KR101530426B1 - 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 필발 분획물은 내이손상에 있어서 자유 라디칼을 억제하여 활성산소(ROS)에 세포자멸의 촉진을 차단함으로써, 내유모세포 및 외유모세포의 손실을 보호하고, 세포자멸하는 세포를 보호하는 효과가 있어, 내이독성에 의한 내이손상을 방지할 수 있고, 천연물 유래 약품으로 부작용 없이 청력 보호용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INNER EAR DAMAGE COMPRISING FRACTION OF PIPER LONGUM L}

본 발명은 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

인체 감각의 하나인 청각은 소실될 경우에 개인적으로는 일상생활에 장애를 초래하며 사회 경제적으로는 막대한 손실을 초래한다. 언어습득 전에 심각한 난청이 발생할 경우 청각장애뿐만 아니라, 정상적인 언어발달에 지장을 받아 언어장애가 동반되어 문제가 된다.

감각신경성 난청은 음파의 진동을 전기신호로 바꾸어주는 내이의 유모세포 (hair cell)의 손상으로 인하여 생기는 것으로 각종 약물에 의하여 발생하는 경우를 이독성(ototoxicity) 난청이라고 한다. 이독성 약제들에 의한 내이손상은 여러 가지 경로를 통해 발생하는데, 경구투여, 근육주사, 정맥주사 등과 같은 전신적 투여 또는 점이액과 같은 국소적 투여는 물론이고 오염된 공기의 흡입으로도 독성을 일으킬 수 있다. 증상은 투여 후 즉시 나타나기도 하고, 약을 중단한 후 수주나 수개월 후에 자연적으로 발생할 수 있다. 증상은 일시적인 경우도 있으나, 영구적인 손상을 초래하기도 하며, 일측 혹은 양측에 모두 발생하기도 한다. 이독성을 일으키는 대표적인 약물로는 아미노글리코사이드계 항생제가 있으며, 이를 장기간/고용량으로 복용하는 경우 이명, 난청, 어지럼증 등의 내이손상에 의한 증상이 발생하게 된다.

가장 광범위하게 이용되는 아미노글리코사이드계 항생제 중 겐타마이신은 내이 유모세포의 손실을 통해서 청력의 손실과 균형 장애를 유발할 수 있다. 아미노글리코사이드계 항생제로 유발된 내이손상과 관련된 일반적인 신호 경로는 ROS 생산과 세포 자멸이다. 세포자멸은 이독성에서 유모세포 손실의 상태로 나타나고, ROS는 세포자멸을 촉진하는 중요한 역할을 한다. 겐타마이신과 같은 아미노글리코사이드계 항생제는 철과 복합체를 형성할 수 있고, 이러한 복합체는 불포화 지방산과 작용하여 활성산소와 과산화지질을 형성한다. 아미노글리코사이드는 내이 조직에서 유도성 iNOS를 활성화시킬 수 있고, 일산화 질소의 증가를 유도할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 활성산소 자유 라디칼은 일산화 질소와 반응하여 파괴적인 퍼옥시니트라이트(peroxinitrnite) 라디칼을 형성할 수 있고, 또는 즉각적으로 유모세포의 사멸을 개시할 수 있다.

따라서 유모세포의 보호는 아미노글리코사이드계 항생제로 유도된 내이손상을 예방하는데 중요한 목적이 되고 있으나, 아직까지 이에 대한 뚜렷한 예방 및 치료 약물이 개발되어 있지 않아, 이의 연구개발이 필요한 실정이다.

한편, 필발(Piper longum L.)은 넝쿨 형태의 다년생 식물이다. 고대 중인도의 한 나라인 마가타국에서는 필발리라고 하였고, 아프가니스탄 북부의 발흐 동쪽의 요충지 푸룸(Purum)에서는 아리아타 라고 불렀다. 필발은 특이한 방향이 있고 맛은 맵고 성질은 뜨거우며, 생김새는 원주형으로 과축(果軸)의 주위에는 작은 알맹이의 열매가 무수히 붙어 있어 그물눈 모양을 나타낸다. 바깥 면은 적갈색이나 흑갈색이다. 열매의 위쪽에 셋으로 갈라진 주두(柱頭)가 있고 아래쪽은 과축이 붙어 있다. 필발은 장위가 차서 생기는 복부동통, 구토, 식욕감퇴, 설사, 이질, 치통 등에 사용하며, 약리작용으로는 억균작용, 항경련작용, 피부혈관확장작용 등이 보고되었으나, 청력 보호 효과에 대해서는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

본 발명자는 이독성에 의한 내이손상의 치료제를 찾기 위한 연구를 계속하던 중, 필발 분획물이 내이의 조직배양 모델에서 내이손상을 억제하는 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

KR10-2008-0114395A

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 필발의 헥산 및 에탄올의 혼합 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 필발(Piper longum L.)은 후추과의 필발을 의미하는 것으로, 식물체의 전체 부위를 이용할 수 있고, 바람직하게는 열매를 이용할 수 있다.

상기 필발 분획물은 필발 추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조할 수 있다. 필발 추출물은 필발을 추출용매로 추출하여 제조한 것일 수 있고, 필발 추출물을 제조하는 방법은 통상의 식물 추출물의 제조방법을 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 불순물을 제거한 상기 식물에 추출용매를 가하고 추출과정을 수행하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 추출과정은 냉침추출법, 온침추출법, 가압추출법 또는 초음파 분쇄 추출법일 수 있다

상기 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 바람직하게는 1 내지 100%의 에탄올 또는 1 내지 100%의 메탄올일 수 있고, 더욱 바람직하게는 20% 내지 40% 에탄올 일 수 있다.

상기 분획물은 상기 추출법으로 제조한 추출물, 구체적으로 조추출액에 분획과정을 더욱 실시한 분획물일 수 있다. 상기 분획용매는 헥산 및 에탄올을 혼합한 혼합 용매일 수 있다. 상기 헥산 및 에탄올의 혼합용매를 분획용매로 사용한 필발 분획물의 경우, 내이 손상에 있어서 자유 라디칼을 억제하여 활성산소(ROS)에 세포자멸의 촉진을 차단함으로써, 내유모세포 및 외유모세포의 손실을 보호하고, 세포자멸하는 세포를 보호하는 효과가 있음을 실험적으로 확인하였고, 이러한 보호효과는 필발 추출물과 비교하여도 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

상기 분획용매는 바람직하게는 헥산 및 에탄올을 1 : 0.9 내지 1 : 5의 부피비, 더욱 바람직하게는 1 : 3.5 내지 1 : 4.5의 부피비로 혼합한 혼합용매를 일 수 있다. 가장 바람직한 혼합용매로는 헥산 및 에탄올을 2 : 8의 부피비로 혼합한 것을 사용할 수 있다. 상기 혼합 용매를 이용한 분획물의 경우 5 ㎍/ml의 농도에서도 유의적인 내이보호효과가 확인되어, 5 mg/ml에서 유의적인 보호효과를 나타내었던 필발 추출물과 비교하여, 1000배 이상으로 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.

본 발명에 있어서 내이손상은 소리가 전달되는 경로의 문제로 발행하는 전음성 난청과 소리를 감지하는 부분의 문제로 발생하는 감각신경성 난청을 모두 포함하는 의미이다. 상기 감각신경성 난청은 미로염, 뇌수막염 등의 염증성 질환, 소음성 난청, 이독성 약물, 측두골 골절 등의 외상, 노인성 난청, 메니에르병, 돌발성 감각신경성 난청, 감상선 기능저하 등의 대사이상, 뇌의 허혈성 질환, 백혈병 등의 혈액질환, 다발성 경화증 등의 신경학적 이상, 면역이상, 청신경 종양 등의 종양성 질환, 골질환 등의 감각신경성 난청에 의하여 유발되는 것을 모두 포함하며, 바람직하게는 유모세포의 손실, 사멸 또는 유모세포의 부동섬유의 상실과 같은 유모세포의 손상에 의하여 유발되는 내이손상, 이독성 약물에 의한 내이손상일 수 있다.

상기 내이손상은 일 예로 이명, 난청, 어지럼증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다.

상기 이독성은 독소에 의한 귀, 특히 달팽이관이나 청신경, 전정기관 등의 손상 입는 것을 말한다. 이는 통상 약제에 의해 유발된다. 이독성은 감각신경성 청력손실, 평형 이상, 또는 두 가지 모두를 야기할 수 있다. 양쪽 모두 회복이 가능하고 일시적일 수 있으나, 되돌릴 수 없고 영구적일 수도 있다.

상기 이독성 약물은 내이 조직에서 독성을 나타내는 모든 치료적 및 비치료적 약물을 포함하는 의미이고, 내이 신경에 독성을 갖는 약제로는 일 예로 아미카신, 아르베카신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신 등을 포함하는 아미노글리코시드 (aminoglycoside)계 항생제, 아세타졸아마이드, 푸로세미드, 부메타니드, 에타크린산 등을 포함하는 이뇨제, 시스플라틴 또는 카보플라틴과 같은 백금을 기본으로 한 화학 요법 물질 등이 포함된다. 또한, 멜록시캄과 같은 비스테로이드성 항염증약(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAIDS), 퀴닌 또는 주석, 수은, 납 등의 중금속, 아스피린, 비아그라, 레비트라, 시알리스 등이 있으나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 필발 분획물을 0.1 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 조성물은 유효성분인 필발 분획물 뿐 만 아니라 기존에 공지된 내이손상의 예방 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합할 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로오스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 조성물의 유효량은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 필발 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 0.001 ㎎/kg 내지 2500 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 필발 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 흉골 내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피 내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

또한 본 발명은 필발의 헥산 및 에탄올의 혼합 분획물을 유효성분으로 포함하는 내이손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초콜릿, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

식품 또는 음료 중의 필발 분획물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능성 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.01 내지 100mg, 바람직하게는 0.1 내지 10mg의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 필발 분획물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한 상기 식품 조성물은 필발 분획물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 필발 분획물은 천연물질로서 독성 및 부작용이 없어 청력 보호 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있고, 내이 유모세포의 보호 및 항산화활성 효과를 통해서 내이 손상을 보호하는 효과가 있음을 실험적으로 확인하였다.

본 발명의 필발 분획물은 내이손상에 있어서 자유 라디칼을 억제하여 활성산소(ROS)에 세포자멸의 촉진을 차단함으로써, 내유모세포 및 외유모세포의 손실을 보호하고, 세포자멸하는 세포를 보호하는 효과가 있어, 내이독성에 의한 내이손상을 방지할 수 있고, 천연물 유래 약품으로 부작용 없이 청력 보호용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 내유모세포(IHC) 및 외유모세포(OHC)에서 겐타마이신에 의한 세포 독성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 100 ㎛ 당 세포의 수를 의미하고, 그래프의 가로축은 겐타마이신의 농도(mM)를 의미한다.
도 2는 겐타마이신에 의한 유모세포의 손상을 확인한 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 겐타마이신의 항생효과를 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 OD 600nm 값을 의미하고, 그래프의 가로축은 겐타마이신의 농도(mM)를 의미한다.
도 4는 겐타마이신의 항생효과에 필발 추출물이 미치는 효과를 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 OD 600nm 값을 의미하고, 그래프의 가로축은 아무 처리도 하지 않은 대조구(control), 필발 추출물(PL only)만 처리한 처리군, 겐타마이신만 처리한 처리군(GM only) 그리고 필발 추출물과 겐타마이신을 함께 처리한 처리군(PL+GM)를 나타낸다
도 5는 내유모세포(IHC) 및 외유모세포(OHC)에서 필발 추출물(PL)에 의한 세포 독성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 100 ㎛ 당 세포의 수를 의미하고, 그래프의 가로축은 필발 추출물의 농도(mM)를 의미한다.
도 6은 필발 추출물의 겐타마이신에 의해 유발된 내이손상에서 내유모세포(IHC) 및 외유모세포(OHC)의 보호효과를 확인하는 그래프이다. 그래프의 세로축은 100 ㎛에 당 내유모세포(IHC) 및 외유모세포(OHC)의 각각의 세포의 수를 의미하고, 그래프의 가로축은 미처리군(untreated)와 겐타마이신 처리군(0) 그리고 필발 추출물의 농도(mM)에 따른 처리군을 의미한다.
도 7은 필발 추출물의 겐타마이신에 의해 유발된 내이 손상에 대한 보호효과를 확인하는 도이다.
도 8은 필발 분획물의 분획용매에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 도이다. 그래프의 세로축은 라디칼 소거 활성 정도(%)를 나타내고, 그래프의 가로축은 분획용매에 따른 분획물 처리군을 나타낸다.
도 9는 필발 분획물의 농도에 따른 자유라디칼 소거 활성을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 라디칼 소거 활성 정도(%)를 나타내고, 그래프의 가로축은 분획물의 농도(㎍/ml)에 따른 처리군을 나타낸다.
도 10은 anti-myosin-7a 및 TUNEL 이중표지된 코르티기관 절편의 전자현미경 사진을 나타내는 도이다. Basal은 기관의 기저부, middle은 중단부 그리고 apical은 정단부를 나타내고, 미처리군(untreated), 겐타마이신 처리군(GM) 그리고 겐타마이신과 각 농도의 필발 분획물 처리군(PL+CM)를 나타내며, 적색은 anti-myosin-7a 으로 표지된 것이고 녹색은 TUNEL로 표지된 것을 나타낸다.
도 11은 TUNEL 표지된 외유모세포 및 내유모세포의 수를 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 100 ㎛ 당 세포의 수를 의미하고, 그래프의 가로축은 미처리군(untreated), 겐타마이신 처리군(GM only) 그리고 겐타마이신과 각 농도의 필발 분획물 처리군(PL+CM)를 나타낸다.
도 12는 팔로이딘 표지된 외유모세포 및 내유모세포의 수를 나타낸 그래프이다. 그래프의 세로축은 100 ㎛ 당 세포의 수를 의미하고, 그래프의 가로축은 미처리군(untreated), 겐타마이신 처리군(GM only) 그리고 겐타마이신과 각 농도의 필발 분획물 처리군(PL+CM)를 나타낸다. 도 12a는 기저부, 도 12b는 중단부 그리고 도 12c는 정단부에서 세포의 수를 측정한 그래프이다.
도 13은 팔로이딘 표지된 외유모세포 및 내유모세포의 전자 현미경 사진을 나타내는 도이다. Basal은 기관의 기저부, middle은 중단부 그리고 apical은 정단부를 나타내고, 미처리군(untreated), 겐타마이신 처리군(GM) 그리고 겐타마이신과 각 농도의 필발 분획물 처리군(PL+CM)를 나타낸다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예를 제시한다. 하기 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예] 필발 추출물 및 분획물의 제조

1. 필발 에탄올 추출물의 제조

본 실험에서 사용한 필발(Piper longum L.)은 동국대학교 일산 병원 (한국)에서 구입하였다. 건조된 필발 열매 분말을 30% 에탄올에 1:10의 부피비로 섞어 85 내지 90 ℃에서 3시간 동안 추출하는 과정을 두 수행하고, 40 μM 필터로 여과하였다. 이 후 진공건조기를 이용(60 ℃)하여 에탄올을 제거하고, PBS(phosphate buffered saline, pH7.2)에 녹여 이 후 실험에서 사용하였다.

2. 필발 분획물의 제조

상기 1에서 제조한 필발 에탄올 추출물을 헥산과 에탄올의 부피비를 상이하게 제조한 여러가지 혼합용매를 이용하여 분획물을 제조하였다. 상기 분획은 85 내지 90 ℃에서 3시간 동안 실시 한 후 40 μM 필터로 여과하고, 진공건조기를 이용(60 ℃)해서 상기 분획용매를 제거하는 방법으로 실시하였다.

상기 분획용매는 헥산 100, 헥산 및 에탄올을 8 : 2, 5 : 5 그리고 2 : 8 부피비로 각각 혼합한 혼합 용매와 에탄올 100인 경우로 나눠 다섯 가지 분획용매를 이용하여 각각의 필발 분획물을 제조하여 실험에 사용하였다.

[실험예 1] 필발 추출물 및 분획물의 내이손상 보호효과 확인

모든 실험은 동국대학교 일산병원의 동물실험윤리위원회의 규정에 따라서 진행하였다. ICR 마우스(Koateck, 평택, 한국)의 출생 후 4일 된 새끼를 이용하여 실험을 실시하였다.

실험예 1-1. 달팽이관 조직배양(Cochlea organotypic culture)

생후 4일이 된 ICR 마우스(Koatech, 한국)의 새끼(pup)를 실험에 사용하여 달팽이관 조직배양을 실시하였다. 코르티(corti) 기관(organ)의 시료(preparation)로 평평한 표면을 갖도록 달팽이관을 절단하였다. 랫트 꼬리 콜라겐(rat tail collagen, Type 1; BD Biosciences, 미국, 3.86 mg/mL in 0.02 N 아세트산, 10x basal medium eagle (Sigma-Aldrich, S. Louis, MO, 미국), 2% 탄산나트륨; 9:1:1 비율)을 35 mm 직경의 배양접시(Nunc, Rochester, 미국) 및 겔에 첨가하였다. 그 후, 1% N-1 보충물(Sigma-Aldrich) 및 50 U/mL 페니실린 G(Sigma-Aldrich)가 포함된 혈청없는 Dulbecco's modified Eagle's medium(Welgene, 한국) 1 mL를 가하였다. 포셉(forcep)을 이용해서 코르티 기관을 콜라겐 겔의 표면에 밀어넣고, 배양 배지의 표면 장력으로 고정하였다. 달팽이관 배양은 5% CO₂ 조건에서, 습기가 많은 상태로 37℃를 유지하며 하룻밤 동안 배양하였다.

겐타마이신에 의한 손상을 유발하는 경우 상기 배양된 배지를 24 시간 동안 겐타마이신(GM, 0.3 mM)에 노출한 후, 각 조건에 따라 처리하여 실험에 사용하였다.

특별한 언급이 없는 경우, 내이손상에 대한 보호효과를 측정하기 위해서, 상기 겐타마이신으로 처리하기 전에, 배양절편을 필발 추출물 또는 분획물로 1시간 동안 처리하여 보호효과를 확인하였다.

실험예 1-2. 유모세포 계수

24 시간 동안 배양한 후에, 배지를 고정하고, Alexa Flour 350 phalloidin(Invitrogen, 미국)으로 염색하였다. 상기 배양체는 Gel Mount Biomedia(Fisher Scientific, 미국)에 절편을 올려놓고, 커버슬라이드로 덮은 후, DMIL 현미경(Leica, 독일)을 이용해서 관찰하였다. 각각의 표지된 유모세포 유모(hair cell cilia)는 세 개의 외유모세포(outer hair cell) 열과 하나의 내유모세포(inner hair cell)열에서 계수되었다. 정상적인 기하학적 배열에 갭이 있는 경우와 부동섬모(stereocilia) 또는 표피판(cuticular plate)이 없는 것이 분명한 경우는 세포가 손실된 것으로 간주하였다.

절편 각각의 정단부(apical), 중단부(middle) 그리고 기저부(basal)에서 무작위로 선택된 5개의 부분에서 100 μm의 길이에 있는 세포의 수를 계수하였다. 5개 부위(field)의 평균값을 하나의 샘플로 하여, 일반적으로 5 내지 11개의 샘플을 각각의 환경에서 측정하는 방법으로 유모세포를 계수하였다.

실험예 1-3. 겐타마이신의 세포독성 실험

상기 실험예 1-1에서 조직배양한 세포에 겐타마이신(Gentamicin, GM)을 0.1 내지 1 mM의 농도로 24시간 동안 처리하여 세포독성을 확인하고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 각각 나타낸 바와 같이, 겐타마이신의 농도가 증가함에 따라 내유모세포(inner hair cell, IHC)와 외유모세포(outer hair cell, OHC)의 수가 유의적으로 감소하였고, 세포의 윤곽이나 배열이 망가지는 현상이 관찰되었다(도 2). 이를 통해 겐타마이신의 농도가 0.3mM인 경우부터, 내유모세포에 대한 세포독성을 나타내는 것을 확인하였고, 이를 기준으로 하여 이하 실험을 수행하였다.

실험예 1-4. 필발 추출물이 겐타마이신의 항생효과에 미치는 영향

필발 추출물이 겐타마이신의 항생효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여 대장균을 배양하여, 상기 대장균에 겐타마이신을 농도별로 처리하고 37 ℃에서 하룻밤 동안(overnight) 배양한 후, OD 600nm값을 측정하여, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 30 μM 이상의 농도에서는 모든 박테리아가 죽었고, 0.3 μM 이하에서는 겐타마이신이 박테리아의 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 겐타마이신 0.3 mM과 필발 추출물 5 mg/ml을 함께 처리한 처리군(PL-GM)와 겐타마이신을 단독으로 처리한 처리군(GM-only)의 경우에 OD 600nm값에 유의적인 차이가 없었다.

상기 결과를 통해서 필발 추출물이 겐타마이신의 항생 효과에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였고, 이하 실험을 실시하였다.

실험예 1-5. 통계분석

실험결과의 통계분석은 Student's t-test 법으로 수행하였고, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. p-value는 0.05 이하의 유의성을 가짐을 의미한다.

[실험예 2] 필발 추출물 및 분획물의 내이손상에 대한 보호효과 확인

실험예 2-1. 필발 추출물의 내이손상 보호효과

상기 실험예 1-1에서 조직배양한 세포에 0.3mM의 겐타마이신과 함께 1.25 mg/ml, 5 mg/ml 그리고 10 mg/ml의 필발 추출물을 24시간동안 처리하고, 생존 유모 세포를 계수하여, 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 필발 추출물은 10 mg/ml의 농도까지 세포 독성을 나타내지 않았다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 필발 추출물은 농도 의존적으로 겐타마이신에 의한 세포 독성을 억제하는 효과를 보였고, 도 7에 나타낸 바와 같이, 필발 추출물 처리군은 아무 처리도 하지 않은 대조군(A)과 비교하여 세포의 배열이 다소 비정상적인 경우도 관찰되었으나, 유모세포의 모양은 유지하는 것을 확인하였다.

따라서 상기 결과를 통해서 필발 추출물의 내이 보호 효과는 농도 의존적임을 확인하였고, 효과를 나타내는 최소 농도는 1.25 mg/ml이고, 5 mg/ml 농도에서부터 통계적으로 유의한 보호효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 2-2. 분획용매에 따른 필발 분획물의 보호효과 확인

필발 에탄올 추출물의 분획물의 내이손상 치료효과 및 용매에 따른 효과의 차이를 확인하기 위하여, 상기 실시예의 필발 분획물 각각에 대한 자유 라디칼(free radical) 소거 활성을 측정하였다.

상기 실시예에 의한, 헥산 100, 헥산 및 에탄올을 8 : 2, 5 : 5 그리고 2 : 8 부피비로 각각 혼합한 분획용매와 에탄올 100의 분획용매 각각에 의한 분획물을 준비하고, 각각의 분획물을 99% 에탄올에 희석하여, 자유 라디칼 소거 활성의 측정하였다. DPPH(Diphenyl-1-picrylhydrazyl, 100 mM; Sigma Aldrich) 용액은 95 % 에타올에 준비하였다. 분획물은 50% 에탄올에서 두 배 희석하였고, DPPH는 95% 에탄올에서 100배 희석하였다(DPPH 용액).

각 분획물 시료의 0.5 ml를 DPPH(1mM) 3.0mL와 섞은 것을 상온의 명상태에서 30 분 동안 안정화시켜 실험에 사용하였다. 분광광도계(Molecular Devices, Sunnyvale, 미국)를 이용해서 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 대조군과 시험군 사이에의 흡광도 차이를 %로 나타내었다. DPPH 소거능은 하기의 수학식 1에 따라서 계산하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

[수학식 1]

소거 활성능(Scavenging activity, d%) = (1-(필발 분획물 처리군의 흡광도 값 - 미처리군의 흡광도 값)/대조군의 흡광도 값)x100

도 8에 나타낸 바와 같이, 모든 분획용매에서 자유 라디칼 소거능이 확인되긴 하였으나, 헥산과 에탄올을 2 : 8의 부피비로 혼합한 혼합용매의 분획물이 70% 가량의 현저히 우수한 라디칼 소거능을 나타냄을 확인하였다. 따라서 이하 실험에서는 헥산과 에탄올을 2 : 8의 부피비로 혼합한 혼합용매의 분획물을 이용하여 내이손상에 대한 보호 효과를 확인하는 실험을 실시 하였다.

실험예 2-3. 필발 분획물의 농도에 따른 항산화 효과 확인

필발 분획물의 농도에 따른 내이손상에 대한 보호효과를 확인하기 위하여, 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다. 측정방법은 필발 에탄올 추출물을 헥산과 에탄올을 2 : 8의 부피비로 혼합한 혼합용매로 분획한 분획물을 1 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 농도로 각각 준비하여 자유 라디칼 소거 활성을 실시한 것 외에는 상기 실험예 2-2와 동일한 방법으로 실시하였다. 소거 활성능은 상기 수학식 1에 의하여 계산하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 필발 분획물은 농도에 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 1 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 농도의 필발 분획물은 각각 25.65 %, 48.59 % 그리고 60 %의 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 또한 1 ㎍/mL의 농도에서도 유의한 소거 활성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실험예 2-4. 필발 분획물의 세포자멸 억제효과 확인

항-세포자멸 효과는 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)로 평가하고, 유모세포 손실은 미오신-7a(myosin-7a) 표지에 의하여 확인하였다.

사멸세포에서 염색된 DNA 절편은 TUNEL 염색 키트(Trevigion, 미국)를 이용해서 평가하였다. 상기 키트를 이용한 평가는 메뉴얼에 따랐다. 고정된 달팽이관 기관형 배양배지는 0.01 M PBS에 10분 동안 고정하고, 상온에서 프로테나아제 K(proteinase K) 용액에 적어도 15분 동안 처리하였다. 증류수로 2 분 동안 2번 세척하고, 각각의 배지를 1 x TdT 표지 완충액에 5 분 동안 담궜다. 배지는 TUNEL 혼합(TUNEL mix, 50 x TdT dNTP, 50 x cation Mg²⁺, 50 x TdT 효소 및 1 x TdT 표지 완충액)에 넣고, 37 ℃의 다습한 챔버 안에서 60 분 동안 배양하였다. 1 x TdT 스탑 완충액으로 5 분 동안 세척해서 반응을 정지시켰다. 배지는 0.01 M PBS-Tween(PBS-T)에서 세척하고, 슬라이드 글라스를 형광 봉입 배지(fluorescence mounting medium)를 사용하는 커버글라스로 덮기 전에 Strep-Flour 용액으로 30 분 동안 상온의 암상태에서 처리하였다. 상기 제조된 샘플은 형광 전자 현미경을 이용해서 495 nm 에서 관찰하였고, 그 결과는 도 10에 나타내었다.

미오신-7a 표지에 의한 평가는 배지를 고정, 투과성화(permeabilized)하고, myosin-7a rabbit polyclonal antibody(1:300 dilution; Proteus BioSciences, Ramona, CA, USA)와 Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG (1:500 dilution; Invitrogen)로 순서대로 염색하였다. 상기 절편을 Gel Mount Biomedia(Fisher Scientific, 미국)에 올려놓고, 커버글라스로 덮은 후 DP70 형광 전자현미경(Olympus, 일본)으로 관찰하였다. 96-웰 플레이트의 5 개 웰은 각 농도 시료에 대하여 사용되었고, 실험 결과는 3 번 반복하여 실시하였다. 상기 결과를 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 겐타마이신 미처리군(도 10A 내지 10C)에서 사멸된 세포는 확인되지 않았고, TUNEL 분석과 미오신-7a 이중 표지 분석에 의해서도 내유모세포(ICH)와 외유모세포(OCH)의 감소는 확인되지 않았다. TUNEL-포지티브(세포자멸) 세포는 0.3mM의 겐타마이신으로 24시간 동안 처리한 달팽이관 배지에서 확인되었다(도 10D 내지 10F). 미오신-7a 이중 표지에 의하여 달팽이관의 정단부, 중단부 및 기저부에서 내유모세포(ICH)와 외유모세포(OCH)의 현저한 손실이 있는 것이 확인되었다. 그러나 필발 분획물(1 ㎍/ml)로 전처리한 처리군은 TUNEL-포지티브 세포(녹색 형광)의 수가 현저하게 감소하고, 유모세포의 수(적색 형광)가 증가된 것을 확인하였다(도 10G 내지 10I). 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml 농도의 필발 분획물은 내유모세포 및 외유모세포 모두에서 겐타마이신에 의한 세포자멸(apoptotic) 세포의 사멸을 보호하는 현저한 효과가 있음을 확인하였다. TUNEL-포지티브 세포는 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml 농도의 필발 분획물에 노출시킨 처리군에서 현저하게 감소한 것이 확인되었다(도 10G 내지 10O).

도 11에 나타낸 바와 같이, TUNEL 표지된 외유모세포 및 내유모세포의 수는 겐타마이신 3mM로 처리한 처리군에서 현저하게 증가하였다. 겐타마이신 처리 전에 필발 분획물로 처리한 경우는 겐타마이신으로만 처리한 경우보다 TUNEL 표지된 외유모세포 및 내유모세포의 수가 감소하였다. 이러한 필발 분획물의 항세포자멸 효과는 농도 의존적임이 확인되었다. 5 ㎍/ml 보다 높은 농도에서, 필발 분획물이 겐타마이신으로 유발되는 세포 자멸 및 유모세포 손실에 대하여 내유모세포 및 외유모세포를 우수하게 보호하였다. 이러한 결과는 겐타마이신으로 유발되는 세포 자멸 및 유모세포 손실에 대한 필발 분획물의 보호 효과 및 분획물의 중요한 농도의존적인 항세포자멸 활성을 증명하였다.

특히 이러한 항세포자멸 활성은 5 mg/ml 농도에서부터 유의한 보호효과를 나타내었던 필발 에탄올 추출물과 비교하면(도 6), 약 1000 배 이상의 현저히 우수한 효과를 나타내는 것으로, 상기 헥산과 에탄올 2 : 8 부피비의 혼합용매로 분획한 분획물의 경우, 다른 분획용매를 사용한 분획물 보다도 우수한 효과를 나타내고, 필발 추출물과 비교하여도 약 1000배 정도의 현저히 우수한 내이손상 보호효과를 가지고 있음을 확인하였다.

실험예 2-5. 필발 분획물의 유모세포 손실 보호효과 확인

신생 마우스의 달팽이관 배양은 필발 분획물을 각각 1, 5 및 10 ㎍/mL로 포함하는 배지에서 1시간 동안 배양하고, 겐타마이신 0.3 mM을 24 시간 동안 처리하였다. 생존하고 있는 팔로이딘 표지된 유모세포(phalloidin-labeled hair cell)의 수를 계수하여, 그 결과를 도 12에 나타내었고, 유모세포의 손실여부를 확인한 현미경 사진은 도 13에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 겐타마이신 처리군에서, 외유모세포(OHC)와 내유모세포(IHC)의 수는 현저하게 감소하였으나, 필발 분획물을 함께 처리한 군에서는 외유모세포(OHC) 또는 내유모세포(IHC)의 감소가 관찰되지 않았다. 도 12a에 나타낸 바와 같이 달팽이관의 기저부에서, 1 ㎍/mL 및 5 ㎍/mL 농도의 필발 분획물 각각의 OHC와 IHC의 사용량 의존적으로 우수한 보호효과를 나타내는 것을 확인하였다(P < 0.01). 도 12b에 나타낸 바와 같이, 기저부와 유사하게, 달팽이관 중단부(middle)에서도 필발 분획물 1 ㎍/mL 및 5 ㎍/mL 농도 각각에서 겐타마이신에 의하여 유발된 외유모세포와 내유모세포의 손실에 대하여 현저한 보호효과가 있는 것을 확인하였다(P<0.01). 도 12c에 나타낸 바와 같이, 달팽이관의 정단부(apical)의 외유모세포와 내유모세포에 대하여 에서도 5 ㎍/mL 농도의 필발 분획물이 현저하게 우수한 보호 효과를 갖는 것을 확인하였다.

10 ㎍/mL 농도의 필발 분획물도 기저부, 중단부 및 정단부의 외유모세포 및 내유모세포 모두에 대한 우수한 보호효과를 가지고 있으나, 사용량 대비 5 ㎍/mL 농도의 사용이 가장 우수한 보호효과를 갖는 것으로 판단된다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 미처리군(untreated)와 비교해서, 겐타마이신 만을 처리한 처리군(도 13D 내지 13F)에서는 코르티 기관의 심각한 기형화가 관찰되었다. 또한, 겐타마이신 처리군(도 13D 내지 13F)에서 유모세포는 정상적인 모습을 나타내지 않고, 구멍(gap)이 관찰되었다. 필발 분획물은 달팽이관에 대해서 독성을 나타내지 않고, 겐타마이신으로 유발되는 세포독성을 감소시켰다(도 13G 내지 13O). 필발 분획물 처리군에서 코르티 기관의 세포 정렬이 불규칙적이나, 각 세포는 형태와 부동섬유를 유지하고 있었다.

도 12 및 13을 살펴보면, 필발 분획물이 겐타마이신에 의해 유발되는 유모세포 손실에 대하여 보호효과가 있고, 이러한 보호효과는 내유모세포 보다 외유모세포에 대하여 더 현저하게 나타남을 확인할 수 있다. 또한 달팽이관의 기저부, 중단부 및 정단부 중에서 정단부 유모세포 보다 기저부와 중단부 유모세포에 대하여 더 현저한 보호효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

이하 본 발명의 상기 조성물을 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

필발 분획물 20 ㎍

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

필발 분획물 10 ㎍

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

필발 분획물 10 ㎍

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

필발 분획물 10 ㎍

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

필발 분획물 20 ㎍

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강식품의 제조

필발 분획물 100 ㎍

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강음료의 제조

필발 분획물 100 ㎍

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (9)

1. 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 필발(Piper longum L.) 에탄올 조추출물을 헥산 및 에탄올 혼합 용매로 분획한 분획물을 유효성분으로 포함하되, 상기 혼합 용매는 헥산 및 에탄올이 1: 4의 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 내이손상은 유모세포 손상에 의하여 유발되는 것인, 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 내이손상은 이명, 난청, 어지럼증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 내이손상은 아미노글리코사이드계 항생제에 의해 유발된 것인 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 아미노글리코사이드계 항생제는 겐타마이신, 아미카신, 아르베카신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인, 내이손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 내이손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 필발(Piper longum L.) 에탄올 조추출물을 헥산 및 에탄올 혼합 용매로 분획한 분획물을 유효성분으로 포함하되, 상기 혼합 용매는 헥산 및 에탄올이 1: 4의 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
9. 삭제

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