	61	35	90
200 ㎍/mL	75	60	91
300 ㎍/mL	83	79	90
400 ㎍/mL	87	80	90

상기 표 1의 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 1의 소나무 뿌리(적송근) 추출물이 비교예 1의 적송엽 추출물 보다 우수한 라디칼 소거 활성을 보였으며, 농도가 높아질수록 강력한 항산화제로 알려진 비타민 C와 등등한 수준의 라디칼 소거 활성을 보였다.

[시험예 2] 세포막 손상 보호 측정

96웰 플레이트의 각 웰에 독일 암연구센터(German Cancer Research Center, Heidelberg, Germany)로부터 분양받은 인간 각질세포(human keratinocytes) HaCaT 세포주(cell line)를 1×10⁵cell/mL의 세포를 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 부착하였다. 배양 후 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 0.625, 1.25, 2.5 및 5 ㎍/mL 농도로 포함시킨 배양액으로 교체하여 3시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 각 웰에 50 ㎕의 인산완충염액을 넣었다. 자외선 B 램프를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후 인산완충염액을 덜어내고 각 웰에 상기 농도의 추출물이 포함된 세포배양액 200 ㎕를 첨가하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 상층액을 적당량 취하여 세포 손상의 지표 효소인 젖산탈수소화효소(LDH)의 양을 비방사성 세포독성 분석 키트(cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay kit)를 이용하여 측정하였으며, 6회 반복 측정 후 평균값을 하기 표 2에 나타내었다. 이때, 대조군은 실시예 1 또는 비교예 1의 추출물을 처리하지 않은 실험군이다.

시험물질		대조군 대비 비율(%)
대조군		100
대조군+UV 조사		222.4
실시예 1+UV 조사	0.625 ㎍/mL	206.1
	1.25 ㎍/mL	151.2
	2.5 ㎍/mL	132.8
	5 ㎍/mL	102.5
비교예 1+UV 조사	0.625 ㎍/mL	214.3
	1.25 ㎍/mL	205.6
	2.5 ㎍/mL	179.2
	5 ㎍/mL	153.2

상기 표 2의 결과에서, 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물을 농도별로 처리하고 자외선 B를 조사한 군에서는 자외선 B 조사에 의한 LDH의 세포배양 배지에서의 활성 증가가 농도 의존적으로 감소하였으며, 동량의 적송엽 추출물(비교예 1)을 처리한 군과 비교하여도 그 효과가 유의적으로 우수하였다. 특히, 5 ㎍/mL의 소나무 뿌리 추출물을 처리한 경우 자외선 B를 조사하지 않은 대조군 수준으로 LDH를 억제함을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물이 자외선 B조사에 의한 HaCaT 세포의 세포막 손상을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 3] 활성산소종 생성억제 측정

형광측정용 96웰 블랙 플레이트(black plate)의 각 웰에 2.0×10⁵cell/mL의 인간 각질세포 HaCaT를 100 ㎕로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 처리하였다. 상기 추출물의 농도는 0.625, 1.25, 2.5 및 5 ㎍/mL로 하였다. 시험시료를 넣고 24시간 배양한 다음 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아 있는 배지를 제거하고 HCSS에 20 μM로 준비된 2', 7'-디클로로디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA: Dichlorodihydro-fluorescein diacetate)를 100 ㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 20분간 배양하고 다시 HCSS로 세척하였다. 이후 각 추출물의 농도별로 처리된 HCSS를 100 ㎕ 가한 후 자외선 B(30 mJ/㎠)를 조사하고, 3시간 후 형광분석기(fluorometer)(Ex = 485 nm, Em = 530 nm)로 형광 강도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 측정결과는 6회 반복측정 후 평균값을 나타내었으며, 대조군은 실시예 1 또는 비교예 1의 추출물을 처리하지 않은 실험군이다.

시험물질		대조군 대비 비율(%)
대조군		100
대조군+UV 조사		182.1
실시예 1+UV 조사	0.625 ㎍/mL	140.3
	1.25 ㎍/mL	137.2
	2.5 ㎍/mL	132.1
	5 ㎍/mL	104.2
비교예 1+UV 조사	0.625 ㎍/mL	168.6
	1.25 ㎍/mL	155.3
	2.5 ㎍/mL	144.2
	5 ㎍/mL	132.6

상기 표 3의 결과에서, 자외선 조사 3시간 경과 후 자외선을 조사하지 않은 대조군에 비해 자외선 B를 조사한 군에서 세포내 활성 산소종이 182.1% 증가하는 현상을 보였다. 이러한 증가는 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물을 농도별로 처리한 경우 농도에 의존적으로 활성산소종 생성이 억제되었다. 이를 통해 본 발명에 의한 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물이 자외선 조사에 의한 세포내 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 비교예 1의 적송엽과 비교하여도 그 효과가 우수하였다.

[시험예 4] 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD: Superoxide dismutase) 및 카탈라아제(catalase) 발현감소 회복 측정

6웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL의 인간 각질세포 HaCaT 세포를 2 mL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 5 ㎍/mL의 농도로 처리하고, 24시간 배양한 다음 인산완충염액으로 세척하여 남아 있는 배지를 제거하고, 50 ㎕의 인산완충염액을 넣고 자외선 B를 조사한 다음 인산완충염액을 덜어내고 각 추출물을 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간 배양한 후 세포를 포집하여 세포파쇄액[Lysis buffer: 250 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA pH 8.0, 1% NP-40, 0.1 M PMSF, 1 M DTT, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail), 증류수(DW)]으로 4℃에서 파쇄한 후 BCA 용액으로 단백질량을 정량화하였다. 동량으로 맞춘 단백질과 각 추출물 완충용액을 섞어서 시료를 만든 후, 소듐 도데실설페이트(SDS: sodium dodesyl sulfate) 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동으로 분리하였다. 웨스턴 블롯분석(Western blot analysis)을 위해 분리된 단백질을 함유한 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 전기블롯팅(electroblotting)에 의해 전이시킨 후, 5% 탈지유(skim milk)를 함유한 TBS-T(0.1% Tween 20 in TBS)로 2번 세척하였다. 세척 후 SOD와 카탈라아제 1차 항체(1:2000)를 각각 처리하여 4℃에서 12시간 방치한 다음, 1차 항체에 맞는 2차 항체(1:2000)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T로 세척 후 화학발광(ECL: enhanced chemiluminescence) 용액을 적용시킨 다음, 암실에서 X-레이 필름에 감광시켜 SOD 및 카탈라아제 단백질의 발현양상을 비교분석하였다. 단백질이 동량 전이되었음을 확인하기 위해 1차 항체로 액틴(actin)을 사용하여 상기의 과정을 반복하여 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 HaCaT 세포에 자외선 B를 조사하고 48시간 뒤 SOD 및 카탈라아제(catalase)의 단백질 발현을 관찰한 결과, SOD 및 카탈라아제 의 발현이 현저히 감소함을 알 수 있었고, 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물(적송근) 5 ㎍/mL을 처리했을 때 자외선에 의한 항산화 효소 발현 감소를 효과적으로 억제시켰으며, 비교예 1의 적송엽과 비교하여도 그 효과가 우수하였다. 이 결과로부터, 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물은 그 자체로 항산화 효능을 가질 뿐 아니라 내부 또는 외부에서 유발되는 산화적 스트레스에 대하여 세포내에 보유하고 있는 항산화 효소시스템 손상에 대한 보호 효과가 우수하여 궁극적으로 피부세포를 보호하는 기능이 있다고 판단할 수 있었다.

[시험예 5] 세포 보호 측정

스트레스에 반응하여 유도되는 단백질인 HSP70은 여러 스트레스에 대항하여 세포와 개체를 보호하고 세포사를 막기도 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 미리 과발현되어 있는 HSP70 단백질은 세포를 스트레스나 각종 독성으로부터 보호하는 것으로 알려져 있다. HSP70 생성촉진을 통한 세포 보호측정을 하기 위하여 6웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL의 정상 섬유모세포(normal fibroblast)를 2 mL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 1 ㎍/mL씩 처리하고 24시간동안 배양한 다음 세포를 포집하여 세포파쇄액으로 4℃에서 파쇄한 후 BCA 용액으로 단백질량을 정량하였다. 동량으로 맞춘 단백질과 각 추출물 완충용액을 섞어서 시료를 만든 후 소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 분리된 단백질을 함유한 아크릴아미드 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 전기블롯팅에 의해 전이시킨 후, Ponceus S 용액으로 염색하여 동량 전이되었음을 확인하였다. 단백질이 전이된 막을 5% 탈지유를 함유한 TBS-T(0.1% Tween 20 in TBS)로 상온에서 1시간 배양하여 비특이적인 단백질들에 대한 블로킹(blocking)을 실시하고 TBS-T로 2번 세척하였다. 세척 후 HSP70 1차 항체(1:1000)를 처리하여 4℃에서 밤새 방치한 다음 1차 항체에 맞는 2차 항체(1:2000)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T로 세척 후 화학발광 용액을 적용시킨 다음 암실에서 X-레이 필름에 감광시켜 HSP70 단백질의 발현양상을 비교 분석하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과에서, 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물을 1 ㎍/mL 처리 시 HSP70 단백질 생성이 많이 유도되었으며, 처리 농도에 의존적으로 HSP70 단백질 생성이 유도됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물(적송근)은 HSP70 단백질을 일정수준 이상으로 발현시켜 이후에 주어지는 스트레스에 대하여 세포 보호 효과를 보일 수 있을 것으로 판단할 수 있었으며, 비교예 1의 적송엽과 비교하여도 그 효과가 우수하였다.

[시험예 6] MMP-2 생합성 억제 측정

배양한 피부세포 및 인체 피부에 자외선을 조사할 경우 각종 기질 단백분해효소(MMPs)의 발현이 증가되며, 증가된 MMPs가 피부를 구성하고 있는 교원질을 분해하여 피부 주름을 형성하게 된다는 가설에 따라, 노화된 세포의 노화 정도를 평가하는 방법으로 노화된 피부의 결핍된 교원질 양을 증가시키는 방법으로 자외선에 의해 ECM 손상 억제에 대한 소나무 뿌리 추출물의 효과를 시험하기 위하여 6웰 플레이트에 1×10⁵cell/mL의 정상 섬유모세포를 2 mL씩 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후 상기 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 0.25, 0.5 및 1 ㎍/mL로 처리하였다. 이후 상기 시험예 5의 방법과 동일하게 자외선 B 30 mJ/㎠을 조사한 다음 소나무 뿌리 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포배양액을 수거하여 세포 배양액과 소나무 뿌리 추출물 완충용액을 섞어서 시료를 만든 다음 젤라틴을 함유한 지모그람 겔(zymogram gel)에 도입한 후 전기영동으로 분리하였다. MMP-2 확인을 위해 분리된 단백질을 포함한 지모그람 겔을 시약사의 사용법에 준수하여 재생 완충용액(renaturing buffer; 2.7% 트리톤 X-100)로 실온에서 30분간 배양하고 현상 완충용액(developing buffer)[50 mM Tris Base, 40 mM 6N HCl, 200 mM NaCl, 5 mM CaCl₂2H₂O, BriJ 35 0.02%]으로 실온에 1시간 배양한 후에 새로운 현상 완충용액으로 갈아서 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 겔은 염색하여 그 생합성 정도를 비교하였다. 샘플간 차이가 없음을 확인하기 위해서 세포를 포집하여 세포파쇄액으로 4℃에서 파쇄한 후 니트로셀룰로오스 막으로 전기블롯팅에 의해 전이시킨 후 Ponceus S 용액으로 염색하여 동량을 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시험물질		대조군 대비 비율(%)
대조군		100
실시예 1	0.25 ㎍/mL	77.2
	0.5 ㎍/mL	76.1
	1 ㎍/mL	49.6
비교예 1	0.25 ㎍/mL	89.3
	0.5 ㎍/mL	80.5
	1 ㎍/mL	62.5

상기 표 4의 결과에서, 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물을 1 ㎍/mL 처리 시 MMP-2 생합성이 억제되었고, 처리 농도에 의존적으로 억제되고 있음이 확인되었으며, 비교예 1의 적송엽과 비교하여도 그 효과가 우수하였다. 이로부터 소나무 뿌리추출물은 자외선에 따른 세포의 MMP-2 생합성 촉진과 ECM손상을 억제하여 피부노화 증상인 주름 발생을 차단해 줄 수 있을 것이라 사료된다.

[시험예 7] SIRT1과 LMNA1 유전자의 발현 유도 효과

인간의 각질형성 세포인 HaCaT 세포는 한국 세포주은행(Korean Cell Line Bank; 한국 서울 소재)에서 분양받아 사용하였다. HaCaT 세포를 10% (v/v) FBS, 페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml를 포함하는 DMEM 배지에 주입하고 37℃, 5% CO₂공급조건을 갖춘 동물세포 배양기에서 배양하였다. 웰 당 1.5×10⁶농도로 준비된 HaCaT 세포에 FBS가 포함되지 않은 배지로 3시간 동안 적응시켰다. 이후 실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 10 ppm 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 총 RNA는 TRIzol^TM(GIBCO BRL, 미국 메릴랜드 소재)을 사용하여 추출하였고 -80℃에서 보관하였다. 총 RNA 1 g을 50 mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 및 40 유닛/l RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25 ℓ에 넣고, 0.5 g/ℓ 올리고(dT)₁₆의 프라이머와 200 유닛 수퍼스크립트 II[SuperScript II, 집코비알엘(GiboBRL)]의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 다음 역전사 반응 용액 2.5 ℓ를 엠플리택(AmpliTaq) DNA 중합효소[0.04 U(Perkin Elmer, 미국 코네티컷주 셸턴 소재)], 50 mM 트리스(pH 8.3), 0.25 mg/ml 우혈청알부민, 3 mM MgCl₂ 및 0.25 mM dNTPs이 함유된 PCR 반응 완충액 50 ℓ에 섞고, 10 M의 프라이머를 첨가하여 94℃에서 30초간 변성, 53℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 수행하였다. 1% 아가로즈젤에서 전기영동한 후 이미지를 획득하였다. 각각의 프라이머는 SCI급 논문들을 토대로 제작하였으며, 각각의 프라이머 서열을 하기 표 5에 나타내었다.

서열번호	명칭	서열
1	LMNA 정방향	5'-TCT GCT GAG AGG AAC AGC AA-3'
2	LMNA 역방향	5'-GGT GAT GGA GCA GGT CAT CT-3'
3	SIRT1 정방향	5'-TGG ACA ATT CCA GCC ATC T-3'
4	SIRT1 역방향	5'-CAA GCC GCC TAC TAA TCT GC-5'

상기 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3의 결과에서, 실시예 1의 소나무 뿌리 추출물을 1 ㎍/mL 처리 시 노화로 손상된 DNA 손상을 복구하는 SIRT1 유전자 및 DNA의 보호벽인 핵막의 구조를 유지하는 LMNA1 유전자의 발현이 유도됨을 알 수 있었으며, 비교예 1의 적송엽과 비교하여도 그 효과가 우수하였다. 따라서, 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물이 SIRT1 및 LMNA1 유전자의 발현을 유도함으로써 노화로 손상된 DNA 손상을 복구하고 DNA의 보호벽인 핵막의 구조를 유지하는 효과를 보일 수 있을 것으로 판단할 수 있었다.

[제형예 1∼3 및 비교제형예 1∼2]

하기 표 6의 조성으로 제형예 1∼3 및 비교제형예 1∼2의 크림을 제조하였다. 제조방법은 각각의 유상과 수상은 70℃에서 완전 용해시키고, 7,000 rpm에서 5분간 유화시켜 크림을 제조하였다(단위: 중량%).

성분		제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1	비교제형예 2
유상	비즈왁스	2	2	2	2	2
	스테아릴알코올	5	5	5	5	5
	스테아린산	8	8	8	8	8
	스쿠알렌	10	10	10	10	10
	프로필렌글리콜모노스테아레이트	3	3	3	3	3
	폴리옥시에틸렌에테르	1	1	1	1	1
	방부제, 항산화제	정량	정량	정량	정량	정량
수상	글리세린	4	4	4	4	4
	프로필렌글리콜	8	8	8	8	8
	트리에틸아민	1	1	1	1	1
	소디윰폴리아크릴레이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
	정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
	실시예 1의 소나무 뿌리 추출물	0.001	1	10	-	-
	비교예 1의 적송엽 추출물	-	-	-	10	-

[시험예 8] 피부 잔주름 개선 효과

상기 제형예 2∼3과 비교제형예 1∼2의 피부 잔주름 개선효과를 사람을 대상으로 평가하였다.

실험자(30-50세 여성) 25명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에 제형예 2에서 제조한 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교제형예 2에서 제조한 크림을 각각 1일 2회씩 연속 6주간 도포하였다. 또 다른 실험자(30-50세 여성) 25명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에 제형예 3에서 제조한 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교제형예 1에서 제조한 크림을 각각 1일 2회씩 연속 6주간 도포하였다. 6주 후 피부 잔주름 완화 효과는 제품 사용전과 6주 사용한 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름장치와 피부 영상분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

평가 항목	제형예 2		비교제형예 2		제형예 3		비교제형예 1
	사용 전	6주후	사용 전	6주후	사용 전	6주후	사용 전	6주후
평균 잔주름 깊이(㎛)	20.8	18.4	20.7	20.2	20.7	17.5	20.6	19.3
사용전 대비 주름 감소율	11.53%		2.41%		15.45%		6.31%

상기 표 7의 결과에서, 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물이 함유된 제형예 2 및 제형예 3의 크림을 사용하였을 경우, 실험자의 안면 눈 주위 피부에서 피부 잔주름 개선 효과가 비교제형예 1, 2 보다 우수함을 알 수 있었다.

도 1은 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물(적송근)이 SOD 및 카탈라아제 단백질의 발현에 미치는 효능을 보여준다.

도 2는 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물(적송근)이 HSP70 단백질의 발현에 미치는 효능을 보여준다.

도 3은 본 발명에 의한 소나무 뿌리 추출물(적송근)이 SIRT1 유전자 및 LMNA1 유전자의 발현에 미치는 효능을 보여준다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> Composition for skin external application containing the extract of red pine roots <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for LMNA <400> 1 tctgctgaga ggaacagcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for LMNA <400> 2 ggtgatggag caggtcatct 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SIRT1 <400> 3 tggacaattc cagccatct 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SIRT1 <400> 4 caagccgcct actaatctgc 20

Claims

소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
소나무 뿌리 추출물을 함유하는 피부 재생 촉진용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 HSP70 단백질의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 자외선 조사에 의한 MMP-2의 생합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 DNA를 복구하는 SIRT1 유전자 또는 핵막의 구조를 유지하는 LMNA1 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 자외선 조사에 의한 세포막 손상을 보호하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
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