KR101596133B1

KR101596133B1 - 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101596133B1
Application number: KR1020140051376A
Authority: KR
Inventors: 강희경; 강정일; 현진원; 유은숙; 고영상; 이남호
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-29
Filing date: 2014-04-29
Publication date: 2016-02-23
Also published as: CN106572983B; CN106572983A; WO2015167267A1; KR20150125053A

Abstract

본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5 dihydroxybenzaldehyde, BDB) 또는 이의 염을 유효성분을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 포함하는 조성물은 탈모를 억제 및 예방하며 육모를 촉진하는 효능을 인정되므로, 약학, 화장품 및 미용 등의 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

Description

3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물{Composition including 3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde for prevention of hair loss or for promoting hair growth}

본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB) 화합물 및 이의 염을 유효성분으로 함유하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만∼15만 개 정도이며 "모낭"에서 형성된다. 모낭에는 유두가 있는데, 이 부위에는 작은 혈관이 분포되어 모발의 성장에 필요한 영양분을 공급하고 유두 위의 옆으로는 모발에 윤기를 주는 기름을 공급해 주는 지루샘이 있다. 모낭(hair follicle)은 여러 다른 상피세포들(epithelial cells) 및 모유두 세포들(dermal papilla cells, DPCs)로 이루어진다. DPCs은 모낭의 기저부에 위치한 중간엽-유래 섬유아세포(mesenchymally-derived fibroblasts)이며 육모에 중요한 역할을 한다. 특히, 미녹시딜(minoxidil)은 DPCs에 증식 및 항-세포사멸 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 유사하게, 여러 보고서들은 DPCs의 증식을 통한 육모의 증가를 보여줬다. 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 휴지기(telogen)를 거쳐서 성장하고 탈락한다. 이러한 주기는 3∼6년에 걸쳐 반복되는데, 일일 평균 50∼100 개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 일반적으로 탈모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기 모발의 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기 모발이 많아져 탈락하는 모발의 숫자가 비정상적으로 많아지는 것을 일컫는다.

탈모의 원인으로는 남성호르몬 작용 과잉설, 피지분비 과잉설, 혈액순환 불량설, 과산화물, 세균 등에 의한 두피기능 저하설, 유전적 요인, 노화, 스트레스 등이 논의되고 있다. 그 원인 중 하나인 남성호르몬의 일종인 테스토스테론(testosteron)은 5α-reductase라는 효소에 의해 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestoserone; DHT)으로 활성화되며, 이 DHT가 특정 수용체와 결합하고 탈모를 일으키는 단백질을 유도하여 탈모가 일어난다. 또한 이와 같은 기작에 의하여 피지를 과잉생성하기도 하며 여드름이나 지루성 피부염 등을 일으켜서 두피에 염증을 동반한 탈모가 나타나기도 한다. 탈모증(alopecia)은 질병, 영양부족, 노화, 호르몬 불균형 등에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 많은 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고, 근본적인 탈모에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 또한 탈모를 치료하기 위한 노력도 진행되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 오직 두 개의 약물들 (피나스테라이드(finasteride) 및 미녹시딜(minoxidil))만이 탈모 치료를 위해 FDA(Food and Drug Administration) (U.S.A)에서 인가되었다. 5α-reductase 억제제인 피나스테라이드는 남성의 안드로겐성 탈모증(androgenetic alopecia)에서 육모를 촉진시키기 위해 이용되어 왔다. 혈압강하제(anti-hypertensive agent)인 미녹시딜은 ATP-민감성 K⁺-채널 개방에 의해 육모를 촉진시킬 수 있다. 그러나, 약물의 효과는 예측불가능한 효과 및 부작용 때문에 제한적이고 일시적이다. 탈모를 예방하고 육모를 촉진시키는 더 나은 새로운 치료제가 필요하다. 지금까지 탈모를 방지하여 주고 발모촉진 및 모발에 생장에 효과를 가지고 있다고 알려져 있는 미녹시딜(minoxidil)이나 트리코사카라이드 (trichosaccharide)등의 제제들의 경우, 뚜렷한 효능의 부재 및 인체 안전성, 피부자극 유발 등의 부작용 문제가 대두되고 있어 안전성 및 효능이 확보된 조성물 개발이 시급한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 독성이 거의 없이 탈모 방지 및 육모 촉진 효과를 나타내는 물질들을 탐색하던 중 Rhodomela confervoides, Polysiphonia morrowii, Polysiphonia urceolata와 같은 홍조(red alga)로부터 분리한 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)가 탈모 방지 및 육모 촉진 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 10-2014-0001618(2014.01.07)

본 발명의 목적은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드를 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드를 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물은 모낭의 길이를 성장을 촉진하고, 세포주기 단백질뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의해 모유두 세포의 증식에 관여하므로 탈모를 억제 및 예방하며 육모를 촉진하는 효능이 인정되어, 약학, 건강식품, 화장품 및 미용 등의 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

도 1은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)의 농도별 모낭의 길이 성장을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)의 모유두세포(Dermal papilla cell) 증식 효과를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)가 세포주기 단백질뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의해 모유두 세포의 증식에 관여하는 것을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 “탈모”는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, “탈모 방지”라 함은 상술한 바와 같은 탈모 현상을 예방하고 억제하는 것을 의미하고, “육모 촉진”이라 함은 새로운 모발의 생성의 촉진뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미한다.

일반적으로 “육모”는 성장기에서 이루어지며, 휴지기에서 성장기로의 유도 및 성장기에서 퇴행기로의 지연에 의하여 촉진된다. 모발주기는 성장기, 퇴행기, 휴지기로 알려져 있는 3개의 주요 단계들로 나눌 수 있다. 성장기에는 세포의 빠른 증식과 함께 피부 안으로 깊이 모낭이 성장하면서 모발형성이 이루어진다. 다음 현상은 퇴행기인데 이것은 세포 분열의 중단이 두드러지는 과도기이며, 이 과정에서 모낭은 점차 퇴행하며 육모가 중단된다. 다음 현상인 휴지기에서는 퇴행 모낭은 조밀하게 찬 모유두(dermal papilla) 세포를 갖는 배(germ)를 포함한다. 휴지기에서 새로운 성장기 현상의 개시는 상기 배에서 빠른 세포 증식, 모유두의 팽창 및 기저막 요소의 합성에 의해 유도된다.

따라서, 성장기의 촉진 또는 연장에 의해 모발의 손실 방지, 즉 탈모를 방지하거나 모발의 재성장을 유발, 즉 육모를 촉진하는 것이 필요하며, 본 발명에 따른 조성물은 이미 존재하고 있는 모발이 빠지지 않게 하는 효과, 이미 존재하는 모발을 굵게 하는 등 개선시키는 효과, 및 새로운 모발을 생성하는 효과 중 하나 이상을 포함한다. 모유두 세포(dermal papilla cell)는 모낭의 기저에 위치한 중배엽유래의 섬유아세포로서, 모낭의 모기질 세포와 상호작용을 통해 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다 (Jahoda CA, et al ., 1984; Oliver RF, et al., 1986). 또한, 탈모치료제로 사용되고 있는 미녹시딜(minoxidil)은 K_ATP-channel opener로, NIH3T3 섬유아세포에서 성장을 증가시킨다는 것이 밝혀져 있다 (Sanders, et al., 1996).

본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5 dihydroxybenzaldehyde, BDB) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 함유된 유효성분인 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB) 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

이러한 BDB를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일

수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다.

비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은, 그다지 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 있어서, 본 발명의 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB) 또는 이의 염의 농도는 0.001 내지 10 μM인 것이 바람직하나, 상기 약학적으로 유효한 양은 탈모의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5 dihydroxybenzaldehyde, BDB) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

이에 따른 화장료 조성물은 예를 들어 화장료 조성물일 수 있으며, 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수도 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여, 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 모발에 도포하기에 적당한 캐리어 또는 캐리어 혼합물을 포함하여 모발 조성물로 제조될 수 있다. 캐리어는 용매와 다른 캐리어 또는 모발 보호 조성물에 통상적으로 사용되는 비히클(vehicle) 성분을 포함하며, 전체 조성물의 조성물 중 약 0.5% 내지 99.5%, 바람직하게는 약 5.0% 내지 99.5%, 가장 바람직하게는 약 10.0% 내지 90.0%로 존재한다. 캐리어로서 용매는 제형화된 모발 조성물이 헤어 스프레이, 무스, 토닉 등과 같이 사용 후 모발에 남는 것이거나 샴푸, 컨디셔너 등과 같이 세정되는 것에 관계없이 사용하는 공중합체에 의해 선택된다. 본 발명에서 사용하는 적합한 용매는 물, 저급 알코올(에탄올, 이소프로판올 등), 하이드로알콜계 혼합물, 탄화수소(이소부탄, 헥산, 데센등), 아세톤, 할로겐화 탄화수소(프레온 등), 탄화수소 에스테르(에틸 아세테이트, 디부틸 프탈레이트 등), 휘발성 실리콘 유도체, 실록산(페닐 펜타메틸 디실록산, 메톡시프로필 헵타메틸 사이클로테트라실록산, 클로로프로필 펜타메틸 디실록산, 하이드록시프로필 펜타메틸 디실록산, 옥타메틸 사이클로테트라실록산, 데카메틸 사이클로펜타실록산 등) 및 이들의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물은 대조군인 미녹시딜(minoxidil)에 비하여 hair fiber의 길이 성장을 촉진하고(도 2 참고), 세포주기 단백질뿐만 아니라 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의해 모유두 세포의 증식에 관여하므로(도 3 및 도 4 참고) 탈모를 억제 및 예방하며 육모를 촉진하므로 탈모 방지를 위한 약학적 조성물 및 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 3- 브로모 -4,5- 디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)의 Hair - fiber 길이 성장 효과 분석

<1-1> 래트 진모 모낭( Rat vibrissa follicles )의 분리 및 배양

생후 3주령인 Wistar rat 수컷을 (Japan SLC, Hamamatsu, Janpan) (주)중앙실험동물로부터 구입하여 에틸 에테르(ethyl ether)로 마취 후 경추 도살하였다. Rat 왼쪽과 오른쪽 mystacial pads를 분리하여 100 units/ml penicillin-100 ㎍/ml streptomycin (Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 E/P buffer [Earle's balanced salts solution (EBSS, Sigma MO, USA) + phosphate-buffered saline (PBS, Sigma MO, USA)]에 넣었다. 해부 현미경으로 관찰하며 vibrissa follicles을 조심스럽게 분리하였다. 모낭이 모두 분리될 때까지 E/P 버퍼를 넣은 페트리 디쉬(Petri dish)에 분리된 모낭을 넣고 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 1시간 정도 배양하였다. 24 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 2 mM L-glutamine (Gibco Inc, NY, USA), 10 ㎍/ml insulin (Sigma MO, USA), 50 nM hydrocortisone (Sigma MO, USA)과 100 units/ml penicillin-100 ㎍/ml streptomycin을 포함하는 500 μl의 William E medium (Gibco Inc, NY, USA)을 넣고, 하나의 well에 하나씩의 모낭을 넣어서 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였다. 배양 중에 배지는 3일 마다 교환하였고 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde,BDB)(Matrix

Scientific, Columbia, SC, USA)은 0.01, 0.1 및 1 μM의 농도로 처리하였다. 양성 대조물질인 미녹시딜(minoxidil)을 10 μM의 농도로 처리하였다.

<1-2> 진모 모낭( vibrissa follicles ) 성장의 측정

배양중인 vibrissa follicle 형태는 현미경 (Olympus, Japan)을 사용하여 촬영하였다. 모낭 길이는 image analyzer (eXcope; DIXI Optics, Korea)를 사용하여 측정하였다. 모낭 길이 변화의 평균값을 구하고 대조군의 평균길이와 비교하여 성장 정도를 측정하였다.

구체적으로, 생후 3 주령 rat의 성장기 vibrissa follicles을 분리하여 3주간 배양하면서 모낭 길이를 측정하여 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB)이 육모 효능 있는지 조사하였다. 모든 측정결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 student's t test으로 검정하였으며, p-value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software (Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다.

그 결과, 21일째 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB) 처리군과 대조군과의 모낭의 길이 차이 (%)를 비교하였을 때, 0.01, 0.1 및 1 μM을 각각 처리하였을 때 대조군보다 hair fiber의 성장이 87.3±17.7%, 98.3±26.3% 및 175.7±22.4% (P<0.05)로 증가하였다. 특히, 1 μM의 농도에서 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)의 hair fiber 성장 증가 효과는 양성대조 물질로 사용한 미녹시딜 (10 μM)의 136.8±24.0% 성장 증가 효과보다 더 높은 것을 확인하였다(도 2).

< 실시예 2> 3- 브로모 -4,5- 디하이드록시벤즈알데하이드의 모유두세포( Dermal papilla cell ) 증식 효과 분석

모유두세포(dermal papilla cell)는 모낭의 기저에 위치한 중배엽 유래의 섬유아세포로서, 모낭의 모기질 세포와 상호작용을 통해 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다 (Jahoda CA, et al ., 1984; Horne K et al ., 1986). 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)가 육모 효능이 있는지 모유두 세포(dermal papilla cell)를 사용하여 조사하였다.

구체적으로, 흰쥐 수염에서 분리된 불멸화된 모유두세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell: Filsell W, et al., 1994)를 100 units/ml penicillin-100 ㎍/ml streptomycin (Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM (Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. 모유두세포(dermal papilla cell)의 증식은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 모유두세포(dermal papilla cell) 1.0×10⁴ cells/ml를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 웰 플레이트에 넣고 24시간 배양 후 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μM의 농도로 처리하였다. 양성 대조군인 미녹시딜(minoxidil) (Sigma, MO, USA)는 10 μM의 농도로 처리하였다. 4일 동안 배양한 후 50 μl의 MTT (Sigma, MO, USA)을 첨가하고 4 시간 동안 반응시켰다. 상층액은 제거하고 DMSO 200 μl을 가하여 침전물을 용해시킨 후 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식 정도를 조사하였다. 모든 측정결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 student's t test으로 검정하였으며, p-value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다. 통계처리는 Sigma Stat software (Jandel Scientific Software, USA)를 사용하였다.

그 결과, 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μM의 농도로 처리하였을 때, 대조군에 비하여 각각 110.1±8.2% (P<0.01), 111.3±6.2% (P<0.001), 114.1±9.4% (P<0.001) 및 107.3±7.7% (P<0.05) 정도 모유두세포(dermal papilla cell)의 증식이 증가하였다. 이는 양성대조 물질로 사용한 10 μM 미녹시딜(minoxidil)의 증식효과인 109.6±7.6% (P<0.01)와 비슷하거나 다소 높은 것으로, 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)이 미녹시딜과 같은 육모 효능을 가지는 것을 확인하였다(도 3).

< 실시예 3> 3- 브로모 -4,5- 디하이드록시벤즈알데하이드의 세포주기 단백질 조절 분 석

3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)가 모유두 세포의 성장증식을 증가시키는 분자적 기전을 밝히기 위해 세포주기 단백질의 발현을 관찰하였다. 포유류 세포는 세포증식의 주요 과정인 세포주기 진행을 위해 cyclin E/CDK2 complex의 활성화, cyclin D1 증가 및 pRB의 인산화 증가 등을 필요로 함이 알려져 있다. BDB의 모유두 세포증식 증가 효과가 세포주기 단백질에 의해 조절되는지 확인하기 위해, cyclin D1, phospho-pRB, cyclin E, phospho-CDK2, CDK2의 발현을 조사하였다.

구체적으로, 모유두세포(dermal papilla cell)는 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24 시간 동안 배양한 후에 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB) 및 10 μM 미녹시딜(minoxidil)을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 세포는 PBS로 2회 세척한 후 200 μl의 lysis buffer[50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol(DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 25 ㎍/mL aprotinin, 25 ㎍/mL leupeptin and 1% NP-40]를 첨가한 다음, 4℃에서 30분 동안 lysis 시켰다. Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다.20-30 ㎍의 lysate를 8-12% mini gel SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성분리하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200 mA에서 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% nonfat dried milk가 함유된 Tween-20-TBS(T-TBS)(50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액에서 2시간 동안 실시하였다. Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 Cyclin D1(1:1000), phospho(ser780)-pRB(1:1000), Cyclin E(1:2000), phospho-CDK2(1:1000), CDK2(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin(1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:2000), phospho(ser9)-GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000) 및 β-actin(1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 실시하였다. Secondary anbibody는HRP(Horse Radish Peroxidase)가 결합된 anti-rabbit Ig, anti-mouse IgG를 1:5000으로 희석하여 1시간 동안 상온에서 진행하였다. 그 다음 T-TBS로 membane을 3회 세척한 후, ECL 기질(Intron, Seoul, Korea)로 1분 동안 반응시킨 다음 X-ray film(AGFA, Mortsel, Belgium)에 감광하였다.

그 결과, 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 모유두 세포에 24시간 동안 0.1 및 1 μM 농도로 처리하였을 때, cyclin D1, phospho-pRB, cyclin E 및 phospho-CDK2의 발현이 증가함을 확인할 수 있었고, 미녹시딜의 처리 역시 3-3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)과 비슷한 결과를 보임을 확인하였다(도 4A) 한편, Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 모발성장, 세포증식 조절에서 중요한 역할을 한다 (Kwack M, et al., 2011; Wangefjord S, et al., 2013). Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 다양한 인자에 의해 조절되며 특히, Akt의 활성화는 β-catenin의 인산화(ser552) 및 GSK3β 인산화(ser9)를 유도하며, PKA는 β-catenin의 인산화(ser552 및 ser675)를 유도하여 결국 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 활성화하게 된다(Hedgepeth C, et al., 1997; Hino S, et at., 2005; Monick MM, et al., 2001). 그 이후에 β-catenin의 안정화 및 세포핵으로의 이동 촉진 등의 과정이 일어나 target gene의 발현을 조절하게 된다 (Hedgepeth C, et al., 1997; Monick MM, et al., 2001). 본 발명의 결과를 통하여, 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB) 처리에서는 Phospho(ser552)-β-catenin, Phospho(ser675)-β-catenin, Phospho(ser9)-GSK3β 활성화가 증가함을 확인하였고, 미녹시딜(minoxidil)의 처리 역시 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)와 비슷하게 Wnt/β-catenin 경로를 활성화시킴을 관찰하였다(도 4B). Kwack 등은 미녹시딜(minoxidil)이 human DPCs에서 PKA, Akt 및 GSK3β 활성화를 경유한 β-catenin 신호전달 경로의 조절을 통해 육모 효능을 나타냄을 보고하고 있다 (Kwack M, et al., 2011). 이러한 결과들은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)가 cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2, phospho-pRB같은 세포주기 단백질뿐만 아니라 GSK3β, PKA및 Akt 경로를 통한 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의해 모유두 세포의 증식증가 효능을 나타냄을 확인하였다.

Claims

3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5 dihydroxybenzaldehyde, BDB) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물로,
상기 조성물은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 0.001 내지 10μM의 농도를 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 정제, 캅셀제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된제형인 것을 특징으로 하는 탈모 방지를 위한 약학적 조성물.
삭제
3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물로,
상기 조성물은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(BDB)를 0.001 내지 10μM의 농도를 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 조성물은 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이로 이루어진 군에서 선택된 제형인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.
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