KR101532553B1

KR101532553B1 - 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101532553B1
Application number: KR1020130128987A
Authority: KR
Inventors: 고영상; 유은숙; 강희경; 현진원
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2015-06-30
Also published as: KR20150049030A

Abstract

본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-Bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, 3-BDB)를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 3-BDB가 염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 활성이 우수하다는 사실을 실험을 통해 입증하여 자가면역질환 또는 염증질환을 위한 치료제로서 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-Bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, 3-BDB)를 사용할 수 있다는 사실을 제공함에 그 효과가 있다.

Description

3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising 3-bromo-4, 5-dihydroxybenzaldehyde for prevention and treatment of autiimmune disease or inflammatory disease}

본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증이란 외부 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻하며, 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방어 반응과정으로, 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등과 같은 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 질환의 주요 병리현상인 과민성 질환 및 만성염증이 발병되며 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

한편, 사람의 신체방어는 면역반응을 통하여 병원체로부터 보호받을 수 있는데, 바이러스나 박테리아와 같은 외래 미생물에 대한 생체방어 기작으로는 자연면역(innate immunity)과 특이면역(specific immunity)으로 나뉘어지며, 이는 면역관련 세포에서 주로 분비되는 사이토킨(cytokine)에 의해서 매개된다(Klaus, B., Immunology Letters., 19, pp183- 192, 1988). 대식세포는 염증반응에서 중요한 역할을 하는 세포중의 하나로서, 외부 침입 인자에 반응하여 tumor necrotic factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6)와 같은 pro-inflammatory cytokine을 생성하고, inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 합성하여 NO 및 prostaglandin E₂(PGE₂)를 생성하는 주요한 세포이다.

또한, 내독소(endotoxin)로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccaride)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 단핵식세포(macrophage 또는 monocyte)로부터 다양한 염증 발병 인자로 알려진 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6) 와 같은 염증 전구 사이토킨(pro-inflammatory cytokines)을 증가시키는 것으로 알려져 있다(An, S. J. et al ., Int . Immunopharmacol ., 2, 1173 - 1181. 2002; Scott, M. G. et al ., Crit . Rev . Immunol ., 20, pp407 - 431, 2000; Ashutosh, K. M. et al ., Cell Immunol ., 219, pp1 - 10, 2002). TNF-α와 같은 다 기능성(multifunctional) 사이토킨은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변과정에서 그 발현 정도가 증가되며 (Groves, R. W. et al., J. Dematol ., 32, pp345 -352 1994; Wakefield, P. E., et al., J. Am . Acad . Dermatol ., 24, pp675- 685, 1991), 류마티스 관절염에서 TNF-α와 IL-6 같은 사이토킨의 발현은 상당히 증가되며 신경계 조직 손상 등을 일으킨다고 알려져 있다. (Ishii R., M. et al., Biochimica . et . Biophysica . Acta ., 1620, pp108 - 118, 2003).

체내 염증과정에서는 과량의 NO(nitric oxide) 및 PGE₂ (prostaglandin E₂) 등의 염증인자가 NOS(NO synthase) 및 COX (cyclooxygenase)에 의해 형성된다. 이중 NO는 NOS라는 유도성(inducible) 또는 상존성(constitutive) 효소에 의하여 생성되어지는 반응성 라디칼(radical)로서(Choi, B. M. et al., Kor . J. Immunol ., 18, pp551 - 558, 1996) 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다(Nathan, C., EASEB J., 6, pp3051- 3064, 1992). 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만, 병리적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다(Weisz, A. et al ., Biochem J., 316, pp209- 215, 1996).

뿐만 아니라 염증과 관련된 인자인 COX(Cyclooxygenase)는 아라키돈 산(arachidonic acid)을 PGs (prostaglandins)로 전환시키는 효소로써 COX-1과 COX-2로 분류된다(Kim R. G. et al ., Yakhak Hoeji , 46(5), pp343 - 347, 2002). COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 프로스타글란딘(prostaglandin)의 합성 등 정상적인 생체기능에 작용한다(Masferrer J. L. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 91(25), pp3228- 3232, 1994). COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발견된다. 따라서, COX-2에 의한 프로스타글란딘의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨지고 있으며, 염증매개물질인 PGE₂를 형성시킨다. PGE₂(Prostaglandin E₂)는 염증반응, 면역반응 및 혈관신생(angiogenesis) 촉진 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다(Seibert, K. Y. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci ., USA , 91(25), pp12013 - 12017, 1994; Masferr, J. L. et al., Proc . Natl . Acad. Sci ., USA , 91(25), pp3228 - 3232, 1994).

한편, 이러한 염증질환 및 자가면역질환을 부작용 없이 효과적으로 치료할 수 있는 치료들이 부재하여 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 특2002-0042020

이에 본 발명자들은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 화합물(3-bromo-4, 5-dihydroxybenzaldehyde; 3-BDB)이 LPS에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제하고, PGE2의 생성 억제효과도 우수할 뿐만 아니라 골수 유래의 대식세포와 수지상세포 모두에서 LPS에 의한 염증반응을 효과적으로 억제함을 확인하여 궁극적으로 3-BDB를 자가면역질환 및 염증질환의 치료제로 사용할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-Bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, 3-BDB) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-Bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, 3-BDB) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드는 염증 전구 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-12 또는 IL-6일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 3-BDB를 1μM 내지 100μM의 농도로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환이란 아토피성 피부염, 원형탈모증, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증질환은 전신성 염증 반응 또는 내독소 쇼크 (endotoxic shock) 증상을 보이는 패혈증일 수 있다.

본 발명은 3-BDB(3-bromo-4, 5-dihydroxybenzaldehyde)를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 3-BDB가 염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 활성이 우수하다는 사실을 실험을 통해 입증하여 자가면역질환 또는 염증질환을 위한 치료제로서 3-BDB(3-bromo-4, 5-dihydroxybenzaldehyde)를 사용할 수 있다는 사실을 제공함에 그 발명의 효과가 있다.

도 1은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포를 대상으로 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, RAW264.7 세포의 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포를 대상으로 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, RAW264.7 세포에서의 산화질소 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포를 대상으로 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, RAW264.7 세포에서의 TNF-alpha 및 IL-6의 생성 정도를 분석한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 4는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포를 대상으로 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, RAW264.7 세포에서의 프로스타글란딘 E2의 생성 정도를 분석한 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 5는 LPS로 자극된 골수 유래 수지상세포에 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, IL-12(도 5A) 및 IL-6(도 5B)의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, SB는 p38 mitogen activated protein kinase 억제제인 SB203580을 처리한 양성대조군의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS로 자극된 골수 유래 대식세포에 3-BDB 화합물을 각 농도별로 처리한 후, IL-12(도 6A) 및 IL-6(도 6B)의 생성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, SB는 p38 mitogen activated protein kinase 억제제인 SB203580을 처리한 양성대조군의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 자가면역질환 및 염증질환 치료효과가 우수하고 세포 내 독성을 유발시키지 않는 새로운 자가면역질환 또는 염증질환의 치료제로서 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, 3-BDB)의 용도를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에서 유효성분으로 사용한 3-BDB 화합물은 종래 hematopoietic necrosis virus 와 infectious pancreatic necrosis virus에 대해 항바이러스 효과를 갖고 있다는 보고된 바 있으며(Kim et al., 2011), 이외의 다른 생리적 활성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

이러한 점에서 본 발명자들은 3-BDB 화합물이 우수한 항염활성을 가지고 있고 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 활성이 우수하여 자가면역질환 또는 염증질환의 치료제로서 사용할 수 있음을 최초로 규명하였는데, 즉, 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 자극된 골수 유래 수지상세포에서 TNF-α, IL-6 또는 IL-12의 생성을 억제하는 효과가 있음을 일실시예를 통해 확인하였다.

참고로, 내독성 물질인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 수지상 세포에서 염증을 유발하는 염증 유도물질로서, 염증반응을 일으키는 염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokines)들의 생성을 촉진한다. 즉, 염증반응을 일으킬 수 있는 외부자극이 가해지는 경우, TNF-α 등의 염증성 사이토카인들의 발현이 유도되고, 생성된 염증성 사이토카인들은 iNOS 및 COX-2를 코딩하는 유전자의 발현을 자극시켜, 염증반응에 관여하는 NO 및 PGE2 물질을 생성하여 염증반응을 일으킨다.

그러므로 이러한 TNF-α, IL-6 또는 IL-12의 염증성 사이토카인의 염증 유발물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래한다.

이러한 점에서 본 발명의 3-BDB 화합물은 염증반응의 매개체인 염증성 사이토카인의 생성 및 활성을 억제하는 활성이 우수한 특징이 있는데, 특히 IL-6 및 IL-12의 생성 억제 효과가 뛰어났다.

특히, 인터루킨-12는 항원 자극에 의해 수지상세포, 마크로파지 등의 항원제공세포에서 제조되는 인터루킨의 한 종류로, T세포를 자극하여 1형 헬퍼 T 세포로 분화시키는 역할을 수행하며, NK(natural killer) 세포, T림포사이트의 활성도에 중요한 역할을 한다. 이는 IL-12A(p35)와 IL-12B(p40)의 헤테로다이머 형태이며, IL-12A(p35)의 발현은 항상적(constitutive)이어서, 인터루킨-12의 생물학적 기능은 주로 IL-12B(p40)의 발현에 좌우되는데, 이러한 인터루킨-12의 억제가 인체 내 세포에 대한 과잉 면역반응인 자가면역 질환, 특히 1형 헬퍼 T 세포가 매개하는 자가면역질환의 치료에 도움이 될 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다. 인터루킨-12는 항원 자극에 의해 수지상세포, 마크로파지 등의 항원제공세포에서 제조되는 인터루킨의 한 종류로, T세포를 자극하여 1형 헬퍼 T 세포로 분화시키는 역할을 수행하며, NK(natural killer) 세포, T림포사이트의 활성도에 중요한 역할을 한다. 이는 IL-12A(p35)와 IL-12B(p40)의 헤테로다이머 형태이며, IL-12A(p35)의 발현은 항상적(constitutive)이어서, 인터루킨-12의 생물학적 기능은 주로 IL-12B(p40)의 발현에 좌우되는데, 이러한 인터루킨-12의 억제가 인체 내 세포에 대한 과잉 면역반응인 자가면역 질환, 특히 1형 헬퍼 T 세포가 매개하는 자가면역질환의 치료에 도움이 될 수 있다는 연구결과가 보고되고 있다.

그러므로, 본 발명의 3-BDB 화합물은 TNF-α, IL-6 또는 IL-12의 생성을 억제하는 활성을 통하여 염증성 질환을 치료 또는 예방하는 용도에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서의 "염증 질환"은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 또는 IL-12의 과량 생성에 기인하는 질환으로써, 자가면역질환 또는 패혈증 등을 들 수 있다.

더욱 상세하게, 상기 자가면역질환은 알레르기, 아토피성 피부염, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환 등을 포함하고, 패혈증(sepsis)은 체온이 38도 이상으로 올라가는 발열 증상, 36도 이하로 내려가는 저체온증, 호흡수가 분당 24회 이상으로 증가(빈호흡), 분당90회 이상의 심박수(빈맥), 혈액 검사상 백혈구 수의 증가 혹은 현저한 감소 증상을 보이는, 미생물의 감염에 의한 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS) 및 내독소 쇼크 (endotoxic shock) 등을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 자가면역질환으로, ⅰ)면역계가 각종관절의 조직을 공격하는 류마티스관절염(Rheumatoid Arthritis), ⅱ) T 세포에 의하여 유도되는 중추신경계의 자가면역증으로 대부분은 비교적 정상적인 생활이 가능하나, 심한 경우 실명, 마비,조기사망(premature death)으로 이어질 수 있는 다발성 경화증(MS, Multiple Sclerosis), ⅲ) 췌장의 인슐린 생산 세포를 면역세포가파괴하여 생기며 MHC 유전자가 중요한 역할을 수행하는 면역매개, 또는 제 Ⅰ 형 당뇨병(Immune-Mediated orType Ⅰ Diabetes Mellitus), ⅳ) 면역계가 장을 공격하여 나타나는 질환인 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Diseases), ⅴ) 피부나 혈관의 경화(thickening)를 유도하는 피부경화증(Scleroderma), ⅵ) 전신성 자가면역증으로 깊은 피로감, 발진, 관절통 등의 증세를 수반하며, 심한 경우 면역계가 신장, 뇌, 폐 등에 손상을 끼칠수 있는 전신성 루프스(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)를 들 수 있다. 또한, 패혈증은 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응이 나타나는 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS) 및 패혈증(내독소) 쇼크를 들 수 있다. 특히, 상기 내독소 쇼크(패혈증 쇼크)는 과량 생성된 인터루킨-6와 TNF-α가 주된 원인이 된다.

따라서, 본 발명의 3-BDB는 염증질환 중 특히 패혈증과 면역질환 중 특히 자가면역질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 함유된 유효성분인 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드(3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB) 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3-bromo-4,5-dihydroxybenzaldehyde, BDB) 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 3-BDB의 약학적으로 유효한 양은 1μM ~ 100μM일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 염증 또는 자가면역질환의 증상의 예방 및 개선용 조성물은 염증 또는 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 3-BDB 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 염증 또는 자가면역질환 증상의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 염증질환 및 자가면역질환은 과다 염증반응으로 인해 유발되는 질환으로 신체가 통제되지 않은 염증반응으로 인해, 비특이적 자극에 과다 반응하는 것으로 특징지어진다. 이러한 과다 염증반응은 질환의 발병과 만성적 고착을 유발하는 병리학적 변화를 야기하는데, 과다활동성 염증 질환의 정의 및 실례는 EP-0 673 646을 참고한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실험재료

생쥐 대식세포주인 RAW264.7 cell은 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS)과 100 unit/㎖ penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 세포배양액으로 이용하여 37℃, 5% CO₂로 유지되는 항온기 (incubator)에서 배양하였으며, 3~4일 간격으로 계대배양 하였다. 자극제로 사용한 LPS (Lipopolysaccharide)는 Sigma로부터 구입하여 사용하였고, human Interferon-γ (hIFN-γ, recombinant E. coli)과 human tumor necrosis factor-α (TNF-α, recombinant E. coli)은 Roche로부터 구입하여 사용하였다. mouse IL-6, mouse TNF-α, mouse PGE2 ELISA kit는 R&D(Minneapolis,MN) 제품을 사용하였다.

또한, 모든 수치는 세 번 측정하였고, 실험 결과는 평균±표준편차로 표기하였다. 실험결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tukey’s test를 이용한 ANOVA로 분석하였다. P 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

< 실시예 1>

3- BDB 화합물의 세포독성 분석

3-BDB의 세포독성을 평가하기 위하여, RAW264.7 세포에 LPS (1μg/mL)를 처리하고, 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 3-BDB를 각각 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 각 웰에 WST reagent를 10 μL씩 넣고 2시간 동안 배양한 후, 플레이트 믹서를 사용하여 잘 흔들어 준 후 ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에 3-BDB를 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 24시간 동안 처리하였을 때, 생쥐 대식세포주 RAW264.7 세포의 세포 생존능에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 3-BDB 화합물이 세포에 대해 독성을 유발시키지 않는 안전한 화합물임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

3- BDB 화합물의 산화질소 생성에 미치는 영향분석

산화질소 생성에 대한 3-BDB의 효과를 알아보기 위하여 NO assay를 실시하였다. 먼저, RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 X 10⁵ 세포/mL로 접종하고, LPS (1μg/mL)를 함유한 새로운 배지와 각 농도의 3-BDB를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 그리즈 (Griess) 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 그리즈 시약 100 μL를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후, ELISA 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 아질산나트륨 (sidium nitrite; NaNO2)을 연속희석 (serial dilution)하여 얻었다 (1-100μM).

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에 3-BDB를 0, 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 처리한 후 griess 시약을 이용하여 NO 생성을 측정한 결과, 3-BDB를 처리하지 않은 군에 비해 3-BDB를 처리한 군에서 산화질소의 생성이 다소 감소되는 것으로 나타났으나, 감소 효과는 미약한 것으로 확인되었다.

< 실시예 3>

3- BDB 화합물의 염증 전구 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2 의 생성에 미치는 영향분석

3-BDB가 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 프로스타글란딘 E2의 생성에 억제활성이 있는지 조사하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

RAW264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 X 10⁵ 세포/mL로 접종하고, LPS (1μg/mL)를 함유한 새로운 배지에 각 농도의 3-BDB를 처리하여 24시간 배양하였다. TNF-α, IL-6 및 PGE2 양은 ELISA kit를 이용하여 정량하였다.

분석 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 RAW264.7 세포에 3-BDB를 12.5, 25, 50, 100 μM 농도로 처리한 후 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6를 정량한 결과, TNF-α 생성 억제효과는 미약한 반면, 3-BDB의 처리 농도 의존적으로 IL-6의 생성은 우수한 억제효과를 나타내었다.

또한, 염증매개 인자인 PGE2의 생성에 대해서도, 3-BDB는 처리 농도 의존적으로 PGE2의 생성이 우수하게 억제되는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

골수 유래 수지상세포와 대식세포를 대상으로 본 발명의 3- BDB 화합물의 항염 활성 분석

(1) 세포 배양

골수 유래 수지상세포(Bone marrow-derived DCs)와 골수-유래 대식세포(macrophages)는 와일드 타입 C57BL/6 마우스(Taconic Farm, NY, U.S.A.)로부터 수득하였다. 보다 구체적으로는 마우스 정강이뼈 및 대퇴골을 DMEM(Dulbecco’s modified Eagles medium) 배지에서 플러싱(flushing)함으로써 골수 세포를 수득하였다. 상기 세포들은 그래뉼로사이트-마크로파지 콜로니-자극인자(GM-CSF)를 함유하는 3% J558L 하이브리도마 세포 배양 상청액으로 보충되어 있는, 10%의 열-비활성화된 FBS(Gibco,NY, U.S.A.), 50 μM β-머캅토에탄올, 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

상기 배양 배지를 격일로 신선한 배지로 교체해주고, 배양 6일째, 비-부착성 세포 및 느슨하게 부착되어 있는 DC 응집체들을 수확하여 세척하고, 5% FBS가 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁하였다. 상기 DC들을 웰 당 1×10⁵cells를 함유하는 0.5 mL의 48-웰 플레이트에서 배양한 후, 1시간 동안 상기 3-BDB 화합물을 2, 10, 25 및 50 μM 농도로 처리한 후 Salmonella minnesota LPS (10 ng/mL, Alexis, NY, U.S.A.)로 세포를 자극하였다. 자극 후 18시간 때 상청액을 수득하였다.

이와 동시에 마우스에서 수득한 상기 골수세포를 마크로파지 콜로니-자극인자(M-CSF)를 함유하는 30% L-세포 배양상청액과 20%의 열-비활성화된 FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양하여 골수-유래 대식세포로 분화시켜 실험에 사용하였다. 대식세포에 화합물 처리 및 LPS 자극은 위 수지상세포와 동일한 조건으로 시행하였다.

배양 상청액 분획에서의 마우스 IL-6, IL-12 p40 농도는 ELISA 분석(Pharmingen, CA, U.S.A.)에 의해 측정하였다. 최소 3회의 트리플리케이트에서 수행한 독립적 실험으로부터 평균±표준편차로 나타낸 데이터를 수득하였다.

(2) 골수-유래 수지상세포(dendritic cells, DCs)와 골수-유래 대식세포( macrophages ) 에서의 염증반응 평가

골수-유래 수지상세포(dendritic cells, DCs)에서의 염증반응을 관찰하였다.

비색의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석(Sigma, MO, U.S.A.)을 이용하여 상기 3-BDB 화합물의 처리가 세포 생존능에서는 거의 영향이 없음을 확인하였다.

참고로, LPS 처리에 있어서, DCs와 대식세포는 염증성 사이토카인, 예를 들어, TNF-α, IL-6, 및 IL-12를 분비함은 이미 공지된 사실이고, 염증성 반응은 이러한 사이토카인 분비, 활성화 및 호중구(neutrophils)의 빠른 축적 및 이후의 단핵구 보충 등에 의한 반응을 포함한다.

따라서 이러한 사실에 기초하여, 본 실험에서는 2×10⁵cells/mL의 밀도로 48-웰 플레이트에서 배양한 DC 대식세포에게 2, 10, 25 및 50 μM 농도로 상기 3-BDB 화합물을 1 시간 동안 처리하고 LPS (10 ng/mL)로 자극하였다. 자극 후 18 시간 때 상청액을 수득하였다. 이때 p38 mitogen-activated protein kinase 억제제인 SB203580 처리군을 양성 대조군 (SB)으로 사용하였다.

분석 결과, 도 5 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3-BDB는 IL-12 및 IL-6 생성을 억제하는 효과가 우수함을 확인할 수 있었는데, 특히 LPS-자극된 수지상세포에서 IL-12 및 IL-6 생성능의 감소 정도는 각각 11.09, 28.35 μM의 IC₅₀ 값을 나타내었다(하기 표 1 참조). 또한, LPS-자극된 대식세포에서는 IL-6 생성능의 감소 정도는 1.33 μM의 IC₅₀ 값을 나타내어 그 효능이 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

LPS로 자극된 골수 유래 수지상세포에서의 항염 효과

Compounds	IC₅₀ (μM)^a
Compounds	IL-12p40	IL-6
3-BDB	11.09	28.35
SB203580^b	5.00	3.50

^aIC₅₀ values for selected compounds are given in column IL-12p40, IL-6.

Values <100 μM are considered to be active.

^bPositive control.

LPS로 자극된 골수 유래 대식세포에서의 항염 효과

Compounds	IC₅₀ (μM)^a
Compounds	IL-12p40	IL-6
3-BDB	>100	1.33
SB203580^b	5.00	3.50

^aIC₅₀ values for selected compounds are given in column IL-12p40, IL-6.

Values <100 μM are considered to be active.

^bPositive control.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드는 염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-12 또는 IL-6인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 3-브로모-4,5-디하이드록시벤즈알데하이드를 1μM 내지 100μM의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 자가면역질환이란 아토피성 피부염, 원형탈모증, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증질환은 전신성 염증 반응 또는 내독소 쇼크 (endotoxic shock) 증상을 보이는 패혈증인 것을 특징으로 하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.