KR101540051B1 - 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물 {Composition for preventing skin aging or improving skin condition}
본 발명은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
햇볕을 쪼이게 되면 노출된 피부는 자외선을 조사 받게 된다. 햇볕의 자외선은 파장의 크기에 따라 UV-A, UV-B, UV-C 세 종류로 나누어지는데 이중 에너지가 가장 크고 파장이 가장 짧은 UV-C는 대기권을 통과하기 전에 차단되어 거의 모두 없어지고 두 번째로 파장이 짧은 UV-B는 일부가 또한 파장이 가장 긴 UV-A 경우는 상당히 많은 양이 대기권을 통과하여 지구상에 도달하게 된다. 지구상에 도달한 자외선은 피부 조직과 세포에 자극과 손상을 야기하게 되는 가장 중요한 환경적 요인으로 작용한다.
지속적인 자외선 조사를 받게 되면 피부 조직에는 잔주름 및 깊은 주름 형성, 피부 건조, 기미 형성 등이 유도되어 피부 조직의 노화가 촉진되고 또한 세포 내의 DNA에 손상을 주어 피부암을 유발하기도 한다. 사람이 나이에 따른 피부의 노화 현상을 촉진하는 가장 중요한 원인으로 상당 기간 동안의 지속적인 자외선에 대한 노출을 들고 있다.
피부 조직에 자외선이 가해지면 표피층에 존재하는 케라티노사이트 세포나 진피층의 섬유아세포 등의 세포 내에서 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생성이 증가되는데 이것이 피부세포에 산화적 스트레스를 주고 조직 내에 염증을 유발하여 궁극적으로 자외선에 의한 여러 피부 손상과 노화의 근본 원인으로 작용한다. 자외선이 피부 세포에 조사되면서 생성된 ROS는 p38, JNK, MAPK 등 신호 전달 카이네이즈들을 활성화시키는데 이들 활성화된 카이네이즈들에 의한 신호는 Nuclear Factor-κB (NF-κB) 와 Activator Protein 1 (AP-1)등의 전사요소의 활성을 증가시키게 된다. 이들 활성화된 전사 요소들은 궁극적으로 여러 유전자 들의 발현을 증가시키는데 이중 특히 MMP-1, MMP-3, MMP-9 등의 매트릭스 메탈로프로티아제 (matrix metalloproteinase (MMP)) 패밀리 등의 콜라겐 단백질 분해 효소들과 IL-1β 와 TNF-α와 같은 염증 촉진 사이토카인 (proinflammatory cytokine)들의 발현의 증가는 피부조직의 노화와 손상의 직접적인 원인이 된다.
피부 조직에서 증가된 MMP 들은 피부 조직에서 조직의 강도와 탄력을 유지하는데 필요한 파이버 콜라겐 단백질의 분해를 촉진하여 이들 파이버 콜라겐 단백질의 양을 줄이고 또한 단편으로 잘라지게 만드는데 이것이 피부의 노화와 주름을 유발하는 결정적인 원인이다.
현재까지 피부 노화에 대해 가장 효과적으로 알려져 있는 방안은 레티놀과 레티노산을 이용한 방안이다. 그러나, 레티노이드는 주름개선 또는 탄력개선이라는 긍정적인 효과와 더불어, 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며, 또한 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 산화 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 있다.
본 발명자들은 한국공개특허 10-2013-0031266호를 통하여, 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해 활성을 가지는 항염증 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성을 공개한 바 있다. 그러나, 상기 문헌에서는 해당 화합물의 염증 면역 질환에 관련된 효과만 기재되어 있을 뿐, 피부 노화와 관련된 내용은 전혀 개시된 바가 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 상기 특허에 공개된 화합물이 염증세포 활성화와 섬유 아세포의 활성화에 의한 TNF-α 나 IL-1β 생성의 증가 뿐만 아니라, MMP 패밀리 단백질의 발현의 증가를 동시에 억제하는 활성을 가지는 것을 처음으로 확인하여 본 발명은 완성하였다.
본 발명의 목적은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부상태 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112013108265897-pat00001
상기 X1 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -OH, 또는 -OCH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(CH2)n-R3, -(CH2)n-C(O)-R3, 또는 -O(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3알킬아미노, 디C1-3알킬아미노, 하이드록시C1-3알킬아미노, 카르복시C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬C1-3알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록시피롤리디닐, 하이드록시C1-3알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐, 디C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및
상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112013108265897-pat00002
상기 X1 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -OH, 또는 -OCH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(CH2)n-R3, -(CH2)n-C(O)-R3, 또는 -O(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3알킬아미노, 디C1-3알킬아미노, 하이드록시C1-3알킬아미노, 카르복시C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬C1-3알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록시피롤리디닐, 하이드록시C1-3알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐, 디C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및
상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
바람직하게, 상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
[구조식]
Figure 112013108265897-pat00003
또한 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
3-(6-(페닐싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
3-(6-브로모-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노)-페놀,
4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페놀,
3-[6-(4-메톡시페닐)-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노]-페놀,
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
3-(6-(4-클로로페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-페네톡시페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피리딘-2-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
(6-퓨란-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
(6-퓨란-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
N-(3-메톡시페닐)-6-(싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
(3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
(3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
3-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)-페놀,
3-((6-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-(피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-((4-메틸피페라진-1-일-메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-((사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-((6-(4-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(2-모폴리노에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에타논,
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(피롤리딘-1-일)에타논,
N,N-다이에틸-2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)아세트아마이드,
3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조산,
(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(피롤리딘-1-일)메타논,
N,N-다이에틸-3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아마이드,
(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실레이트,
3-(6-(4-((2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-((4-메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(((2R,6S)-2,6-다이메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복사마이드 염산염,
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실산 염산염,
3-(6-(4-((2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
메틸 2-(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로파노에이트,
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-3-올 염산염,
3-(6-(4-(에톡시메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)-N-(1-하이드록시프로판-2-일)벤즈아마이드,
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로판산,
3-(6-(3-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(3-(2-(피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(2-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(6-(4-모폴리노페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(2-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(4-((4-메틸피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(모폴리노메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(2-(4-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(4-메틸피페라진-1-일)싸이아졸로[4,5-d]피리미딘-7-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(모폴리노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산)
3-(6-(4-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
3-(6-(4-((에틸아미노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(2-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(2-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 염은 무기산염, 유기카본산염 또는 설폰산염인 것일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 무기산염은 염산염이고, 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 상기 조성물은 0.1 내지 500mg/kg 체중으로 투여되는 것일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 투여는 경피 투여인 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 표함하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112013108265897-pat00004
상기 X1 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -OH, 또는 -OCH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(CH2)n-R3, -(CH2)n-C(O)-R3, 또는 -O(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3알킬아미노, 디C1-3알킬아미노, 하이드록시C1-3알킬아미노, 카르복시C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬C1-3알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록시피롤리디닐, 하이드록시C1-3알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐, 디C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및
상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
바람직하게는, 상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다.
[구조식]
Figure 112013108265897-pat00005
또한 본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있으며, 이러한 약학적으로 허용 가능한 염에는 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성산부가염을 형성하는 산, 예를 들면 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트라이클로로아세트산, 트라이플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기카본산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 바람직하게는 염산 또는 트라이플루오로아세트산과 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다.
화학식 1로 표시되는 화합물 중 대표적인 화합물로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다. 괄호 안의 명칭은 코드네임으로서 본 발명에서 화합물의 구분을 위하여 사용한다:
3-(6-(페닐싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0008),
4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴 (LCB 03-0009),
4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴 (LCB 03-0013),
3-(6-브로모-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노)-페놀 (LCB 03-0015),
4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페놀 (LCB 03-0016),
3-[6-(4-메톡시페닐)-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노]-페놀 (LCB 03-0017),
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0018),
3-(6-(4-클로로페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0019),
3-(6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0020),
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-페네톡시페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0021),
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피리딘-2-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0022),
(6-퓨란-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민 (LCB 03-0023),
(6-퓨란-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민 (LCB 03-0024),
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0026),
N-(3-메톡시페닐)-6-(싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0027),
(3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민 (LCB 03-0028),
N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민 (LCB 03-0029),
(3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민 (LCB 03-0030),
3-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)-페놀 (LCB 03-0031),
3-((6-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0032),
3-((6-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0033),
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0034),
3-((6-(4-(피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0035),
3-((6-(4-((4-메틸피페라진-1-일-메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0036),
3-((6-(4-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0037),
3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0038),
3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0039),
3-(6-(4-((사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0040),
3-((6-(4-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0041),
3-((6-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0042),
3-((6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0043),
3-((6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0044),
3-((6-(4-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0045),
3-(6-(4-(2-모폴리노에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0046),
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에타논 (LCB 03-0047),
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(피롤리딘-1-일)에타논 (LCB 03-0049),
N,N-다이에틸-2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)아세트아마이드 (LCB 03-0050),
3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조산 (LCB 03-0051)
(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)(4-메틸피페라진-1-일)메타논 (LCB 03-0052),
(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(피롤리딘-1-일)메타논 (LCB 03-0053),
N,N-다이에틸-3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아마이드 (LCB 03-0054),
(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(4-메틸피페라진-1-일)메타논 (LCB 03-0055),
메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실레이트 (LCB 03-0056),
3-(6-(4-((2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0057),
3-(6-(4-((4-메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0058),
3-(6-(4-(((2R,6S)-2,6-다이메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0059),
3-(6-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0060),
3-(6-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0061),
3-(6-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0062),
3-(6-(3-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0063),
3-(6-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0064),
3-(6-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0065),
3-(6-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0066),
3-(6-(3-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0067),
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복사마이드 염산염 (LCB 03-0068)
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실산 염산염(LCB 03-0069)
3-(6-(4-((2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0070),
메틸 2-(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로파노에이트 (LCB 03-0071)
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-3-올 염산염 (LCB 03-0072)
3-(6-(4-(에톡시메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0073),
4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)-N-(1-하이드록시프로판-2-일)벤즈아마이드 (LCB 03-0074),
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로판산 (LCB 03-0075)
3-(6-(3-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0076),
3-(6-(3-(2-(피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0079),
3-(2-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0080),
3-(6-(4-모폴리노페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0082),
3-(2-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0083),
3-(2-(4-((4-메틸피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0084),
3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0085),
3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0086),
3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0087),
3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0088),
3-(6-(5-(모폴리노메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0089),
3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0090),
3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0091),
3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0092),
3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0093),
3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0094),
3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0095),
3-(2-(4-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0097),
3-(2-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0098),
3-(2-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0099),
3-(2-(4-메틸피페라진-1-일)싸이아졸로[4,5-d]피리미딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0100),
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0101),
3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0102),
3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0103),
3-(6-(4-(모폴리노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0104)
3-(6-(4-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0105)
3-(6-(4-((에틸아미노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0106),
3-(2-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0107),
3-(2-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0108),
3-(2-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0109),
3-(2-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0110),
3-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0111),
3-(2-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀 (LCB 03-0112), 및
3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0113).
3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0114) 및
3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 (LCB 03-0115).
바람직한 양태로, 본 발명의 화합물은 LCB 03-0110으로 표시한 3-(2-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀을 포함한다.
이상에서 설명한 화합물들은 한국공개특허 10-2013-0031266호에 개시된 내용을 참고로 하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법을 도식화하여 나타내면 하기 반응식 1과 같다. 다만, 하기의 제조방법이 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 한정하는 것은 아니며, 하기의 제조방법의 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 달리 언급이 없는 한 하기 반응식의 치환체의 정의는 상기 화학식 1에서의 정의와 동일하다.
화학식 1의 화합물은 싸이에노피리미디논, 싸이에노피리디논 또는 싸이아졸로피리미디논의 골격을 가지는 (I)의 화합물을 클로리네이션하여 7-클로로싸이에노피리미딘 또는 싸이에노피리딘 유도체 (II)를 합성하고, 브로미네이션하여 2-브로로-7-클로로싸이에노피리미딘 또는 싸이에토피리딘 유도체(III)을 합성한 다음, 아닐린 유도체 (IV)와 치환반응을 통해 (V)의 화합물을 합성 할 수 있다. 화합물 (V)는 스즈키 커플링(Suzuki coupling)을 통하여 각각의 화학식 1-1, 1-2, 1-3의 싸이에노피리미딘, 싸이에노피리딘 및 싸이아졸로피리미딘 골격을 갖는 화합물을 제조할 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112013108265897-pat00006
상기 제조방법을 보다 구체화하여 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 반응식을 도식화하면 하기 반응식 2와 같다. 하기 반응식 2에 기재되어 있는 화합물은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 출발물질로 사용될 수 있다. 다만, 하기 제조방법의 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 달리 언급이 없는 한 하기 반응식의 치환체의 정의는 상기 화학식 1에서의 정의와 동일하다.
[반응식 2]
Figure 112013108265897-pat00007
본 발명에 따른 화합물들은 피부 노화에 관여하는 면역세포 및 상처치유반응에서 활성화되는 섬유 아세포의 활성화를 저해한다. 구체적으로, 본 발명자들은 이 화합물들이 염증세포 활성화와 섬유아세포의 활성화에 의한 TNF-α 나 IL-1β 생성의 증가와 MMP 패밀리 단백질의 발현의 증가를 동시에 억제하는 활성을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 자외선 조사 또는 염증성 사이토카인인 TNF-α 처리에 의한 MMP-1 발현 확인하고, 본 발명의 화합물을 처리하였을 때의 발현 변화를 비교하였다.
그 결과, 본 발명에서 사용한 화합물들은 3 uM 농도에서 인간 섬유아세포 또는 HaCaT 세포에서 UV-B조사 또는 TNF-α 처리에 의한 MMP-1 생성 증가를 저해함을 확인하였고, 특히, LCB 03-0107 내지 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내는 것을 확인하였다(실험결과 1-1 내지 1-3).
또 다른 실시예에서는, 본 발명의 화합물 중 LCB 03-0110을 선택하여 자외선 조사 피부 노화 생쥐 동물 모델을 이용하여 주름 형성 방지, 표피층 증식 억제 등의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 활성이 있는지를 확인하였다.
그 결과, LCB 03-0110을 처리시 농도 의존적으로 피부 두께 증가를 유의성 있게 억제되었고(실험결과 2-1), 외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 육안으로 평가한 주름 형성 정도도 LCB 03-0110 농도 의존적으로 억제되었으며(실험결과 2-2), 주름의 평균길이, 평균 깊이, 그리고 주름 영역 %값들의 증가 현상을 유의성있게 감소시켰다(실험결과 2-3).
또한, 본 발명의 실시예에서는, 의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 표피층의 길이 및 콜라겐 양을 측정하여 LCB 03-0110의 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선 효과를 확인하였다.
그 결과, LCB 03-0110의 처리가 지속적인 UV-B조사에 의한 표피층의 두께 증가를 유의성 있게 감소할 수 있다는 것을 확인하였고(실험결과 4), UV-B조사는 콜라겐 밀도를 유의성 있게 감소시키지만 UV-B조사와 함께 0.1% LCB 03-0110을 매일 처리한 실험군에서는 그 감소 정도가 유의성 있게 저해되는 것을 확인하였다(실험결과 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 양을 측정하여 본 발명의 화합물의 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선효과를 확인하였다.
그 결과, LCB 03-0110의 경피 도포 처리는 이들 염증성 사이토카인의 증가 현상을 유의성 있게 억제하였다(실험결과 6).
또한 본 발명에서는, 본 발명 화합물의 UV-B 조사 또는 TNF-α에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억제 활성 및 MMP-1, MMP-3 단백질 생성 억제 활성을 확인하였다.
그 결과, UV-B 조사 또는 TNF-α를 처리하는 경우 MMP-1과 MMP-3 단백질의 양이 증가하였지만, LCB 03-0110을 3 μM, 1 μM, 혹은 0.3 μM 의 농도로 UV-B를 조사하기 전 또는 TNF-α를 처리하기 전에 처리한 경우는 MMP-1과 MMP-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(실험결과 8 및 실험결과 9).
또한, 본 발명의 실시예에서는 UV-B 조사나 TNF-α 처리에 의한 HaCaT 세포에서 본 발명의 화합물인 LCB 03-0110의 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화 억제 활성을 확인하였다(실험결과 10).
따라서, 본 발명의 조성물은 피부노화 방지 및/또는 피부상태 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 항산화, 피부 주름의 개선, 피부 노화의 억제 및 개선, 피부 탄력의 개선, 백반증의 개선, 및 피부 재생 효능 등을 포함한다.
본 발명의 조성물을 의약용으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구, 비경구, 직장, 경피, 안구, 비강, 혈관 주사제, 근육주사제, 국소 투여, 플라스터 또는 패취 형태등의 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이 약제 조성들은 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., 2000등에 잘 밝혀진 것과 같은 약제 기술 등을 이용한 잘 알려진 방법으로 편리하게 제조 될 수 있다.
모든 방법들은 활성 구성 성분을 하나 혹은 그 이상의 구성성분으로 이루어진 캐리어와 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 약제 조성은 일정하게 잘 섞이게끔 하여 활성 구성 성분들을 액체 캐리어 또는 잘게 부순 고체 캐리어 각각 혹은 둘 모두와 혼합되어 제조되고 또 필요하면 그 산물을 바람직한 형태로 만들수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 향낭, 과립제, 로젠지 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 오일(예: 목화씨 오일, 참깨오일, 코코넛오일 또는 피넛오일 같은 식용오일), 현택제(예: 트래거캔스, 알지네이트, 아카시아, 덱스트란, 카복시메틸셀루로오즈나트륨, 젤라틴, 메틸셀루로오즈, 하이드록시프로필메틸셀루로오즈, 하이드록시프로필셀루로오즈, 카보머, 폴리비닐피롤리돈 같은 합성 또는 천연 검)를 함유한다.
정제 제형으로는 유효성분을 하나 혹은 그 이상의 보조성분을 선택적으로 사용하여 압력을 가하거나 몰딩하여 만들 수 있다. 압력을 가해서 만드는 정제는 분말 또는 과립 같은 자유-유동 형태의 유효성분을 이외에 결합제(예: 락토즈, 글루코즈, 전분, 젤라틴, 아카시아 검, 트래거캔스 검, 알지네이트나트륨, 카복시메틸셀루로오즈, 메틸셀루로오즈, 하이드록시프로필메틸셀루로오즈, 폴리에틸렌글리콘, 왁스), 윤활제(예: 올레인산염, 스테아린산염, 스테아린산마그네슘, 벤조산염, 아세트산염, 염화나트륨) 붕해제(예: 전분, 메틸셀루로오즈, 한천, 벤토나이트, 크로스카멜로오즈나트륨, 전분 클리콜산나트륨, 크로스포비돈), 분산제(폴리솔베이트 80)와 혼합한 뒤 압력을 가하여 제조할 수 있다. 몰딩된 정제는 분말화 된 유효성분과 적당한 비활성 용매를 섞은 후 몰딩 기기를 이용하여 몰딩함으로써 만들 수 있다.
상기 화학식 1 로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 혈관 주사제, 경피투여, 국소투여, 직장투여, 근육주사, 플라스터 또는 패취 형태로 가능하다.
국소 투여에 적당한 조성으로서 액체상 혹은 도포제, 로션, 젤이나 크림, 연고 또는 반죽 같은 에멀젼 형태의 준 액상, 혹은 드롭 형태의 용액이나 현탁액을 포함 할 수 있다.
또한, 코나 구강 흡수를 통한 투여를 위한 약제 조성은 파우더나 자가추진 스프레이를 이용하여 에어로졸이나 분무형태와 같은 형태로의 조성으로 만들어 가능하다. 이러한 조성의 제조에 관한 방법은 Modern Pharmaceutics, 2＜nd＞ ed., G. S. Banker and CT. Rhodes (Eds.), page 427-432, Marcel Dekker, New York; Modern Pharmaceutics, 3th ed., G. S. Banker and CT. Rhodes (Eds.), page 618-619 and 718-721, Marcel Dekker, New York and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology vol. 10, J Swarbrick and J. C. Boylan (Eds), page 191-221, Marcel Dekker, New York 의 문헌에 나와 있는 일반적인 방법을 따를 수 있다.
앞에 언급된 요소에 추가하여 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 약제 조성은 희석제, 완충용액, 방향제, 발색제, 계면활성제, 침강제, 메틸 하이드록시벤조산 같은 방부제, 에멀젼화제나 그 유사물질 같은 하나 혹은 그 이상의 구성요소를 포함 할 수 있고, 활성 성분이 약리적으로 허용되는 무독성의 산이나 염기를 이용하여 염의 형태로 투여되는 경우, 바람직한 염은 특정경우에 부합되는 흡수도를 달성하도록 예를 들어 쉽게 물에 녹을 수 있거나 약하게 녹는 형태로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 투여 대상의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 500 mg/kg 체중이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물은 예를 들어, 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
상기 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 비경구 투여 형태로 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 1㎍/kg 내지 200mg/kg, 바람직하게는 50㎍/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 유연화장수(스킨로션 및 밀크로션), 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지크림, 팩, 젤, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일 및 보디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하는 화합물, 이의 이성질체, 또는 이의 생리적으로 허용 가능한 염, 혹은 이를 유효성분으로 하는 조성물의 용도를 제공하며, 이를 이용하면 피부에 지속적인 자외선 조사 노출 등에 의한 잔주름과 깊은 주름 형성, 염증반응 증가 등을 억제하는 생리활성 기능을 가지기 때문에 피부 노화를 억제하는 용도로 사용할 수 있다.
도 1 및 도 7b에서 "No UV-B" 또는 "No UV-B control"은 UV-B를 조사하지 않은 실험군, "UV-B"는 UV-B를 조사한 실험군, "Vehicle" 또는 "Vehicle(ethanol)"은 UV-B를 조사하고 에탄올만 처리한 실험군, "LCB 03-0110"은 UV-B를 조사하고 본 발명의 화합물인 LCB 03-0110을 처리한 실험군을 나타낸다.
도 1은 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 LCB 03-0110을 농도 별로 처리 시 피부 두께 증가 차이를 나타낸다. "
도2는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 LCB 03-0110을 농도 별로 처리 시 주름 형성 정도의 차이를 나타낸다.
도3은 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 반영 레프리카 (impression replica) 평면에 대해 35°도의 각도로 빛을 조사 후 주름 영상을 찍은 후 결과 사진을 나타낸다. 각 군에서 얻은 대표적인 영상을 나타낸 것이고
도 4a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0.1% LCB 03-0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름 영역(wrinkle area)의 차이를 나타낸다.
도 4b는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0.1% LCB 03-0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 평균 주름 길이(Mean length)의 차이를 나타낸다.
도 4c는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0.1% LCB 03-0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름의 평균 깊이(Mean depth) 차이를 나타낸다.
도 5a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 채취한 3군 동물의 피부조직을 헤마톡실린-에오신 염색 후 광학 현미경하에서 400배의 배율로 관찰한 디지털 이미지를 나타낸다.
도 5b는 도 5a에서 얻은 디지털 이미지들에서 표피층 길이의 평균을 나타낸다.
도 6a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록 절편조직을 마손-트라이크롬 염색 후 광학 현미경 하에서 400배율로 관찰한 디지털 이미지를 나타낸다.
도 6b는 도 6a에서 얻은 디지털 이미지들에서 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6.0 (Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 정량하여 UV-B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 구한 각 실험동물군의 상대적인 값을 나타낸다.
도 7a 및 7b는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 생체검사(biopsy)하여 생쥐들의 등 부위 피부조직에서 단백질을 추출한 후 ELISA 법을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α(도 7a)와 IL-1β(도 7b)의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도8a 및 8b는 배양된 HaCaT 세포(도 8a) 및 인간 피부 섬유아세포(도 8b)에서 LCB 03-0110을 처리한 경우, p-JNK, p-p38, p-ERK를 이용하여 웨스턴블랏 실험을 한 결과를 나타낸다.
도9a 및 9b는 배양된 HaCaT 세포(도 9a) 및 인간 피부 섬유아세포(도 9b)에서 LCB 03-0110을 처리한 경우, MMP-1과 MMP-3를 인식하는 항체를 이용한 웨스턴블랏 실험을 한 결과를 나타낸다.
도10a 및 10b는 배양된 인간 피부 섬유아세포에 LCB 03-0110을 처리한 경우, 10 ng/ml의 IL-1β(도 10a)나 10 ng/ml의 TNF-α(도 10b) 처리에 의한 MMP-1과 MMP-3의 생성분비 변화를 MMP-1과 MMP-3를 인식하는 항체를 이용한 웨스턴블랏 실험결과를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 농도 의존적으로 억제하는지를 웨스턴블랏을 통하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 11c 및 11d는 LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 농도 의존적으로 억제하는지를 NF-kB 혹은 AP-1을 특이적으로 인식하는 시퀀스를 포함하는 이중 DNA 올리고뉴클레오타이드를 이용한 EMSA 에세이를 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실험예1 . 세포배양과 UV -B조사와 화합물 처리
인간 피부 섬유 아세포는 Lonza Walkersville, Inc (Walkersville, MD USA)에서 구매하여 판매사가 추천하는 방법대로 인간 FGF-B단백질과 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 본 실험에는 5 계대 배양 이하의 세포를 사용하였다. HaCaT세포는 CLS Cell Lines Service 사 (Eppelheim, Germany)에서 구매하여 사용하였고 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하여 사용하였다. 화합물은 10mM의 농도로 DMSO에 녹인 스톡 용액으로 만들어 각 실험에 필요한 조건의 농도가 되도록 배양세포에 처리하였다. 배양 세포에 UV-B조사는 275 nM와 380 nM (피크, 310-315 nm)사이의 에미션(emission) 스펙트럼을 가지는 TL20W/01RS UV 램프 (Philips, Somerst, NJ, USA)를 사용하였고 290 nM 이하의 파장을 가지는 UV-C를 제거하기 위하여 코닥 필터를 장착하여 사용하였다. UV-B는 배양세포 표면에서 30 cM 거리에서 조사하였고 배양 세포 표면에서의 UV-B 조사 세기는 UV 미터 (Waldmann GmbH & Co., Villingen-Schwenningen, Germany)를 사용하여 측정 하였다. 본 실험에서 UV-B 조사 강도는 100 mJ/cm2 의 강도로 조사하였다.
실험예 2. 배양액중의 MMP -1 단백질의 정량
인간 섬유아세포 혹은 HaCaT 세포를 24웰(well) 배양접시에서 바닥이 포화될 때까지 실험예 1에서와 같이 배양하였다. 여기에 정해진 농도의 화합물을 처리하고 30분 후에 100 mJ/cm2 양의 UV-B 조사 혹은 염증성 사이토카인인 10ng/ml의 TNF-α, 혹은 10 ng/ml의 IL-1β 을 처리 후 24에서 48 시간 후 배양액을 회수하였다. 회수한 배양액에 존재하는 인간 MMP-1 단백질 양을 측정하기 위하여 R&D 시스템사에서 판매하는 MMP-1 에 대한 ELISA 키트를 구매하여 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 정량하였다. MMP-1의 양에 따라 발색 반응에 의해 나타나는 흡광도를 측정하여 그 상대적인 양을 구하였다. MMP-1의 양에 따른 흡광도가 0.4까지는 비례적으로 증가함을 확인하였으며 따라서 측정하는 시료의 흡광도가 0.4를 넘지 않도록 시료를 묽혀서 정량에 사용하거나 발색 반응 시간을 조절 하였다.
실험예 3. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 노화 억제 및 염증성 사이토카인 억제
자외선 조사 피부 노화 동물 모델 실험을 위하여 Charles River Laboratory (Wilmington, Ma, USA)에서 6주령 알비노 무모 생쥐 종인 SKH-1 생쥐 암놈을 구매하여 1주간 실험동물실에서 안정화를 거쳤다. 275 nM와 380 nM (피크, 310-315 nm)사이의 에미션 스펙트럼을 가지는 TL20W/01RS UV 램프 (Philips, Somerst, NJ, USA)를 사용하여 UV-B를 생쥐 30 cM위에서 조사하였다. 이때 290 nM 이하의 파장을 가지는 UV-C는 코닥 필터를 이용하여 제거하였다. 생쥐 피부 표면에서의 UV-B 조사 세기는 UV 미터 (Waldmann GmbH & Co., Villingen-Schwenningen, Germany)를 사용하였다. 생쥐 피부 표면에서의 그 강도는 약 0.5 mW/cm2 였다. 먼저 본격적인 동물 실험 전에 48시간 후에 생쥐 등 피부에 확실한 홍반을 유발하기 위하여 필요한 UV-B 조사량을 측정한 결과 100 mJ/cm2 로 측정되었다. 본 실험에서는 이 조사량을 1 MED (Minimal Erythema Dose)로 정의하였다. 동물 실험 첫 주에는 생쥐 각 피부 표면에 UV-B 조사는 1주에 3회 (월요일, 수요일, 금요일) 총 8주를 실시하였다. 조사량은 첫 주에는 1 MED, 2번째 주에는 2 MED로, 3번째부터 마지막 주까지는 3 MED로 조사 하였다. 실험동물군은 각 군당 6마리씩하여 총 5군으로 나누었다. 하나의 대조군에는 에탄올만 처리하고 UV-B를 조사하지 않았다. 또 하나의 다른 대조군에는 에탄올만을 처리하고 UV-B 조사를 진행하였다. 나머지 3개의 동물 군에는 0.02%, 0.05%, 0.1%의 세가지 다른 농도로 각각 에탄올에 녹인 LCB 03-0110 화합물을 생쥐당 150 μl씩 UV-B를 조사하는 등 부위에 매일 1회 경피 도포하였다. UV-B를 조사하는 날에는 UV 조사 후 30분 후에 도포하였다. 실험 시작 후 매 2주 마다 각 군의 생쥐의 피부를 핀셋으로 부드럽게 집어 들어 올린 후 캘리퍼 (Tokyo, Japan)를 이용하여 피부의 두께를 측정하여 각군의 평균값과 표준 편차를 구하였다. 매주 2주마다 주름 형성 정도를 각 군에 대한 처리 방식을 전혀 모르는 3명의 관찰자를 이용하여 육안으로 비셋등이 제안한 스케일링 방식에 의거하여 평가후 기록한 값을 각군에 대한 평균값과 표준편차를 구하였다. 8주간의 실험을 종료하는 날 UV-B를 조사하지 않은 동물군, UV-B를 조사후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물군, UV-B를 조사 후 0.1% LCB 03-0110을 처리한 동물군의 각 동물의 피부 부위에 실리콘 고무 (Silflo Dental Impression Material, Flexico Developments, Stevenage, Hertford- shire, UK)를 적용하여 판매사가 제시한 통상적인 방법으로 반영 레프리카 (impression replica)를 제작하였다. 이 레프리카 평면에 대해 35°도의 각도로 빛을 조사하며 주름 음영이 나타나는 영상을 찍었다. 기록된 각 영상을 Skin-Visiometer VL 650 과 그 소프트웨어 (Courage & Khazaka, Cologne, Germany)를 이용하여 주름의 평균길이, 평균 깊이, 그리고 주름 영역 %값을 이전 문헌에 제안된 방식에 따라 구하였다. 또 한편으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 생쥐들을 마지막으로 안락사 시키기 전에 마취 시킨 후 UV-B를 조사하지 않은 정상군, UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군, 그리고 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 직경 7 mm바이옵시 펀치를 이용하여 채취하였다. 이를 4% 포르말린 용액에서 픽싱한 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 5-μm 두께의 절편으로 만든 후 파라핀을 제거하고 이를 통상적인 방법으로 조직 분석을 위해 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하였다. 각 염색한 피부 절편에 대해 5개의 영역을 임의로 선정하여 광학 현미경하에서 400배의 배율로 디지털 영상을 얻었다. 이 디지털 이미지들에서 표피층의 기저막 (basement membrane)에서 각질층의 맨 아래까지의 가장 짧은 직선 길이를 재서 표피층의 길이를 구하여 평균을 내었다. 위의 3군의 실험군의 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록을 5-μm 두께의 절편으로 절단한 후 이 절편을 콜라겐 양의 정도를 알기 위해 통상적인 방법으로 마손-트라이크롬 (Mason-trichrome) 염색을 시행 하였다. 이후 광학 현미경 하에서 염색된 절편 부위 5군데를 임의로 정하여 400배의 디지털 영상을 얻었다. 이 디지털 이미지들의 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6.0 (Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 상대적인 염색밀도 정량하여 UV-B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 각 실험동물군의 상대적인 콜라겐 밀도값을 구하였다. 다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 UV-B를 조사하지 않은 정상군, UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군, 그리고 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 바이오시 펀치를 이용하여 채취 후 액체질소에 넣어 급속 냉각하였다. 이 동결 조직을 분말형태로 으깬 후에 20 mmol Tris (pH 7.5), 150 mmol NaCl, 1 mmol EDTA (ethylenediamine tetra-acetic acid), 1% Triton-X-100, 프로티아제 저해제 칵테일 (Roche, Indianapolis, IN, U.S.A.)을 포함하는 조성의 버퍼용액 1ml을 넣고 호모게나이저를 이용하여 조직을 완전히 파쇄하였다. 이 시료를 다시 10초간 소니케이션한 후 4℃에서 10분간 10,000g에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. eBioscience (San Diego, CA, U.S.A.)에서 구매한 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)을 이용하여 제조사가 공급한 프로토콜에 따라 이 상층액 추출 단백질에 포함된 TNF-α와 IL-1β의 양을 정량하였다.
실험예 4. LCB 03-0110의 UV -B 조사에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억제 및 MMP -1, MMP -3 단백질 생성 억제 활성 확인
위에 서술한 바와 같이 HaCaT 세포나 인간 섬유아세포를 24 웰 배양 접시에서 바닥이 포화될 때까지 10% FBS 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고 혈청이 없는 DMEM 배지로 배양액을 교환 한 후 여기에 10mM DMSO에 녹인 각 화합물을 1 uM과 3 uM 의 농도로 처리하였다. 30 분 후에 100mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사 후 2시간 후에 배양액을 제거한 후 100ul의 1x램리 버퍼 용액을 가하여 배양 접시의 세포를 녹여낸 후 이를 100℃에서 2분간 가열하고 12,000rpm에서 마이크로센트리퓨지를 이용하여 원심분리후 상층액을 회수하여 세포파쇄액 시료를 얻었다. 또 한편으로는 UV-B를 조사 후 48시간 후에 배양 접시의 세포를 녹여낸 후 이를 100℃에서 2분간 가열하고 12,000rpm에서 마이크로센트리퓨지를 이용하여 원심분리 후 상층액을 회수하여 세포파쇄액 시료를 얻었다. 이 시료들에 포함된 특정 단백질의 양을 웨스턴 블랏 기법을 이용하여 측정하고자 하였다. 시료들을 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드젤 전기영동으로 분리하고 이를 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 이 멤브레인을 TBS 버퍼에 녹인 5% 스킴밀크 용액에서 2시간 동안 배양하고 500-5000배 정도 묽혀지도록 정량하고자 하는 단백질의 1차 항체를 가하고 2시간 실온에서 배양한다. 본 실시예에서 사용한 항체들은 구매하여 사용하였다. 즉 p38, 인산화-38 (pThr180/pTyr182), JNK, 인산화-JNK (pThr183/pTyr185), p44/p42 MAPK, 인산화-p44/p42 MAPK(pThr202/pTyr204), 그리고 GAPDH 에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 에서 구매하여 사용하였다. α-smooth muscle actin 에 대한 항체는 시그마(St. Louis, MO, USA)사로부터 구매하여 사용하였다. 배양을 마친 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻은 후에 TBS 버퍼에 적당히 묽힌 HRP가 결합된 2차 항체를 가한 후 1시간 배양하고 다시 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻는다. 이 멤브레인에서의 케미루미네슨스 신호 강도를 케미루미네슨스 신호 발생 키트 (GE 헬쓰케어, UK)와 X-레이 필름을 이용하여 오토라디오그라피 기법으로 가시화하였다. MMP-1 혹은 MMP-3의 양을 측정하는 또 다른 방법으로 회수한 세포 배양액을 분자량 컷-오프 10,000 달톤의 Viva Spin concentrator (GE 헬스케어, UK) 을 이용하여 10배 농축 후 1/2 부피의 3x램리 버퍼를 넣은 후 끊는 물에서 2분간 가열하였다. 이 시료를 10% 폴리아크릴아카이드 전기영동 후 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼 하고 이를 MMP-1, 혹은 MMP-3 를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 후 케미루미네슨스 신호를 X-레이 필름에 현상 하여 정량하였다. 본 실시예의 실험에서 GAPDH 단백질의 정량은 시료의 세포파쇄액이 동일한 양으로 분석되었음을 보이기 위함이다.
실험예 5. LCB 03-0110의 UV -B 조사나 TNF -α 처리에 의한 HaCaT 세포 에서의 전사요소 AP -1과 NF - kB 활성화 억제 활성 확인
배양한 오백만개의 HaCaT 세포에 위에 서술한 대로 UV-B 조사나 TNF-a 처리를 마친 후 이 세포의 핵 추출물을 얻는다. 즉 배양 배지를 PBS로 치환 후 세포를 조심스럽게 긁어내어 회수 후에 4℃ PBS로 간단히 씻는다. 이 세포를 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl 3 mM MgCl2 프로티아제 저해제 칼테일 (BMS) 을 포함하는 4℃ 저삼투압 (hypotonic) 버퍼에 서스펜션하고 얼음속에서 10분간 방치한다. 그리고 세포를 헐거운 프레슬 호모제나이저를 이용하여 10번 정도 부드럽게 호모게나이즈 한다. 현미경하에서 세포막이 완전히 파괴되어 대부분의 핵이 노출된 것을 확인 후에 이것을 4℃ 3000 rpm 에서 10분간 원심분리하여 펠렛을 회수하여 세포핵을 얻는다. 이 세포핵 펠렛(pellet)에 100 ul 의 미리 얼음물에 식힌 100 mM Tris (pH 7.4), 10% glycerol, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 2 mM orthovanadate, 1 mM NaF, and protease inhibitor cocktail (BMS) 을 포함하는 버퍼를 가한 후 완전히 서스펜션(suspension)하고 이를 얼음속에서 10분 마다 볼텍싱(veltexing)하며 30분간 방치한다. 이후에 14,000 x g 로 4°C에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 핵추출물을 얻는다. 단백질 농도를 측정 후에 소량으로 나누어 사용할 때까지 -70℃에 보관한다. 핵 추출물속에 포함된 NF-κB p65 단백질 양을 정량하기 위하여 NF-κB p65를 특이적으로 인식하는 항체 (Santa Cruz Biotech. U.S.A.)를 이용하여 위에 기술된 바와 같이 웨스턴블랏을 행하였다.
이어서 핵 추출물속에 포함된 활성 NF-κB와 AP-1 전사요소의 양을 측정하기 위하여 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay) 에세이를 행하였다. 먼저 NF-κB EMSA assay를 위하여 NF-κB 부착 부위가 포함된 3'위치에 바이오틴이 부착된 DNA 올리고뉴클리오타이드의 센스 스트랜드 (서열번호 1: 5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA -3')와 앤티센스 스트랜드 (서열번호 2: 5'- TTC CGG CTG AGT CAT CAA GCG -3') (Guttridge DC, et al. Mol Cell Biol. 1999;19(8):5785-5799)를 제작한 후 서로 어닐링(annealing)하여 이중나선구조로 만들었다. 이어서 20 fmole 의 이중나선의 올리고머, 8 ug 의 핵 추출물, 10 mM Trs (pH 8.0), 1 ug Poly(dlㆍdC), 5% Glycerol, 0.1% NP-40, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM EDTA를 섞어서 최종 부피 20 ul의 NF-κB와 올리고머와의 부착반응을 시행한 후 30분간 얼음에서 방치하였다. 여기에 1 ul의 0.1% 브로모페놀블루 용액을 섞은 후 이를 네이티브 6% 폴리아크릴아마이드젤에서 콜드룸에서 80V에서 약 3시간 전기영동하였다. 이를 PVDF 멤브레인에 전이한 후 여기에 UV를 조사하여 전이된 올리고머 DNA를 고정하였다. 멤브레인에 고정된 올리고머 DNA는 부착된 바이오틴을 인식하는 스트렙토아비딘-HRP를 가하여 표식 후 피어스사(미국)로부터 구매한 Chemiluminescent EMSA kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 케미루미네슨스 신호를 발현함으로써 검출 할 수 있었으며 이를 x-레이 필름을 이용하여 오토라디오그래피로 감광하였다. 한편 AP-1의 EMSA 에세이를 위하여는 위의 NF-κB 에세이 경우와 다음 사항을 제외하고는 동일하게 시행하였다. 즉 이전 문헌에 나타낸 AP-1 부착 부위가 포함된 3' 위치에 바이오틴이 부착된 DNA 올리고뉴클리오타이드의 센스 스트랜드 (서열번호 3: 5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA -3')와 앤티센스 스트랜드 (서열번호 4: 5'- TTC CGG CTG AGT CAA GCG -3') (Angel P., and Karin, M., Biochem. Biophys. Acta, 1072, 129-157 (1991))를 제작한 후 서로 어닐링하여 2중 나선구조로 만들었으며 AP-1 부착반응 버퍼에 10% glycerol을 사용하였다. 부착을 나타내는 밴드의 특이성과 유의성을 보이기 위하여 단백질-올리고머 부착을 나타내는 밴드가 20 내지 50배로 많이 사용한 바이오틴이 부착되지 않은 어닐링한 올리고머에 의해 경쟁적으로 사라지는 것을 확인하였다.
실험결과
1. 자외선 조사 또는 TNF -α 처리에 의한 MMP -1 발현 확인
1-1. 자외선 조사에 의한 인간 섬유 아세포에서 MMP -1 발현 변화 확인
먼저 인간 피부 섬유 아세포 세포 배양에 DMSO에 녹인 각각 화합물을 3 μM 의 농도로 처리하거나 처리하지 않고 30분 후에 100 mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사하거나 조사하지 않는 조건에서 24시간 후에 세포 배양액을 회수하였다. 인간 MMP-1 단백질 양을 측정하는 효소 면역 측정법 키트 (ELISA) 키트를 이용하여 회수한 배양액에 MMP-1의 존재에 의한 흡광도를 측정하여 구함으로써 각 배양액 배지 내의 상대적인 MMP-1 양을 측정하였다. 화합물이 처리되지 않고 UV를 조사하지 않은 배지의 상대적인 MMP-1 양을 0%, 화합물이 처리되지 않고 UV를 조사한 배양 배지의 상대적인 MMP-1 양을 100% 로 했을 때 각 화합물을 처리하고 UV를 조사한 배양 웰의 배지의 상대적인 MMP-1양의 % 값을 표 1에서 나타내었다. 이 표에서 처리한 각각의 화합물이 자외선 조사에 의한 인간 피부 섬유 아세포에서의 MMP-1의 생성 증가를 어느 정도 억제하는지를 평가할 수 있다.
화합물 상대적인 MMP -1 양 (%) 화합물 상대적인 MMP -1 양 (%)
LCB03-0008 57 LCB03-0066 40
LCB03-0015 68 LCB03-0067 44
LCB03-0018 79 LCB03-0070 53
LCB03-0030 61 LCB03-0072 58
LCB03-0032 31 LCB03-0076 79
LCB03-0033 35 LCB03-0079 85
LCB03-0034 39 LCB03-0080 47
LCB03-0035 33 LCB03-0082 59
LCB03-0036 37 LCB03-0083 51
LCB03-0037 31 LCB03-0084 54
LCB03-0038 61 LCB03-0085 57
LCB03-0039 65 LCB03-0086 59
LCB03-0040 34 LCB03-0087 53
LCB03-0041 25 LCB03-0088 51
LCB03-0042 23 LCB03-0089 55
LCB03-0048 93 LCB03-0090 58
LCB03-0049 59 LCB03-0091 53
LCB03-0053 85 LCB03-0092 59
LCB03-0054 79 LCB03-0093 53
LCB03-0057 59 LCB03-0094 52
LCB03-0058 52 LCB03-0101 66
LCB03-0059 56 LCB03-0106 77
LCB03-0060 41 LCB03-0107 14
LCB03-0061 44 LCB03-0108 16
LCB03-0062 43 LCB03-0109 12
LCB03-0063 42 LCB03-0110 7
LCB03-0064 46 LCB03-0111 16
LCB03-0065 45 LCB03-0112 18
그 결과, 본 발명에서 사용한 화합물들은 3 uM 농도에서 인간 섬유아세포에서 UV-B조사에 의한 MMP-1 생성 증가를 저해하였다. 저해 화합물들은 대체적으로 특징적인 구조적 공통성을 가지고 저해 활성을 보여 주었고 특히 LCB 03-0107 내지 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내었다.
1-2. 자외선 조사에 의한 HaCaT 세포에서 MMP -1 발현 변화 확인
또한, 상기 인간 피부 섬유 아세포를 사용 했을 때와의 동일한 실험을 인간 케라티노사이트 세포 유래 세포인 HaCaT 세포를 이용하여 시행한 후 각 화합물들 처리한 경우의 배양배지에 존재하는 MMP-1의 상대적인 % 값을 표 2에서 나타내었다.
화합물 상대적인 MMP -1 양 화합물 상대적인 MMP -1 양
LCB03-0008 63 LCB03-0066 40
LCB03-0015 71 LCB03-0067 47
LCB03-0018 77 LCB03-0070 67
LCB03-0030 60 LCB03-0072 65
LCB03-0032 35 LCB03-0076 83
LCB03-0033 32 LCB03-0079 87
LCB03-0034 38 LCB03-0080 55
LCB03-0035 41 LCB03-0082 64
LCB03-0036 35 LCB03-0083 64
LCB03-0037 32 LCB03-0084 62
LCB03-0038 69 LCB03-0085 56
LCB03-0039 71 LCB03-0086 63
LCB03-0040 36 LCB03-0087 62
LCB03-0041 31 LCB03-0088 67
LCB03-0042 24 LCB03-0089 59
LCB03-0048 96 LCB03-0090 67
LCB03-0049 62 LCB03-0091 69
LCB03-0053 87 LCB03-0092 71
LCB03-0054 88 LCB03-0093 59
LCB03-0057 68 LCB03-0094 65
LCB03-0058 57 LCB03-0101 79
LCB03-0059 54 LCB03-0106 72
LCB03-0060 44 LCB03-0107 15
LCB03-0061 47 LCB03-0108 13
LCB03-0062 42 LCB03-0109 15
LCB03-0063 51 LCB03-0110 8
LCB03-0064 50 LCB03-0111 11
LCB03-0065 54 LCB03-0112 13
그 결과, 인간 피부 섬유 아세포를 이용한 실험에서와 거의 마찬가지로 HaCaT 세포를 이용한 실험에서도 본 발명의 화합물들은 3 uM 처리 농도에서 UV-B조사에 의한 MMP-1 생성 증가를 저해하는 활성을 보여주었고 특히 LCB 03-0107에서 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내었다.
1-2. TNF -α 처리에 의한 인간 섬유 아세포에서 MMP -1 발현 변화 확인
본 발명의 화합물들이 염증성 사이토카인 TNF-α에 의한 인간 피부 섬유 아세포에서의 MMP-1의 생성 증가를 억제 할 수 있는지를 세포 배양을 이용한 실험에서 확인하였다.
인간 피부 섬유 아세포를 24 웰 배양 접시에서 바닥이 포화될 때까지 배양하고 배양액을 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환 한 후 여기에 10 mM DMSO에 녹인 각 화합물을 1 μM 의 농도로 처리하였다. 이후 30 분 후에 10 ng/ml의 농도로 TNF-α를 처리하였다. 이후에 세포를 세포 배양기에서 24시간 배양한 후 각 웰의 세포 배양액을 회수하였다. 배양액에서의 상대적인 MMP-1의 양을 실험예1과 같은 방법으로 측정하였다. 화합물이 처리되지 않고 TNF-α를 처리하지 않은 배지의 상대적인 MMP-1 양을 0%, 화합물이 처리되지 않고 TNF-α를 처리한 배지의 상대적인 MMP-1 양을 100% 로 한 후 각 화합물을 처리하고 TNF-α를 처리한 배양 웰의 배지의 상대적인 MMP-1양의 % 값을 다음 표 3에서 나타내었다.
화합물 상대적인 MMP -1 양 (%) 화합물 상대적인 MMP -1 양 (%)
LCB03-0008 64 LCB03-0066 15
LCB03-0015 59 LCB03-0067 40
LCB03-0018 78 LCB03-0070 46
LCB03-0030 53 LCB03-0072 52
LCB03-0032 31 LCB03-0076 31
LCB03-0033 32 LCB03-0079 35
LCB03-0034 26 LCB03-0080 33
LCB03-0035 33 LCB03-0082 63
LCB03-0036 30 LCB03-0083 48
LCB03-0037 34 LCB03-0084 46
LCB03-0038 57 LCB03-0085 51
LCB03-0039 59 LCB03-0086 69
LCB03-0040 25 LCB03-0087 71
LCB03-0041 17 LCB03-0088 46
LCB03-0042 12 LCB03-0089 69
LCB03-0048 89 LCB03-0090 42
LCB03-0049 54 LCB03-0091 42
LCB03-0053 79 LCB03-0092 43
LCB03-0054 73 LCB03-0093 46
LCB03-0057 61 LCB03-0094 47
LCB03-0058 49 LCB03-0101 61
LCB03-0059 31 LCB03-0106 76
LCB03-0060 24 LCB03-0107 17
LCB03-0061 23 LCB03-0108 14
LCB03-0062 24 LCB03-0109 16
LCB03-0063 25 LCB03-0110 7
LCB03-0064 24 LCB03-0111 12
LCB03-0065 29 LCB03-0112 14
그 결과, 본 발명에서 사용한 화합물들은 인간 섬유아세포 배양을 이용한 실험예 1에서의 UV-B를 조사한 실험에서의 결과와 거의 마찬가지로 1 uM 농도에서 TNF-α처리에 의한 MMP-1의 생성 증가를 저해하였다. 또한 표 1에서와 마찬가지로 특히 LCB 03-0107에서 LCB 03-0112의 화합물이 우수한 저해능을 나타내었다.
2. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 노화 억제 및 염증성 사이토카인 억제 확인
본 발명의 화합물 중 LCB 03-0110을 선택하여 자외선 조사 피부 노화 생쥐 동물 모델을 이용하여 주름 형성 방지, 표피층 증식 억제 등의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 활성이 있는지를 확인하고자 하였다.
2-1. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 피부 두께 변화 확인
6 주령 알비노 무모 생쥐 종인 SKH-1 생쥐 암놈을 각 군당 6마리씩하여 총 5군으로 나누어 실험군을 만들었다. 첫번째 군의 생쥐들에는 그 등부위에 자외선 조사나 LCB 03-0110처리 없이 150 ul의 에탄올만을 처리하고 (No UV군), 두번째 군에는 LCB 03-0110처리 없이 150 μl의 에탄올만을 매일 경피 도포하였다 (Vehicle 군). 나머지 3개의 동물 군에는 0.02%, 0.05%, 0.1%의 세 가지 다른 농도로 각각 에탄올에 녹인 LCB 03-0110 화합물을 생쥐 당 150 ul씩 UV를 조사하는 등 부위에 매일 1회 경피 도포하고 도포 후 30분 지나서 매 주 3회 UV-B를 조사하였다. UV-B 조사는 첫주에는 100 mJ/cm2 , 둘째주에는 200 mJ/cm2, 셋째주 이후부터는 300 mJ/cm2 로 매주 3회씩 총 8주간 지속적으로 조사하여 자외선에 의한 피부 노화를 유도하였다. 실험 시작 후 매 2주 마다 각 군의 생쥐의 피부 두께를 캘리퍼 (Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하여 각 군의 평균값과 표준 편차를 구하여 그 변화 정도를 꺽은선 그래프로 하여 도 1에서 나타내었다.
그 결과, 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 나타나는 공통적인 현상은 피부 두께가 증가하는 것인데 LCB 03-0110을 처리시 농도 의존적으로 피부 두께 증가를 유의성 있게 억제하였다.
2-2. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 주름 정도 변화 확인
또한 이 실험에서 매 2주마다 자외선을 조사하는 부위에서의 주름 형성 정도를 각 군에 대한 처리 방식을 전혀 모르는 3명의 관찰자를 이용하여 육안으로 비셋등이 제안한 스케일링 방식에 의거하여 (D. L. Bissett, et. al., Photochem Photobiol, vol. 46, no. 3, pp. 367-378, 1987) 평가 후 기록된 값을 각군에 대한 평균값과 표준편차를 내어 선 그래프로 도 2에서 나타내었다.
그 결과, 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 육안으로 평가한 주름 형성이 실험 진행에 따라 증가하였는데 LCB 03-0110 처리 할 때는 농도 의존적으로 그 증가가 유의성 있게 억제되었다.
2-3. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 주름의 평균 길이, 평균 깊이, 주름 영역 변화 확인
UV-B를 조사 후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물군의 피부는 UV-B를 조사하지 않은 정상군에 비해 깊고 긴 주름 형성이 뚜렸이 증가하였다. 하지만 0.1% LCB 03-0110을 처리한 동물군에서는 깊고 긴 주름 형성 정도가 뚜렸이 감소하였다. 기록된 각 영상을 Skin-Visiometer VL 650 과 그 소프트웨어 (Courage & Khazaka, Cologne, Germany)를 이용하여 주름의 평균길이, 평균 깊이, 그리고 주름 영역 %값을 이전 문헌에 (H. S. Kim, et. al., Eur J Pharmacol, vol. 689, no. 1-3, pp. 38-44, 2012) 제안된 방식에 따라 구하여 도 4에서 나타내었다. 0.1% LCB 03-0110을 처리한 동물군에서는 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름의 평균길이, 평균 깊이, 그리고 주름 영역 %값들의 증가 현상을 유의성있게 감소시켰다. (##; No UV-B 군 vs Vehicle 군, p<0.01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군, p<0.01, *; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군, p<0.05 by student t-test)
3. 반영 레프리카 제작 및 영상 촬영 결과
8주간의 실험을 종료하는 날 UV-B를 조사하지 않은 동물군 (No UV-B), UV-B를 조사 후 LCB 03-0110을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 동물군 (Vehicle), UV-B를 조사 후 0.1% LCB 03-0110 처리 후 UV-B를 조사한 동물 군 (0.1% LCB 03-0110)의 각 동물의 등 피부 부위에 실리콘 고무 재료를 적용하여 반영 레프리카 (impression replica)를 제작하고 이 레프리카 평면에 대해 35°도의 각도로 빛을 조사하며 주름 음영이 나타나는 영상을 찍은 후 각 군에서 얻은 대표적인 영상을 도 3에서 나타내었다.
그 결과, UV-B를 조사후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물의 피부는 UV-B를 조사하지 않은 정상에 비해 깊고 긴 주름 형성이 뚜럿이 증가하였다. 하지만 0.1% LCB 03-0110 을 처리한 동물군에서는 깊고 긴 주름 형성 정도가 뚜럿이 감소하였다.
4. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 표피층 길이 측정 결과
다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 생쥐들을 마지막으로 안락사 시키기 전에 마취 시킨 후 UV-B를 조사하지 않은 정상군 (No UV-B control), UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군 (Vehicle (ethanol)), 그리고 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군 (0.1% LCB 03-0110)의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 바이옵시(biopsy) 펀치를 이용하여 채취하였다. 이를 4% 포르말린 용액에서 픽싱(fixing)한 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 5-μm 두께의 절편으로 만든 후 파라핀을 제거하고 이를 통상적인 방법으로 조직 분석을 위해 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하였다. 염색한 각 피부 절편에 대해 5개의 영역을 임의로 선정하여 광학 현미경하에서 400배의 배율로 디지털 영상을 얻었다. 이 영상 중 각군에 대해 대표적인 영상을 도 5a에 나타내었다.
그 결과, UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군의 피부 조직에서는 UV-B를 조사하지 않은 정상군 조직에 비해 표피층 두께가 확연히 증가하였고 진피층에 염증성 세포들의 증가가 관찰되었다. 하지만 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 생쥐의 피부에서는 표피층 두께 증가가 확연히 감소되었으며 염증성 세포의 증가 경향도 뚜렸하게 줄어든 것을 관찰 할 수 있었다. 이 디지털 이미지들에서 표피층의 기저막 (basement membrane)에서 각질층의 맨 아래까지의 가장 짧은 직선 길이를 재서 표피층의 길이를 구하여 평균을 내어 도 5b 에서 나타내었는데 위의 도 5a에서 관찰한 LCB 03-0110의 처리가 지속적인 UV-B조사에 의한 표피층의 두께 증가를 유의성 있게 감소할 수 있다는 것을 확인 시켜 주었다. (##; No UV-B 군 vs Vehicle 군, p<0.01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군, p<0.01, by student t-test).
5. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 콜라겐 양 측정 결과
다음으로 위의 3군의 실험 군의 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록을 5-μm 두께의 절편으로 절단한 후 이 절편조직의 콜라겐 양의 정도를 알기 위해 마손-트라이크롬 염색을 하였다. 이후 광학 현미경 하에서 염색된 절편 부위 5군데를 임의로 정하여 400배의 디지털 영상을 얻은 후 이 영상 중 각군에 대해 대표적인 영상을 도표 6a에서 나타내었다.
그 결과, UV-B를 조사하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군의 피부 조직에서는 UV-B를 조사하지 않은 정상군 조직에 비해 콜라겐 단백질 염색 정도가 더욱 진하게 염색되는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 UV-B를 조사하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 생쥐의 피부에서는 UV-B 조사에 의한 콜라겐 염색 정도의 증가 경향이 뚜렷하게 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 이 디지털 이미지들의 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6.0 (Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 정량하여 UV-B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 각 실험동물군의 상대적인 값을 구하여 도 6b에 나타내었다. UV-B조사는 콜라겐 밀도를 유의성 있게 감소시키지만 UV-B조사와 함께 0.1% LCB 03-0110을 매일 처리한 실험군에서는 그 감소 정도가 유의성 있게 저해됨을 알 수 있다. (##; No UV-B 군 vs Vehicle 군, p<0.01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군, p<0.01, by student t-test). 이것은 LCB 03-0110의 피부 경피 도포가 자외선에 의한 노화 현상에서 피부조직 내의 콜라겐의 양이 줄어드는 것을 저해할 수 있음을 보여준다.
6. LCB 03-0110의 UV -B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 염증성 사이토카인 억제 확인
다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 UV-B를 조사하지 않은 정상군, UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군, 그리고 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직에서 단백질을 추출한 후 ELISA 법을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 양을 측정하여 그 결과를 도 7a (TNF-α)와 7b (IL-1β)에 나타내었다.
그 결과, 지속적인 자외선의 조사는 피부 조직 내에 TNF-α와 IL-1β의 염증성 사이토카인의 발현을 확연히 증가 시켰다. 하지만 0.1% LCB 03-0110의 경피 도포 처리는 이들 염증성 사이토카인의 증가 현상을 유의성 있게 억제하였다. (##; No UV-B 군 vs Vehicle 군, p<0.01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군, p<0.01, by student t-test). 이 결과는 LCB 03-0110가 지속적인 자외선 노출에 의해 생기는 피부 조직내의 염증성 면역반응을 억제 할 수 있음을 의미한다.
7. UV -B 조사에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억제 확인
배양된 HaCaT 세포나 인간 피부 섬유아세포에 LCB 03-0110을 화합물을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 등의 농도로 각각 처리한 후 30 분 후에 100mJ/cm2의 강도로 UV-B를 조사 후 2시간 후에 세포 파쇄액을 만들어 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리하고 JNK, p38, ERK의 항체 (JNK, p38, Erk)와 이들의 활성화 특이적 인산화 단백질을 인식하는 항체 (p-JNK, p-p38, p-ERK)를 이용하여 웨스턴블랏을 하여 이들 단백질의 UV 조사에 따른 활성화와 이의 LCB 03-0110에 의한 억제를 측정하여 도표 8a (HaCaT 세포) 와 8b (인간 섬유아세포)에서 나타내었다.
그 결과, 신호전달 단백질인 pJNK, p38, ERK 의 특정 인산화에 의해 활성화되는 결과를 보여주었다. 하지만 LCB 03-0110을 3 μM, 1 μM, 0.3 μM 의 농도로 UV-B를 조사하기 전에 처리한 경우는 UV-B 조사에 의한 pJNK와 p38의 특정 인산화에 의한 활성화가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. pJNK와 p38의 활성화가 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화와 관련 있다고 보고된 사실로부터 이 실험결과는 LCB 03-0110가 자외선 조사에 의한 케라티노사이트와 섬유아세포등의 피부 세포 내의 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하는 이유를 제공한다.
8. UV -B 조사에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포에서의 MMP -1, MMP -3 단백질 생성 억제 활성 확인
또한 배양된 HaCaT 세포나 인간 섬유 아세포의 배양배지를 혈청이 없는 DMEM 배지로 바꾸어 준 후 LCB 03-0110을 화합물을 3 μM, 1 μM 혹은 0.3 μM의 농도로 각각 처리하고 30 분 후에 100 mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사 후 48시간 후에 배양액을 회수하여 이를 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리한 후 배양액에 생성 분비된 MMP-1과 MMP-3 단백질의 양을 이들을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 측정 한 후 이를 도 9a(HaCaT 세포) 와 9b (인간섬유아세포)에서 나타내었다. GAPDH는 배양액 회수시에 각 세포를 회수하여 세포파쇄액을 만든 후 이를 전기영동 후 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하여 배양액 회수 시에 거의 같은 수의 세포가 배양되고 있었음을 보이고자 함이다.
그 결과, UV-B 조사에 의해 MMP-1과 MMP-3 단백질의 생성 분비된 양이 증가된 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b). 하지만 LCB 03-0110을 3 μM, 1 μM, 혹은 0.3 μM 의 농도로 UV-B를 조사하기 전에 처리한 경우는 MMP-1과 MMP-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이것은 LCB 03-0110가 자외선 조사에 의한 케라티노사이트나 섬유아세포등의 피부세포내의 pJNK과 p38 단백질의 특정 인산화에 의해 활성화를 억제하고 이것은 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하게 되고 이 두 전사요소에 의해 발현이 영향을 받는 MMP-1과 MMP-3단백질의 증가를 억제한다는 것을 보여준다. MMP-1과 MMP-3 단백질 활성은 피부조직내의 콜라겐을 파괴하여 피부 노화를 촉진하는 주요 원인이 되는데 따라서 이 결과는 LCB 03-0110의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 기전을 설명하는 것이다.
9. TNF -α 처리에 의한 인간 섬유 아세포에서의 MMP -1, MMP -3 단백질 생성 억제 활성 확인
배양된 인간 섬유 아세포의 배양 배지를 혈청이 없는 DMEM 배지로 바꾼 후에 LCB 03-0110을 화합물을 3 μM, 1 μM 혹은 0.3 μM의 농도로 각각 처리하고 다시 30 분 후에 10 ng/ml의 IL-1β나 10 ng/ml의 TNF-α를 처리한 후 48시간 배양하였다. 이후 세포배양액을 회수하여 이를 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리한 후 배양액에 생성 분비된 MMP-1 과 MMP-3 단백질의 양을 이들을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 측정 한 후 이를 도 10 에서 나타내었다. GAPDH는 배양액 회수 시에 각 세포를 회수하여 세포파쇄액을 만든 후 이를 전기영동 후 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하여 배양액 회수 시에 거의 같은 수의 세포가 배양되고 있었음을 보이고자 함이다.
그 결과, 섬유아세포에 IL-1β나 TNF-α 처리시 MMP-1과 MMP-3 단백질의 생성 분비된 양이 증가되는 것을 보여준다. 하지만 LCB 03-0110을 3 μM, 1 μM, 혹은 0.3 μM 의 농도로 염증성 사이토카인을 처리하기 전에 처리한 경우는 MMP-1과 MMP-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인해준다. 이것은 LCB 03-0110가 염증성 사이토카인인 IL-1β나 TNF-α 의 자극에 의해 섬유아세포등 피부세포가 증가된 MMP 단백질 생산 분비를 억제할 수 있음을 보여준다. 이 사실은 자외선 조사등 여러가지 이유로 피부에 염증이 생기고 그로 인해 염증성 사이토카인의 양이 증가하고 이들이 피부세포를 자극하여 MMP 단백질 발현을 증가시키며 이것은 결국 피부 조직의 콜라겐 단백질의 파괴로 연결되어 피부 노화를 유발하는 주요 원인중의 하나인데 LCB 03-0110 가 이러한 현상을 억제 할 수 있음을 보여준다.
10. LCB 03-0110의 UV -B 조사나 TNF -α 처리에 의한 HaCaT 세포에서의 전사요소 AP -1과 NF - kB 활성화 억제 활성 확인 결과
LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하는 활성을 보이는 지를 직접 확인하고자 하였다. 이를 위해 배양된 HaCaT 세포에 그냥 방치하거나 혹은 100 mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사하거나 혹은 10 ng/ml 의 농도로 TNF-α를 처리하고 2 시간 후에 각 세포를 수확 한 후 통상적인 방법으로 핵을 분리하고 이로부터 핵단백질을 포함하는 핵추출물을 얻었다. 이 추출물을 10% SDS-PAGE 전기영동으로 분리 후 NF-κB의 한 서브 유닛인 p65 단백질에 대한 항체로 웨스턴블랏을 하여 p65 단백질의 양을 정량하고 또한 NF-κB나 AP-1이 특이적으로 부착하는 시퀀스를 포함하는 DNA 이중나선 올리고 뉴크리오타이드 프로브를 이용하여 EMSA에세이를 시행하여 추출한 핵단백질 추출물에 포함된 활성 NF-κB양과 AP-1양을 정량하였다.
도 11a과 도 11b 에서 보여주는 바와 같이 자외선 조사나 TNF-α 처리에 의해 핵내에 p65 단백질 양이 증가하고 이 증가는 LCB 03-0110 처리시 그 농도 의존적으로 저해됨을 알 수 있다. 또한 도 11c와 11d에서 보여주는 바와 같이 자외선 조사나 TNF-α 처리에 의해 핵 내에 표적 염기서열에 부착할 수 있는 NF-κB양과 AP-1양이 증가하고 이 증가현상은 LCB 03-0110처리시 농도 의존적으로 저해됨을 알 수 있었다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for preventing skin aging or improving skin condition <130> DPP20136095KR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand comprising NF-kB binding site <400> 1 cgcttgatga ctcagccgga a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand comprising NF-kB binding site <400> 2 ttccggctga gtcatcaagc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand comprising AP-1 binding site <400> 3 cgcttgatga ctcagccgga a 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand comprising AP-1 binding stie <400> 4 ttccggctga gtcaagcg 18

Claims (16)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112015027097083-pat00008

    상기 X1 은 N 또는 CH이고;
    상기 R1은 -OH, 또는 -OCH3 이고;
    상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    상기 R2는 -(CH2)n-R3, -(CH2)n-C(O)-R3, 또는 -O(CH2)n-R3이고;
    상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3알킬아미노, 디C1-3알킬아미노, 하이드록시C1-3알킬아미노, 카르복시C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬C1-3알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록시피롤리디닐, 하이드록시C1-3알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐, 디C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및
    상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
    [구조식]
    Figure 112015027097083-pat00009

  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    3-(6-(페닐싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
    4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
    3-(6-브로모-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노)-페놀,
    4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페놀,
    3-[6-(4-메톡시페닐)-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노]-페놀,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    3-(6-(4-클로로페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-페네톡시페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피리딘-2-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (6-퓨란-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
    (6-퓨란-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
    3-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)-페놀,
    3-((6-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((4-메틸피페라진-1-일-메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(2-모폴리노에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에타논,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(피롤리딘-1-일)에타논,
    N,N-다이에틸-2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)아세트아마이드,
    3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조산,
    (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
    (3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(피롤리딘-1-일)메타논,
    N,N-다이에틸-3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아마이드,
    (3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
    메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실레이트,
    3-(6-(4-((2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(((2R,6S)-2,6-다이메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복사마이드 염산염,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실산 염산염,
    3-(6-(4-((2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    메틸 2-(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로파노에이트,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-3-올 염산염,
    3-(6-(4-(에톡시메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)-N-(1-하이드록시프로판-2-일)벤즈아마이드,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로판산,
    3-(6-(3-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(2-(피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-모폴리노페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-((4-메틸피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(모폴리노메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-메틸피페라진-1-일)싸이아졸로[4,5-d]피리미딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(모폴리노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산)
    3-(6-(4-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
    3-(6-(4-((에틸아미노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
    3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염은 무기산염, 유기카본산염 또는 설폰산염인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 무기산염은 염산염이고, 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 0.1 ~ 500mg/kg 체중으로 투여되는 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 투여는 경피 투여인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 제형은 연고, 크림 또는 패취제인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 약학적 조성물.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112015027097083-pat00010

    상기 X1 은 N 또는 CH이고;
    상기 R1은 -OH, 또는 -OCH3 이고;
    상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
    상기 R2는 -(CH2)n-R3, -(CH2)n-C(O)-R3, 또는 -O(CH2)n-R3이고;
    상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, C1-3알킬아미노, 디C1-3알킬아미노, 하이드록시C1-3알킬아미노, 카르복시C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬C1-3알킬아미노, 피롤리디닐, 하이드록시피롤리디닐, 하이드록시C1-3알킬피롤리디닐, 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐, 디C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐, C1-3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및
    상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐, 아미노, 에틸아미노, 디에틸아미노, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
    [구조식]
    Figure 112015027097083-pat00011

  11. 제9항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    3-(6-(페닐싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
    4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조나이트릴,
    3-(6-브로모-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노)-페놀,
    4-(4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페놀,
    3-[6-(4-메톡시페닐)-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-닐아미노]-페놀,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    3-(6-(4-클로로페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-페네톡시페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피리딘-2-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (6-퓨란-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
    (6-퓨란-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-(3-메톡시페놀)-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
    N-(3-메톡시페닐)-6-(4-(2-(피페라진-1-일)에톡시)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-아민,
    (3-메톡시페닐)-(6-싸이오펜-2-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일)-아민,
    3-(6-싸이오펜-3-일-싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)-페놀,
    3-((6-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((4-메틸피페라진-1-일-메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(피페리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-((6-(4-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(2-모폴리노에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에타논,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)-1-(피롤리딘-1-일)에타논,
    N,N-다이에틸-2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)아세트아마이드,
    3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤조산,
    (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐)(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
    (3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(피롤리딘-1-일)메타논,
    N,N-다이에틸-3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아마이드,
    (3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)페닐(4-메틸피페라진-1-일)메타논,
    메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실레이트,
    3-(6-(4-((2-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(((2R,6S)-2,6-다이메틸피페리딘-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복사마이드 염산염,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-2-카복실산 염산염,
    3-(6-(4-((2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    메틸 2-(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로파노에이트,
    1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤질)피롤리딘-3-올 염산염,
    3-(6-(4-(에톡시메틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)-N-(1-하이드록시프로판-2-일)벤즈아마이드,
    2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노[3,2-d]피리미딘-6-일)벤즈아미도)프로판산,
    3-(6-(3-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(3-(2-(피페라진-1-일)에틸)페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-모폴리노페닐)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-((4-메틸피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(모폴리노메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(4-메틸피페라진-1-일)싸이아졸로[4,5-d]피리미딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(모폴리노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산)
    3-(6-(4-(피페라진-1-일메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
    3-(6-(4-((에틸아미노메틸)싸이오펜-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피롤리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피페리딘-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(모폴리노메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(2-(3-((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노[3,2-b]피리딘-7-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-(피롤리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀,
    3-(6-(4-((4-메틸피페라진-1-일)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
    3-(6-(4-(피페리딘-1-일메틸)퓨란-2-일)싸이에노[3,2-d]피리미딘-4-일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 염은 무기산염, 유기카본산염 또는 설폰산염인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 무기산염은 염산염이고, 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 0.1 ~ 500mg/kg 체중으로 투여되는 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 투여는 경피 투여인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 상기 조성물의 제형은 연고, 크림 또는 패취제인 것인, 피부 노화 방지 또는 개선용 화장료 조성물.
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