KR101567901B1

KR101567901B1 - 동결건조 방법, 조성물, 및 키트

Info

Publication number: KR101567901B1
Application number: KR1020127016039A
Authority: KR
Inventors: 지안신 궈; 앤터니 클로스; 데보라 바네트
Original assignee: 그리폴스 테라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2015-11-10
Also published as: CN102762196B; ZA201203603B; AU2010324839A1; JP2015155455A; CA2781120A1; CL2012001350A1; BR112012012460B1; JP2013512194A; HUE037733T2; EP2503995A2; IL219827A0; CA2781120C; PT2503995T; BR112012012460A2; EP2503995A4; WO2011066291A4; US8648177B2; KR20120102715A; IL219827A; AU2010324839B2

Abstract

동결건조 방법, 특히 AT III를 포함하는 제형을 동결건조하는 방법이 제공된다. 그로부터 제조된 조성물도 또한 제공된다. 또한 상기 조성물 및/또는 동결건조된 생성물을 포함하는 키트도 또한 제공된다.

Description

동결건조 방법, 조성물, 및 키트{LYOPHILIZATION METHODS, COMPOSITIONS, AND KITS}

관련 출원의 교차 참조

본 출원은, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2009년 11월 24일 출원된 미국 특허 출원 번호 61/264.014호를 우선권 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 조성물, 특히 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 수성 약제학적 제형을 동결건조하는 방법, 및 그로부터 제조된 조성물, 특히 안티트롬빈-III(AT III)을 동결건조하는 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

동결건조는 활성 성분들을 더욱 단단한 형태의 약제로 제조하기 위해 흔히 사용되는 방법이다. 예를 들어, 알파₂-당단백질인 AT III과 같은 활성 성분은 보통 혈장 내에 존재하며 또 용액에서 비교적 불량한 안정성을 갖는 것으로 알려져 있는, 트롬빈의 혈장 억제제이다. 따라서, AT III는 동결건조된 제제로 가공되어 왔다.

동결건조는 화학반응 또는 생물학적 성장을 더 이상 지지하지 않는 수준으로 제형 중의 용매 성분을 제거하는 것에 의해 활성 성분의 분해를 감소 또는 억제하는 것으로 제안되어 있다. 또한, 용매의 제거는 분자 이동성을 감소시켜서 분해 반응의 가능성을 감소시키는 것으로 믿어진다. 또한, 동결건조된 생성물에 흔히 사용되는 결정화 부형제(crystallizing excipient)(예를 들어, 아미노산 및 염)는 케이크 구조를 지지하는 고체 매트릭스를 제공하기 위하여 냉동하는 동안 가능한 한 완전히 결정화하는 것이 바람직하다. 그러나, 수성 약제학적 제형을 동결건조시키기 위한 이전의 다수의 시도들은 만족스런 결정화도를 달성하는데 실패하였다. 예를 들어, 전형적인 동결건조 수법 자체의 다양한 냉동(freezing) 및/또는 어닐링(annealing) 단계는 결정화를 촉진시키기에는 불충분한 것으로 밝혀져 있다. 또한, 특정 결정화 부형제(예를 들어, 알라닌 및 염화 나트륨)의 존재가 부형제의 결정화를 억제하거나 감소시킬 수 있어, 결정화 정도도 또한 제한하는 것으로 제시되어 있다.

수성 약제학적 제형을 동결건조하기 위하여 몇 개 시도가 행하여 졌지만, 효과적인 동결건조 방법 및 그로부터 제조된 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다.

발명의 요약

일 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 제1 기간 동안 상기 조성물을 제1 온도에 노출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 AT III, NaCl, 및 알라닌을 포함하는 액체 조성물을 동결건조하는 방법을 제공한다. 이 방법은,

(a) 완전히 또는 거의 완전히 결정화된 하나 이상의 성분을 갖는 제1 조성물을 제공하기 위하여 상기 조성물의 온도가 약 5 시간 이상 동안 약 48℃ 이하이도록 상기 조성물을 약 54℃ 이하에 노출하는 단계; 및

(b) 상기 제1 조성물을 건조시켜 동결건조된 케이크를 얻는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조된 동결건조된 케이크를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 제조된 하나 이상의 조성물 및/또는 동결건조된 케이크를 포함하는 키트를 제공한다.

도 1. NaCl 용액(0.15M)을 냉동 및 가온하는 동안의 DSC 써모그램.
도 2. 알라닌 용액(0.1M)을 냉동(A) 및 가온(B)하는 동안의 DSC 써모그램.
도 3. 재구성된 AT III를 냉동(A) 및 가온(B)하는 동안의 DSC 써모그램.
도 4. DOE 분석에 의해 제공된 최적 결정화 조건.
도 5. A. ETP-5807 주기에 의해 냉동 및 어닐링하는 동안의 열용량(heat capacity)(Cp) 변화. B. 제1 냉동하는 동안 Cp 변화. C. 어닐링하는 동안 Cp 변화. D. 제2 냉동하는 동안 Cp 변화.
도 6. ETP-5807 주기에 의한 온도에 따른 열류(heat flow) 변화. 용융 피크에 대한 융해열은 5.5 J/g로 결정되었다.
도 7. A. 냉동 유지 시간을 5 시간까지 연장하는 것에 의해 냉동 및 어닐링하는 동안 Cp 변화. B. 제1 냉동하는 동안 Cp 변화. C. -52℃에서부터 -30℃까지 가온 램프(warming ramp)동안 Cp 변화. D. 어닐링하는 동안 Cp 변화. E. 제2 냉동하는 동안 Cp 변화.
도 8. 냉동 유지 시간을 2 시간에서부터 5 시간까지 연장하는 것에 의해 온도에 따른 열류 변화. 용융 피크에 대한 융해열은 6.4 J/g로 결정되었다.
도 9. Lyostar II FTS 유닛에서 실시된 ETP-5807 주기에 의한 AT III 동결건조 프로파일(profile).
도 10. FTS 유닛에서 ETP-5807 주기에 의해 냉동하는 동안 생성물 온도 데이터.
도 11. -54℃에서 2시간 동안 냉동될 때 AT III 동결건조 프로파일.
도 12. -54℃에서 2시간 동안 냉동될 때 생성물 온도 데이터.
도 13. FTS 유닛 중 -54℃에서 6시간 동안 냉동될 때 AT III 동결건조 프로파일.
도 14. FTS 유닛 중 -54℃에서 6시간 동안 냉동될 때 생성물 온도 데이터.
도 15. FTS 유닛 중 -50℃에서 6시간 동안 냉동될 때 AT III 동결건조 프로파일.
도 16. FTS 유닛 중 -50℃에서 6시간 동안 냉동될 때 생성물 온도 데이터.
도 17. Usifroid 중 -60℃에서 6시간 동안 냉동될 때 AT III 동결건조 프로파일.
도 18. ATIII가 Usifroid 중 -60℃에서 6시간 동안 냉동될 때 생성물 온도 데이터.
도 19. -52℃에서 15시간 동안 냉동될 때 AT III 동결건조 프로파일.
도 20. -52℃에서 15시간 동안 냉동될 때 생성물 온도 데이터.
도 21. 케이크의 주사전자 현미경사진(200 x 배율). 스케일 바(scale bars)는 100 ㎛이다. A: 붕괴된 케이크. B: 고체 케이크.
도 22. NaCl의 주사전자 현미경사진. 좌측에서 200 x 배율 및 우측에서 1500x 배율. 스케일 바는 100 ㎛ (A) 및 10 ㎛ (B)이다.
도 23. 알라닌의 주사전자 현미경사진. 좌측에서 50 x 배율 및 우측에서 200 x 배율. 스케일 바는 500 ㎛ (A) 및 100 ㎛ (B)이다.
도 24. NaCl, 알라닌, ETP 5807(붕괴된 케이크), 및 ETP 5807의 2회째 시험으로 얻은 물질(고체 케이크)에 대하여 회절분석기를 이용한 분말 X-선 회절(XRD) 패턴.

발명의 상세한 설명

본 발명은 건조 이전의 단일 저온 냉동 단계가 활성 성분을 포함하는 제형 중의 결정성 부형제의 결정화를 유도하기에 충분하다는 예상치 못한 발견을 제공하므로, 본 발명의 방법은 강력한 부형제 결정화를 제공하는 한편 더욱 효율적이고, 실제적이며 및/또는 강력한 동결건조 수법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이전의 방법에 비하여 결정성 증량제(bulking agent)의 증가를 허용하는 한편, 제형에 존재하는 활성 성분의 안정성 및 활성을 유지한다.

일 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 제1 기간 동안 상기 조성물을 제1 온도에 노출하는 것을 포함한다.

상기 조성물은 액체 또는 반-액체 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 수성 약제학적 용액 또는 현탁액일 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 조성물은 액체 제형, 바람직하게는 수용액일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 약제학적 용도에 적합하며, 예를 들어 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이다.

일 실시양태에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 활성 성분, 적어도 하나의 결정화 부형제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리학적으로 혼화성(physiologically compatible)인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅 등을 포함한다. 담체의 유형은 목적하는 투여 경로를 기초로 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 담체는 비제한적으로 정맥, 흡입, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절강내, 기관지내, 복강내(intraabdominal), 관절내인대, 연골내, 강내, 복내, 소내뇌, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위장내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막공간내, 복강내(intraperitoneal), 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활액내, 흉관내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질내, 직장, 볼내, 설하, 코내, 또는 경피 수단에 의해 투여하기에 적합하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 멸균 수용액 또는 멸균 주사성 용액 또는 분산액을 제조하기 위한 분산액을 포함한다.

활성 성분

일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 활성 성분은 비제한적으로 단백질, 핵산, 및 그의 조합을 비롯한 임의 활성 성분일 수 있다. 단백질은 비제한적으로 당단백질(예를 들어 ATIII), 응고인자, 성장인자, 사이토카인, 항체, 및 키메라 작제물(chimeric construct)을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "단백질"은 광범위한 것으로 의미하며 또 개별적 또는 집합적 천연 인간 또는 다른 포유동물 단백질; 및/또는 단일 또는 복수의 유전자 산물로부터 생기는 폴리펩티드의 균질 분포 또는 비균질 분포; 및/또는 특정 활성을 나타내는 단백질의 단편; 및/또는 트랜스제닉(transgenic) 기술을 비롯한 재조합 수법에 의해 생성된 단백질 및/또는 그의 활성 단편을 지칭한다.

일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 활성 성분은 단백질이다. 일 실시양태에서, 상기 단백질은 AT III이다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 오직 1개의 활성 성분을 포함하며, 상기 활성 성분은 AT III이다. 다른 실시양태에서, 상기 AT III는 조성물 중의 유일한 활성 성분이지만, 상기 조성물은 비-AT III 단백질 및/또는 AT III의 불활성 형태를 비롯한 다른 단백질을 포함한다. 예를 들어, 기능적 AT III는 조성물의 총 단백질 함량의 %일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "AT III"는 특별히 다르게 나타내지 않는 한 광범위하게 의도된다. 예를 들어, 이 용어는 AT III의 모든 천연 산출 다형태(polymorphs)를 지칭한다. 이 용어는 또한 AT III의 기능적 단편, AT III를 포함하는 키메라 단백질 또는 그의 기능적 단편, AT III의 하나 이상의 아미노산의 유사 치환에 의해 얻은 상동체(homologs), 및 종 상동체를 포함한다. 이 용어는 또한 트랜스제닉 기술의 생성물인 AT III를 포함하는 재조합 DNA 기술의 생성물인 모든 AT III 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, AT III를 코딩하는 유전자는, 예를 들어 단백질성 화합물을 생산하는 방법을 시사하기 위하여 참조에 의해 본 명세서에 포함되어 있는 미국 특허번호 제5,322,775호에 기재된 바와 같이, DNA 서열이 유선(mammary gland)에서 발현되도록 유즙 단백질을 코딩하는 포유동물 유전자에 삽입될 수 있다. 이 용어는 또한 예를 들어, 고체-상 펩티드 합성과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성된 모든 AT III 단백질을 지칭한다. 이 용어는 또한 혈장으로부터 제조된 AT III를 지칭한다. 이 용어는 또한 상업적으로 수득될 수 있는 AT III를 지칭한다. 상기 AT III는 인간 또는 비-인간 AT III에 상응할 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 AT III는 혈장 유래 AT III이다. 다른 실시양태에서, 상기 AT III는 혈장 분획 페이스트로부터 제조된다. 다른 실시양태에서, 상기 AT III는 알부민-제거된 혈장 분획 또는 예비정제된 AT III 제제 분획으로부터 제조된다. 테놀드에게 허여된 미국 특허번호 제5,561,115호는 혈청 또는 혈장으로부터 AT III를 제조하는 방법을 시사하기 위하여 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

다른 실시양태에서, 상기 AT III는 재조합 AT III이다. 재조합 AT III를 비롯한 재조합 단백질의 제조는 예를 들어, 미국 특허번호 제4,517,294호, 제4,632,981호, 제4,873,316호, 제5,420,252호, 제5,618,713호, 제5,700,663호, 제5,843,705호, 제6,441,145호, 제6,878,813호, 제7,019,193호, Fan et al., JBC, 268:17588 (1993), Garone et al ., Biochemistry, 35:8881 (1996), 국제특허 공개번호 WO02/02793호; 미국 공개번호 US2003/096974호 및 US2006/0024793호, 및 Gillespie et al ., JBC, 266:3995 (1991)에 기재되어 있고, 이들 문헌 각각은 재조합 AT III를 비롯한 재조합 단백질의 제조를 시사하기 위하여 참조에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.

일 실시양태에서, 상기 조성물은 90%를 초과하는 순도를 갖는 AT III를 포함하는 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 상기 AT III는 95% 초과, 바람직하게는 적어도 약 99%의 순도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 중의 모든 AT III의 적어도 약 50%, 예시적으로, 약 50% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 80%가 활성 AT III이다.

다른 실시양태에서, 동결건조될 상기 조성물은 적어도 약 0.1 mg/ml AT III, 예시적으로, 약 0.1 내지 약 100 mg/ml, 약 0.5 내지 약 50 mg/ml, 약 1 내지 약 30 mg/ml, 및 약 5 내지 약 15 mg/ml의 AT III를 포함하며, 상기 AT III는 조성물 내에 존재하는 총 단백질의 분획 또는 전부이다.

일 실시양태에서, 상기 조성물은 치료 유효량(therapeutically effective amount)의 AT III를 포함한다. "치료 유효량"은 예를 들어 유전적 안티트롬빈 결핍과 관련된 항응집과 같은 소망하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서 유효량을 지칭한다. 치료 유효량의 AT III는 개별 검체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 검체에서 소망하는 반응을 유발하는 AT III의 능력에 따라서 달라질 수 있다. 치료 유효량은 치료적으로 유리한 효과가 AT III의 독성 효과 또는 유해 효과를 상회하는 양일 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 조성물은 예방 유효량(prophylactically effective amount)의 AT III를 포함한다. "예방 유효량"은 예를 들어 다수의 혈전색전성 에피소드(thromboembolic episode)를 갖는 검체 또는 추가의 에피소드의 우려가 있는 검체에서 혈전색전성 에피소드를 예방 또는 억제하는 것과 같이 소망하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량과 기간 동안에서 유효량을 지칭한다. 예방 유효량은 상기 치료 유효량에 대하여 상기 기재한 바와 같이 결정될 수 있다.

결정화 부형제

일 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 결정화 부형제는 알라닌, 만니톨, 글리신, 및 NaCl로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 결정화 부형제는 적어도 약 0.01% (w/v), 예시적으로, 약 0.01% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 5%, 및 약 0.7% 내지 약 1.8% (w/v)의 총 결정화 부형제 양으로 조성물 내에 존재한다.

다른 실시양태에서, 상기 동결건조된 생성물은 적어도 약 20% (w/v)의 총 결정화 부형제, 예시적으로, 약 20 내지 약 80%, 약 30 내지 약 70 %, 및 약 36 내지 약 60% (w/v)의 총 결정화 부형제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 결정화 부형제는 알라닌 및 NaCl이다. 일 실시양태에서, 상기 NaCl은 약 50 mM 내지 약 300 mM, 바람직하게는 약 100 mM 내지 약 250 mM의 양으로 존재한다. 일 실시양태에서, 염화 나트륨 자체는 상술한 결정화 부형제 없이 사용될 수 있고, 이 경우 제형 내에 약 300 mM 이상의 양으로 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물(예를 들어, 수성 약제학적 제형)은 고장성(hypertonic) 용액이다.

적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제 이외에, 상기 조성물은 하나 이상의 다른 부형제, 즉 상기 조성물을 구성하는 활성 성분과 함께 사용되는 하나 이상의 다른 물질을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 다른 부형제의 일부 비제한적인 예는 안정화제, 완충제, 2가 양이온(예를 들어, 칼슘 염), 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제, 착색제, 향미제, 활택제(glidant), 계면활성제, 흡수제, 및 감미제를 포함한다.

본 발명에 따른 활성 성분과 부형제의 조합은 동결건조된 제제 중의 활성성분의 안정성을 제공할 수 있다; 그러나, 본 발명의 상기 조성물은 액체 또는 반-액체 상태에서도 어느 정도의 안정성을 나타낼 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 조성물은 안정화제를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 안정화제는 수크로오스, 만니톨, 및 트레할로오스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 동결건조 전에, 상기 안정화제는 적어도 약 1%, 예시적으로, 약 1% 내지 약 4% 및 약 2% 내지 약 3%의 총 안정화제 양으로 조성물 내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 안정화제는 약 2%의 양으로 조성물 내에 존재한다.

특히 동결건조되는 동안 pH 변동에 의해 활성 성분이 나쁜 영향을 받기 쉬운 본 발명의 조성물에는 완충액이 또한 존재할 수 있다. 상기 pH는 동결 건조되는 동안 바람직하게는 약 6 내지 8 범위, 더욱 바람직하게는 약 pH 7에서 유지되어야 한다. 상기 완충제는 비제한적으로 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 시트르산/포스페이트 완충액, 히스티딘, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄(트리스), 1,3-비스-[트리스-(히드록시메틸)메틸아미노]-프로판(비스-트리스프로판), 피페라진-N,N'-비스-(2-에탄설폰산)(PIPES), 3-{N-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS), N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES), 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산(MES), 및 N-2-아세트아미도-2-아미노에탄설폰산(ACES)을 비롯한 완충액으로 작용하는 능력을 갖는 임의의 생리학적으로 허용되는 화학 성분 또는 화학 성분의 조합일 수 있다.

일 실시양태에서, 상기 완충제는 약 10 내지 약 50 mM의 농도로 조성물에 포함된다. 히스티딘이 조성물에 부가되면, 적어도 약 20 mM, 바람직하게는 약 25 mM의 농도가 단독으로 또는 트리스와 같은 다른 완충액과 조합되어 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 조성물은 2가 양이온, 예를 들어 칼슘 염을 더 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 칼슘 염은 약 1 mM 내지 약 5 mM의 양으로 존재한다.

일 실시양태에서, 상기 조성물은 계면활성제를 더 포함한다. 상기 계면활성제는 약 0.1% 이하의 양으로 존재할 수 있다. 계면활성제의 비제한적인 예는 POLYSORBATE 20(예를 들어, TWEEN®20), POLYSORBATE 80(예를 들어, TWEEN® 80), 폴리옥시에틸렌(80) 소르비탄 지방산 에스테르, 플루로닉(pluronic) 폴리올(예를 들어, F-38, F-68), 및 폴리옥시에틸렌글리콜 도데실 에테르(예를 들어, Brij-35)를 포함한다.

본 발명에 따르면, 상기 조성물은 또한 항산화제를 더 포함한다. 상기 항산화제는 적어도 0.05 mg/ml, 예시적으로, 약 0.05 내지 약 50 mg/ml, 약 0.1 내지 약 10 mg/ml, 및 약 1 내지 약 5 mg/ml의 총 양으로 조성물 내에 존재할 수 있다. 항산화제의 비제한적인 예는 N-아세틸-L-시스테인/호모시스테인, 글루타치온, 6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복시산(Trolox), 리포산, 메티오닌, 티오황산 나트륨, 백금, 글리신-글리신-히스티딘(트리펩티드), 및 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 약 0.05 mg/ml 내지 약 5 mg/ml 양으로 글루타치온을 더 포함한다.

본 발명의 조성물은 양이온이 그의 활성을 유지하기 위해 활성 성분과 상호작용을 제공하는 경우 칼슘 또는 다른 2가 양이온을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 조성물은 2가 양이온을 더 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 2가 양이온은 칼슘 염, 예를 들어 염화칼슘으로서 제공될 뿐만 아니라 글루콘산 칼슘, 칼슘 글루비오네이트(calcium glubionate), 또는 칼슘 글루셉테이트(calcium gluceptate)와 같은 다른 칼슘 염일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 칼슘 염은 약 1 mM 내지 약 5 mM의 양으로 존재한다.다른 실시양태에서, 상기 칼슘 염은 약 3 mM 내지 약 4 mM, 바람직하게는 약 4mM의 양으로 존재한다.

일부 실시양태에서, 히스티딘 및 글루타치온의 조합은 조성물에 존재하는 특정 활성 성분의 안정성에 대하여 상승작용적으로 유리한 효과를 생성할 수 있다. 예를 들어, 히스티딘은 완충액으로 작용하는 한편, 금속 킬레이터로서도 작용할 수 있다. 활성 성분의 활성 정도가 금속-유도된 산화에 의해 영향을 받을 것으로 믿어지는 정도에 대하여, 예를 들어, 히스티딘은 금속 이온을 산화시키는 것에 의해 결합을 안정화시키는 작용을 할 수 있다. 이들 금속을 결합시키는 것에 의해, 상기 글루타치온(또는 임의의 존재할 수 있는 다른 항산화제)은 항산화 보호를 더 제공할 수 있을 것으로 생각되며, 이는 히스티딘에 의해 결합된 금속 이온의 산화 효과가 함유되어 있기 때문이다. 다른 킬레이트제가 본 발명의 조성물/제형에 또한 포함될 수 있다. 이러한 킬레이트제는 예를 들어 칼슘 염이 조성물에 사용되는 경우와 같이 칼슘에 비하여 더 큰 친화성을 갖는 구리 및 철과 같은 금속을 바람직하게 결합한다. 이러한 킬레이터의 일례는 Al⁺⁺ 및 철의 제거를 용이하게 하는 킬레이트제인 데페록사민이다.

동결건조

일반적으로, 동결건조 방법의 특정 온도 및/또는 온도 범위는 다르게 나타내지 않는 한, 동결건조 장치의 선반 온도(shelf temperature)를 지칭한다. 상기 선반 온도는 동결건조하는 동안 온도 측면에서 전형적으로 제어하는 동결건조기의 선반을 유동 통과하는 냉각제의 제어 온도를 지칭한다. 샘플의 온도(즉, 생성물 온도)는 선반 온도, 챔버 압력 및/또는 일차 건조하는 동안 증발/승화 속도(증발성 냉각은 생성물 온도를 선반 온도보다 낮게 만든다)에 따라 달라진다.

A. 냉동

일 실시양태에서, 상기 제1 온도는 약 -48℃ 이하이다. 다른 실시양태에서, 상기 제1 온도는 약 -54℃ 이하이다. 다른 실시양태에서, 상기 기간은 적어도 약 30분, 예시적으로, 약 30분 내지 약 20시간, 약 1 내지 약 18시간, 약 2 내지 약 16시간, 약 3 내지 약 14시간, 약 4 내지 약 10시간, 약 5 내지 약 8시간, 및 약 6 내지 약 7시간이다. 일 실시양태에서, 상기 기간은 약 6시간이다.

상기 온도 및 기간은 동결건조될 조성물과 독립적으로 바이얼당 용액의 부피와 같은 인자에 의존할 수 있다.

본 발명은 때때로 완전한 또는 100% 부형제 결정화하는 목적을 지칭하며 또 당업자는 "완전히 결정화"라는 것은 부형제가 완전히 또는 100% 결정화되는 절대 확실성으로 기술의 감도 정보를 제공하지 못하는 경우 입증하기가 어려울 수 있음을 이해하고 있다. 따라서, 실질적인 용어로, 본 발명은 종래 방법에 비하여 부형제 결정화를 적어도 향상시키는 동결건조 방법을 제공한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "완전히 결정화된" 생성물은 예를 들어 미분주사열량계(DSC)에 의해 평가될 수 있으며, 당업자는 첫 스캔에서 비가역적 발열이 결정화를 나타내며, 이는 동결건조하는 동안 결정화 부형제가 완전히 결정화되지 않았음을 나타내는 것을 인식하고 있다. 일부 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 결정화 부형제는 부분적으로 결정화되며, 부분적으로 결정화된 것은 약 50% 이상, 예시적으로, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 적어도 약 99.8%, 및 100% 미만의 결정화도를 특징으로 한다.

B. 어닐링

다른 실시양태에서, 상기 방법은 상기 제1 조성물을 제2 기간 동안 제2 온도에 노출하여 제2 조성물을 얻는 단계를 더 포함하며, 상기 제2 온도는 제1 온도를 초과하는 것이다.

일 실시양태에서, 상기 제2 온도는 제1 온도를 적어도 약 5℃ 초과, 예시적으로, 제1 온도를 약 5℃ 내지 약 30℃ 및 약 10℃ 내지 약 20℃ 초과한다. 예를 들어, 상기 제1 온도가 약 -50℃이면, 일부 실시양태에서, 상기 제2 온도는 약 -30℃이다.

일부 실시양태에서, 상기 제2 기간은 적어도 10분, 예시적으로, 약 10분 내지 약 10 시간, 약 30분 내지 약 8시간, 약 1시간 내지 약 6시간, 및 약 2시간 내지 약 4시간이다. 다른 실시양태에서, 상기 제2 기간은 상기 제1 기간 미만, 초과이거나 또는 그와 거의 동일하다.

특정 이론에 얽매이지 않고, 이러한 어닐링 단계는, 조건 및 특정 조성물에 따라서, 승화 속도를 향상시키거나 및/또는 뱃치내 이질성을 감소시키는데 도움을 줄 수 있는 것으로 믿어진다.

일부 실시양태에서, 어닐링 단계는 선택적일 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 제2 기간 이후, 상기 제2 조성물은 제3 기간 동안 제3 온도에 노출되며, 상기 제3 온도는 상기 제2 온도 미만이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 제3 온도는 상기 제1 온도와 거의 동일하다. 다른 실시양태에서, 상기 제3 온도는 상기 제2 온도보다 적어도 5℃ 미만, 예시적으로, 상기 제2 온도보다 약 5℃ 내지 약 30℃ 및 약 10℃ 내지 약 20℃ 미만일 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 온도가 약 -30℃이면, 일부 실시양태에서, 상기 제2 온도는 약 -50℃이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법을 제공한다. 이 방법은,

(a) 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 제1 기간 동안 상기 조성물을 제1 온도에 노출하는 단계;

(b) 상기 제1 조성물을 제2 기간 동안 제2 온도에 노출하여 제2 조성물을 얻는 단계, 이때 상기 제2 온도는 상기 제1 온도를 초과하며; 및

(c) 상기 제2 조성물을 제3 기간 동안 제3 온도에 노출하여 제3 조성물을 얻는 단계를 포함하며, 이때 상기 제3 온도는 상기 제2 온도 미만이다.

일 실시양태에서, 상기 기간은 적어도 약 30분, 예시적으로, 약 30분 내지 약 20시간, 약 1 내지 약 18시간, 약 2 내지 약 16시간, 약 3 내지 약 14시간, 약 4 내지 약 10시간, 약 5 내지 약 8시간, 및 약 6 내지 약 7시간이다. 다른 실시양태에서, 상기 기간은 약 6시간이다. 다른 실시양태에서, 상기 기간은 약 3시간이다. 다른 실시양태에서, 상기 제3 기간은 제1 기간 미만, 초과이거나 또는 그와 거의 동일하다. 더 다른 실시양태에서, 단계 (a) 및 (b)에서 조건(예를 들어, 온도 및 시간)은 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다.

C. 건조

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 건조 단계를 더 포함한다. 상기 건조 단계는 일차 건조 단계 및 이차 건조 단계를 포함할 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법을 제공한다. 이 방법은,

(a) 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 제1 기간 동안 상기 조성물을 제1 온도에 노출하는 단계; 및

(b) 상기 제1 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 형성하는 단계를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성 성분 및 적어도 하나의 결정화 부형제를 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법으로서,

(b) 상기 제1 조성물을 제2 기간 동안 제2 온도에 노출하여 제2 조성물을 얻는 단계, 이때 상기 제2 온도는 제1 온도를 초과하며;

(c) 상기 제2 조성물을 제3 기간 동안 제3 온도에 노출하여 제3 조성물을 얻는 단계, 이때 상기 제3 온도는 상기 제2 온도 미만이고; 및

(d) 상기 제3 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 동결건조하는 방법을 제공한다.

일 실시양태에서, 건조는 일차 건조 단계를 포함한다. 이 일차 건조는 냉동된 물을 제거(얼음의 승화)할 수 있다. 바람직하게는, 결합되지 않은 또는 용이하게 제거가능한 얼음은 일차 건조에 의해 샘플로부터 제거된다. 일차 건조 단계의 초기에 있는 결합되지 않은 물은 바람직하게는 유리 얼음 형태일 수 있어, 승화에 의해 제거될 수 있으며, 즉 얼음을 고체에서부터 직접 증기로 전환할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 일차 건조 단계는 약 -35℃ 내지 약 20℃, 또는 약 -25℃ 내지 약 10℃, 또는 약 -20℃ 내지 약 0℃의 온도에서 실시될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 일차 건조 단계는 약 0℃에서 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 일차 건조 단계는 적어도 약 1시간, 예시적으로, 약 1시간 내지 약 1주, 약 10시간 내지 약 4일, 및 약 20시간 내지 약 40시간의 합계 시간 동안 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 일차 건조 단계는 상기 제1 또는 제3 조성물을 약 0 내지 약 200 mTorr, 바람직하게는 약 100 mTorr의 압력하, 약 -50℃의 온도에서 약 1시간, 이어 0℃에서 약 35시간 동안 건조하는 단계를 포함한다.

임의의 "일차 건조 램프" 단계 (즉, 일차 건조 온도로 일차 건조하기 전의 단계로부터 온도의 증가)는 분당 약 0.1℃ 내지 약 10℃의 속도로 본 발명의 방법에 따라서 실시될 수 있다.

상기 일차 건조 단계는 냉동 수의 실질적으로 전부가 샘플로부터 확실하게 제거되도록 하기에 충분한 시간 동안 실시될 수 있다. 당업자는 상기 일차 건조 시간은 일차 건조 기간이 충전 부피 및 기하(케이크의 표면적-내성/플럭스)에 따라서 달라질 수 있는 점에서 형태에 따라 다양한 것을 이해하고 있다. 일 실시양태에서, 일차 건조 기간은 적어도 약 5시간, 예시적으로, 약 5시간 내지 약 100시간, 약 10시간 내지 약 80시간, 약 30시간 내지 약 60시간, 및 약 40 내지 약 50시간이다.

일차 건조는 냉동-건조하는 동안 생성물 온도에서 변화를 관찰하는 것을 포함하는 다수의 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 다른 방법은 챔버 압력에서 변화를 관찰하는 것으로, 승화가 끝나면, 압력 변화에 관여하는 물 분자가 더 이상 챔버에 존재하지 않는다. 일차 건조 단계의 끝은, 예를 들어 승화 속도 감소에 기인한 생성물 온도 추적 슬로프에서 현저한 변화에 의해 분명한 바와 같이, 생성물(샘플) 온도가 선반 온도에 도달하는 때인 것으로 결정될 수 있다; 승화가 끝나면, 증발성 냉각이 끝난다. 너무 이른 종료를 방지하기 위하여, 일부 실시양태에서는, 상기 기간에 2 내지 3시간의 일차 건조를 더 부가할 수 있다. 일차 건조의 종료를 모니터링하는 다른 방법은 압력 상승 시험으로서, 진공 공급원을 빼내는 것에 의해 챔버 압력은 생성물 중의 수분의 양에 따른 속도로 증가해야 한다. 일 실시양태에서, 일차 건조 방법의 종료는 압력 상승 속도가 특정 값 아래일 때로 설정될 수 있다. 일차 건조 단계의 종료를 결정하는 다른 방법은 열전달 속도의 측정이다.

다른 실시양태에서, 일차 건조 직전에, 상기 조성물은 이차 건조 직전의 단계의 온도에서 진공하에 방치될 수 있다. 일단 개시되면, 진공은 진공의 수준이 변화될 수 있지만, 동결건조 공정의 나머지 동안 존재할 수 있다.

동결건조하는 동안 건조에 대한 다른 정보는 Carpenter, J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of Protein Pharmaceuticals, Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. Wu, eds. (Buffalo Grove, IL Interpharm Press, Inc.) (1996)에서 찾아 볼 수 있으며, 이 문헌은 건조를 시사하기 위하여 참조에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.

일 실시양태에서, 건조는 수분 양을 바람직하게는 최종 생성물의 소망하는 생물학적 및/또는 구조적 특징을 제공하는 수준으로 감소시키기 위하여 하나 이상의 이차 건조 단계를 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 이차 건조 단계의 각각은 약 0℃ 이상, 예시적으로, 약 0℃ 내지 약 100℃, 약 10℃ 내지 약 90℃, 약 20℃ 내지 약 80℃, 약 30℃ 내지 약 70℃, 약 40℃ 내지 약 60℃, 및 약 45℃ 내지 약 50℃인 온도에서 실시된다. 일 실시양태에서, 상기 이차 건조 단계는 약 40℃, 약 45℃, 및 약 50℃에서 각각 실시된 제1, 제2 및 제3의 이차 건조 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 이차 건조 단계는 약 16시간의 기간 동안 약 35℃의 온도를 포함한다.

온도를 하나 이상의 이차 건조 단계로 증가시키는 단계는 "이차 건조 램프"로 칭하며, 이는 선택적일 수 있다. 이차 건조 램프는 분당 약 0.1℃ 내지 약 10℃의 온도 증가 속도로 실시될 수 있다.

하나 이상의 이차 건조 단계의 각각은 동결건조된 생성물에서 잔류 수분 양을 최종 수준으로 감소하기에 충분한 시간 동안 실시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최종 잔류 수분 양은 약 10% 이하, 예시적으로, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.8% 이하, 약 0.6% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.2% 이하, 및 약 0.1% 이하이다.

일 실시양태에서, 상기 이차 건조 단계는 약 35℃에서 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 이차 건조 단계는 적어도 약 1시간, 예시적으로, 약 1시간 내지 약 1주, 약 10시간 내지 약 4일, 및 약 16시간 내지 약 40시간의 합계 시간 동안 실시될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 이차 건조 단계는 약 0 내지 약 200 mTorr, 바람직하게는 약 100 mTorr의 압력하, 약 35℃의 온도에서 약 16시간 동안 건조하는 단계를 포함한다.

샘플 중의 잔류 수분 양을 결정하기 위하여 예를 들어 칼 피셔(Karl Fischer) 방법이 이용될 수 있다. 또한, 상기 압력 상승 시험 또는 열 전달 속도의 측정은 하나 이상의 이차 건조 단계의 각각의 종료를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 다르게는, 전자습도계 또는 잔류 가스 분석기도 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 이차 건조 단계의 최소 기간은 선반 온도(하나 이상의 이차 건조 단계의 선반 온도는 고온 단계에 사용된 온도와 동일하거나 그 미만이다) 및 기간의 상이한 조합을 이용하여 결정될 수 있다. 잔류 수분 함량은 건조감량, 칼 피셔 적정, 열중량 분석(TGA), 가스 크로마토그래피(GC), 또는 적외선 분광을 비롯한 몇 개 방법에 의해 측정될 수 있다.

특정 이론에 얽매이지 않고, 동결건조 동안, 상기 활성 성분은 수성 상으로부터 비정질 고체 상으로 전환되어, 화학적 및/또는 형태학적 불안정성으로부터 활성성분을 보호하는 것으로 생각된다. 동결건조된 제제는 비정질 상을 함유할 뿐만 아니라 동결건조 동안 결정화되는 성분을 포함한다. 이는 활성 성분의 동결건조 및 더 명확한 케이크의 형성을 제공할 수 있다(예를 들어, 동결건조되는 용기의 측면으로부터 최소로 수축되는 케이크).

일 실시양태에서, 상기 동결건조된 케이크는 50% 미만 붕괴(collapsed)되는 것을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 상기 동결건조된 케이크는 약 0% 내지 약 24% 붕괴되는 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 AT III를 포함하는 수성 약제학적 제형을 동결건조하는 방법으로서,

(a) 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 기간 동안 상기 제형을 약 -45℃ 미만의 온도에 노출하는 단계; 및

(b) 상기 제1 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 수성 약제학적 제형을 동결건조하는 방법을 제공한다.

(a) 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 기간 동안 상기 제형을 약 -50℃ 미만의 냉동 온도에 노출하는 단계; 및

(b) 상기 제1 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 수성 약제학적 제형을 동결건조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 경우에 따라, 제형이 냉동 온도를 초과하는 어닐링 온도에 노출되는 어닐링 단계를 더 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 AT III를 포함하는 수성 약제학적 제형을 동결건조 하는 방법으로서,

(a) 부분적으로 또는 완전히 결정화된 적어도 하나의 결정화 부형제를 갖는 제1 조성물을 얻기에 충분한 기간 동안 상기 제형을 약 -60℃ 미만의 온도에 노출하는 단계; 및

(b) 상기 제1 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 수성 약제학적 제형을 동결건조 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 조성물(예를 들어, 결정화된 및/또는 동결건조된 약제학적 조성물 및 케이크)이 또한 제공된다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 동결건조된 ATIII 조성물 또는 케이크를 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 동결건조된 생성물을 저장한 후에도 활성 성분(들)의 효능을 적어도 유지하거나 또는 실질적으로 유지하는 생성물을 제공한다. 일 실시양태에서, 상기 활성 성분(들)의 효능은 약 5℃, 약 25℃, 또는 약 40℃에서 약 1, 약 2, 약 3, 또는 약 6 개월 이상 동안 동결건조 생성물을 저장한 후 유지되거나 또는 실질적으로 유지된다. 다른 실시양태에서, 동결건조된 생성물을 저장한 후, 활성 성분의 효능은 예비-동결건조 효능에 비하여 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 및 100%이다.

키트

더 다른 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공되며, 상기 키트는 건조 성분 및 액체 성분을 더 포함하며, 상기 건조 성분은 제1 용기에 존재하고 또 액체 성분은 제2 용기에 존재하며 상기 용기들은 결합된 구조로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는 키트와 같이, 상기 건조 성분 및 액체 성분은 키트 내의 별개의 용기에 존재할 수 있거나, 또는 성분의 일부가 1개 용기 내에 조합될 수 있다. 경우에 따라, 상기 키트는 다수의 부가적인 시약을 더 포함할 수 있다. 경우에 따라, 상기 키트는 예를 들어 상기 동결건조된 조성물을 적절한 희석제를 사용하여 재구성하기 위한 지시서를 비롯하여 키트의 성분들을 사용하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 상기 지지서는 키트의 용기의 라벨링 또는 그의 성분에 팩키징 삽입물로서 키트에 존재할 수 있다.

본 발명은 실시예를 들어 더욱 자세하게 설명되지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아님을 명심해야 하다.

실시예

실시예 1

AT III 용액 중의 성분의 결정화를 증진시키고 또 완성된 생성물의 물리적 외관을 개량하기 위한 냉동 조건을 결정하기 위하여, 인간 혈장 유래 AT III(6.88 mg/ml), 알라닌(100 mM), 및 NaCl(150 mM)을 함유하는 AT III 제형 상에 대하여 동결건조를 실시하였다. 알라닌 및 NaCl 모두 결정성 부형제이다. 상기 제형의 경우, 물리적 외관은 부형제의 결정성과 직접적으로 연관될 수 있다. 케이크 구조를 지지하는 고체 매트릭스를 제공하기 위하여 NaCl 및 알라닌은 냉동 기간 동안 가능한한 완전하게 결정화하는 것이 바람직하다.

미분주사 열량계: AT III 제형의 냉동-열 해동은 미분주사 열량계(Model 2920, TA instruments, Inc., New Castle, DE)를 이용하여 조사하였다. DSC의 온도 및 셀 상수는 고순도 인듐을 사용한 표준 수법에 따라 검량하였다. 최대 냉동-농축 용질의 열류 및 열용량(Cp) 변화를 연구하기 위해 조절된(Modulated) DSC를 이용하였다. 0.5℃ 진폭으로 80초간 시험을 실시하였다. 20 마이크로리터의 샘플을 알루미늄 밀봉 팬에 밀봉시키고 또 0 아래 온도 범위를 통하여 스캔하였다.

NaCl, 알라닌 및 AT III 재구성된 용액에서 열적 특성: NaCl, 알라닌 및 AT III 재구성된 용액에서 결정화 및 용융 특성을 조사하였다.

E-CHIP에 의한 DSC 실험 디자인: 부형제의 결정화에 대한 냉동 온도, 냉동 유지 시간 및 어닐링 유지 시간의 효과를 평가하기 위하여 Echip에 의해 고안된 DOE를 실시하였다. 냉동(5℃에서 냉동 온도까지) 램프 속도는 2℃/분으로 설정하였다. 어닐링 후, 생성물을 -30℃로부터 5℃/분으로 냉동 온도까지 냉동하였다. 가온 램프 속도는 1℃/분으로 고정하였다.

결정화에 대한 램프 속도의 효과: 결정화에 대한 램프 속도의 효과를 조사하기 위하여 상이한 냉각 속도(2℃/분 대 0.2℃/분)를 비교하였다. 어닐링(5℃/분 대 0.2℃/분, 1℃/분 대 0.2℃/분) 동안 다양한 램프 속도를 또한 평가하였다.

응축된 상의 형성: 과냉각 과정 동안에, 액체 상에서는 얻을 수 있지만 결정성 고체 상에서는 얻을 수 없는 분자 형태 및 구조는 냉동되었다. 냉각하는 동안의 "트래핑(trapping)" 입체형태 및 배열의 과정은 점도 증가 속도가 분자의 재-배향 속도를 초과할 때 생긴다. 입체구조(conformational state)의 "내부 냉동"은 짧은 범위의 액체와 유사한 분자량 배열도를 가지고, 결정성 고체 PI의 긴 범위 분자 배열 특징이 결여된 응축된 상을 초래한다.

응축된 상의 형성은 조절된 DSC에 의해 관찰되며, 냉동-농축된 비정질 상의 열용량(Cp)은 균형이 도달할 때까지 연속적으로 감소하였다. Cp는 고유한 특성이며 또 분자 이동도와 직접적으로 관련되어 있다. Cp가 더 큰 것은 이동도가 더 크다는 것을 의미하고 또 Cp가 더 작은 것은 이동도가 더 작은 것을 의미한다. 액체 상태의 물질은 고체 상태의 물질에 비하여 Cp가 더 크다. Cp에서의 감소는 유체 상태에서부터 고체 상태로 물질의 물리적 변환에 기인한다.

Cp는 표 1에 나타낸 냉동 및 어닐링 수법을 이용하여 모니터링하였다.

1회째 시험(first run)하는 동안 AT III 동결건조 주기

단계	램프 시간 (시간)	선반 온도(℃)		유지 시간 (분)	압력 ( mTorr )
단계	표적	표적	범위	표적	표적	범위
로딩	N/A	5	±3	로딩이 완료될 때까지	대기압
냉동	N/A	5	±3	120	대기압
	150	-25	±3	60	대기압
	240	-52	±3	120	대기압
어닐링	90	-30	±3	60	대기압
어닐링	180	-52	±3	120	대기압
평가	압력이 제어될 때까지	-52	+3	60	100	+50
일차 건조	240	0	±3	1920	100	±50
이차 건조	180	35	±3	840	100	±50

상기 용액을 0℃에서부터 -52℃로 냉동하고 또 120분간 유지하였다. -30℃까지 가온한 다음 1시간 동안 유지하였다. 마지막으로, 생성물을 다시 2시간 더 -52℃로 냉동한 다음 0℃까지 가온하였다. 최초의 냉동 속도는 0.2℃/분이었다. Cp에 대한 냉동 유지 시간(2시간, 5시간 및 10 시간) 및 온도(-46℃, -48℃ 및 -52℃)의 효과를 평가하였다.

냉동-건조: 대부분의 실험은 Lyostar II FTS system(SP 인더스트리스 제조)에서 실시하였다. 일부는 미닐요(Minilyo) 냉동 건조기(Usifroid)에서 실시하였다. 냉동 수법은 하기 표 2에 수록한다.

냉동 수법.

수법	냉동 온도 (℃)	냉동 유지 시간 (시간)
1	-52	2
2	-54	2
3	-54	6
4	-50	6
5	-60	6
6	-52	15

수법 1 내지 5는 제1 냉동 단계 동안 선반 온도 및 유지 시간에서 다르다. 제2 냉동 온도는 제1 냉동 온도와 동일하게 설정하였다. 제2 냉동에 대한 유지 시간은 2 시간이었다. 수법 6은 생성물을 -52℃에서 2시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1시간 동안 어닐링하며 또 15시간 동안 -52℃로 다시 냉동하는 조건을 명시한다. 어닐링, 일차 및 제2 건조는 표 1에 수록된 모든 주기에 대해 동일하였다.

주사전자 현미경(SEM): 냉동-건조된 케이크의 형태를 조사하기 위하여 SEM(히타치 제조, Model S-3200, NCSU)을 이용하였다. 표면에서 또는 표면 아래에서 샘플의 영상은 50 내지 5000배 배율로 표시되었다. 냉동-건조된 케이크는 우수한 전기적 절연체이기 때문에, 이들은 전자 빔에 노출되면 충전(charged)되었다. 이것은 해상도 상실을 초래하였다. 전기 빔에 샘플이 노출될 때의 충전 효과를 감소시키기 위하여, 벤치 탑 덴톤 진공(bench top Denton Vacuum)을 이용하여 스퍼터링하는 것에 의해 금 박층을 모든 샘플에 코팅하였다. 붕괴된 케이크, 고체 케이크, NaCl 결정 및 알라닌 결정의 영상을 찍었다.

분말 X-선 회절: 분말 X-선 회절(XRD)은 붕괴된 케이크(ETP 5807) 및 고체 케이크 (ETP 5807 26N9540)의 결정화를 특징화하기 위하여 적용하였다. XRD 패턴은 40 kV 및 40 mA에서 구리 Ka 방사선을 갖는 회절장치(리가꾸 제조, 모델 Multiflex)를 이용하여 기록하였다. 10°내지 90°의 20 범위에서 스캔을 실시하였다. 스캔 속도는 NaCl 샘플의 경우 1°/분이었고 또 알라닌, ETP 5807의 경우 0.125°/분이었다.

결과 및 논의:

DSC 작업은 AT III 제형 중의 부형제의 결정화 특성, 결정화 온도(Tx), 공정 용융(eutectic melting) 온도(Te) 및 % 결정화를 지배하는 중요 인자를 특징화하는 것을 목적으로 하였다.

NaCl, 알라닌 및 AT III 용액의 결정화 및 용융: NaCl 니트(neat) 용액의 경우, 냉동하는 동안 약 -38℃에서 발열 결정화 피크가 생겼고 또 가온하는 동안 -19℃에서 흡열 용융 피크가 나타났다(도 1). 용융 피크에 대한 융해열은 7.4 J/g인 것으로 결정되었다. 알라닌 용액에 대한 써모그램은 냉동하는 동안 -45℃에서 발열 피크를 나타내었고, 이는 결정화를 지시한다. 그러나, 가온하는 동안, 약 -44℃에서 작은 그룹의 피크가 생겼다. 이들 피크의 기원은 결정하기 어려웠다(도 2).

재구성된 AT III 용액을 분석하면, 냉동하는 동안 어떠한 발열 활성의 증거도 관찰되지 않았다. 그러나, 공정 용융 피크는 NaCl로 인하여 -22℃에서 잘 보였다(도 3). 융해열(2.0 J/g)은 NaCl 니트 용액보다 더 작았다. 융해열에서 감소는 AT III 제형에서 NaCl의 부분적 결정화에 기인할 수 있었다. 이 상관관계를 기초로, % 결정화는 상기 제형들로부터 얻은 융해열을 NaCl 니트 용액에 대한 융해열인 상수 7.4 J/g로 나누는 것에 의해 산출하였다.

DOE 결과: 중심 복합 큐브 모델(cnetral composite cube model)을 이용하여 ECHIP에 의해 고안된 DOE는 AT III 용액의 결정화에 대한 냉동 온도, 냉동 유지 시간 및 어닐링 유지 시간의 효과를 평가하기 위하여 실시하였다(표 3).

결정화 특성.

시험	냉동 온도 (℃)	냉동 유지 시간 (시간)	어닐링 유지 시간 (시간)	NaCl 공정 용융 피크 면적 (J/g)	NaCl 결정화 % (%)
1	-44	5	5	0	0
2	-60	5	5	1.47	19.9
3	-52	0	5	0	0
4	-52	10	5	5.45	73.55
5	-52	5	0	2.81	37.99
6	-52	5	10	5.20	70.15
7	-60	10	10	4.30	58.05
8	-44	10	10	3.77	50.90
9	-60	0	10	0	0
10	-44	0	10	0	0
11	-60	10	0	2.01	27.12
12	-44	10	0	0.11	1.53
13	-60	0	0	0	0
14	-44	0	0	0	0
15	-52	5	5	4.12	55.58
16	-52	5	5	4.88	65.87
17	-52	5	5	4.62	62.39
18	-52	5	5	4.72	63.72
19	-52	5	5	4.89	65.98
NaCl				7.407	100

DOE로부터 얻은 결과는 평가된 모든 가변 조건이 용액의 결정화에 대하여 상당한 영향을 미치고 있음을 나타내었다. -52℃에서의 냉동은 -44℃ 및 -60℃ 온도에서의 냉동에 비교할 때 더 많은 %의 결정성 NaCl를 생성하였다. 더 저온(-60℃)에서 결정화의 감소는 결정성 및 결정화 속도 사이에서 균형에 의해 설명된다. 결정성은 저온에서 더 컸다. 그러나, 상기 용액은 점성이 강해서 결정화 속도는 현저히 감소되었다. DOE 데이터 분석은 -54℃에서 최적 냉동 온도를 나타내었다(도 4).

유지 시간의 평가는 냉동 유지 시간 및 어닐링 유지 시간의 연장이 % 결정화에서 증가를 초래함을 나타낸다. DOE 결과는 최적 유지 시간이 냉동 및 어닐링 모두에 대해 10시간이라는 것을 제시한다(도 4).

데이터 분석은 또한 적합성 결여(out-of-fit) 메시지를 생성하며, 이는 E-CHIP에 의해 생성된 모델이 결정화 공정을 충분히 반영하지 않을 수 있음을 나타낸다. 따라서, 냉동 및 어닐링 동안 결정화 공정에 수반되는 물리적 특성 변화를 더 잘 이해하도록 부가적 DSC 작업을 실시하였다.

결정화:냉각 속도에 대한 램프 속도의 효과: 가소제로서, 물은 물리적 희석제로서 작용하여 유리 체적 및 분자 이동도를 증가시킨다. 결정화와 같은 확산-제어된 공정을 촉진할 수 있는 분자 이동도를 증가시키는 것이 물의 능력이다. 신속한 냉각은 비정질 상 내에 더 많은 물을 취득하는 반면에, 느린 냉각은 계 밖으로 물이 흘러나가게 한다. 따라서, 신속한 냉각은 결정의 형성을 촉진한다. 냉동 속도가 2℃/분에서부터 0.2℃/분으로 감소되면, NaCl % 결정화는 82% 감소하였다(17%에서 3%로).

어닐링 동안 램프 속도: 냉동으로부터 더 가온으로 향할 때, 분자 이동도도 핵생성 및 결정화가 생길 정도로 증가한다. 이 단계에서 램프 속도는 충분한 결정을 생성할 만큼 충분하게 느려야 한다. 1℃에서부터 0.2℃/분으로 램프 속도를 감소시키면 % 결정화를 38%에서부터 95%로 증가시켰다. 또한 0.1℃/분까지 램프 속도가 감소하는 것은 많은 차이를 나타내지 않았다.

-30℃에서부터 -52℃로 향해짐에 따라서, 5℃/분에서부터 0.2℃/분으로의 속도 감소는 결정화도를 1.35배(17%에서 39%로) 증가시켰다. 이들 결과는 0.2℃/분 램프 속도가 결정화가 생기게 하는데 적절함을 제시한다.

응축된 상 및 결정화: 부가적 작업은 응축된 상 및 결정화에 집중되었다. 도 5A는 ETP-5807 주기(표 1)에 의해 시간에 따른 Cp 변화를 도시한다. 제1 냉동(도 5B), 어닐링(도 5C) 및 제2 냉동(도 5D) 동안 Cp에서 약간 변화가 있다. 응축된 상의 형성은 Cp 강하에 의해 나타난다. Cp에서 약간의 변화는 냉동 및 어닐링하는 동안 상 변화가 약간 생김을 나타낸다. 이들 변수를 이용하여, 오직 75% 결정화를 얻었다. % 결정화는 5.5 J/g(도 6)인 융해열을 NaCl 니트 용액에 대한 융해열인 상수 7.4 J/g으로 나누는 것에 의해 산출하였다.

응축된 상의 형성은 냉동 유지 시간의 연장에 따라서 관찰되었다. 도 7A는 냉동 및 어닐링하는 동안 Cp 변화의 전체 사진을 도시한다. 제1 냉동 유지 시간이 2시간에서부터 5시간으로 연장되면, Cp는 최소 평형값으로 떨어졌고, 이는 더 유동 상에서부터 더욱 응축된 상으로의 변화를 나타낸다(도 7B). 5시간에서부터 10시간으로 유지 시간에서의 증가는 Cp에서 추가의 감소를 나타내지 않았다(데이터 도시되지 않음). 가온 램프 동안 결정화 피크가 관찰되었다(도 7C). 이러한 독특한 피크는 냉동 유지 시간이 2시간일 뿐일 때에는 존재하지 않았다. 상기 용액이 제1 냉동 및 가온 램프 동안 완전히 결정화되면, 부가적인 어닐링 또는 냉동은 Cp에 대한 영향이 미미하거나 거의 영향을 미치지 않을 것이라 추정될 수 있다. 이러한 것은 어닐링 및 제2 냉동 기간 동안 Cp에서 변화가 관찰되지 않는 사실에 의해 드러났다(도 7D 및 7E). % 결정화는 냉동 시간이 2 시간에서부터 5 시간으로 연장되면 87%로 증가하였다. 다시, % 결정화는 6.4 J/g(도 8)인 융해열을 상수 7.4 J/g로 나누는 것에 의해 산출하였다.

이들 결과는 AT III 비정질 상이 완전한 물리적 변환까지 -52℃에서 5시간을 필요로 함을 나타낸다. 응측된 상은 냉동이 2시간 동안뿐이면 형성하기 시작한다. 충분한 냉동 유지 시간은 결정화를 위해 1개의 필요불가결한 조건이다.

-52℃보다 더 높은 온도에서 유사한 작업을 실시하였다. 이들 결과는 생성물 온도가 -46℃였을 때 결정화 활성이 없음을 나타내었다. -48℃에서, 유지 시간이 4 시간에서부터 5 시간으로 증가하면, % 결정화는 36%에서부터 84%로 증가하였다. 따라서, 충분한 결정화를 유도하기 위하여 AT III 용액이 -48℃ 미만에서 적어도 5시간 동안 냉동되는 것이 바람직하다.

동결건조 공정 개발: 거시적 규모로 DSC 작업의 결과를 확인하기 위하여, 4개의 냉동 온도(-50℃, -52℃, -54℃ 및 -60℃)와 2개의 유지 시간(2 시간 및 6 시간)을 실험실 냉동-건조기에서 평가하였다.

-52℃에서 2시간 동안 냉동: 시험을 실시하는 동안 사용된 표 1의 현재 주기 변수의 초기 평가는 Lyostar II FTS 유닛을 사용하여 평가하였다. 온도 및 챔버 압력 특성은 도 9에 제공된다. 냉동 공정 동안 써모커플에 의해 측정된 가장 높은 생성물 온도는 대략 -49℃였다(도 10.). 가공 후, 물리적 조사에 의해 케이크의 2% 만이 허용가능하였고, 17%는 작은 구멍을 지니고 있었고, 57%는 부분적으로 붕괴되어 있으며 또 23%는 파쇄되어 있음이 밝혀졌다. DSC 결과를 기초로, 상기 생성물 온도(-49℃)는 결정화를 유도할 만큼 충분히 냉각되었지만, 상기 냉동 유지 시간은 결정화하기 전에 응축된 상을 형성하기 위해서는 적어도 5시간이 필요하다. 2시간의 냉동 기간은 너무 짧아서 충분한 결정을 얻을 수 없었다.

-54℃에서 2시간 동안 냉동: 이 주기에서는 AT III 용액을 -54℃에서 2 시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1시간 동안 어닐링하며 또 -54℃에서 2시간 동안 다시 냉동하였다. 냉동은 Lyostar II FTS 유닛에서 실시하였다. 일차 및 이차 건조는 CS10-0.5 (Serail 14L03)에서 실시하였다. 도 11 및 12에서 그래프는 냉동하는 동안 생성물 온도가 -50℃ 미만으로 유지되었음을 나타내었다. 물리적 조사에 의해 74% 케이크가 허용가능성이고 또 26%는 작은 구멍들을 지니고 있음이 밝혀졌다. 생성물 온도를 -49℃에서부터 -50℃로 감소시키는 것에 의해 케이크 외관 개량을 볼 수 있지만, 그 결과는 여전히 만족스럽지는 않다. 이들 결과는 저온에서 냉동하는 것만은 완전한 결정화를 유도하기에 충분하지 않음을 나타낸다.

-54℃에서 6시간 동안 냉동: 이 주기에서는 AT III 용액을 -54℃에서 6시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1시간 동안 어닐링하며 또 -54℃에서 2시간 동안 다시 냉동하였다. 이 주기는 FTS 냉동-건조 유닛에서 실시하였다. 생성물 온도는 냉동하는 동안 -50℃ 미만으로 유지되었다(도 13 및 14). 물리적 조사에 의해, 모든 케이크가 허용가능함이 밝혀졌다. 이들 결과는 최적 결정화를 확실히 하기 위해서는 생성물 온도 및 냉동 유지 시간이 동일하게 중요하다는 것을 나타낸다.

-50℃에서 6 시간 동안 냉동: 이 주기에서는 AT III 용액을 -50℃에서 6시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1 시간 동안 어닐링하며 또 -50℃에서 2시간 동안 다시 냉동하였다. 이 주기는 Lyostar II FTS 유닛에서 실시하였다. 이들 변수를 이용하여, 상기 생성물 온도는 냉동 기간 동안 -47℃ 미만 및 -48℃ 초과로 유지되었다 (도 15 및 16). 물리적 조사에 의해, 18%만이 허용가능하였고, 23%는 작은 구멍을 가지고 있었고 또 59%는 붕괴를 나타냄이 밝혀졌다. 이 연구는 결정화를 개시하기 위해서는 생성물 온도가 -48℃ 미만일 필요가 있다는 이전의 DSC 발견을 확인해 준다. 냉동 유지 시간의 연장만으로는 충분한 결정을 형성하기에 충분하지 않음을 나타낸다.

-60℃에서 6 시간 동안 냉동: 이 주기에서는 AT III 용액을 -60℃에서 6시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1시간 동안 어닐링하며 또 -60℃에서 2시간 동안 다시 냉동하였다. 이 주기는 Minilyo 냉동 건조기(Usifroid)에서 실시하였다. 상기 생성물 온도는 냉동하는 동안 상부 선반에서는 -51.6℃이었고 또 하부 선반에서는 -52.7℃이었다(도 17 및 18). 물리적 조사에 의해, 모든 케이크가 허용가능함이 밝혀졌다. 이 실험은 또한 선반 온도 감소 및 냉동 유지시간의 연장이 약제학적으로 허용되는 케이크 제조에 중요한 전략이라는 것을 나타낸다.

-52℃에서 15 시간 동안 냉동: 이 주기에서는 AT III 용액을 -52℃에서 2시간 동안 냉동하고, -30℃에서 1시간 동안 어닐링하며 또 -52℃에서 15 시간 동안 다시 냉동하였다. 상기 냉동은 Lyostar II FTS 유닛에서 실시하였다. 일차 및 이차 건조는 FTS 중의 분리 밸브가 일차 건조 기간 동안 달라붙기 때문에 Serail에서 실시되었다. 냉동 기간 동안 써모커플(thermocouples)에 의해 측정된 가장 높은 생성물 온도는 -48℃ 미만(도 19 및 20)이었다. 모든 케이크의 물리적 외관은 허용가능하였다. DSC 결과를 기초로 할 때, -48℃는 결정화를 유도하는데 필요한 가장 높은 생성물 온도이다. 그리고 15 시간의 유지 시간은 완전한 결정화를 확실히 하는데 충분히 긴 시간으로 보인다.

요약: 표 4는 상이한 선반 온도 설정값에 따른 온도 대응을 수록한다.

상이한 선반 온도 설정값에 대한 온도 대응

실험	A	B	C	D	E	F	G	H	I
1	FTS	-52	-52.03	-51.15					-49
2	FTS	-54	-53.99	-53.15	-52.46	-51.75	-52.38	-51.98	-50
3	FTS	-54	-54.03	-53.23	-52.19	-51.81	-52.24	-51.77	-51
4	FTS	-50	-50.07	-49.18	-48.59	-47.46	-48.51	-48.12	-47
5	Usifroid	-60	-58.00	--	-54.64	-54.66	-55.44	-54.66	-51.6, -52.7
4	FTS	-52	-51.99	-51.15					48

A = 건조기; B = 선반 온도 설정값 (℃); C = 선반 내부(℃); D = 선반 외부 (℃); E = 상부 선반 내부 (℃); F = 상부 선반 외부 (℃); G = 하부 선반 내부 (℃); H = 하부 선반 외부(℃); 및 I = 생성물 온도(℃).

상기 생성물 온도는 표적 선반 온도 설정값에 비하여 전형적으로 4°내지 6°더 가온이기 때문에, 상기 선반 온도는 모든 생성물 온도가 동결건조기 전반에 걸쳐 -48℃ 미만으로 유지되도록 바람직하게는 -54℃에서 설정된다. 이들 연구 결과(표 5)를 기초로 하여, 냉동기간 동안 표적 선반 온도는 생성물 온도가 -48℃ 미만으로 확실히 되도록 선택될 수 있다.

케이크 외관에 대한 냉동 온도 및 유지 시간의 효과

번호	냉동 온도 (℃)	제1 냉동 유지 시간 (시간)	제2 냉동 유지 시간 (시간)	결과
번호	냉동 온도 (℃)	제1 냉동 유지 시간 (시간)	제2 냉동 유지 시간 (시간)	A (고체 케이크)	B*	C**	D***
1	-52	2	2	2%	17%	57%	23%
2	-54	2	2	74%	26%	-	-
3	-52	2	15	100%	-	-	-
4	-50	6	2	18%	23%	59%	-
5	-60	6	4.5	100%	-	-	-
6	-54	6	2	100%	-	-	-

*작은 구멍; **붕괴됨; ***파쇄됨.

또한, 완전한 결정화를 확실히 하도록 충분한 시간이 허용될 수 있다. 상기 데이터는 -54℃의 선반 온도에서 6시간 침지(soak)는 이들 조건을 달성하고 또 적절한 결정화를 촉진할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 냉동 침지 시간(freezing soak time)을 2시간에서부터 6시간으로 연장하는 것과 표적 선반 온도 설정값을 -52℃에서부터 -54℃로 감소시키는 것은 완성된 생성물의 물리적 외관을 개량할 것이다.

냉동-건조된 케이크의 형태: 냉동-건조된 케이크의 형태는 주사전자현미경에 의해 관찰하였다. 부분적으로 붕괴된 케이크를 고체의 강한 케이크에 대한 대조용으로 사용하였다. 상기 붕괴된 케이크는 얇고 다공성인 다수의 박편(flake)를 함유한다(도 21A). 고체 케이크(도 21B)는 주로 케이크 전반에 걸쳐 약간의 원형 결정을 갖는 판형(plate-shaped) 결정으로 이루어진다. NaCl 그자체는 작은 원형 결정을 형성한다(도 22). 알라닌 단독(도 23)은 얼음 승화에 기인한 것으로 보이는 일부 구멍을 갖는 연속적 판을 형성한다. 도 21B 중의 판형 결정은 주로 알라닌으로부터 생기고 또 원형 결정은 NaCl로부터 생기는 것으로 추정된다.

분말 X-선 회절: DSC 및 냉동 연구로부터 생성된 데이터를 기초로 하여, 2회째 ETP-5807 최대 로딩(maximum load) 시험을 실시하였다. 이 시험은 연장된 침지 시간뿐만 아니라 제1 냉동 단계 동안 더 낮은 냉동 온도를 포함하였다. 상기 변형된 주기는 허용가능한 물리적 외관을 갖는 생성물을 생성하였다.

1회째 시험으로부터 얻은 붕괴된 케이크 및 2회째 시험으로부터 얻은 고체 케이크의 결정성을 특징화하기 위하여, NaCl, 알라닌, ETP 5807(붕괴된 케이크) 및 ETP 5807의 2회째 시험으로부터 얻은 물질(고체 케이크)의 XRD 패턴을 평가하였다(도 24). 주요 NaCl 결정성 분획 피크는 31.7°및 45.5°20에 있었다. 주요 알라닌 결정성 분획 피크는 20.5°20에 있다. 알라닌 샘플에서 생기는 넓은 피크는 비정질 부분에 해당된다. ETP 5807(1회째 시험) 및 ETP 5807(2회째 시험) 케이크는 NaCl 및 알라닌의 피크 조합을 나타낸다. 양쪽 샘플에 대해 모두 넓은 피크가 관찰된다.

결정성은 결정성 피크 면적을 비정질 및 결정성 피크 면적의 합으로 나누는 것에 의해 산출한다. NaCl, 알라닌, ETP 5807 및 ETP 5807 (2회째 시험)의 결정성은 각각 99±20%, 50±1%, 66±2% 및 60±1%이다. 상기 붕괴된 케이크 및 상기 고체 케이크에 대해서 회절 패턴에서의 어떠한 차이도 확인되지 않는다.

결론: AT III 제형은 동결건조에서 냉동 수법의 설계에 대한 % 결정화에 대하여 강조하는 것으로 특징화된다. 상기 결과는 냉동 온도 및 유지 시간 모두 동일하게 완전한 결정화를 위한 중요한 전제조건이라는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 동결건조는 약 -54℃의 냉동 온도뿐만 아니라 약 6 시간의 연장된 침지시간을 포함할 수 있다. 상기 시험으로 약제학적으로 허용되는 완성된 생성물을 수득하였다.

실시예 2

30 ml의 성형된 바이얼에, AT III(~6.88 mg/ml), 알라닌(100 mM (~8.91 mg/ml)), 및 NaCl(150 mM, (~8.7 mg/ml))을 포함하는 10 ml의 멸균 여과 용액을 충전하였다. ATIII 샘플은 처음에는 -25℃로 냉동되었고, 2 시간 동안 유지되었으며, 또 이어 -54℃로 다시 냉동된 다음 6시간 동안 유지되었다. 이어 선반 온도를 0.2℃/분의 속도로 -30℃로 서서히 상승시켰고, 또 상기 온도에서 2시간 동안 유지한 다음, 또 0.2℃/분으로 서서히 감소시켜 -54℃로 되돌아갔다. 생성물은 일차 건조되기 전에 -54℃에서 2시간 동안 유지되었다. 일차 건조는 0℃의 선반 온도 및 100 mTorr의 제어된 챔버 압력에서 실시하였다. 일차 건조는 이차 건조가 개시되기 전 대략 32 시간 동안 지속되었다. 이차 건조는 35℃ 선반 온도 및 100 mTorr 챔버 압력에서 14시간 동안 실시하였다.

건조 이후, 약 100%의 약제학적으로 허용되는 동결건조된 케이크를 얻었다. 약제학적으로 허용되는 케이크의 %는 허용가능한 케이크의 양을 전체 뱃치 중의 케이크의 수로 나누는 것에 의해 산출하였다. 또한 조절된 DSC를 적용하고 또 냉동 단계 동안 응축된 상의 형성 및 가온 램프 동안 결정화 공정을 관찰하였다.

Claims

적어도 하나의 결정화 부형제 및 혈장 유래 안티트롬빈 III(AT III)을 포함하는 조성물을 동결건조하는 방법으로서, 상기 적어도 하나의 결정화 부형제는 알라닌 및 NaCl을 포함하고, 상기 방법은:
(a) 상기 조성물을 제1 온도에서 노출시키는 단계로, 제1 온도는 -48 내지 -54 ℃의 범위 내인 단계, 및
(b) 동결 건조에 앞서 상기 조성물의 온도를 4 내지 10시간의 기간 동안 -48 내지 -54 ℃의 온도 범위로 유지시키는 단계
를 포함하는, 조성물을 동결 건조하는 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 기간은 적어도 5시간인 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 알라닌 및 NaCl은 각각 100 mM로 조성물 내에 존재하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제1 온도 및 상기 기간은 적어도 하나의 결정화 부형제가 완전히 결정화되기에 충분한 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 안정화제, 완충제, 계면활성제, 항산화제, 및 2가 양이온으로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 더 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 시트르산/포스페이트 완충액, 히스티딘, 트리스-(히드록시메틸)-아미노메탄, 1,3-비스-[트리스-(히드록시메틸)메틸아미노]-프로판, 히스티딘, 피페라진-N,N'-비스-(2-에탄설폰산), 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산, N-2-히드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산, 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산 및 N-2-아세트아미도-2-아미노에탄설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충액을 더 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 수득하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 50 부피% 고체 케이크인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 액체 약제학적 조성물인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물을 제2 온도에 노출시켜 제2 조성물을 얻는 단계를 더 포함하며, 상기 제2 온도는 제1 온도를 초과하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 제2 조성물을 제3 온도에 노출시켜 제3 조성물을 얻는 단계를 더 포함하며, 상기 제3 온도는 상기 제2 온도 미만인 방법.
제 16항에 있어서, 상기 제3 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 얻는 단계를 더 포함하는 방법.
제 12항의 방법에 의해 수득된 동결건조된 케이크를 포함하는 키트.
혈장 유래 안티트롬빈 III(AT III), NaCl, 및 알라닌을 포함하는 액체 조성물을 동결건조하는 방법으로서,
(a) 완전히 결정화된 하나 이상의 성분을 갖는 제1 조성물을 제공하기 위하여 상기 조성물이 -48℃ 이하로 적어도 5시간 이상 유지되도록 -54℃ 이하에 노출하는 단계; 및
(b) 상기 제1 조성물을 건조하여 동결건조된 케이크를 얻는 단계를 포함하는, 액체 조성물을 동결건조하는 방법.
제 19항에 있어서, 상기 동결건조된 케이크가 25℃ 내지 40℃에서 1개월 내지 6 개월간 저장된 후에도 상기 AT III의 효능이 유지되는, 액체 조성물을 동결건조하는 방법.