WO2015080489A1 - 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

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WO2015080489A1
WO2015080489A1 PCT/KR2014/011488 KR2014011488W WO2015080489A1 WO 2015080489 A1 WO2015080489 A1 WO 2015080489A1 KR 2014011488 W KR2014011488 W KR 2014011488W WO 2015080489 A1 WO2015080489 A1 WO 2015080489A1
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phenol
ylamino
pyrimidin
phenyl
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양범석
김해종
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한국과학기술연구원
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Definitions

  • composition for preventing skin aging or improving skin condition Composition for preventing skin aging or improving skin condition
  • the present invention is to share a hydroxy (or meth) anilino-cyeno pyrimidine or hydroxy (or methoxy) anino-cyeno pyridine as a parent nucleus and a compound having an inhibitory activity against a plurality of tyrosine kinase as an active ingredient
  • Pharmaceutical composition and cosmetic composition for preventing skin aging or improving skin condition containing; And a method for preventing skin aging or a method for improving skin condition comprising administering to a subject an effective amount of said compound.
  • UV-A which has the largest energy and the shortest wavelength, is blocked before passing through the atmosphere and almost disappears.
  • UV-B which has the largest energy and the shortest wavelength, is blocked before passing through the atmosphere and almost disappears.
  • the second, shorter wavelengths of UV-B some of which also have the longest UV A, pass through the atmosphere and reach the Earth.
  • UV-B some of which also have the longest UV A, pass through the atmosphere and reach the Earth.
  • ROs reactive oxygen speci- es
  • MMP-1 matrix metalloproteinases
  • MMP-3 matrix metalloproteinases
  • MMP-9 matrix metalloproteinases
  • retinoids have the positive effect of improving wrinkles or improving elasticity, and have a disadvantage in that irritation occurs even when only a small amount is applied to the skin, and because of instability, they are easily oxidized and deteriorated. .
  • the present inventors have disclosed an anti-inflammatory compound having inhibitory activity against ascites tyrosine kinase and a pharmaceutical composition comprising the same through Korean Patent Publication No. 10-2013-0031266.
  • the document only describes the effects related to the inhibition of inflammation and tissue fibrosis symptoms or diseases of the compound, there is no disclosure related to skin aging or skin condition improvement.
  • the inventors have found that the compounds disclosed in the patent In addition to suppressing the increase of TNF- ⁇ or IL- ⁇ production by inflammatory cell activation and fibroblast activation, it simultaneously inhibits the increase in the expression of MMP family proteins by external stimulation in skin tissue or skin tissue-derived cells. It was confirmed for the first time that the activity has completed the present invention.
  • An object of the present invention is to share a compound having hydroxy (black memes) anilino thieno pyrimidine or hydroxy (or mesy) anilino thieno pyridine as a mother nucleus and having inhibitory ability against a plurality of tyrosine kinase. It is to provide a pharmaceutical composition for preventing skin aging or skin condition containing as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to share a hydroxy (or meso) anilino-cyeno ' pyrimidine or a hydroxy (or meso) anino-cyeno pyridine as a mother nucleus and have an inhibitory effect on a plurality of tyrosine kinase. It is to provide a cosmetic composition for preventing skin aging or improving skin condition containing a compound as an active ingredient.
  • compositions and cosmetic compositions for preventing skin aging or improving skin condition containing a compound represented by the formula (1), an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R1 is -0H, or -0C3 ⁇ 4;
  • Y is C6-10 aryl substituted with R2, or C5-10 heteroaryl or N-methylpiperazinyl substituted with R2;
  • R2 is eu (C3 ⁇ 4) n-R3, - (CH 2) nC (0) , and -R3, or -0 (C3 ⁇ 4) n-R3;
  • R3 is -H, -CN, halogen, C1-3 alkyl, C1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, C1-3 alkylamino, di C1-3 alkylamino, hydroxy C1-3 alkylamino, carboxy C1'3 alkylamino, C3-6 cycloalkyl C1-3 alkylamino, pyridinyl, hydroxypyridinyl, hydroxy C1-3 alkylpyridinyl, carboxypyridinyl piperidinyl, C1 -3 alkylpiperidinyl, di C1-3 alkylpiperidinyl, piperazinyl, C1-3 alkylpiperazinyl, C1'4 alkoxycarbonylpiperazinyl, or morphonyline; And n is an integer of 0 to 3.
  • Still another object of the present invention is to share hydroxyspecific (or methoxy) aniino thieno pyrimidine or hydroxy (or methoxy) anilino thieno pyridine as a mother nucleus and have an inhibitory effect on a plurality of tyrosine kinase.
  • a method comprising administering to a subject an effective amount of a compound, an isomer thereof, or a salt thereof, to provide a method for preventing skin aging or a method for improving skin condition.
  • XI is N or CH
  • R 1 is — 0H, or —0CH 3 ;
  • Y is C 6-10 aryl substituted with R 2, or C 5-10 heteroaryl substituted with R 2 or N-methylpirazinyl;
  • R2 is-(CH 2 ) n-R3,-(CH 2 ) nC (0) -R3, or 0 (C3 ⁇ 4) n-R3;
  • R3 is -H, -CN, halogen, C1-3 alkyl, C1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, C1-3 alkylamino, di C1-3 alkylamino, hydroxy C1-3 alkylamino, carboxy C1-3 alkylamino , C3-6 cycloalkyl C1-3 alkylamino , pyridinyl , hydroxypyridinyl , hydroxy C1-3 alkylpyridinyl , carboxypyridinyl piperidinyl , C1 -3 alkylpiperidinyl, di C1-3 alkylpiperidinyl, piperazinyl, C1-3 alkylpiperazinyl, C1-4 alkoxycarbonylpiperazinyl, or morphonyline; And n is an integer of 0 to 3.
  • An object of the present invention is a compound, an isomer thereof, or a physiologically acceptable hydroxy (or methoxy) anilino thieno pyrimidine or a hydroxy (black hydroxy) anilino thieno pyridine covalently It provides a use of a salt or a composition comprising the same as an active ingredient, and it has a physiological activity that inhibits fine wrinkles, deep wrinkle formation, and increased inflammatory response due to continuous UV irradiation on the skin. It can be used for the purpose of suppressing.
  • UV-B is a group not irradiated with UV-B
  • UV-B is a group irradiated with UV-B
  • Vehi cle or “Vehi c le (ethanol)
  • LCB 03-0110 shows the experimental group which irradiated UV-B and treated LCB 03-0110 which is a compound of this invention.
  • Figure 1 shows the difference in skin thickness increase in the treatment of LCB 03-0110 by concentration in the skin aging animal model experiment by ultraviolet light.
  • Figure 2 shows the difference in the degree of wrinkles when the LCB 03-0110 treatment for each concentration in the skin aging animal model experiment by ultraviolet light.
  • Figure 3 shows the result photograph after taking a wrinkle image after irradiating light at an angle of 35 ° with respect to the impress i on rep li ca plane in the skin aging animal model experiment by ultraviolet light. Representative images from each group
  • FIG. 4A shows the difference in wrinkle areas by repeated UV-B irradiation when treated with 0.1% LCB 03-0110 in skin aging animal model experiments with ultraviolet light.
  • Figure 4c is 0 in the skin aging animal model experiment by ultraviolet light. Treatment of 1% LCB 03-0110 shows the mean depth difference of wrinkles by repeated UV-B irradiation.
  • Figure 5a shows a digital image of the skin tissue of Group 3 animals taken immediately after the completion of the skin aging animal model experiment by ultraviolet light observed at 400 times magnification under a light microscope after hemaroxylin ⁇ eosin staining.
  • FIG. 5B shows the average of epidermal layer lengths in the digital images obtained in FIG. 5A.
  • FIG. 6A shows a digital image of a skin tissue paraffin block section taken from mice immediately after completion of the experiment of skin aging animal model by ultraviolet light under magnification-trichrome staining at 400 magnification.
  • FIG. 6B shows the normal collagen staining density of the normal animal skin which was not irradiated with UV ⁇ B by quantifying the relative collagen staining density in the digital images obtained in FIG. 6A using Image Pro Plus 6.0 software supplied by MediaCybernetics. The relative value of each group of experimental animals obtained with a density value of 100% is shown.
  • 7A and 7B are biopsy immediately after completion of the skin aging animal model experiment by ultraviolet light to extract proteins from the dorsal skin tissue of the mice and using the ELISA method TNF- ⁇ (Fig. 7a) and IL inflammatory cytokines The result of measuring the amount of - ⁇ (FIG. 7B) is shown.
  • FIG. 8A and 8B show cultured HaCaT cells (FIG. 8A) and human skin fibroblasts (FIG.
  • FIG. 9a and 9b are Western blot experiments using antibodies that recognize ⁇ P-1 and ⁇ P-3 when LCB 03-0110 was treated in cultured HaCaT cells (Fig. 9a) and human skin fibroblasts (Fig. 9b). The result is shown.
  • 10A and 10B show that when treated with cultured human dermal fibroblasts, LCB 03-0110, 10 ng / ml IL-1
  • the results of Western blot experiments using antibodies recognizing the changes of P-1 and P-3 are shown.
  • LCB 03-0110 treatment increased the amount of p65 subunits into the nucleus and increased the amount of nuclear protein extracts due to UV-B irradiation or activation of the transcription factor NF-kB by inflammatory cytokines. It shows the result of quantification by Western blot whether it suppresses dependently.
  • 11C and lid specifically detect NF-kB or AP-1 whether LCB 03-0110 treatment inhibits concentration-dependent transcription factor AP-1 and NF-kB activation by UV-B irradiation or inflammatory cytokines.
  • the results confirmed through the EMSA assay using double DNA oligonucleotides containing the sequence are shown.
  • the present invention is a first embodiment for achieving the above object.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition and a cosmetic composition for preventing skin aging or improving skin condition containing a compound represented by 1, an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for preventing skin aging or a method for improving skin condition, comprising administering to a subject an effective amount of a compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a salt thereof.
  • XI is N or CH
  • R 1 is —0H, or ⁇ 0C3 ⁇ 4;
  • Y is C6-10 aryl substituted with R2, or C5-10 heteroaryl or N-methylpiperazinyl substituted with R2;
  • R2 is-(C3 ⁇ 4) n-R3,-(C3 ⁇ 4) n— C (0) -R3, or -0 (CH 2 ) n-R3;
  • R 3 is — H, —CN, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, C 1-3 alkylamino, di C 1-3 alkylamino, hydroxy C 1-3 alkylamino, carboxy C 1-3 alkylamino, C 3 6 cycloalkyl C 1-3 alkylamino, pyrrolidinyl, hydroxypyridinyl, hydroxy C 1-3 alkylpyridinyl, carboxypyrrolidinyl, piperidinyl, C 1-3 Alkylpiperidinyl, di C 1-3 alkylpiperidinyl, piperazinyl, " C 1-3 alkylpiperazinyl, C 1-4 alkoxycarbonylpiperazinyl, or; morphonyline; and n is 0 to Is an integer of 3.
  • R3 is -H, -CN, halogen, C1-3 alkyl, C1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, ethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, Morphoniline or the following structural formula It may be a compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is any one selected from the group.
  • the salt may be an inorganic acid salt, ⁇ gi carbonate or sulfonate.
  • the inorganic acid salt is hydrochloride
  • the organic carbonate may be trifluoroacetic acid salt
  • the composition may be administered in 0.1 to 500mg / kg body weight.
  • the administration may be transdermal administration.
  • the present invention will be described in more detail.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition and a cosmetic composition for preventing skin aging or improving skin condition, comprising a compound represented by the following formula (1), an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • XI is N or CH
  • R 1 is —0H, or —0C3 ⁇ 4;
  • Y is C6-10 aryl substituted with R2, or C5-10 heteroaryl or N-methylpiperazinyl substituted with R2;
  • R2 is eu (C3 ⁇ 4) n eu R3, - (CH 2) nC (0) -R3, or _0 (CH 2) n-R3, and;
  • R 3 is —CN, halogen, C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, C 1-3 alkylamino, multi C 1-3 alkylamino, hydroxy C 1-3 alkylamino, carboxy C 1-3 Alkylamino, C3-6 cycloalkyl C1-3 alkylamino, pyridinyl, hydroxyspecificpyridinyl, hydroxy C1-3 alkylpyridinyl, carboxypyrrolidinyl, piperidinyl, C1-3 alkyl Piperidinyl, di C 1-3 alkylpiperidinyl, piperazinyl, C 1-3 alkylpiperazinyl, C 1-4 alkoxycarbonylpiperazinyl, or morphonyline; And n is an integer of 0 to 3.
  • R3 is -H, -CN, halogen, C1-3 alkyl, C1-3 alkoxy, phenyl, pyridinyl, amino, ethylamino, diethylamino, pyridinyl, Piperidinyl, piperazinyl, morphonyline, or any one selected from the group consisting of the following structural formulas.
  • the compounds of formula 1 of the present invention may form pharmaceutically acceptable salts, and such pharmaceutically acceptable salts include acids that form non-toxic acid addition salts containing pharmaceutically acceptable anions, such as hydrochloric acid.
  • Organic acids such as inorganic acids such as sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, etc.
  • a pharmaceutically acceptable salt can be formed with hydrochloric acid or trifluoroacetic acid.
  • Representative compounds among the compounds represented by the formula (1) include the following.
  • the names in parentheses are codenames used to distinguish compounds in the present invention:
  • the compound of the present invention is a 3 ′ (2 ′ (3- (morpholinomethyl) phenyl) thieno [3,2-b] pyridin-7-ylamino) phenol represented by LCB 03-0110.
  • LCB 03-0110 3- (morpholinomethyl) phenyl) thieno [3,2-b] pyridin-7-ylamino) phenol represented by LCB 03-0110.
  • the compound of formula (1) is a 7-chlorothienopyrimidine or thienopyridine by cloning a compound of (I) having a skeleton of thienopyrimidinone, thienopyridinone or thiazolopyrimidinone Synthesis of derivative (II), bromination to synthesize 2-broro-chlorochloropyripyridine or cytotopyridine derivative (III), followed by substitution reaction with aniline derivative (IV) (V) ) Compound can be synthesized.
  • Compound (V) is a compound having a thienopyrimidine, thienopyridine and thiazolopyrimidine backbone of formulas (I), 1-2 and 1-3, respectively, via Suzuki coupling. It can manufacture.
  • the compounds according to the invention inhibit the activation of immune cells involved in skin aging and fibroblasts activated in wound healing. Specifically, the present inventors confirmed that these compounds have the activity of simultaneously inhibiting the increase of TNF- ⁇ or IL- ⁇ ⁇ production and the expression of the VII P family protein by inflammatory cell activation and fibroblast activation.
  • MMP-1 expression was confirmed by ultraviolet irradiation or TNF- ⁇ treatment, which is an inflammatory cytokine, and the expression change when the compound of the present invention was treated was compared.
  • TNF- ⁇ treatment which is an inflammatory cytokine
  • the compounds used in the present invention inhibited the increase in ⁇ ⁇ 1 production by UV—B irradiation or TNF ⁇ ⁇ treatment in human fibroblasts or HaCaT cells at 3 ⁇ concentration, in particular, LCB 03-0107 to It was confirmed that the compounds between LCB 03-0112 had structural commonalities and showed excellent inhibition (Experimental Results 1-1 to 1 ′ 3).
  • LCB 03-0110 is selected from the compounds of the present invention to determine whether there is activity to inhibit skin aging caused by ultraviolet light, such as anti-wrinkle formation, epidermal layer growth inhibition, etc. using an animal model of ultraviolet irradiation skin aging mouse. It was.
  • UV-B irradiation or TNF-a of the compound of the present invention HaCaT cells, human fibroblast activation signaling inhibitory activity and MMP-1, MMP-3 protein production inhibitory activity was confirmed.
  • the composition of the present invention can be usefully used for skin aging prevention and / or skin condition improvement.
  • the improvement of the skin condition includes antioxidant, improvement of skin wrinkles, inhibition and improvement of skin aging, improvement of skin elasticity, improvement of vitiligo, and skin regeneration efficacy.
  • the pharmaceutical composition containing the compound represented by Formula 1, an isomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient may be used orally, parenterally, or rectally during clinical administration. It may be formulated in a dosage form such as transdermal, ocular, nasal, vascular injection, intramuscular injection, topical administration, plaster or patch form, but is not limited thereto.
  • compositions are described in Remington, The Science and Practise of Pharmacy, 20th ed. It can be conveniently prepared by well-known methods using pharmaceutical techniques such as those well known in 2000, etc.
  • All methods include the step of bringing into association the active ingredient with a carrier consisting of one or more ingredients.
  • the pharmaceutical composition is constantly mixed well to prepare the active ingredients in admixture with each or both of the liquid carrier or the crushed solid carrier and, if necessary, The product can be made in the desired form.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard / soft accelerators, solutions, suspensions, sachets, granules, lozenges, etc. These formulations may contain oils such as cottonseed oil, sesame oil, Edible oils such as coconut oil or peat oil), suspensions (e.g. tragacanth, alginate, acacia, dextran, carboxymethylcellulose sodium, gelatin, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydride) Synthetic or natural gums such as oxypropylcellulose, carbomer, polyvinylpyridone).
  • oils such as cottonseed oil, sesame oil, Edible oils such as coconut oil or peat oil
  • suspensions e.g. tragacanth, alginate, acacia, dextran, carboxymethylcellulose sodium, gelatin, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydride
  • Synthetic or natural gums such as oxypropylcellulose, carbomer, polyvin
  • the active ingredient may be prepared by pressure or molding using one or more accessory ingredients.
  • Pressurized tablets may contain binders (e.g. lactose, glucose, starch, gelatin, acacia gum, tragacanth gum, sodium alginate, carboxymethylcellulose, methyl, in addition to free-flowing active ingredients such as powders or granules).
  • binders e.g. lactose, glucose, starch, gelatin, acacia gum, tragacanth gum, sodium alginate, carboxymethylcellulose, methyl, in addition to free-flowing active ingredients such as powders or granules).
  • lubricants e.g. oleate salts, stearates, stearic acid magnesium, benzoates, acetates, sodium chloride
  • disintegrants e.g.
  • starches methylcellulose It can be prepared by mixing with rose, agar, bentonite, sodium croscarmellose, sodium starch glycolate, crospovidone), dispersant (polysorbate 80) and applying pressure. Molded tablets can be made by mixing the powdered active ingredient with a suitable inert solvent and molding using a molding machine.
  • compositions comprising the compound represented by Formula 1 as an active ingredient may be parenterally administered, and parenteral administration may be in the form of vascular injection, transdermal administration, topical administration, rectal administration, intramuscular injection, plaster or patch.
  • compositions suitable for topical administration may include liquid blacks, lotions, sub-liquids in the form of emulsions, such as gels or creams, ointments or pastes, or solutions or suspensions in the form of drops.
  • the pharmaceutical composition for administration through nasal oral absorption may be in the form of aerosol or spray form using powder or self-propelled spray. It is possible to make a composition. Methods for the preparation of such compositions are described in Modern Pharmaceutics, 2 ⁇ nd> ed. , GS Banker and CT. Rhodes (Eds.), Page 427-432, Marcel Dekker, New York; Modern Pharmaceutics, 3th ed., GS Banker and CT. Rhodes (Eds.), Page 618-619 and 718-721, Marcel Dekker, New York and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology vol. 10, J Swarbr i ck and J. You can follow the general method described in C. Boy lan (Eds), pages 191-221, Marcel Dekker, New York.
  • the pharmaceutical composition comprising the compound of Formula 1 may be a diluent, a buffer, a fragrance, a coloring agent, a surfactant, a precipitant, a preservative such as methyl hydroxybenzoic acid, an emulsifier or the like.
  • the active ingredient is administered in the form of a salt using a pharmacologically acceptable non-toxic acid or base, which may include more components, the preferred salt may be easily watered, for example, to achieve a certain degree of absorption. It can be dissolved in or weakly dissolved.
  • the dosage of the compound of the present invention to the human body may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the subject to be administered, and is generally based on an adult patient having a weight of 70 kg. As 0.1 to 500 mg / kg body weight, depending on the judgment of the doctor or pharmacist may be divided doses once a day.
  • the composition for preventing skin aging or improving skin condition according to the present invention may be, for example, a pharmaceutical composition or a cosmetic composition.
  • the pharmaceutical composition for preventing skin aging or improving skin condition may further contain pharmaceutical supplements and other therapeutically useful substances such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, salts and / or laxatives for controlling osmotic pressure. And may be formulated in various oral or parenteral dosage forms according to conventional methods. Parenteral dosage forms may be transdermal dosage forms, for example, but not limited to, lotions, ointments, gels, creams, patches or spray formulations. Dosage determination of the active ingredient is within the level of those skilled in the art,
  • the daily dosage will vary depending on various factors such as less progression, onset time, age, health condition, complications, etc. of the subject to be administered, but generally based on adults, the composition I / ig / kg to 200 mg / kg, preferably 50 / zg / kg to 50 mg / kg may be administered by dividing 1 to 3 times a day, the dosage does not limit the scope of the invention in any way.
  • the cosmetic composition for preventing skin aging or improving skin condition is not particularly limited in formulation, and may be appropriately selected as desired.
  • supple cream skin lotion and milk lotion
  • nourishing cream essence
  • nourishing cream massage cream, pack, gel, essence
  • eye cream eye essence
  • cleansing cream cleansing foam
  • cleansing water cleansing water, pack, powder
  • It may be prepared in any one or more formulations selected from the group consisting of body lotion, body cream, body oil and body essence, but is not limited thereto.
  • UV-B was irradiated at a distance of 30 cM from the surface of the cultured cells, and the intensity of UV-B irradiation at the surface of the cultured cells was measured using a UV meter (Waldmann GmbH & Co., Vi 1 l ingeni Schwenningen, Germany). In this experiment, the UV_B irradiation intensity was irradiated with an intensity of 100 mJ / cm2.
  • Experimental Example 2 Quantification of M P-1 Protein in Culture
  • Human fibroblasts black HaCaT cells were cultured as in Experiment 1 until the bottom was saturated in a 24-well plate. UV-B irradiation of 100 mJ / cm2 amount of black inflammatory cytokines 10 ng / ml TNF- ⁇ and black 10 ng / nd IL- ⁇ ⁇ The cultures were recovered after 24 to 48 hours.
  • the ELISA kit for P-1 sold by R & D system was purchased and quantified according to the protocol provided by the manufacturer. According to the amount of -1 P-1, the absorbance caused by the color reaction was measured and its relative amount was determined. It was confirmed that the absorbance according to the amount of P-1 increased proportionally up to 0.4.
  • UV-aging skin aging animal model SKH-1 mouse female, a 6-week-old albino hairless mouse species, was purchased from Char les River Laboratory (Wi lmington, Ma, USA) and stabilized in the laboratory for 1 week.
  • UV-B over 30 cM of mice using a TL20W / 01RS UV lamp (Phi l ips, Somerst, NJ, USA) with emission spectra between 275 nM and 380 nM (peak, 31 to 315 Hz)
  • UV-C having a wavelength of 290 nM or less was removed using a Kodak filter.
  • UV-B irradiation intensity on the skin surface of the mouse was used with a UV meter (Waldmann GmbH & Co., Vi 1 1 ingen-Schwenningen, Germany). The intensity at the surface of the mouse was about 0.5 mW / cm 2.
  • the amount of UV-B irradiation required to induce a strong interest in the skin of mice and the like was measured and measured as 100 mJ / cm 2. In this experiment, this dose was defined as 1 MED (Minimal Erythema Dose).
  • a total of eight weeks of UV-B irradiation were performed three times a week (Monday, Wednesday, and Friday) on the surface of each mouse.
  • the dose was 1 MED in the first week and 2 MED in the second week, 3 MED from the third to the last week.
  • the experimental animal group was divided into 5 groups of 6 animals in each group.
  • One control group was treated with ethane only and did not irradiate UV-B.
  • Another control was treated only with ethane and UV ⁇ B irradiation.
  • the other three animals were exposed to UV-B daily by irradiating with 150 ⁇ l of LCB 03-0110 compound dissolved in ethanol at three different concentrations of 0.02%, 0.05% and 0.1%.
  • UV On the day of ⁇ irradiation, apply 30 minutes after UV irradiation ⁇ Every two weeks after the start of the experiment, gently lift the skin of each group of mice with tweezers, and then use a caliper (Tokyo, Japan) to thicken the skin. The average value and standard deviation of each group were calculated. The average value and standard deviation of each group were obtained by evaluating the wrinkles by visual observation based on the scaling method proposed by Bisset et al. Using three observers who did not know the treatment method for each group every two weeks.
  • the cells of the culture dish were dissolved and heated for 2 minutes at 100 ° C and centrifuged using a microcentrifuge at 12,000 rpm, and the supernatant was recovered to obtain a cell lysate sample. .
  • the amount of specific protein contained in these samples was measured using Western blot technique. Samples were separated by 10% SDS ⁇ poly acrylamide gel electrophoresis and transferred to PVDF membrane. This membrane was incubated for 2 hours in a skim milk solution dissolved in TBS buffer and quantitated to be diluted 500-5000 times. The primary antibody of the protein is added and incubated at room temperature for 2 hours.
  • the antibodies used in this example were purchased and used.
  • HaCaT cells cultured Five million HaCaT cells cultured are subjected to UV-B irradiation or TNF-a treatment as described above to obtain nuclear extracts of these cells. That is, after replacing the culture medium with PBS, carefully scrape the cells, and after recovery, simply wash with 4 ° C PBS.
  • the cells are suspended in 4 ° C hypotonicity buffer with 20 mM Tr i s-HCl, H 7.4, 10 mM NaCl 3 mM MgC12 protease inhibitor caltail (BMS) and iced for 10 minutes. Leave it. And the loose cells Use homogenizer to gently homogenize about 10 times.
  • the pellet was recovered by centrifugation at 4 ° C 3000 rpm for 10 minutes to obtain a cell nucleus.
  • BMS protease inhibitor cocktail
  • an EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) assay was performed to determine the amounts of active NF-icB and AP-1 transcription elements contained in the nuclear extract.
  • EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • the UV oligomer DNA was immobilized by irradiating it with UV.
  • the oligomeric DNA immobilized on the membrane is labeled with streptoavidin-HRP that recognizes the attached biotin, and then expresses the chemluminescence signal according to the manufacturer's protocol using a Chemi luminescent EMSA kit purchased from Pierce (USA). It could be detected by the autoradiography using an X-ray film.
  • the EMSA assay of AP-1 was performed in the same manner as the above NF- ⁇ assay except for the following.
  • the sense strand (SEQ ID NO: 3: 5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA ⁇ 3 ') of the DNA oligonucleotide attached to the biotin at the 3' position including the AP-1 attachment site shown in the previous literature.
  • Sense strands (SEQ ID NO: 4: 5'- TTC CGG CTG AGT CM GCG-3 ') (Angel P., and Karin, M. Biochem. Biophys. Acta, 1072, 129-157 (1991)) Annealing was made into a double helix structure, and 10% glycerol was used as the AP-1 attachment buffer.
  • cell culture medium after 24 hours in a condition of irradiating or irradiating with UV-B at an intensity of 100 mJ / cm2 after 30 minutes with or without treatment of each compound dissolved in DMS0 in human skin fibroblast cell culture at a concentration of 3 ⁇ was recovered.
  • ELISA enzyme immunoassay kit
  • the absorbance due to the presence of MMP-1 was obtained from the culture broth recovered to determine the relative amount of P-1 in each culture medium.
  • Each compound was determined when the relative amount of P-1 in the medium without any compound and no UV irradiation was 0% and the relative amount of P-1 in the culture medium without the compound was irradiated with UV was 10 OT.
  • Table 1 shows the relative% P-1 amounts of the cultured wells that were treated and irradiated with UV. It can be evaluated to what extent each compound treated in this table inhibits the increase in production of MMP-1 in human dermal fibroblasts by ultraviolet irradiation.
  • the compounds of the present invention showed the activity of inhibiting the increase of MMP-1 production by UV-B irradiation at 3 ⁇ treatment concentration, especially LCB Compounds between 03-0107 and LCB 03-0112 had structural commonalities and showed excellent inhibition.
  • the compounds used in the present invention were cultured in human fibroblasts.
  • the production of MMP-1 was inhibited by TNF- ⁇ treatment at a concentration of 1 ⁇ .
  • LCB 03-0107 compound of LCB 03-0112 showed excellent inhibition.
  • IXB 03-0110 was selected to determine whether there is activity to inhibit skin aging by ultraviolet rays such as anti-wrinkle formation, epidermal layer proliferation, and the like by using an ultraviolet-ray skin aging mouse animal model.
  • mice Six groups of 6-week-old albino hairless mouse species, SKH-1 mouse females, were divided into a total of five groups, each of which was made into an experimental group.
  • the first group of mice was treated with 150 ul of ethanol only without UV irradiation or LCB 03-0110 treatment on the back (No UV group), and the second group was percutaneously coated with 150 ⁇ l of ethanol daily without LCB 03-0110 treatment. (Vehi cle group).
  • the other three animals were applied once per day to the site, each time with three different concentrations of 0.023 ⁇ 4, 0.05% and 0.01%, LCB 03-0110 compound dissolved in ethanol at 150 ul per mouse, irradiated with UV.
  • UV—B was irradiated three times a week 30 minutes after application. UV-B irradiation was continuously conducted for 3 weeks every week for 100 mJ / cm2 in the first week, 200 mJ / cm2 in the second week, and 300 mJ / cm2 after the third week to induce skin aging by UV rays. Every two weeks after the start of the experiment, the skin thickness of each group of mice was measured using a caliper (Tokyo, Japan), and the mean value and standard deviation of each group were obtained. As a result, a common phenomenon in the skin aging animal model caused by ultraviolet light is the increase in skin thickness, which significantly inhibited the increase in skin thickness in a concentration-dependent manner when LCB 03-0110 was treated.
  • the skin tissues of the group treated with ethane only without UV-B irradiated with UV-B significantly increased the thickness of the epidermal layer compared to the normal group without UV ⁇ B and increased inflammatory cells in the dermis. It became.
  • the thickness of epidermal layer was markedly decreased and the tendency of inflammatory cells was significantly reduced.
  • the length of the epidermal layer was obtained by averaging the shortest straight length from the basement membrane of the epidermal layer to the bottom of the stratum corneum and averaged as shown in FIG. 5B.
  • LCB 03-0110 compounds After treatment with cultivated HaCaT cells or human dermal fibroblasts, LCB 03-0110 compounds at concentrations of 3 ⁇ , 1 ⁇ , 0.3 ⁇ , etc., respectively, were irradiated with UV-B at an intensity of 100 m J / cm2 after 30 min. After time, cell lysates were made and isolated on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and antibodies that recognize JNK, P 38, ERK antibodies (JNK, p38, Erk) and their activation specific phosphorylated proteins (p- Western blot using JNK, p- P 38, p-ERK) was used to measure the activation of these proteins according to UV irradiation and their inhibition by LCB 03-0110. Tables 8a (HaCaT cells) and 8b (human fibroblasts) were measured. ).
  • LCB 03 '0110 provides a reason for inhibiting the activation of transcription factors AP-1 and NF-kB in skin cells such as keratinocytes and fibroblasts by ultraviolet irradiation.
  • the culture medium of cultured HaCaT cells or human fibroblasts was changed to DMEM medium without serum, and LCB 03-0110 was treated with compounds at concentrations of 3 ⁇ , 1 ⁇ or 0.3 ⁇ , respectively, for 30 minutes.
  • the culture solution was recovered 48 hours later, separated from 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and produced and secreted ⁇ P-1 and fflP-3 proteins.
  • the amount of was measured by Western blot using an antibody that specifically recognizes them, and it is shown in FIGS. 9a (HaCaT cells) and 9b (human fibroblasts).
  • GAPDH is intended to show that almost the same number of cells were incubated at the time of culture recovery by Western blot using antibody against GAPDH after electrophoresis after collecting each cell at the time of culture recovery. .
  • LCB 03-0110 inhibits activation by specific phosphorylation of pjNK and p38 proteins in skin cells such as keratinocytes and fibroblasts by UV irradiation, which inhibits the activation of transcription factor AP-1 and NF-kB. It is shown that expression of both transcription factors inhibits the increase in the proteins ⁇ P-1 and P-3 that are affected. MMP-1 and MMP-3 protein activity is a major cause of promoting skin aging by destroying collagen in skin tissues. Thus, this result explains the mechanism by which LCB 03-0110 inhibits UV aging. 9. Confirmation of MMP-1, M P-3 Protein Production Inhibitory Activity in Human Fibroblasts by TNF- ⁇ Treatment
  • LCB 03-0110 was treated with compounds at concentrations of 3 ⁇ , 1 ⁇ or 0.3, respectively, and after 30 minutes, 10 ng / ml IL- After treatment with ⁇ or 10 ng / ml TNF- ⁇ , the cells were incubated for 48 hours. Then, the cell culture solution was recovered and separated by 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, followed by Western blot using an antibody that specifically recognizes the amount of -1 P-1 and fflP-3 proteins produced and secreted in the culture medium. After measurement as shown in FIG. GAPDH recovered each cell at the time of culture recovery to make a cell lysate, and electrophoresed it, followed by Western blot using antibody against GAPDH. It is.
  • LCB 03-0110 was treated before treatment with inflammatory cytokines at concentrations of 3 ⁇ , 1 ⁇ , and black ⁇ 0.3 ⁇ , the increase in protein levels of Li P-1 and Li 3 was increased. 0110 confirms suppression of treatment concentration dependent. This suggests that LCB 03-0110 can inhibit the production of ⁇ P protein produced by skin cells such as fibroblasts by stimulation of inflammatory cytokines IL- ⁇ or TNF-a.
  • the extract was separated by 10% SDS-PAGE electrophoresis and subjected to Western blotting with an antibody against p65 protein, a subunit of NF- ⁇ ⁇ , to quantify the amount of p65 protein and also to be specific for NF- ⁇ ⁇ or AP-1.
  • DNA double-helix containing a sequence attached to each other and the nucleotide probes were used to quantify the amount of active NF- ⁇ ⁇ and AP-1 contained in the extracted nuclear protein extract by EMSA assay.
  • the amount of p65 protein in the nucleus was increased by UV irradiation or TNF-a treatment, and this increase was inhibited in a concentration-dependent manner when LCB 03-0110 was treated.
  • the amount of NF- ⁇ ⁇ and AP-1 that could be attached to the target sequence in the nucleus was increased by self-irradiation or TNF-a treatment, and the increase was LCB 03-0110 treatment. It was found that inhibition was concentration dependent upon time.

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Abstract

본 발명은 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시(혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물; 및 상기 화합물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화를 방지하는 방법 또는 피부 상태를 개선하는 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물
[기술분야]
본 발명은 하이드록시 (혹은 메특시 ) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시 (혹은 메톡시 ) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물; 및 상기 화합물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 노화를 방지하는 방법 또는 피부 상태를 개선하는 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
햇볕을 2이게 되면 노출된 피부는 자외선을 조사 받게 된다. 햇볕의 자외선은 파장의 크기에 따라 UV-A , UV-B , UV-C 세 종류로 나누어지는데 이중 에너지가 가장 크고 파장이 가장 짧은 UV-C는 대기권을 통과하기 전에 차단되어 거의 모두 없어지고 두 번째로 파장이 짧은 UV-B는 일부가 또한 파장이 가장 긴 UV A 경우는 상당히 많은 양이 대기권을 통과하여 지구상에 도달하게 된다. 지구상에 도달한 자외선은 피부 조직과 세포에 자극과 손상을 야기하게 되는 가장 중요한 환경적 요인으로 작용한다.
지속적인 자외선 조사를 받게 되면 피부 조직에는 잔주름 및 깊은 주름 형성， 피부 건조， 기미 형성 등이 유도되어 피부 조직의 노화가 촉진되고 또한 세포 내의 DNA에 손상을 주어 피부암을 유발하기도 한다. 사람이 나이에 따른 피부의 노화 현상을 촉진하는 가장 중요한ᅳ원인으로 상당 기간 동안의 지속적인 자외선에 대한 노출을 들고 있다.
피부 조직에 자외선이 가해지면 표피층에 존재하는 케라티노사이트 세포나 진피층의 섬유아세포 등의 세포 내에서 활성산소 (react ive oxygen spec i es , R0S)의 생성이 증가되는데 이것이 피부세포에 산화적 스트레스를 주고 조직 내에 염증을 유발하여 궁극적으로 자외선에 의한 여러 피부 손상과 노화의 근본 원인으로 작용한다. 자외선이 피부 세포에 조사되면서 생성된 R0S는 p38 , JNK, MAPK 등 신호 전달 카이네이즈들을 활성화시키는데 이들 활성화된 카이네이즈들에 의한 신호는 Nuc lear Factor- κ Β (NF- κ Β) 와 Act ivator Protein 1 (AP-l )등의 전사요소의 활성을 증가시키게 된다. 이들 활성화된 전사 요소들은 궁극적으로 여러 유전자 들의 발현을 증가시키는데 이중 특히 MMP-l , MMP-3 , MMP-9 등의 매트릭스 메탈로프로티아제 (matr ix metal loproteinase (醒 P) ) 패밀리 등의 콜라겐 단백질 분해 효소들과 IL-Ι β 와 TNF- α와 같은 염증 촉진 사이토카인 (proinf lammatory cytokine)들의 발현의 증가는 피부조직의 노화와 손상의 직접적인 원인이 된다.
피부 조직에서 증가된 MMP 들은 피부 조직에서 조직의 강도와 탄력을 유지하는데 필요한 파이버 콜라겐 단백질의 분해를 촉진하여 아들 파이버 콜라겐 단백질의 양을 줄이고 또한 단편으로 잘라지게 만드는데 이것이 피부의 노화와 주름을 유발하는 결정적인 원인이다.
현재까지 피부 노화에 대해 가장 효과적으로 알려져 있는 방안은 레티놀과 레티노산을 이용한 방안이다. 그러나， 레티노이드는 주름개선 또는 탄력개선이라는 긍정적인 효과와 더불어， 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며， 또한 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 산화 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 있다.
본 발명자들은 한국공개특허 10-2013-0031266호를 통하여， 복수꾀 타이로신 카이네이즈에 대한 저해 활성을 가지는 항염증 화합물 및 이를 포함하는 약학적 조성을 공개한 바 있다. 그러나, 상기 문헌에서는 해당 화합물의 염증및 조직섬유화 증상이나 질환의 억제에 관련된 효과만 기재되어 있을 뿐， 피부 노화 또는 피부 상태 개선과 관련된 내용은 전혀 개시된 바가 없다.
【발명의 상세한 설명]
[기술적 과제】
이러한 배경 하에서， 본 발명자들은 상기 특허에 공개된 화합물이 염증세포 활성화와 섬유 아세포의 활성화에 의한 TNF- α 나 IL-Ι β 생성의 증가에 대한 억제뿐만이 아니라， 피부 조직이나 피부 조직 유래 세포에서 외부 자극에 의한 MMP 패밀리 단백질의 발현의 증가를 동시에 억제하는 활성을 가지는 것을 처음으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 목적은 하이드록시 (흑은 메특시 ) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시 (혹은 메특시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부상태 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이드록시 (혹은 메특시 ) 아닐리노 싸이에노 ' 피리미딘이나 하이드록시 (혹은 메특시 ) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
세
쇼5쒜 ^ 상기 XI 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -0H , 또는 -0C¾ 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴， 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 ᅳ (C¾)n-R3 , -(CH2)n-C(0)-R3 , 또는 -0(C¾)n-R3이고;
상기 R3는 -H , -CN , 할로겐， C1-3알킬, C1-3알콕시， 페닐, 피리디닐, 아미노， C1— 3알킬아미노, 디 C1-3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노， 카르복시 C1ᅳ 3알킬아미노， C3-6사이클로알킬 C1-3알킬아미노， 피를리디닐, 하이드록시피를리디닐， 하이드록시 C1-3알킬피를리디닐， 카르복시피를리디닐 피페리디닐， C1-3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐， 피페라지닐， C1- 3알킬피페라지닐, C1ᅳ 4알콕시카르보닐피페라지닐， 또는 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하이드특시 (혹은 메톡시) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시 (혹은 메특시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하며 복수의 타이로신 카이네이즈에 대한 저해능을 가지는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는.， 피부 노화를 방지하는 방법 또는 피부 상태를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로， 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 피부 노화를 방지하는 방법 또는 피부 상태를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure imgf000005_0001
상기 XI 은 N또는 CH이고;
상기 R1은 — 0H , 또는 -0CH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴， 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피쩨라지닐이고;
상기 R2는 -(CH2)n-R3 , -(CH2)n-C(0)-R3 , 또는 0(C¾)n-R3이고;
상기 R3는 -H , -CN, 할로겐， C1-3알킬， C1—3알콕시， 페닐， 피리디닐， 아미노， C1— 3알킬아미노， 디 C1-3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노， 카르복시 C1— 3알킬아미노， C3-6사이클로알킬 C1-3알킬아미노， 피를리디닐， 하이드록시피를리디닐， 하이드록시 C1-3알킬피를리디닐， 카르복시피를리디닐 피페리디닐， C1-3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐， 피페라지닐， C1- 3알킬피페라지닐， C1-4알콕시카르보닐피페라지닐， 또는 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
【유리한 효과】
본 발명의 목적은 하이드록시 (혹은 메록시 ) 아닐리노 싸이에노 피리미딘이나 하이드록시 (흑은 메록시) 아닐리노 싸이에노 피리딘을 모핵으로 공유하는 화합물， 이의 이성질체， 또는 이의 생리적으로 허용 가능한 염 , 혹은 이를 유효성분으.로 하는 조성물의 용도를 제공하며， 이를 이용하면 피부에 지속적인 자외선 조사 노출 등에 의한 잔주름과 깊은 주름 형성， 염증반응 증가 등을 억제하는 생리활성 기능을 가지기 때문에 피부 노화를 억제하는 용도로 사용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 및 도 7b에서 "No UV-B" 또는 "No UV-B control " 은 UV-B를 조사하지 않은 실험군， "UV-B" 는 UV-B를 조사한 실험군, "Vehi cle" 또는 "Vehi c le(ethanol ) " 은 UV-B를 초사하고 에탄을만 처리한 실험군, "LCB 03-0110" 은 UV-B를 조사하고 본 발명의 화합물인 LCB 03-0110을 처리한 실험군을 나타낸다.
도 1은 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 LCB 03-0110을 농도 별로 처리 시 피부 두께 증가 차이를 나타낸다. " 도 2는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 LCB 03-0110을 농도 별로 처리 시 주름 형성 정도의 차이를 나타낸다.
도 3은 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 반영 레프리카 ( impress i on rep l i ca) 평면에 대해 35° 도의 각도로 빛을 조사 후 주름 영상을 찍은 후 결과 사진을 나타낸다. 각 군에서 얻은 대표적인 영상을 나타낸 것이고
도 4a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0. 1% LCB 03- 0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름 영역 (wr inkl e area)의 차이를 나타낸다.
도 4b는 자외선쎄 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0. 1% LCB 03-
0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 평균 주름 길이 (Mean l ength)의 차이를 나타낸다.
도 4c는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험에서 0 . 1% LCB 03- 0110을 처리시 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름의 평균 깊이 (Mean depth) 차이를 나타낸다.
도 5a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 채취한 3군 동물의 피부조직을 헤마록실린ᅳ에오신 염색 후 광학 현미경하에서 400배의 배율로 관찰한 디지털 이미지를 나타낸다.
도 5b는 도 5a에서 얻은 디지털 이미지들에서 표피층 길이의 평균을 나타낸다.
도 6a는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록 절편조직을 마손 -트라이크롬 염색 후 광학 현미경 하에서 400배율로 관찰한 디지털 이미지를 나타낸다. 도 6b는 도 6a에서 얻은 디지털 이미지들에서 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6.0 ( Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 정량하여 UVᅳ B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 구한 각 실험동물군의 상대적인 값을 나타낸다. 도 7a 및 7b는 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델 실험 완료 직후 생체검사 (biopsy)하여 생쥐들의 등 부위 피부조직에서 단백질을 추출한 후 ELISA 법을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF- α (도 7a)와 IL-Ιβ (도 7b)의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 배양된 HaCaT 세포 (도 8a) 및 인간 피부 섬유아세포 (도
8b)에서 LCB 03-0110을 처리한 경우， pᅳ JNK, p-p38 , p-ERK를 이용하여 웨스턴블랏 실험을 한 결과를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 배양된 HaCaT 세포 (도 9a) 및 인간 피부 섬유아세포 (도 9b)에서 LCB 03-0110을 처리한 경우， 匪 P-1과 醒 P-3를 인식하는 항체를 이용한 웨스턴블랏 실험을 한 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 배양된 인간 피부 섬유아세포에 LCB 03-0110을 처리한 경우， 10 ng/ml의 IL-1|3 (도 10a)나 10 ng/ml의 TNF— α (도 10b) 처리에 의한 匪 P-1과 腿 P— 3의 생성분비.변화를 薩 P— 1과 腿 P-3를 인식하는 항체를 이용한 웨스턴블랏 실험결과를 나타낸다.
도 11a 및 lib는 LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 NF-kB의 활성화로 인해 p65 서브유닛이 핵내로 이동하여 핵 단백질 추출액애 그 양이 증가하는 것을 것을 농도 의존적으로 억제하는지를 웨스턴블랏을 통하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 11c 및 lid는 LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 농도 의존적으로 억제하는지를 NF-kB 혹은 AP-1을 특이적으로 인식하는 시뒌스를 포함하는 이중 DNA 을리고뉴클레오타이드를 이용한 EMSA 에세이를 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 하기 화학식
1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 염의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 노화를 방지하는 방법 또는 피부 상태를 개선하는 방법에 관한 것이다.
1]
Figure imgf000009_0001
상기 XI 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -0H , 또는 ᅳ 0C¾ 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴， 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(C¾)n-R3 , -(C¾)n— C(0)-R3 , 또는 -0(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 — H , -CN , 할로겐， C1-3알킬， C1-3알콕시， 페닐， 피리디닐, 아미노， C1-3알킬아미노, 디 C1— 3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노， 카르복시 C1-3알킬아미노, C3 6사이클로알킬 C1-3알킬아미노, 피롤리디닐， 하이드록시피를리디닐， 하이드록시 C1-3알킬피를리디닐， 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐， C1— 3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐, 피페라지닐， "C1- 3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피페라지닐， 또는; 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
바람직하게， 상기 R3는 -H, -CN , 할로겐, C1-3알킬， C1-3알콕시， 페닐， 피리디닐， 아미노， 에틸아미노， 디에틸아미노， 피롤리디닐， 피페리디닐, 피페라지닐， 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
[구조식]
Figure imgf000010_0001
또한 바람직하게， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
3- (6- (페닐싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀，
4- (4-(3ᅳ메특시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴,
4-(4-( 3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [ 3， 2— d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴，
3- (6-브로모 -싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-닐아미노) -페놀， .
4- ( 4- ( 3-메톡시페닐아미노)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘 -6-일)페놀， 3- [ 6- ( 4-메톡시페닐 ) -싸이에노 [ 3； 2-d ]피리미딘—4 닐아미노] -페놀, N-(3-메톡시페닐) -6-(4-(2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-아민，
3-(6-(4-클로로페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀, 3-(6-(4-(2-모폴리노에록시)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
N- ( 3-메톡시페닐) -6- ( 4-페네톡시페닐)싸이에노 [ 3， 2— d ]피리미딘 -4- 아민,
N-(3-메톡시페닐 )-6-(4-(2- (피리딘 -2-일 )에록시.)페닐 )싸이에노 [3， 2一 d]피리미딘 -4-아민，
(6-퓨란 -2-일ᅳ싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일) -(3-메특시페놀) -아민, (6-퓨란 -3-일ᅳ싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일 )-(3-메록시페놀) -아민， N-(3—메특시페닐) -6-(4-(2- (피를리딘 -1- 일)에록시)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민，
. N-(3-메톡시페닐 )-6- (싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민 (3ᅳ메록시페닐 )-(6-싸이오펜 -3—일 -싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일 ) - 아민，
N-(3-메특시페닐) -6-(4-(2- (피페라진— 1- 일 )에톡시 )페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민，
(3-메록시페닐 )-(6-싸이오펜 -2-일 -싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일 )- 아민，
3-(6-싸이오펜 -3-일-싸이에노 [3，2— d]피리미딘 -4-일아미노) -페놀，
3-( (6-(4- (모폴리노메틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4— (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(4- (피를리딘 -1ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4- (피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-( (4—메틸피페라진 -1-일-메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2ᅳ
d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-( (6-(4ᅳ ( (다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6- (퓨란 -2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3-(6- (퓨란 -2—일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘— 4-일아미노)페놀,
3-(6— (4- ( (사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3-( (6— (4ᅳ ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘一 4- 일아미노)페놀， 3-( (6-(4-( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-(2- (피를리딘 -1-일)에틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4一 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-(2- (피페리딘 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘-4ᅳ 일아미노)페놀，
3ᅳ ( (6ᅳ(4-(2-(4-메틸피페라진 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ (6-(4— (2-모폴리노에틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
2ᅳ (4- (4- (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1-(4-메틸피페라진 -1-일)에타논，
2- (4-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1- (피를리딘 -1-일)에타논，
N ,Ν-다이에틸 -2- (4- (4ᅳ (3—하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -6-일)페닐)아세트아마이드，
3- (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6ᅳ일)벤조산 (4-(4ᅳ (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) (4-메틸피페라진 -1-일)메타논,
(3-(4ᅳ (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 (피를리딘 -1-일)메타논，
N, N-다이에틸ᅳ 3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -6-일)벤즈아마이드,
(3-(4ᅳ(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 (4-메틸피페라진 -1ᅳ일)메타논，
메틸 1— (4-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -2-카복실레이트，
3ᅳ(6-(4-( (2- (하이드록시메틸)피를리딘 -1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(4ᅳ( (4-메틸피페리딘 -1ᅳ일 )메틸)퍼ᅳ닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ
4-일아미노)페놀,
3ᅳ(6-(4ᅳ( ( (2R , 6S)-2，6-다이메틸피페리딘 -1- 일)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(3ᅳ (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
3-(6-(3ᅳ( (4-메틸피페라진 -1—일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘- 4-일아미노)페놀，
3-(6-(3ᅳ (피를리딘ᅳ 1—일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘-4- 일아미노)페놀,
3_(6-(3ᅳ ( (다이.에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(3ᅳ (피페라진ᅳ 1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘-4- 일아미노)페놀，.
3ᅳ(6ᅳ(3ᅳ ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3ᅳ2-d]피리미딘-4- 일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3ᅳ ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4— 일아미노)페놀,
1ᅳ(4-(4-(3—하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피롤리딘 -2—카복사마이드 염산염，
1ᅳ(4— (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -2ᅳ카복실산 염산염，
3ᅳ(6-(4-( (2ᅳ하이드록시에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2— d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
메틸 2-(3-(4-(3-하이드톡시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 _6ᅳ 일 )벤즈아미도)프로파노에이트，
1-(4ᅳ (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -3-을 염산염，
3- (6ᅳ(4ᅳ (에톡시메틸)페닐)싸이에노 [3,2— d]피리미딘— 4ᅳ일아미노)페놀，
4- (4ᅳ (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 ,2-d]피리미딘 -6-일 )-Ν-(1- 하이드록시프로판 -2-일 )벤즈아마이드 ,
2ᅳ(4ᅳ (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤즈아미도)프로판산，
3ᅳ (6-(3-(2- (피롤리딘 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3- ( 6- ( 3- ( 2— (피페라진 - 1-일)에틸)페닐)싸이에노 [ 3 , 2-d ]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
3ᅳ (2ᅳ (4- (피롤리딘— 1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(4—모폴리노페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 3ᅳ(2-(4- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -그일아미노)페놀， 3ᅳ(2— (4— ( (4ᅳ메틸피페라진ᅳ 1-일메틸)페닐 )싸이에노 [3 ,2-b]피리딘ᅳ 7- 일아미노)페놀,
3-(6-(5- (피롤리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피를리딘 -1-일메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3-(6-(5-((4-메틸피페라진 -1-일)메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6— (5- (피페리딘 -1-일메틸)퓨란ᅳ2—일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
. 3-(6-(5- (모폴리노메틸)퓨란 -2—일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀， 3-(6-(5ᅳ (피페라진ᅳ 1-일메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3- ( 6ᅳ ( 5- ( (에틸아미노)메틸)퓨란ᅳ 2-일)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3- ( 6- ( 5ᅳ ( ( 4-메틸피페라진ᅳ 1-일)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [ 3， 2- d ]피리미딘— 4-일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(5ᅳ (피페리딘ᅳ 1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3ᅳ (6ᅳ(5ᅳ (피페라진 -1-일메틸 )싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6ᅳ(5- ( (에틸아미노)메틸)싸이오펜— 2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘- 4ᅳ일아미노)페놀，
3-(2ᅳ(4- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘ᅳ 7- " 일아미노)페놀，
3-(2ᅳ(4- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘-7- 일아미노)페놀，
3ᅳ (2-(4ᅳ ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3ᅳ(2-(4-메틸피페라진 -1-일 )싸이아졸로 [4， 5-d]피리미딘 -7- 일아미노)페놀， '
3ᅳ(6-(4- (피를리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2ᅳ일)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(4— ( (4ᅳ메틸피페라진ᅳ 1—일)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘— 4-일아미노)페놀，
3ᅳ (6-(4- (피페리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(4- (모폴리노메틸)싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산) 3- ( 6— ( 4- (피페라진 - 1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [ 3， 2- d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
3-(6-(4- ( (에틸아미노메틸)싸이오펜ᅳ 2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀，
3_(2-(3- (피롤리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘-7- 일아미노)페놀，
3_(2ᅳ(3-( (4-메틸피페라진 -1ᅳ일 )메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7— 일아미노)페놀，
3-(2-(3- (피페리딘— 1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘ᅳ그 일아미노)페놀,
3-(2ᅳ (3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -그일아미노)페놀 3ᅳ(2ᅳ(3ᅳ (피페라진ᅳ 1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘ᅳ 7- 일아미노)페놀，
3ᅳ(2ᅳ (3— ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(6-(4- (피를리딘 -1-일메틸)퓨란— 2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀'
3ᅳ(6-(4— ( (4-메틸피페라진 -1-일)퓨란— 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘- 4ᅳ일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
3-(6ᅳ(4- (피페리딘 -1-일메틸)퓨란ᅳ 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한 바람직하게， 상기 염은 무기산염， ^기카본산염 또는 설폰산염인 것일 수 있다.
보다 바람직하게， 상기 무기산염은 염산염이고， 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것일 수 있다.
또한 바람직하게， 상기 조성물은 0. 1 ~ 500mg/kg 체중으로 투여되는 것일 수 있다.
보다 바람직하게， 상기 투여는 경피 투여인 것일 수 있다. 이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 표함하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure imgf000017_0001
상기 XI 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -0H, 또는 — 0C¾ 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴, 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 ᅳ (C¾)nᅳ R3 , -(CH2)n-C(0)-R3 , 또는 _0(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 -CN , 할로겐， C1-3알킬， C1-3알콕시， 페닐， 피리디닐， 아미노, C1-3알킬아미노， 다 C1-3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노, 카르복시 C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬 C1— 3알킬아미노, 피를리디닐， 하이드특시피를리디닐， 하이드록시 C1-3알킬피를리디닐， 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐， C1-3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐， 피페라지닐, C1- 3알킬피페라지닐, C1ᅳ 4알콕시카르보닐피페라지닐， 또는 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
바람직하게는， 상기 R3는 -H , -CN , 할로겐， C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐， 피리디닐, 아미노， 에틸아미노, 디에틸아미노， 피를리디닐， 피페리디닐， 피페라지닐， 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이다.
[구조식]
、
Figure imgf000018_0001
또한 본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있으며， 이러한 약학적으로 허용 가능한 염에는 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성산부가염을 형성하는 산, 예를 들면 염산， 황산， 질산, 인산， 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산， 시트르산， 아세트산， 트라이클로로아세트산， 트라이플루오로아세트산， 글루콘산， 벤조산， 락트산， 푸마르산, 말레인산 등과 같은 유기카본산， 메탄설폰산， 벤젠설폰산, P-를루엔설폰산 또는 나표탈렌설폰산 등괴. 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 바람직하게는 염산 또는 트라이플루오로아세트산과 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다.
화학식 1로 표시되는 화합물 중 대표적인 화합물로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다. 괄호 안의 명칭은 코드네임으로서 본 발명에서 화합물의 구분을 위하여 사용한다:
3- (6- (페닐싸이에노 [3 , 2— d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0008) ,
4- (4-(3-메록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴 (LCB 03-0009)，
4- (4- (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴 (LCB 03-0013) ,
3-(6-브로모 -싸이에노 [3 , 2ᅳ d]피리미딘 -4—닐아미노) -페놀 (LCB 03- 0015) ,
4-(4ᅳ(3-메특시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6-일)페놀 (LCB 03-0016) ,
3ᅳ [6-(4-메특시페닐)ᅳ싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-닐아미노]ᅳ페놀 (LCB 03-0017)，
N- ( 3-메톡시페닐 ) -6- (4- ( 2ᅳ모폴리노에특시)페닐)싸이에노 [ 3， 2- d]피리미딘— 4-아민 (LCB 03-0018)，
3-(6— (4-클로로페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0019) ,
3— (6- ( 4- ( 2-모폴리노에특시)페닐)싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0020) ,
N-(3-메특시페닐 )ᅳ6-(4-페네록시페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 아민 (LCB 03-0021) ,
N-(3-메록시페닐 )ᅳ6ᅳ(4ᅳ (2- (피리딘 -2-일)에톡시)페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-아민 (LCB 03—0022)，
(6-퓨란 -2-일 -싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4-일 )-(3-메특시페놀) -아민 (LCB 03-0023) ,
(6-퓨란 -3-일-싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4-일) -(3-메록시페놀) -아민 (LCB 03-0024) ,
N-(3-메특시페닐) -6ᅳ (4-(2- (피를리딘 -1- 일)에톡시)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-아민 (LCB 03-0026) ,
N-(3-메록시페닐 )-6ᅳ (싸이오펜ᅳ 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ아민 (LCB 03-0027) ,
( 3ᅳ메특시페닐) - ( 6-싸이오펜 -3-일 -싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘 -4-일)ᅳ 아민 (LCB 03-0028) ,
N-(3—메록시페닐) -6-(4-(2- (피페라진 -1- 일)에톡시)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4ᅳ아민 (LCB 03-0029) ,
( 3-메특시페닐 )ᅳ ( 6ᅳ싸이오펜 -2-일―싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4—일)ᅳ 아민 (LCB 03-0030),
3- (6-싸이오펜 -3-일 -싸이에노 [3， 2-d]피리미딘— 4ᅳ일아미노) -페놀 (LCB 03-0031),
3-( (6-(4- (모폴리노메틸 )페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ4ᅳ
일아미노)페놀 (LCB 03-0032)，
3-( (6-(4- (피페라진 -1-일메틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0033),
3-(6-(4ᅳ (피롤리딘-：卜일메틸)페닐)싸이에노 [3,2ᅳ 피리미딘 _4_ 일아미노)페놀 (LCB 03-0034) ,
3-((6ᅳ (4- (피페리딘-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0035),
3-((6ᅳ(4-((4-메틸피페라진 -1-일-메틸)페닐)싸이에노 [3,2- d]피리미딘— 4-일아미노)페놀 (LCB 03-0036)，
3-((6ᅳ(4ᅳ ((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0037),
3-(6- (퓨란 -2ᅳ일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘— 4-일아미노)페놀 (LCB 03-
0038) ,
3_(6- (퓨란ᅳ 2ᅳ일)싸이에노 [3，2— d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-
0039) ,
3-(6-(4- ((사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3ᅳ 2- d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03-0040),
3-((6-(4— ((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘ᅳ4ᅳ 일아미노)페놀 (LCB 03-0041)，
3ᅳ((6-(4ᅳ ((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 4ᅳ 일아미노)페놀 (LCB 03-0042),
3ᅳ ( (6ᅳ(4ᅳ(2- (피를리딘 -1-일 )에틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03— 0043)，
3ᅳ( (6-(4ᅳ(2— (피페리딘— 1-일 )에틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0044) ,
3-( (6-(4-(2-(4ᅳ메틸피페라진 -1-일)에틸 )페닐)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0045)，
3-(6_(4-(2ᅳ모폴리노에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0046)，
2-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 )ᅳ1ᅳ (4-메틸피페라진 -1-일)에타논 (LCB 03-0047) ,
2- (4-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1- (피를리딘 -1-일)에타논 (LCB 03-0049)，
Ν,Ν-다이에틸 -2ᅳ(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -6-일)페닐)아세트아마이드 (LCB 03-0050) ,
3- (4ᅳ (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6-일 )밴조산 (LCB 03-0051)
(4-(4-(3—하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) (4-메틸피페라진 -1ᅳ일)메타논 (LCB 03-0052) ,
(3ᅳ (4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2— d]피리미딘 -6- 일 )페닐 (피롤리딘 -1-일 )메타논 (LCB 03-0053) ,
N , N-다이에틸 -3- ( 4- ( 3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [ 3， 2ᅳ d]피리미딘— 6—일)벤즈아마이드 (LCB 03-0054) ,
(3ᅳ(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 (4ᅳ메틸피페라진— 1—일)메타논 (LCB 03ᅳ 0055)，
메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘— 2-카복실레이트 (LCB 03ᅳ 0056)，
3-(6-(4-( (2- (하이드록시메틸)피를리딘 -1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2— d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0057) ,
3-(6-(4-( (4ᅳ메틸피페리딘-1ᅳ일)메틸)페닐)싸이에노[3 ,2-(1]피리미딘- 4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03-0058) ,
3-(6-(4ᅳ( ( (2 ，63)ᅳ2，6ᅳ다이메틸피페리딘ᅳ1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0059) ,
3-(6-(3- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0060) ,
3-(6-(3-( (4-메틸피페라진 -1-일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘- 4-일아미노)페놀 (LCB 03-0061)，
3-(6ᅳ(3- (피를리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아마노)페놀 (LCB 03-0062)，
3-(6ᅳ (3— ( (다이에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀 (LCB 03-0063) ,
3-(6ᅳ (3- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03ᅳ 0064)，
3-(6ᅳ(3- ( (에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀 (LCB 03ᅳ 0065)，
3-(6ᅳ (3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ
일아미노)페놀 (LCB 03-0066)，
3-(6-(3- ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0067)，
1— (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -2-카복사마이드 염산염 (LCB 03-0068)
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 ,2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -2-카복실산 염산염 (LCB 03-0069)
3-(6-(4-( (2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0070)，
메틸 2-(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3ᅳ 2-d]피리미딘 -6- 일)벤즈아미도)프로파노에이트 (LCB 03-0071)
1-(4-(4-(3-하이드톡시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -3-올 염산염 (LCB 03-0072)
3-(6-(4- (에특시메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03ᅳ 0073)，
4- (4- (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6-일 )— N-( 1- 하이드록시프로판 -2—일 )벤즈아마이드 (LCB 03-0074) ,
2- (4— (4ᅳ(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)벤즈아미도)프로판산 (LCB 03-0075)
3一 ( 6- ( 3ᅳ ( 2ᅳ (피를리딘 - 1—일)에틸)페닐)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0076) ,
3- (6ᅳ(3ᅳ (2- (피페라진ᅳ 1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0079) ,
3-(2ᅳ(4ᅳ (피를리딘— 1—일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘ᅳ7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0080) ,
3- (6- (4-모폴리노페날)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0082) ,
3ᅳ(2ᅳ(4ᅳ (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7-일아미노)페놀 (LCB 03-0083)，
3ᅳ(2-(4-( (4-메틸피페라진 -1-일메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0084) ,
3-(6-(5— (피를리딘ᅳ 1-일메틸)싸이오펜 -2ᅳ일)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0085)，
3ᅳ(6ᅳ(5- (피를리딘 -1-일메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0086)，
3ᅳ (6ᅳ(5-( (4ᅳ메틸피페라진ᅳ 1-일 )메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0087)，
3-(6-(5- (피페리딘 -1-일메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0088)，
3- ( 6- ( 5- (모폴리노메틸)퓨란— 2-일)싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03—0089)，
3-(6ᅳ(5- (피페라진 -1-일메틸)퓨란 -2—일 )싸이쎄노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0090)，
3-(6-(5ᅳ ((에틸아미노)메틸)퓨란ᅳ 2-일)싸이에노 [3,2— d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0091),
3-(6-(5-((4-메틸피페라진 -1-일)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0092),
3- ( 6- ( 5ᅳ (피페리딘 - 1—일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [ 3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 (LCB 03-0093),
3— .( 6- ( 5ᅳ (피페라진 - 1-일메틸)싸이오펜— 2ᅳ일)싸이에노 [3， 2ᅳ
d]피리미딘 -4—일아미노)페놀 (LCB 03-0094) ,
3-(6-(5-((에틸아미노)메틸)싸이오펜 -2ᅳ일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀 (LCB 03-0095),
3-(2-(4ᅳ (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2ᅳ b]피리딘 -7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0097)，
3- ( 2- ( 4ᅳ (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [ 3 , 2-b ]피리딘 -Ί- 일아미노)페놀 (LCB 03-0098)，
3-(2-(4- ((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘ᅳ7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0099)，
3— (2-(4-메틸피페라진 -1—일)싸이아졸로 [4,5-d]피리미딘" 7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0100),
3_(6-(4- (피를리딘 -1-일메틸)싸이오펜ᅳ 2—일)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03-0101)，
3_(6-(4-((4-메틸피페라진 -1-일)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘ᅳ4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03-0102),
3-(6— (4- (피페리딘 -1—일메틸 )싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀 (LCB 03-0103),
3-(6-(4- (모폴리노메틸 )싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0104)
3ᅳ (6-(4- (피페라진 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0105)
3-(6— (4ᅳ ( (에틸아미노메틸)싸이오펜ᅳ 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘- 4-일아미노)페놀 (LCB 03-0106)，
3— (2ᅳ(3ᅳ (피를리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘ᅳ7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0107) ,
3-(2-(3ᅳ ( (4-메틸피페라진 -1—일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -그 일아미노)페놀 (LCB 03-0108) ,
3_(2ᅳ(3- (피페리딘ᅳ 1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2— b]피리딘ᅳ7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0109) ,
3— (2— (3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -그일아미노)페놀
(LCB 03-0110) ,
3ᅳ(2ᅳ(3ᅳ (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘ᅳ 7- 일아미노)페놀 (LCB 03-0111)，
3ᅳ (2ᅳ (3- ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘—7—
일아미노)페놀 (LCB 03-0112)， 및
3ᅳ(6ᅳ(4- (피를리딘 -1-일메틸)퓨란 -2—일 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀 (LCB 03-0113) .
3ᅳ(6ᅳ(4-( (4-메틸피페라진 -1-일)퓨란 -2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘- 4ᅳ일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 (LCB 03-0114) 및
3ᅳ (6ᅳ(4- (피페리딘— 1-일메틸)퓨란 -2-일 )싸아에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀 (LCB 03ᅳ 0115) .
바람직한 양태로， 본 발명의 화합물은 LCB 03-0110으로 표시한 3ᅳ(2ᅳ (3- (모폴리노메틸 )페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7-일아미노)페놀을 포함한다 . 이상에서 설명한 화합물들은 한국공개특허 1으 2013-0031266호에 개시된 내용을 참고로 하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
예를 들면， 본 발명의 화학식 1의 화합물의 제조방법을 도식화하여 나타내면 하기 반웅식 1과 같다. 다만， 하기의 제조방법이 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 방법을 한정하는 것은 아니며， 하기의 제조방법의 변형은 당업자에게 자명할 것이며, 달리 언급이 없는 한 하기 반응식의 치환체의 정의는 상기 화학식 1에서의 정의와 동일하다.
화학식 1의 화합물은 싸이에노피리미디논， 싸이에노피리디논 또는 싸이아졸로피리미디논의 골격을 가지는 (I)의 화합물을 클로리네이션하여 7-클로로싸이에노피리미딘 또는 싸이에노피리딘 유도체 (II)를 합성하고, 브로미네이션하여 2-브로로-그클로로싸이에노피리미딘 또는 싸이에토피리딘 유도체 (III)을 합성한 다음, 아닐린 유도체 (IV)와 치환반웅을 통해 (V)의 화합물을 합성 할 수 있다. 화합물 (V)는 스즈키 커플링 (Suzuki coupling)을 통하여 각각의 화학식 1ᅳ1, 1-2, 1-3의 싸이에노피리미딘, 싸이에노피리딘 및 싸이아졸로피리미딘 골격을 갖는 화합물을 제조할 수 있다.
[반웅식 1]
Figure imgf000026_0001
화학식 1-3 상기 제조방법을 보다 구체화하여 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 반웅식을 도식화하면 하기 반응식 2와 같다. 하기 반웅식 2에 기재되어 있는 화합물은 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 출발물질로 사용될 수 있다. 다만, 하기 제조방법의 변형은 당업자에게 자명할 것아며, 달리 언급이 없는 한 하기 반웅식의 치환체의 정의는 상기 화학식 1에서의 정의와 동일하다.
[반웅식 2]
Figure imgf000027_0001
본 발명에 따른 화합물들은 피부 노화에 관여하는 면역세포 및 상처치유반응에서 활성화되는 섬유 아세포의 활성화를 저해한다. 구체적으로， 본 발명자들은 이 화합물들이 염증세포 활성화와 섬유아세포의 활성화에 의한 TNF- α 나 IL-Ι β 생성의 증가와 醒 P 패밀리 단백질의 발현의 증가를 동시에 억제하는 활성을 가지는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는， 자외선 조사 또는 염증성 사이토카인인 TNF- α 처리에 의한 MMP-1 발현 확인하고， 본 발명의 화합물을 처리하였을 때의 발현 변화를 비교하였다. 그 결과， 본 발명에서 사용한 화합물들은 3 μΜ 농도에서 인간 섬유아세포 또는 HaCaT 세포에서 UV— B조사 또는 TNFᅳ α 처리에 의한 ΜΜΡᅳ 1 생성 증가를 저해함을 확인하였고， 특히， LCB 03-0107 내지 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내는 것을 확인하였다 (실험결과 1-1 내지 1ᅳ 3) .
또 다른 실시예에서는， 본 발명의 화합물 중 LCB 03-0110을 선택하여 자외선 조사 피부 노화 생쥐 동물 모델을 이용하여 주름 형성 방지， 표피층 증식 억제 등의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 활성이 있는지를 확인하였다.
그 결과， LCB 03-0110을 처리시 농도 의존적으로 피부 두께 증가를 유의성 있게 억제되었고 (실험결과 2-1)， 외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 육안으로 평가한 주름 형성 정도도 LCB 03-0110 농도 의존적으로 억제되었으며 (실험결과 2ᅳ2)， 주름의 평균길이， 평균 깊이， 그리고 주름 영역 %값들의 증가 현상을 유의성있게 감소시켰다 (실험결과 2-3) .
또한， 본 발명의 실시예에서는, 의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 표피층의 길이 및 콜라겐 양을 측정하여 LCB 03-0110의 피부 '노화 방지 또는 피부 상태 개선 효과를 확인하였다.
그 결과, LCB 03-0110의 처리가 지속적인 UV-B조사에 의한 표피층의 두께 증가를 유의성 있게 감소할 수 있다는 것을 확인하였고 (실험결과 4)， UV— Β조사는 콜라겐 밀도를 유의성 있게 감소시키지만 UV-B조사와 함께 0. 1% LCB 03-0110을 매일 처리한 실험군에서는 그 감소 정도가 유의성 있게 저해되는 것을 확인하였다 (실험결과 5) .
본 발명의 또 다른 실시예에서는， 염증성 사이토카인인 TNF- α와 IL- 1 β의 양을 측정하여 본 발명의 화합물의 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선효과를 확인하였다.
그 결과， LCB 03-0110의 경피 도포 처리는 이들 염증성 사이토카인의 증가 현상을 유의성 있게 억제하였다 (실험결과 6) .
또한 본 발명에서는， 본 발명 화합물의 UV-B 조사 또는 TNF- a에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억쎄 활성 및 MMP-1 , MMP-3 단백질 생성 억제 활성을 확인하였다.
그 결과， UV-B 조사 또는 TNF- α를 처리하는 경우 MMP-1과 MMPᅳ 3 단백질의 양이 증가하였지만， LCB 03-0110을 3 μ Μ, 1 μ Μ, 혹은 0.3 μ Μ 의 농도로 UV-B를 조사하기 전 또는 TNF- a를 처리하기 전에. 처리한 경우는 丽 P-1과 MMP-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다 (실험결과 8 및 실험결과 9) .
또한， 본 발명의 실시예에서는 UV-B 조사나 TNF- a 처리에 의한 HaCaT 세포에서 본 발명의 화합물인 LCB 03— 0110의 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NFᅳ kB 활성화 억제 활성을 확인하였다 (실험결과 10) . 따라서， 본 발명의 조성물은 피부노화 방지 및 /또는 피부상태 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 피부상태의 개선은 항산화， 피부 주름의 개선, 피부 노화의 억제 및 개선， 피부 탄력의 개선, 백반증의 개선， 및 피부 재생 효능 등을 포함한다.
본 발명의 조성물을 의약용으로 사용하는 경우， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구， 비경구， 직장， 경피， 안구， 비강, 혈관 주사제， 근육주사제， 국소 투여， 플라스터 또는 패취 형태등의 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
이 약제 조성들은 Remington , The Science and Pract i ce of Pharmacy, 20th ed. , 2000등에 잘 밝혀진 것과 같은 약제 기술 등을 이용한 잘 알려진 방법으로 편리하게 제조 될 수 있다.
모든 방법들은 활성 구성 성분을 하나 혹은 그 이상의 구성성분으로 이루어진 캐리어와 결합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 약제 조성은 일정하게 잘 섞이게끔 하여 활성 구성 성분들을 액체 캐리어 또는 잘게 부순 고체 캐리어 각각 혹은 둘 모두와 흔합되어 제조되고 또 필요하면 그 산물을 바람직한 형태로 만들수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제， 경 /연질 갑셀제， 액제， 현탁제， 향낭， 과립제， 로젠지 등이 있는데， 이들 제형은 유효성분 이외에 오일 (예: 목화씨 오일， 참깨오일， 코코넛오일 또는 피¾오일 같은 식용오일)， 현택제 (예: 트래거캔스, 알지네이트， 아카시아， 덱스트란， 카복시메틸셀루로오즈나트륨， 젤라틴， 메틸셀루로오즈， 하이드록시프로필메틸셀루로오즈， 하이드록시프로필셀루로오즈， 카보머， 폴리비닐피를리돈 같은 합성 또는 천연 검)를 함유한다.
정제 제형으로는 유효성분을 하나 혹은 그 이상의 보조성분을 선택적으로 사용하여 압력을 가하거나 몰딩하여 만들 수 있다. 압력을 가해서 만드는 정제는 분말 또는 과립 같은 자유 -유동 형태의 유효성분을 이외에 결합제 (예 : 락토즈， 글루코즈 , 전분 , 젤라틴， 아카시아 검 , 트래거캔스 검， 알지네이트나트륨， 카복시메틸셀루로오즈, 메틸셀루로오즈， 하이드록시프로필메틸셀루로오즈， 폴리에틸렌글리콘， 왁스)， 윤활제 (예: 올레인산염， 스테아린산염， 스테아린산마그네슴， 벤조산염, 아세트산염, 염화나트륨) 붕해제 (예: 전분， 메틸셀루로오즈, 한천， 벤토나이트， 크로스카멜로오즈나트륨， 전분 클리콜산나트륨， 크로스포비돈) , 분산제 (폴리솔베이트 80)와 흔합한 뒤 압력을 가하여 제조할 수 있다 . 몰딩된 정제는 분말화 된 유효성분과 적당한 비활성 용매를 섞은 후 몰딩 기기를 이용하여 몰딩함으로써 만들 수 있다.
상기 화학식 1 로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여는 혈관 주사제， 경피투여， 국소투여， 직장투여， 근육주사, 플라스터 또는 패취 형태로 가능하다.
국소 투여에 적당한 조성으로서 액체상 흑은 도포제， 로션， 젤이나 크림， 연고 또는 반죽 같은 에멀견 형태의 준 액상， 혹은 드롭 형태의 용액이나 한탁액을 포함 할 수 있다.
또한， 코나 구강 흡수를 통한 투여를 위한 약제 조성은 파우더나 자가추진 스프레이를 이용하여 에어로졸이나 분무형태와 같은 형태로의 조성으로 만들어 가능하다. 이러한 조성의 제조에 관한 방법은 Modern Pharmaceutics, 2<nd> ed. , G. S. Banker and CT. Rhodes (Eds.), page 427-432 , Marcel Dekker , New York; Modern Pharmaceutics, 3th ed.， G. S. Banker and CT. Rhodes (Eds.), page 618-619 and 718-721, Marcel Dekker , New York and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology vol . 10, J Swarbr i ck and J . C. Boy lan (Eds) , page 191-221 , Marcel Dekker , New York 의 문헌에 나와 있는 일반적인 방법을 따를 수 있다.
앞에 언급된 요소에 추가하여 상기 화학식 1의 화합물을 포함하는 약제 조성은 희석제， 완충용액， 방향제， 발색제， 계면활성제， 침강제， 메틸 하이드록시벤조산 같은 방부제， 에멀견화제나 그 유사물질 같은 하나 혹은 그 이상의 구성요소를 포함 할 수 있고, 활성 성분이 약리적으로 허용되는 무독성의 산이나 염기를 이용하여 염의 형태로 투여되는 경우， 바람직한 염은 특정경우에 부합되는 흡수도를 달성하도록 예를 들어 쉽게 물에 녹을 수 있거나 약하게 녹는 형태로 할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 투여 대상의 나이， 몸무게， 성별， 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 kg인 성인 환자를 기준으로 할 때， 일반적으로 0.1 ~ 500 mg/kg 체중이며， 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일.1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
구체적으로， 본 발명에 따른 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 조성물은 예를 들어， 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
상기 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학 조성물에는 방부제, 안정화제， 수화제 또는 유화 촉진제， 삼투압 조절을 위한 염 및 /또는 완층제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며， 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 비경구 투여 형태로 경피 투여형 제형일 수 있으며， 예를 들어 로션， 연고， 겔， 크림， 패취 또는 분무제 제형일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의
1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도， 발병 시기， 연령， 건강상태， 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만， 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 Ι/ig/kg 내지 200mg/kg, 바람직하게는 50/zg/kg 내지 50 mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며， 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며， 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어， 유연화장수 (스킨로션 및 밀크로션)， 영양화장수， 에센스， 영양크림， 마사지크림， 팩， 젤， 에센스， 아이크림， 아이에센스， 클렌징크림， 클렌징폼， 클렌징워터， 팩， 파우더， 보디로션， 보디크림， 보디오일 및 보디 에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실험예 1. 세포배양과 UV-B조사와화합물 처리
인간 피부 섬유 아세포는 Lonza Walkersvi 1 le , Inc (Walkersvi 1 l e ,
MD USA)에서 구매하여 판매사가 추천하는 방법대로 인간 FGF-B단백질과 10¾> FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 본 실험에는 5 계대 배양 이하의 세포를 사용하였다. HaCaT세포는 CLS Cel l Lines Service 사 (Eppelheim , Germany)에서 구매하여 사용하였고 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하여 사용하였다. 화함물은 lOmM의 농도로 DMS0에 녹인 스특 용액으로 만들어 각 실험에 필요한 조건의 농도가 되도록 배양세포에 처리하였다. 배양 세포에 UV-B조사는 275 nM와 380 nM (피크， 310-315 訓)사이의 에미션 (emi ss ion) 스펙트럼을 가지는 TL20W/01RS UV 램프 (Phi l ips , Somerst , NJ , USA)를 사용하였고 290 nM 이하의 파장을 가지는 UV-C를 제거하기 위하여 코닥 필터를 장착하여 사용하였다. UV-B는 배양세포 표면에서 30 cM 거리에서 조사하였고 배양 세포 표면에서의 UV-B 조사 세기는 UV 미터 (Waldmann GmbH & Co . , Vi 1 l ingen一 Schwenningen, Germany)를 사용하여 측정 하였다. 본 실험에서 UV_B 조사 강도는 100 mJ/cm2 의 강도로 조사하였다. 실험예 2. 배양액중의 M P-1 단백질의 정량
인간 섬유아세포 흑은 HaCaT 세포를 24웰 (wel l ) 배양접시에서 바닥이 포화될 때까지 실험예 1에서와 같이 배양하였다. 여기에 정해진 농도의 화합물을 처리하고 30분 후에 100 mJ/cm2 양의 UV-B 조사 흑은 염증성 사이토카인인 10ng/ml의 TNF- α , 흑은 10 ng/nd의 IL-Ι β 을 처리 후 24에서 48 시간 후 배양액을 회수하였다. 회수한 배양액에 존재하는 인간 匪 P-1 단백질 양을 측정하기 위하여 R&D 시스템사에서 판매하는 丽 P-1 에 대한 ELISA 키트를 구매하여 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라서 정량하였다. 讓 P-1의 양에 따라 발색 반웅에 의해 나타나는 흡광도를 측정하여 그 상대적인 양을 구하였다. 丽 P-1의 양에 따른 흡광도가 0.4까지는 비례적으로 증가함을 확인하였으며 따라서 측정하는 시료의 흡광도가 0.4를 넘지 않도록 시료를 묽혀서 정량에 사용하거나 발색 반웅 시간을 조절 하였다. 실험예 3. LCB 03-0110의 UV— B조사 생쥐 파부 노화 모델에서의 노화 억제 및 염증성 사이토카인 억제
자외선 조사 피부 노화 동물 모델 실험을 위하여 Char les River Laboratory (Wi lmington, Ma , USA)에서 6주령 알비노 무모 생쥐 종인 SKH-1 생쥐 암놈을 구매하여 1주간 실험동물실에서 안정화를 거쳤다. 275 nM와 380 nM (피크， 31으 315 麵)사이의 에미션 스펙트럼을 가지는 TL20W/01RS UV 램프 (Phi l ips , Somerst , NJ , USA)를 사용하여 UV-B를 생쥐 30 cM위에서 조사하였다ᅳ 이때 290 nM 이하의 파장을 가지는 UV-C는 코닥 필터를 이용하여 제거하였다. 생쥐 피부 표면에서의 UV-B 조사 세기는 UV 미터 (Waldmann GmbH & Co . , Vi 1 1 ingen-Schwenningen , Germany)를 사용하였다. 생쥐 피부 표면에서의 그 강도는 약 0.5 mW/cm2 였다. 먼저 본격적인 동물 실험 전에 48시간 후에 생쥐 등 피부에 확실한 흥반을 유발하기 위하여 필요한 UV-B 조사량을 측정한 결과 100 mJ/cm2 로 측정되었다. 본 실험에서는 이 조사량을 1 MED (Minimal Erythema Dose)로 정의하였다. 동물 실험 첫 주에는 생쥐 각 피부 표면에 UV-B 조사는 1주에 3회 (월요일， 수요일， 금요일) 총 8주를 실시하였다. 조사량은 첫 주에는 1 MED , 2번째 주에는 2 MED로 3번째부터 마지막 주까지는 3 MED로 조사 하였다. 실험동물군은 각 군당 6마리씩하여 총 5군으로 나누었다. 하나의 대조군에는 에탄을만 처리하고 UV-B를 조사하지 않았다. 또 하나의 다른 대조군에는 에탄을만을 처리하고 UVᅳ B 조사를 진행하였다. 나머지 3개의 동물 군에는 0.02%， 0.05%, 0. 1%의 세가지 다른 농도로 각각 에탄올에 녹인 LCB 03-0110 화합물을 생쥐당 150 μ 1씩 UV-B를 조사하는 등 부위에 매일
1회 경피 도포하였다. UV— Β를 조사하는 날에는 UV 조사 후 30분 후에 도포하였다ᅳ 실험 시작 후 매 2주 마다 각 군의 생쥐의 피부를 핀셋으로 부드럽게 집어 들어 올린 후 캘리퍼 (Tokyo , Japan)를 이용하여 피부의 두께를 측정하여 각군의 평균값과 표준 편차를 구하였다. 매주 2주마다 주름 형성 정도를 각 군에 대한 처리 방식을 전혀 모르는 3명의 관찰자를 이용하여 육안으로 비셋등이 제안한 스케일링 방식에 의거하여 평가후 기록한 값을 각군에 대한 평균값과 표준편차를 구하였다. 8주간의 실험을 종료하는 날 UV-B를 조사하지 않은 동물군， UV-B를 조사후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물군， UV-B를 조사 후 0. 1% LCB 03-0110을 처리한 동물군의 각 동물의 피부 부위에 실리콘 고무 (Si l f lo Dental Impress ion Mater i al , -Flexi co Developments , Stevenage , Hert ford- shi re , UK)를 적용하여 판매사가 제시한 통상적인 방법으로 반영 레프리카 ( impress ion repl i ca)를 제작하였다. 이 레프리카 평면에 대해 35° 도의 각도로 빛을 조사하며 주름 음영이 나타나는 영상을 찍었다. 기록된 각 영상을 Skin- Vi siometer VL 650 과 그 소프트웨어 (Courage & K azaka , Cologne , Germany)를 이용하여 주름의 평균길이, 평균 깊이， 그리고 주름 영역 %값을 이전 문헌에 제안된 방식에 따라 구하였다. 또 한편으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 생쥐들을 마지막으로 안락사 시키기 전에 마취 시킨 후 UV-B를 조사하지 않은 정상군， UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄을만 차리한 군， 그리고 UV-B를 조사 하며 0. 1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 직경 7 mm바이옵시 편치를 이용하여 채취하였다. 이를 4% 포르말린 용액에서 픽싱한 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 5- μ ηι 두께의 절편으로 만든 후 파라핀을 제거하고 이를 통상적인 방법으로 조직 분석을 위해 헤마록실린ᅳ에오신 염색을 시행하였다. 각 염색한 피부 절편에 대해 5개의 영역을 임의로 선정하여 광학 현미경하에서 400배의 배율로 디지털 영상을 얻었다. 이 디지털 이미지들에서 표피층의 기저막 (basement membrane)에서 각질층의 맨 아래까지의 가장 짧은 직선 길이를 재서 표피층의 길이를 구하여 평균을 내었다. 위의 3군의 실험군의 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록을 5- ii m 두께의 절편으로 절단한 후 이 절편을 콜라겐 양의 정도를 알기 위해 통상적인 방법으로 마손ᅳ트라이크롬 (Masonᅳ tr i chrome) 염색을 시행 하였다. 이후 광학 현미경 하에서 염색된 절편 부위 5군데를 임의로 정하여 400배의 디지털 영상을 얻었다. 이 디지털 이미지들의 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6 : 0 ( Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 상대적인 염색밀도 정량하여 UV-B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 각 실험동물군의 상대적인 콜라겐 밀도값을 구하였다. 다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 UV-B를 조사하지 않은 정상군， UV- B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄을만 처리한 군, 그리고 UV-B를 조사 하며 0. 1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 바이오시 편치를 이용하여 채취 후 액체질소에 넣어 급속 넁각하였다. 이 동결 조직을 분말형태로 으깬 후에 20 隱 ol Tris (pH 7,5), 150 mmol NaCl , 1 麵 ol EDTA (ethylenedi amine tetra-acetic acid) , 1% Triton— X-100, 프로티아제 저해제 칵테일 (Roche, Indianapolis, IN, U.S.A.)을 포함하는 조성의 버퍼용액 1ml을 넣고 호모게나이저를 이용하여 조직을 완전히 파쇄하였다. 이 시료를 다시 10초간 소니케이션한 후 4o(：에서 10분간 10,000g에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. eBioscience (San Diego, CA, U.S.A.)에서 구매한 enzyme- 1 i nked i隱 unosorbent assay (ELISA)을 이용하여 제조사가 공급한 프로토콜에 따라 이 상층액 추출 단백질에 포함된 TNF-α와 IL-Ιβ의 양을 정량하였다. 실험예 4. LCB 03-0110의 UV-B 조사에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억제 및 MMP-1, MMP-3 단백질 생성 억제 활성 확인
위에 서술한 바와 같이 HaCaT 세포나 인간 섬유아세포를 24 웰 배양 접시에서 바닥이 포화될 때까지 10% FBS 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고 혈청이 없는 DMEM 배지로 배양액을 교환 한 후 여기에 10mM DMS0에 녹인 각 화합물을 1 uM과 3 uM 의 농도로 처리하였다. 30 분 후에 100mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사 후 2시간 후에 배양액을 제거한 후 lOOul의 lx램리 버퍼 용액을 가하여 배양 접시의 세포를 녹여낸 후 이를 lOOoC에서 2분간 가열하고 12,000rpm에서 마이크로센트리퓨지를 이용하여 원심분리후 상층액을 회수하여 세포파쇄액 시료를 얻었다. 또 한편으로는 UV-B를 조사 후 48시간 후에 배양 접시의 세포를 녹여낸 후 이를 lOOoC에서 2분간 가열하고 12,000rpm에서 마이크로센트리퓨지를 이용하여 원심분리 후 상층액을 회수하여 세포파쇄액 시료를 얻었다. 이 시료들에 포함된 특정 단백질의 양을 웨스턴 블랏 기법을 이용하여 측정하고자 하였다. 시료들을 10% SDSᅳ폴리 아크릴 아마이드젤 전기영동으로 분리하고 이를 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 이 멤브레인을 TBS 버퍼에 녹인 스킴밀크 용액에서 2시간 동안 배양하고 500-5000배 정도 묽혀지도록 정량하고자 하는 단백질의 1차 항체를 가하고 2시간 실온에서 배양한다. 본 실시예에서 사용한 항체들은 구매하여 사용하였다. 즉 p38 , 인산화—38 (pThr l80/pTyrl82) , JNK, 인산화 -JNK (PThrl83/pTyrl85) , P44/p42 MAPK, 인산화 -p44/p42 MAPK(pThr202/pTyr204) , 그리고 GAPDH 에 대한 항체는 Cel l Signal ing Technology (Danvers , MA, USA) 에서 구매하여 사용하였다. α - smooth musc le act in 에 대한 항체는 시그마 (St . Loui s , MO, USA)사로부터 구매하여 사용하였다. 배양을 마친 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻은 후에 TBS 버퍼에 적당히 묽힌 HRP가 결합된 2차 항체를 가한 후 1시간 배양하고 다시 멤브레인을 TBS 버퍼로 5번 씻는다. 이 멤브레인에서의 케미루미네슨스 신호 강도를 케미루미네슨스 신호 발생 키트 (GE 헬쓰케어， UK)와 X-레이 필름을 이용하여 오토라디오그라피 기법으로 가시화하였다. 醒 P-1 혹은 丽 P-3의 양을 측정하는 또 다른 방법으로 회수한 세포 배양액을 분자량 컷 -오프 10 , 000 달톤의 Viva Spin concentrator (GE 헬스케어， UK) 을 이용하여 10배 농축 후 1/2 부피의 3x램리 버퍼를 넣은 후 끊는 물에서 2분간 가열하였다. 이 시료를 10% 폴리아크릴아카이드 전기영동 후 PVDF 멤브레인에 트랜스퍼 하고 이를 丽 P-1 , 혹은 丽 P-3 를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 후 케미루미네슨스 신호를 X-레이 필름에 현상 하여 정량하였다. 본 실시예의 실험에서 GAPDH 단백질의 정량은 시료의 세포파쇄액이 동일한 양으로 분석되었음을 보이기 위함이다. 실험예 5. LCB 03-0110의 UV-B 조사나 TNF- α 처리에 의한 HaCaT 세포 에서의 전사요소 AP-1과 NF-kB활성화 억제 활성 확인
배양한 오백만개의 HaCaT 세포에 위에 서술한 대로 UV-B 조사나 TNF- a 처리를 마친 후 이 세포의 핵 추출물을 얻는다. 즉 배양 배지를 PBS로 치환 후 세포를 조심스럽게 긁어내어 회수 후에 4°C PBS로 간단히 씻는다. 이 세포를 20 mM Tr i s-HCl , H 7.4， 10 mM NaCl 3 mM MgC12 프로티아제 저해제 칼테일 (BMS) 을 포함하는 4°C 저삼투압 (hypotoni c) 버퍼에 서스펜션하고 얼음속에서 10분간 방치한다. 그리고 세포를 헐거운 프레슬 호모제나이저를 이용하여 10번 정도 부드럽게 호모게나이즈 한다. 현미경하에서 세포막이 완전히 파괴되어 대부분의 핵이 노출된 것을 확인 후에 이것을 4°C 3000 rpm 에서 10분간 원심분리하여 펠렛을 회수하여 세포핵을 얻는다. 이 세포핵 펠렛 (pel let)에 100 ul 의 미리 얼음물에 식힌 100 niM Tris ( H 7.4), 10% glycerol, 100 mM NaCl , 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X- 100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 2 mM orthovanadate, 1 mM NaF, and protease inhibitor cocktail (BMS) 을 포함하는 버퍼를 가한 후 완전히 서스펜션 (suspension)하고 이를 얼음속에서 10분 마다 볼텍싱 (veltexing)하며 30분간 방치한다. 이후에 14,000 x g 로 4° C에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하여 핵추출물을 얻는다. 단백질 농도를 측정 후에 소량으로 나누어 사용할 때까지 -70°C에 보관한다. 핵 추출물속에 포함된 NF-κΒ p65 단백질 양을 정량하기 위하여 NF-κΒ p65를 특이적으로 인식하는 항체 (Santa Cruz Biotech. U.S.A.)를 이용하여 위에 기술된 바와 같이 웨스턴블랏을 행하였다.
이어서 핵 추출물속에 포함된 활성 NF-icB와 AP-1 전사요소의 양을 측정하기 위하여 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay) 에세이를 행하였다. 먼저 NF-κΒ EMSA assay를 위하여 NF-κΒ 부착 부위가 포함된 3' 위치에 바이오틴이 부착된 DNA 을리고뉴클리오타이드의 센스 스트랜드 (서열번호 1: 5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA -3')와 앤티센스 스트랜드 (서열번호 2: 5'ᅳ TTC CGG CTG AGT CAT C GCG — 3') (Gut t ridge DC, et al. Mol Cell Biol. 1999; 19(8) :5785-5799)를 제작한 후 서로 어닐링 (annealing)하여 이중나선구조로 만들었다. 이어서 20 fniole 의 이중나선의 올리고머, 8 ug 의 핵 추출물 , 10 mM Trs (pH 8.0)， 1 ug Poly(dl'dC), 5% Glycerol, 0.1% NP-40, 100 mM C1, 1 mM MgC12, 2 mM EDTA를 섞어서 최종 부피 20 ul의 NF-κΒ와 올리고머와의 부착반옹을 시행한 후 30분간 얼음에서 방차하였다. 여기에 1 ul의 0.1% 브로모페놀블루 . 용액을 섞은 후 이를 네이티브 6% 폴리아크릴아마이드젤에서 콜드룸에서 80V에서 약 3시간 전기영동하였다. 이를 PVDF 멤브레인에 전이한 후 여기에 UV를 조사하여 전이된 올리고머 DNA를 고정하였다. 멤브레인에 고정된 을리고머 DNA는 부착된 바이오틴을 인식하는 스트렙토아비딘 -HRP를 가하여 표식 후 피어스사 (미국)로부터 구매한 Chemi luminescent EMSA kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 케미루미네슨스 신호를 발현함으로써 검출 할 수 있었으며 이를 X-레이 필름을 이용하여 오토라디오그래피로 감광하였다. 한편 AP-1의 EMSA 에세이를 위하여는 위의 NF-κΒ 에세이 경우와 다음 사항을 제외하고는 동일하게 시행하였다. 즉 이전 문헌에 나타낸 AP-1 부착 부위가 포함된 3' 위치에 바이오틴이 부착된 DNA 올리고뉴클리오타이드의 센스 스트랜드 (서열번호 3: 5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA ᅳ 3' )와 앤티센스 스트랜드 (서열번호 4: 5'- TTC CGG CTG AGT CM GCG -3' ) (Angel P. , and Karin, M. Biochem. Biophys. Acta, 1072, 129-157 (1991))를 제작한 후 서로 어닐링하여 2중 나선구조로 만들었으며 AP-1 부착반응 버퍼에 10% glycerol을 사용하였다. 부착을 나타내는 밴드의 특이성과 유의성을 보이기 위하여 단백질ᅳ을리고머 부착을 나타내는 밴드가 2으50배로 많이 사용한 바이오틴이 부착되지 않은 어닐링한 올리고머에 의해 경쟁적으로 사라지는 것을 확인하였다. 실험결과
1. 자외선 조사또는 TOF-α 처리에 의한 MMP-1 발현 확인
1-1. 자외선 조사에 의한 인간 섬유 아세포에서 MMP-1 발현 변화 확인
먼저 인간 피부 섬유 아세포 세포 배양에 DMS0에 녹인 각각 화합물을 3 μΜ 의 농도로 처리하거나 처리하지 않고 30분 후에 100 mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사하거나 조사하지 않는 조건에서 24시간 후에 세포 배양액을 회수하였다. 인간 丽 P-1 단백질 양을 측정하는 효소 면역 측정법 키트 (ELISA) 키트를 이용하여 회수한 배양액에 MMP-1의 존재에 의한 흡광도를 측정하여 구함으로써 각 배양액 배지 내의 상대적인 麵 P-1 양을 측정하였다ᅳ 화합물이 처리되지 않고 UV를 조사하지 않은 배지의 상대적인 腿 P-1 양을 0%， 화합물이 처리되지 않고 UV를 조사한 배양 배지의 상대적인 腿 P-1 양을 10OT 로 했을 때 각 화합물을 처리하고 UV를 조사한 배양 웰의 배지의 상대적인 丽 P-1양의 % 값을 표 1에서 나타내었다. 이 표에서 처리한 각각의 화합물이 자외선 조사에 의한 인간 피부 섬유 아세포에서의 MMP-1의 생성 증가를 어느 정도 억제하는지를 평가할 수 있다.
【표 11
Figure imgf000040_0001
017
Figure imgf000041_0001
ΜΪ0/Μ0ΖΗΜ/Χ3<1 68 )80/SI0Z OAV 화합물들은 대체적으로 특징적인 구조적 공통성을 가지고 저해 활성을 보여 주었고 특히 LCB 03-0107 내지 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내었다.
1-2. 자외선 조사에 의한 HaCaT세포에서 醒 P-1 발현 변화 확인 또한, 상기 인간 피부 섬유 아세포를 사용 했을 때와의 동일한 실험을 인간 케라티노사이트 세포 유래 세포인 HaCaT 세포를 이용하여 시행한 후 각 화합물들 처리한 경우의 배양배지에 존재하는 丽 P-1의 상대적인 % 값을 표 2에서 나타내었다.
【표 2】
화합물 상대적인 MMP-1 양 화합물 상대적인 MMP-1 양
LCB03-0008 63 LCB03-0066 40
LCB03-0015 71 LCB03-0067 47
LCB03-0018 77 LCB03-0070 67
LCB03-0030 60 LCB03-0072 65
LCB03-0032 35 LCB03-0076 83
LCB03-0033 32 LCB03-0079 87
LCB03-0034 38 LCB03-0080 55
LCB03-0035 41 LCB03-0082 64
LCB03-0036 35 LCB03-0083 64
LCB03-0037 32 LCB03-0084 62
Figure imgf000043_0001
그 결과, 인간 피부 섬유 아세포를 이용한 실험에서와 거의 마찬가지로 HaCaT 세포를 이용한 실험에서도 본 발명의 화합물들은 3 μΜ 처리 농도에서 UV-B조사에 의한 MMP-1 생성 증가를 저해하는 활성을 보여주었고 특히 LCB 03-0107에서 LCB 03-0112 사이의 화합물이 구조적인 공통점을 가지며 우수한 저해능을 나타내었다.
1-2. TNF- α 처리에 의한 인간 섬유 아세포에서 MMP-1 발현 변화 확인
본 발명의 화합물들이 염증성 사이토카인 TNF- a에 의한 인간 피부 섬유 아세포에서의 匪 P-1의 생성 증가를 억제 할 수 있는지를 세포 배양을 이용한 실험에서 확인하였다.
인간 피부 섬유 아세포를 24 웰 배양 접시에서 바닥이 포화될 때까지 배양하고 배양액을 혈청이 없는 DMEM 배지로 교환 한 후 여기에 10 mM DMSO에 녹인 각 화합물을 1 μ Μ 의 농도로 처리하였다. 이후 30 분 후에 10 ng/ml의 농도로 TNF- a를 처리하였다. 이후에 세포를 세포 배양기에서 24시간 배양한 후 긱 웰의 세포 배양액을 회수하였다. 배양액에서의 상대적인 丽 P-1의 양을 실험예 1과 같^ 방법으로 측정하였다. 화합물이 처리되지 않고 TNF- a를 처리하지 않은 배지의 상대적인 丽 P-1 양을 0%， 화합물이 처리되지 않고 TNF- a를 처리한 배지의 상대적인 丽 P-1 양을 100% 로 한 후 각 화합물을 처리하고 TNF- a를 처리한 배양 웰의 배지의 상대적인 MMP-1양의 % 값을 다음 표 3에서 나타내었다.
【표 3】
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
LCB03-0057 61 LCB03-0094 47
LCB03-0058 49 LCB03-0101 61
LCB03-0059 31 LCB03-0106 76
LCB03-0060 24 LCB03-0107 17
LCB03-0061 23 LCB03-0108 14
LCB03-0062 24 LCB03-0109 16
LCB03-0063 25. LCB03-0110 7
LCB03-0064 24 LCB03-0111 12
LCB03-0065 29 LCB03-0112 14
그 결과, 본 발명에서 사용한 화합물들은 인간 섬유아세포 배양을. 이용한 실험예 1에서의 UV-B를 조사한 실험에서의 결과와 거의 마찬가지로 1 μΜ 농도에서 TNF- α처리에 의한 MMP-1의 생성 증가를 저해하였다. 또한 표 1에서와 마찬가지로 특히 LCB 03-0107에서 LCB 03-0112의 화합물이 우수한 저해능을 나타내었다.
2. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 노화 억제 및 염증성 사이토카인 억제 확인
본 발명의 화합물 중 IXB 03-0110을 선택하여 자외선 조사 피부 노화 생쥐 동물 모델을 이용하여 주름 형성 방지， 표피층 증식 억제 등의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 활성이 있는지를 확인하고자 하였다.
2-1. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 피부 두께 변화 확인
6 주령 알비노 무모 생쥐 종인 SKH-1 생쥐 암놈을 각 군당 6마리씩하여 총 5군으로 나누어 실험군을 만들었다. 첫번째 군의 생쥐들에는 그 등부위에 자외선 조사나 LCB 03-0110처리 없이 150 ul의 에탄올만을 처리하고 (No UV군)， 두번째 군에는 LCB 03-0110처리 없이 150 μ ΐ의 에탄올만을 매일 경피 도포하였다 (Vehi cle 군) . 나머지 3개의 동물 군에는 0.02¾， 0.05% , 0. 1%의 세 가지 다른 농도로 각각 에탄올에 녹인 LCB 03-0110 화합물을 생쥐 당 150 ul씩 UV를 조사하는 등 부위에 매일 1회 경피 도포하고 도포 후 30분 지나서 매 주 3회 UV— B를 조사하였다. UV-B 조사는 첫주에는 100 mJ/cm2 , 둘째주에는 200 mJ/cm2 , 셋째주 이후부터는 300 mJ/cm2 로 매주 3회씩 총 8주간 지속적으로 조사하여 자외선에 의한 피부 노화를 유도하였다. 실험 시작 후 매 2주 마다 각 군의 생쥐의 피부 두께를 캘리퍼 (Tokyo , Japan)를 이용하여 측정하여 각 군의 평균값과 표준 편차를 구하여 그 변화 정도를 꺽은선 그래프로 하여 도 1에서 나타내었다. 그 결과, 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 나타나는 공통적인 현상은 피부 두께가 증가하는 것인데 LCB 03-0110을 처리시 농도 의존적으로 피부 두께 증가를 유의성 있게 억제하였다.
2-2. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 주름 정도 변화 확인
또한 이 실험에서 매 2주마다 자외선을 조사하는 부위에서의 주름 형성 정도를 각 군에 대한 처리 방식을 전혀 모르는 3명의 관찰자를 이용하여 육안으로 비셋등이 제안한 스케일링 방식에 의거하여 (D . L . Bi sset t , et . al . , Photochem Photobiol , vo l . 46， no . 3 , pp . 367-378 , 1987) 평가 후 기록된 값을 각군에 대한 평균값과 표준편차를 내어 선 그래프로 도 2에서 나타내었다.
그 결과， 자외선에 의한 피부 노화 동물 모델에서 육안으로 평가한 주름 형성이 실험 진행에 따라 증가하였는데 LCB 03-0110 처리 할 때는 농도 의존적으로 그 증가가 유의성 있게 억제되었다.
2-3. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 주름의 평균 길이, 평균 깊이， 주름 영역 변화 확인
UV-B를 조사 후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물군의 피부는 UV-
B를 조사하지 않은 정상군에 비해 깊고 긴 주름 형성이 뚜렸이 증가하였다. 하지만 0.1% 1 8 03-0110을 처리한 동물군에서는 깊고 긴 주름 형성 정도가 뚜렸이 감소하였다. 기록된 각 영상을 Skin-Visiometer VL 650 과 그 소프트웨어 (Courage & Khazaka, Cologne, Germany)를 이용하여 주름의 평균길이， 평균 깊이， 그리고 주름 영역 %값을 이전 문헌에 (H. S. Kim, et. al . , Eur J Pharmacol, vol. 689， no. 1-3， pp. 38-44, 2012) 제안된 방식에 따라 구하여 도 4에서 나타내었다. 0.1% LCB 03-0110을 처리한 동물군에서는 반복적인 UV-B 조사에 의한 주름의 평균길이， 평균 깊이， 그리고 주름 영역 %값들의 증가 현상을 유의성있게 감소시켰다. (##； No UV-B 군 vs Vehicle 군, ρ<0·01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군， p<0.01, *； Vehicle 군 vs LCB03— 0110 군， p<0.05 by student t~test)
3. 반영 레프리카 제작 및 영상 촬영 결과
8주간의 실험을 종료하는 날 UV-B를 조사하지 않은 동물군 (No UV-B), UV—B를 조사 후 LCB 03-0110을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 동물군 (Vehicle), UV-B를 조사 후 0.1% LCB 03-0110 처리 후 UV-B를 조사한 동물 군 (0.1% LCB 03-0110)의 각 동물의 등 피부 부위에 실리콘 고무 재료를 적용하여 반영 레프리카 (impression replica)를 제작하고 이 레프리카 평면에 대해 35° 도의 각도로 빛을 조사하며 주름 음영이 나타나는 영상을 찍은 후 각 군에서 얻은 대표적인 영상을 도 3에서 나타내었다.
그 결과， UV-B를 조사후 LCB 03-0110을 처리하지 않은 동물의 피부는 UV-B를 조사하지 않은 정상에 비해 깊고 긴 주름 형성이 뚜럿이 증가하였다. 하지만 0.1% LCB 03-0110 을 처리한 동물군에서는 깊고 긴 주름 형성 정도가 뚜렷이 감소하였다.
4. LCB 03-0110의 UV-B조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 표피층 길이 측정 결과
다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 생쥐들을 마지막으로 안락사 시키기 전에 마취 시킨 후 UV-B를 조사하지 않은 정상군 (No UV-B control) UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄올만 처리한 군 (Vehicle (ethanol)), 그리고 UV—B를 조사 하며 0.1% LCB 03—0110 화합물을 처리한 군 (0.1% LCB 03-0110)의 생쥐들의 등 부위의 피부조직을 바이옵시 (biopsy) 편치를 이용하여 채취하였다. 이를 4% 포르말린 용액에서 픽성 (fixing)한 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 5-μηι 두께의 절편으로 만든 후 파라핀을 제거하고 이를 통상적인 방법으로 조직 분석을 위해 헤마특실린- 에오신 염색을 시행하였다. 염색한 각 피부 절편에 대해 5개의 영역을 임의로 선정하여 광학 현미경하에서 400배의 배율로 디지털 영상을 얻었다. 이 영상 중 각군에 대해 대표적인 영상을 도 5a에 나타내었다.
그 결과， UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄을만 처리한 군의 피부 조직에서는 UVᅳ B를 조사하지 않은 정상군 조직에 비해 표피층 두께가 확연히 증가하였고 진피층에 염증성 세포들의 증가가 관찰되었다. 하지만 UV-B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 생쥐의 피부에서는 표피층 두께 증가가 확연히 감소되었으며 염증성 세포의 증가 경향도 뚜렸하게 줄어든 것을 관찰 할 수 있었다. 이 디지털 이미지들에서 표피층의 기저막 (basement membrane)에서 각질층의 맨 아래까지의 가장 짧은 직선 길이를 재서 표피층의 길이를 구하여 평균을 내어 도 5b 에서 나타내었는데 위의 도 5a에서 관찰한 LCB 03-0110의 처리가 지속적인 UV— B조사에 의한 표피층의 두께 중가를 유의성 있게 감소할 수 있다는 것을 확인 시켜 주었다. (##； No UV-B 군 vs Vehicle 군， pO.Ol, **； Vehicle 군 vs LCB03-0110 군， p<0.01, by student t— test). 5. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 콜라겐 양 측정 결과
다음으로 위의 3군의 실험 군의 생쥐들로부터 채취한 피부 조직 파라핀 블록을 5-μηι 두께의 절편으로 절단한 후 이 절편조직의 콜라겐 양의 정도를 알기 위해 마손ᅳ트라이크름 염색을 하였다. 이후 광학 현미경 하에서 염색된 절편 부위 5군데를 임의로 정하여 400배의 디지털 영상을 얻은 후 이 영상 중 각군에 대해 대표적인 영상을 도표 6a에서 나타내었다. 그 결과， UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지 않고 에탄을만 처리한 군의 피부 조직에서는 UV-B를 조사하지 않은 정상군 조직에 비해 콜라겐 단백질 염색 정도가 더욱 진하게 염색되는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 UV-B를 조사하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 생쥐의 피부에서는 UV- B 조사에 의한 콜라겐 염색 정도의 증가 경향이 뚜렷하게 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 이 디지털 이미지들의 상대적인 콜라겐 염색 밀도를 미디어사이버네틱스 사에서 공급하는 이미지 프로 플러스 6.0 (Image Pro Plus 6.0) 소프트웨어를 이용하여 정량하여 UVᅳ B를 조사하지 않은 정상동물군 피부의 밀도 값을 100%로 하여 각 실험동물군의 상대적인 값을 구하여 도 6b에 나타내었다. UV-B조사는 콜라겐 밀도를 유의성 있게 감소시키지만 UV-B조사와 함께 0.1% LCB 03-0110을 매일 처리한 실험군에서는 그 감소 정도가 유의성 있게 저해됨을 알 수 있다. (##； No UV-B 군 vs Vehicle 군， ρθ.01, **; Vehicle 군 vs LCB03-0110 군， ρθ.01, by student t— test). 이것은 LCB 03-0110의 피부 경피 도포가 자외선에 의한 노화 현상에서 피부조직 내의 콜라겐의 양이 줄어드는 것을 저해할 수 있음을 보여준다. 6. LCB 03-0110의 UV-B 조사 생쥐 피부 노화 모델에서의 염증성 사이토카인 억제 확인
다음으로 동물 모델 실험이 끝나는 날 UVᅳ B를 조사하지 않은 정상군， UV-B를 조사 하며 화합물을 처리하지,않고 에탄을만 처리한 군， 그리고 UV- B를 조사 하며 0.1% LCB 03-0110 화합물을 처리한 군의 생쥐들의 등 부위의 피부조직에서 단백질을 추출한 후 ELISA 법을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-Ιβ의 양을 측정하여 그 결과를 도 7a (TNF- α)와 7b (IL-Ιβ)에 나타내었다.
그 결과, 지속적인 자외선의 조사는 피부 조직 내에 TNF-α와 IL-
1β의 염증성 사이토카인의 발현을 확연히 증가 시켰다. 하지만 0.1% LCB 03-0110의 경피 도포 처리는 이들 염증성 사이토카인의 증가 현상을 유의성 있게 억제하였다. (##； No UV-B 군 vs Vehicle 군， ρ<0·01, **； Vehicle 군 vs LCB03-0110 군， pO.01, by student t-test). 이 결과는 LCB 03-0110가 지속적인 자외선 노출에 의해 생가는 피부 조직내의 염증성 면역반웅을 억제 할 수 있음을 의미한다.
7. UV-B 조사에 의한 HaCaT 세포， 인간 섬유아세포 활성화 신호전달 억제 확인
배양된 HaCaT 세포나 인간 피부 섬유아세포에 LCB 03-0110을 화합물을 3 μΜ, 1 μΜ, 0.3 μΜ 등의 농도로 각각 처리한 후 30 분 후에 100m J /cm2 의 강도로 UV-B를 조사 후 2시간 후에 세포 파쇄액을 만들어 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리하고 JNK, P38, ERK의 항체 (JNK, p38, Erk)와 이들의 활성화 특이적 인산화 단백질을 인식하는 항체 (p-JNK, p-P38, p— ERK)를 이용하여 웨스턴블랏을 하여 이들 단백질의 UV 조사에 따른 활성화와 이의 LCB 03-0110에 의한 억제를 측정하여 도표 8a (HaCaT세포) 와 8b (인간 섬유아세포)에서 나타내었다.
그 결과， 신호전달 단백질인 pJNK, p38, ERK 의 특정 인산화에 의해 활성화되는 결과를 보여주었다. 하지만 LCB 03-0110을 3 μΜ, 1 μΜ, 0.3 μΜ 의 농도로 UV-B를 조사하기 전에 처리한 경우는 UV-B 조사에 의한 pJNK와 p38의 특정 인산화에 의한 활성화가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다. pJNK와 p38의 활성화가 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화와 관련 있다고 보고된 사실로부터 이 실험결과는 LCB 03ᅳ 0110가 자외선 조사에 의한 케라티노사이트와 섬유아세포등의 피부 세포 내의 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하는 이유를 제공한다.
8. UV-B 조사에 의한 HaCaT 세포, 인간 섬유아세포에서의 MMP-1 , MMP-3 단백질 생성 억제 활성 확인
또한 배양된 HaCaT 세포나 인간 섬유 아세포의 배양배지를 혈청이 없는 DMEM 배지로 바꾸어 준 후 LCB 03-0110을 화합물을 3 μ Μ , 1 μ Μ 혹은 0 .3 μ Μ의 농도로 각각 처리하고 30 분 후에 100 mJ/cm2 의 강도로 UVᅳ B를 조사 후 48시간 후에 배양액을 회수하여 이를 10% SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리한 후 배양액에 생성 분비된 醒 P-1과 fflP-3 단백질의 양을 이들을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 측정 한 후 이를 도 9a(HaCaT 세포) 와 9b (인간섬유아세포)에서 나타내었다. GAPDH는 배양액 회수시에 각 세포를 회수하여 세포파쇄액을 만든 후 이를 전기영동 후 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하여 배양액 회수 시에 거의 같은 수의 세포가 배양되고 있었음을 보이고자 함이다.
그 결과， UV-B 조사에 의해 MMP-1과 匿ᅳ3 단백질의 생성 분비된 양이 증가된 것을 확인하였다 (도 9a 및 도 9b) . 하지만 LCB 03-0110을 3 μ Μ , 1 μ Μ , 혹은 0 .3 μ Μ 의 농도로 UV-B를 조사하기 전에 처리한 경우는 fflP-l과 MMP-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 이것은 LCB 03-0110가 자외선 조사에 의한 케라티노사이트나 섬유아세포등의 피부세포내의 pjNK과 p38 단백질의 특정 인산화에 의해 활성화를 억제하고 이것은 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하게 되고 이 두 전사요소에 의해 발현이 영향을 받는 應 P-1과 丽 P- 3단백질의 증가를 억제한다는 것을 보여준다. MMP-1과 MMP-3 단백질 활성은 피부조직내의 콜라겐을 파괴하여 피부 노화를 촉진하는 주요 원인이 되는데 따라서 이 결과는 LCB 03-0110의 자외선에 의한 피부 노화를 억제하는 기전을 설명하는 것이다. 9. TNF- α 처리에 의한 인간 섬유 아세포에서의 MMP-l , M P-3 단백질 생성 억제 활성 확인
배양된 인간 섬유 아세포의 배양 배지를 혈청이 없는 DMEM 배지로 바꾼 후에 LCB 03-0110을 화합물을 3 μ Μ, 1 μ Μ 혹은 0.3 의 농도로 각각 처리하고 다시 30 분 후에 10 ng/ml의 IL-Ιβ나 10 ng/ml의 TNF- α를 처리한 후 48시간 배양하였다. 이후 세포배양액을 회수하여 이를 10% SDS- 폴리 아크릴 아마이드 젤 전기영동에서 분리한 후 배양액에 생성 분비된 醒 P-1 과 fflP-3 단백질의 양을 이들을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 측정 한 후 이를 도 10 에서 나타내었다. GAPDH는 배양액 회수 시에 각 세포를 회수하여 세포파쇄액을 만든 후 이를 전기영동 후 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하여 배양액 회수 시에 거의 같은 수의 세포가 배양되.고 있었음을 보이고자 함이다.
그 결과， 섬유아세포에 IL-Ιβ나 TNF— a 처리시 MMPᅳ 1과 MMP-3 단백질의 생성 분비된 양이 증가되는 것을 보여준다. 하지만 LCB 03-0110을 3 μ Μ, 1 μ Μ, 흑은 0.3 μ Μ 의 농도로 염증성 사이토카인을 처리하기 전에 처리한 경우는 丽 P-1과 丽 Ρ-3 단백질 양의 증가가 LCB 03-0110 처리 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인해준다. 이것은 LCB 03-0110가 염증성 사이토카인인 IL-Ιβ나 TNF- a 의 자극에 의해 섬유아세포등 피부세포가 증가된 醒 P 단백질 생산 분비를 억제할 수 있음을 보여준다. 이 사실은 자외선 조사등 여러가지 이유로 피부에 염증이 생기고 그로 인해 염증성 사이토카인의 양이 증가하고 이들이 피부세포를 자극하여 丽 P 단백질 발현을 증가시키며 이것은 결국 피부 조직의 콜라겐 단백질의 파괴로 연결되어 피부 노화를 유발하는 주요 원인중의 하나인데 LCB 03-0110 가 이러한 현상을 억제 할 수 있음을 보여준다.
10. LCB 03-0110의 UV-B 조사나 TNF- a 처리에 의한 HaCaT 세포에서의 전사요소 AP— 1과 NF-kB활성화 억제 활성 확인 결과 LCB 03-0110 처리가 UV-B 조사나 염증성 사이토카인에 의한 전사요소 AP-1과 NF-kB 활성화를 억제하는 활성을 보이는 지를 직접 확인하고자 하였다. 이를 위해 배양된 HaCaT 세포에 그냥 방치하거나 혹은 100 mJ/cm2 의 강도로 UV-B를 조사하거나 흑은 10 ng/ml 의 농도로 TNF- α를 처리하고 2 시간 후에 각 세포를 수확 한 후 통상적인 방법으로 핵을 분리하고 이로부터 핵단백질을 포함하는 핵추출물을 얻었다. 이 추출물을 10% SDS- PAGE 전기영동으로 분리 후 NF- κ Β의 한 서브 유닛인 p65 단백질에 대한 항체로 웨스턴블랏을 하여 p65 단백질의 양을 정량하고 또한 NF- κ Β나 AP- 1이 특이적으로 부착하는 시뒌스를 포함하는 DNA 이중나선 을리고 뉴크리오타이드 프로브를 이용하여 EMSA에세이를 시행하여 추출한 핵단백질 추출물에 포함된 활성 NF- κ Β양과 AP-1양을 정량하였다.
도 11a과 도 lib 에서 보여주는 바와 같이 자외선 조사나 TNF- a 처리에 의해 핵내에 p65 단백질 양이 증가하고 이 증가는 LCB 03-0110 처리시 그 농도 의존적으로 저해됨을 알 수 있다. 또한 도 11c와 lid에서 보여주는 바와 같이 자의선 조사나 TNF- a 처리에 의해 핵 내에 표적 염기서열에 부착할 수 있는 NF- κ Β양과 AP-1양이 증가하고 이 증가현상은 LCB 03-0110처리시 농도 의존적으로 저해됨을 알 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】 【청구항 1】 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
[화학식 1]
Figure imgf000055_0001
상기 XI 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -0H , 또는 -0CH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴， 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(C¾)nᅳ R3 , -(CH2)n-C(0)-R3 , 또는 -0(C¾)n-R3이고;
상기 R3는 — H , -CN , 할로겐， C1-3알킬, C1-3알콕시, 페닐, 피리디닐， 아미노， C1-3알킬아미노, 디 C1-3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노， 카르복시 C1-3알킬아미노， C3-6사이클로알킬 C1ᅳ 3알킬아미노， 피를리디닐， 하이드록시피를리디닐， 하이드록시 C1— 3알킬피를리디닐， 카르복시피롤리디닐, 피페리디닐， C1-3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐， 피페라지닐, C1- 3알킬피페라지닐, C1-4알콕시카르보닐피쩨라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다. 【청구항 2】
거 U항에 있어서, 상기 R3는 -H , -CN , 할로겐， C1-3알킬， C1ᅳ 3알콕시， 페닐， 피리디닐, 아미노， 에틸아미노, 디에틸아미노， 피롤리디닐， 피페리디닐， 피페라지닐, 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
[구조식]
Figure imgf000056_0001
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
3- (6- (페닐싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
4- (4-(3-메특시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴，
4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴,
3- ( 6-브로모-싸이에노 [ 3 , 2-d ]피리미딘ᅳ4-닐아미노) -페놀，
4- ( 4- ( 3-메톡시페닐아미노)싸이에노 [ 3 , 2-d ]피리미딘 -6-일)페놀， 3ᅳ[6-(4—메록시페닐) -싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘— 4-닐아미노] -페놀， Nᅳ (3-메톡시페닐 )-6-(4-(2ᅳ모폴리노에톡시 )페닐)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘ᅳ 4ᅳ아민,
3ᅳ(6-(4-클로로페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀， 3-(6-(4— (2-모폴리노에톡시 )페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
Nᅳ (3ᅳ메특시페닐 )-6-(4-페네특시페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4- 아민，
Nᅳ (3-메톡시페닐) -6-(4-(2- (피리딘 -2-일)에록시)페닐)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -4-아민，
(6-퓨란 -2ᅳ일 -싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일 )ᅳ(3-메톡시페놀) -아민， ( 6-퓨란— 3ᅳ일 -싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4-일 ) - ( 3ᅳ메특시페놀) -아민， N— (3-메톡시페닐) -6-(4ᅳ (2ᅳ (피롤리딘ᅳ 1- 일 )에록시 )페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-아민，
N-(3-메톡시페닐 )-6- (싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민
(3-메특시페닐) -(6-싸이오펜 -3-일-싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4-일) - 아민，
N-(3-메특시페닐)ᅳ 6ᅳ(4ᅳ(2ᅳ (피페라진 -1- 일 )에록시 )페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민，
(3-메특시페닐 )ᅳ(6-싸이오펜 -2-일ᅳ싸이에노 [3 , 2ᅳ d]피리미딘— 4-일)ᅳ 아민 ,
. 3-( 6-싸이오펜ᅳ 3-일ᅳ싸이에노 [3ᅳ 2-d]피리미딘— 4-일아미노)—페놀， 3-( (6-(4-(모풀리노메틸)페닐)싸이에노[3，2ᅳ1]피리미딘ᅳ4- 일아미노)페놀,
3-( (6-(4-(피페라진 -1-일메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]괴리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(4ᅳ (피를리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘-4- 일아미노)페놀,
3-( (6-(4- (피페리딘ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6ᅳ(4-( (4ᅳ메틸피페라진 -1—일-메틸 )페닐)싸이에노 [3， 2ᅳ d]피리미딘— 4ᅳ일아미노)페놀，
3-( (6-(4- ( (다이에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6- (퓨란ᅳ2ᅳ일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀，
3-(6- (퓨란ᅳ2ᅳ일)싸이에노 [3，2— d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀，
3-(6— (4- ( (사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-( (6— (4- ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4ᅳ ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4— (2- (피롤리딘 -1-일 )에틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4一 일아미노)페놀,
3-( (6-(4ᅳ(2- (피페리딘 -1-일)에틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀，
3_( (6-(4-(2-(4-메틸피페라진ᅳ1ᅳ일)에틸)페닐)싸이에노[3，2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(4-(2-모폴리노에틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ4- 일아미노)페놀,
2-(4-(4ᅳ(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1-(4ᅳ메틸피페라진 -1-일)에타논，
2- (4-(4— (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1- (피를리딘 -1-일)에타논，
Ν,Ν-다이에틸— 2-(4ᅳ (4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -6-일 )페닐)아세트아마이드，
3- (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 6-일 )벤조산 (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) (4—메틸피페라진 -1-일)메타논，
(3-(4ᅳ(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 (피를리딘 -1-일)메타논, N , N-다이에틸 -3ᅳ(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -6-일)벤즈아마이드，
(3-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 (4-메틸피페라진 -1-일)메타논,
메틸 1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -2-카복실레이트,
3-(6-(4-((2ᅳ (하이드록시메틸)피를리딘 -1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
3-(6-(4-( (4-메틸피페리딘 -1ᅳ일 )메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘- 4-일아미노)페놀，
3-(6- -(((2R,6S)-2,6-다이메틸피페리딘 -1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3-(6ᅳ (3- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘一 4- 일아미노)페놀,
3-(6-(3-( (4-메틸피페라진 -1ᅳ일 )메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀,
3-(6 (3- (피롤리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3- ((다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
3-(6-(3- (피페라진ᅳ1ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3-((에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀，
3-(6-(3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3,2— d]피리미딘ᅳ4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3-((아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀， l-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ6- 일)벤질)피롤리딘 -2-카복사마이드 염산염，
1-(4— (4-(3_하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 6- 일)벤질)피롤리딘— 2-카복실산 염산염，
3-(6-(4-( (2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀，
메틸 2- (3-(4- (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤즈아미도)프로파노에이트， .
1ᅳ (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -3-을 염산염，
3ᅳ(6-(4- (에톡시메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4—일아미노)페놀， 4-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6-일 HH 1- 하이드록시프로판 -2-일)벤즈아마이드，
2ᅳ (4-(4ᅳ(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘一 6- 일；)벤즈아미도)프로판산，
3-(6-(3-(2- (피를리딘 -1-일)에틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3-(2- (피페라진 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(2-(4- (피를리딘ᅳ 1-일메틸)페닐)싸아에노 [3 , 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3- (6- (4-모폴리노페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ (2-(4- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘-그일아미노)페놀， 3ᅳ (2-(4-( (4-메틸피페라진 -1ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 _7一 일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피를리딘 -1ᅳ일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피롤리딘 -1-일메틸)퓨란 -2ᅳ일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ 일아미노)페놀，
3ᅳ(6— (5-((4-메틸피페라진 -1-일)메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
3-(6ᅳ(5- (피페리딘 -1—일메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
3ᅳ ( 6- ( 5- (모폴리노메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피페라진 -1ᅳ일메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀，
3ᅳ ( 6- ( 5- ((에틸아미노)메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘ᅳ4- 일아미노)페놀，
3-(6-(5-((4ᅳ메틸피페라진 -1ᅳ일 )메틸)싸이오펜 -2—일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀，
3-(6— (5- (피페리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘ᅳ4-일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피페라진 -1-일메틸)싸이오펜 -2ᅳ일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(5- ((에틸아미노)메틸)싸이오펜ᅳ2ᅳ일)싸이에노 [3，2-d}피리미딘- 4-일아미노)페놀,
3-(2-(4- (피페리딘 -1—일메틸)페닐)싸이예노 [3,2ᅳ b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2-(4- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2-(4-( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2-(4-메틸피페라진ᅳ 1-일)싸이아졸로 [4,5-d]피리미딘ᅳ그
일아미노)페놀，
3-(6-(4ᅳ (피롤리딘 -1-일메틸)싸이오펜ᅳ2-일)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘 -4—일아미노)페놀，
3ᅳ (6ᅳ(4-((4-메틸피페라진ᅳ 1-일)메틸)싸이오펜 -2ᅳ일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ (6-(4- (피페리딘 -1-일메틸 )싸이오펜 -2ᅳ일)싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(4- (모폴리노메틸 )싸이오펜 -2ᅳ일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산)
' 3ᅳ(6— (4- (피페라진 -1—일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
3-(6-(4- ((에틸아미노메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀，
3-(2-(3- (피를리딘— 1-일메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-b]피리딘-그
일아미노)페놀，
3-(2-(3— ((4ᅳ메틸피페라진 -1-일)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2-(3- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3，2ᅳb]피리딘-7- 일이-미노)페놀，
3-(2-(3— (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -7-일아미노)페놀， 3- ( 2- ( 3- (피페라진ᅳ 1-일메틸)페닐)싸이에노 [ 3， 2-b ]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2— (3- ((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -그
일아미노)페놀，
3-(6-(4- (피롤리딘 -1-일메틸)퓨란— 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(4ᅳ ((4-메틸피페라진 -1-일)퓨란 -2ᅳ일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
3-(6-(4- (피페리딘 -1-일메틸)퓨란 -2ᅳ일)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 염은 무기산염， 유기카본산염 또는 설폰산염인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 5]
제 4항에 있어서， 상기 무기산염은 염산염이고， 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 1항에 있어서， 상기 조성물은 0. 1 一 500mg/kg 체중으로 투여되는 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 7]
제 6항에 있어서， 상기 투여는 경피 투여인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 8】
게 1항에 있어서， 상기 조성물의 제형은 연고, 크림 또는 패취제인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 약학적 조성물.
【청구항 9】
하기 화학식 1로 표시되는 화합물， 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물. [화학식 1]
Figure imgf000064_0001
상기 XI 은 N 또는 CH이고;
상기 R1은 -0H, 또는 -0CH3 이고;
상기 Y는 R2로 치환된 C6-10아릴， 또는 R2로 치환된 C5-10헤테로아릴 또는 N-메틸피페라지닐이고;
상기 R2는 -(CH2)n-R3 , -(CH2)n-C(0)-R3 , 또는 -0(CH2)n-R3이고;
상기 R3는 -H, -CN, 할로겐, C1-3알킬， C1-3알콕시， 페닐， 피리디닐, 아미노， C1-3알킬아미노, 디 C1-3알킬아미노， 하이드록시 C1-3알킬아미노， 카르복시 C1-3알킬아미노, C3-6사이클로알킬 C1-3알킬아미노， 피를리디닐, 하이드록시피를리디닐， 하이드록시 C1-3알킬피를리디닐, 카르복시피를리디닐 피페리디닐, C1-3알킬피페리디닐， 디 C1-3알킬피페리디닐， 피페라지닐, C1ᅳ 3알킬피페라지닐， C1-4알콕시카르보닐피페라지닐, 또는 모르포닐린이고; 및 상기 n은 0 내지 3의 정수이다.
【청구항 10】
게 9항에 있어서， 상기 R3는 -H , -CN, 할로겐, C1-3알킬， C1ᅳ 3알콕시， 페닐， 피리디닐， 아미노， 에틸아미노， 디에틸아미노， 피를리디닐， 피페리디닐， 피페라지닐， 모르포닐린 또는 하기 구조식으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
[구조식]
Figure imgf000065_0001
【청구항 11】
제 9항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
3- (6- (페닐싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀,
4- (4-(3-메톡시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6
일)벤조나이트릴，
4- ( 4- ( 3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘 -6- 일)벤조나이트릴,
3- (6-브로모—싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4ᅳ닐아미노) -페놀，
4- (4- (3ᅳ메톡시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6-일 )페놀， 3-[6-(4-메톡시페닐) -싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4ᅳ닐아미노] -페놀, N-(3-메특시페닐 )ᅳ6ᅳ(4-(2-모폴리노에톡시 )페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-아민,
3-(6ᅳ (4-클로로페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀, 3-(6-(4— (2-모폴리노에톡시)페닐)싸이에노 [3 , 2— d]피리미딘 -4— 일아미노)페놀,
N-(3-메특시페닐) -6-(4-페네톡시페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 아민，
N-(3ᅳ메톡시페닐 )— 6ᅳ(4-(2-(피리딘 -2ᅳ일 )에특시 )페닐 )싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4—아민， (6ᅳ퓨란 -2-일ᅳ싸이에노 [3,2ᅳ d]피리미딘 -4-일 )-(3ᅳ메록시페놀) -아민， (6ᅳ퓨란 -3ᅳ일ᅳ싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4ᅳ일 )ᅳ(3ᅳ메톡시페놀) -아민， N-(3ᅳ메톡시페닐 )-6ᅳ(4-(2- (피를리딘 -1—
일 )에특시 )페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ아민，
N— (3-메톡시페닐 )-6ᅳ (싸이오펜ᅳ 2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ아민
(3—메특시페닐) - ( 6-싸이오펜 -3ᅳ일ᅳ싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4-일 )ᅳ 아민，
N-(3-메록시페닐) _6-(4ᅳ(2- (피페라진ᅳ 1- 일 )에록시)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-아민，
(3-메록시페닐) -(6-싸이오펜ᅳ 2-일ᅳ싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4ᅳ일)ᅳ 아민，
3ᅳ ( 6ᅳ싸이오펜 -3-일ᅳ싸이에노 [ 3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ일아미노) -페놀, 3ᅳ( (6-(4- (모폴리노메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4— 일아미노)페놀，
3-((6-(4- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀， . ■
3-(6-(4- (피를리딘 -1-일메릴)페닐)싸이에노 [3,2-d]피리미딘 -4ᅳ 일아미노)페놀，
3_( (6ᅳ (4_(피페리딘ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3,2ᅳ d]피리미딘 _4ᅳ 일아미노)페놀，
3_((6-(4-((4-메틸피페라진 -1-일-메틸)페닐)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
3-( (6-(4- ((다이에틸아미노)메틸 )페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6ᅳ (퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6- (퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4-일아미노)페놀， 3-(6-(4-( (사이클로프로필메틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2- d]피.리미딘 -4-알아미노)페놀, 3-( (6-(4— ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘— 4ᅳ 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-( (에틸아미노)메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ4ᅳ 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-(2ᅳ (피롤리딘 -1ᅳ일)에틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6ᅳ(4-(2ᅳ (피페리딘 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-( (6-(4-(2ᅳ(4ᅳ메틸피페라진 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(4-(2-모폴리노에틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4一
일아미노)페놀，
2ᅳ(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐 )-1-(4ᅳ메틸피페라진 -1-일)에타논，
2ᅳ (4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)페닐) -1- (피를리딘 -1-일)에타논，
N ,Ν 다이에틸 2-(4-(4-(3-하이드톡시페닐아미노)싸이에노 [3， 2- . d]피리미딘 -6-일 )페닐)아세트아마이드，
3ᅳ(4ᅳ(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 6-일 )벤조산 (4- (4- (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘— 6ᅳ 일)페닐) (4-메틸피페라진 -1-일)메타논，
(3-(4ᅳ (3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -6ᅳ
일)페닐 (피롤리딘ᅳ 1-일)메타논，
Ν , Ν-다이에틸ᅳ 3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3，2- d]피리미딘 -6ᅳ일)벤즈아마이드，
(3-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6一
일)페닐 (4-메틸피페라진 -1-일 )메타논,
메틸 1ᅳ(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3ᅳ 2-d]피리미딘 -6ᅳ 일)벤질)피를리딘ᅳ2ᅳ카복실레이트，
3-(6ᅳ(4-( (2- (하이드록시메틸)피를리딘 -1ᅳ
일)메틸)페닐 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘— 4-일아미노)페놀，
3-(6-(4-( (4ᅳ메틸피페리딘 -1ᅳ일 )메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘- 4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(4ᅳ( ( (2 ，63)ᅳ2，6ᅳ다이메틸피페리딘ᅳ1- 일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2— d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(3- (피페리딘 -1ᅳ일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2ᅳ d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀， .
3-(6-(3— ( (4-메틸피페라진 -1-일 )메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(3ᅳ (피를리딘ᅳ 1ᅳ일메틸 )페날)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀，
3-(6-(3- ( (다이에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(3- (피페라진ᅳ 1ᅳ일메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(3- ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3，2— d]피리미딘— 4- 일아미노)페놀，
3ᅳ (6-(3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3-(6-(3- ( (아이소부틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2ᅳ d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
1-(4— (4-(3—하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ6ᅳ 일)벤질)피를리딘ᅳ2ᅳ카복사마이드 염산염,
1-(4-(4ᅳ (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘ᅳ 6ᅳ 일)벤질)피를리딘ᅳ 2ᅳ카복실산 염산염，
3一 (6ᅳ(4-( (2-하이드록시에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘— 4-일아미노)페놀，
메틸 2-(3-(4-(3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤즈아미도)프로파노에이트，
1-(4-(4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -6- 일)벤질)피를리딘 -3-을 염산염，
3ᅳ ( 6- (4- (에록시메틸)페닐)싸이에노 [ 3， 2-d ]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
4- (4- (3ᅳ하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3，2ᅳ d]피리미딘 -6ᅳ일 )-Ν-( 1- 하이드록시프로판 -2-일 )밴즈아마이드，
2ᅳ (4ᅳ (4-(3-하이드록시페닐아미노)싸이에노 [3， 2ᅳ d]피리미딘 -6ᅳ 일)벤즈아미도)프로판산，
3ᅳ (6ᅳ (3ᅳ(2- (피롤리딘 -1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀,
3— (6-(3ᅳ(2- (피페라진ᅳ 1-일)에틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀，
3ᅳ(2ᅳ(4- (피를리딘ᅳ 1-알메틸)페닐 )싸이에노 [3， 2-b]피리딘ᅳ7- 일아미노)페놀，
3- (6- (4ᅳ모폴리노페닐)싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀， 3ᅳ(2-(4— (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘-그일아미노)페놀， 3-(2-(4-( (4-메틸피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2— b]피리딘 -그 일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피를리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3 , 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피를리딘 -1ᅳ일메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4ᅳ 일아미노)페놀,
3-(6-(5-( (4—메틸피페라진 -1-일)메틸)퓨란 -2ᅳ일)싸이에노 [3，2- d]피리미딘— 4-일아미노)페놀，
3-(6-(5- (피페리딘 -1ᅳ일메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀， 3-(6ᅳ(5— (모폴리노메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3 ,2-d]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3ᅳ ( 6ᅳ ( 5- (피페라진 - 1ᅳ일메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [ 3 , 2-d ]피리미딘ᅳ 4- 일아미노)페놀，
3— (6-(5- ((에틸아미노)메틸)퓨란 -2-일)싸이에노 [3，2— d]피리미딘 -4ᅳ 일아미노)페놀，
3-(6-(5-( (4ᅳ메틸피페라진ᅳ 1-일 )메틸 )싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3 ,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(5- (피페리딘 -1-일메틸)싸이오펜— 2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀， .
3- ( 6- ( 5- (피페라진 - 1-일메틸)싸이오펜— 2-일)싸이에노 [ 3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀,
3-(6-(5— ((에틸아미노)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2— d]피리미딘- 4-일아미노)페놀，
3-(2-(4- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3，2ᅳ b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3一 (2 (4- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀'
3_(2-(4ᅳ ((에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3,2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(2-(4ᅳ메틸피페라진 -1-일)싸이아졸로 [4,5-d]피리미딘 -7- 일아미노)페놀，
3-(6— (4- (피롤리딘 -1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀，
3ᅳ(6ᅳ (4ᅳ ((4ᅳ메틸피페라진 -1-일)메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3,2ᅳ d]피리미딘 -4ᅳ일아미노)페놀，
3ᅳ(6-(4ᅳ (피페리딘ᅳ1-일메틸 )싸이오펜 -2-일 )싸이에노 [3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀， 3-(6-(4- (모폴리노메틸)싸이오펜 -2—일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산)
3- ( 6- ( 4- (피페라진 - 1-일메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [ 3， 2- d]피리미딘 -4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산
5 3-(6-(4- ( (에틸아미노메틸)싸이오펜 -2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘- ᅳ 4-일아미노)페놀，
3-(2ᅳ (3- (피를리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘一 7- 일아미노)페놀，
3-(2ᅳ(3-( (4—메틸피페라진 -1—일)메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7- 10 일아미노)페놀，
3ᅳ (2ᅳ (3- (피페리딘 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7- 일아미노)페놀，
3— (2ᅳ(3- (모폴리노메틸)페닐)싸이에노 [3 , 2-b]피리딘 -7-일아미노)페놀 3-(2— (3- (피페라진 -1-일메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -7- 15 일아미노)페놀，
3-(2ᅳ (3- ( (에틸아미노)메틸)페닐)싸이에노 [3， 2-b]피리딘 -그 일아미노)페놀，
3-(6ᅳ(4- (피를리딘 -1-일메틸)퓨란ᅳ 2-일)싸이에노 [3 , 2-d]피리미딘ᅳ 4ᅳ 일아미노)페놀，
20 3-(6-(4-( (4-메틸피페라진 -1-일)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘-
4-일아미노)페놀 트라이플루오로아세트산 및
3-(6-(4- (피페리딘 -1-일메틸)퓨란 -2-일 )싸이에노 [3， 2-d]피리미딘 -4- 일아미노)페놀로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체 또는 이들의 약학적으로
25 허용 가능한 염인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 12】
제 9항에 있어서， 상기 염은 무기산염， 유기카본산염 또는 설폰산염인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 131
제 12항에 있어서， 상기 무기산염은 염산염이고, 상기 유기카본산염은 트라이플루오로아세트산염인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 14]
제 1항에 있어서， 상기 조성물은 0. 1 ~ 500mg/kg 체중으로 투여되는 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 투여는 경피 투여인 것인, 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
【청구항 16】
제 9항에 있어서， 상기 조성물의 제형은 연고， 크림 또는 패취제인 것인， 피부 노화 방지 또는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
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