KR101530417B1 - 단백질 ａ 결정 및 가교 결합된 결정 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

단백질 A 결정 및 단백질 A의 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)이 기재된다. 제조 방법 및 사용 방법도 개시된다.

Description

단백질 Ａ 결정 및 가교 결합된 결정 및 이들의 사용 방법{PROTEIN A CRYSTALS AND CROSS-LINKED CRYSTALS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2009년 9월 15일자로 출원된 미국 가출원 제61/242,537호(이의 개시내용은 온전히 그대로 본 명세서에 참고로 도입됨)의 이익을 주장한다.

단백질 A는 박테리아 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 처음 발견된 40 내지 60 kDa의 표면 단백질이다. 단백질 A는 면역글로불린에의 그의 결합 능력으로 인해 생화학적 연구에서 사용되어 왔다. 단백질 A는 많은 포유동물 종으로부터의 단백질, 특히 IgG에 결합한다. 단백질 A는 중쇄와의 상호작용을 통해 면역글로불린의 Fc 영역과 결합한다. 재조합 스타필로코칼 단백질 A는 면역학 및 다른 생물학적 연구에서의 사용을 위해 종종 이. 콜라이(E. coli)에서 제조된다. 단백질 A는 항체 결합 부위에 영향을 미치지 않으면서 다른 분자, 예컨대, 형광 염료, 효소, 바이오틴, 콜로이드성 금 또는 방사성 요오드에 종종 커플링된다. 또한, 단백질 A는 자기 비드, 라텍스 비드 및 아가로스 비드에 커플링된 상태로 널리 사용된다. 단백질 A는 종종 고체 지지체 상에 고정화되어 미정제 단백질 혼합물, 예컨대, 혈청 또는 복수액으로부터 총 IgG를 정제하기 위한 신뢰할만한 수단으로서 사용되거나 항체의 존재를 검출하기 위해 상기 마커들 중 하나와 커플링된다. 또한, 비드에 접합된 단백질 A를 사용한 면역침전 연구는 관심 있는 단백질 또는 단백질 착물에 대한 항체를 통해 간접적으로 상기 단백질 또는 상기 단백질 착물을 정제하는 데 있어서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 연구는 매우 다양한 공급원으로부터 단일클론 항체를 정제함에 있어서 널리 사용된다.

본 발명은 부분적으로, 예를 들면, 항체의 정제를 위한 혁신적인 단백질 A 시스템(예를 들면, 크로마토그래피 시스템)을 개발하기 위해 제조된 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)의 제조에 관한 것이다. 단백질 A CLPC는 높은 안정성 및 내화학성과 함께 고도로 농축된 단백질 A 활성이라는 이점을 제공한다. 응축된 단백질 A 농축은 컬럼 크기(사용되는 경우), 완충제 부피 및 공정 시간을 감소시킨다. 더욱이, 단백질 A 결정의 가교 결합은 예를 들면, 면역글로불린(예를 들면, 항체)의 정제(예를 들면, 크로마토그래피를 사용하는 정제) 동안 단백질 A의 침출을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 더불어, 이것은 항체 제조 시간 및 비용을 감소시킬 수 있다.

본 발명은 단백질 A 결정 및 이의 가교 결합된 형태("단백질 A-CLPC 또는 CLPC" 또는 유도체; 면역글로불린/항체 또는 상응하는 Fab 또는 Fc 단편을 정제하는 데 있어서, 예를 들면, 세포 배양물로부터 다클론 항체 또는 단일클론 항체를 정제하거나 박테리아 배양물, 혈청 또는 혈장으로부터 치료 항체 또는 항체를 정제하는 데 있어서 이들의 용도; 및 면역침전 및 체외 장치를 위한 상기 단백질 A 결정의 용도에 관한 것이다.

단백질 A의 결정형을 함유하는 조성물이 본 명세서에 개시된다. 이의 한 실시양태는 단백질 A의 가교 결합된 결정질(CLPC) 형태를 함유하는 조성물이다. 추가 실시양태에서, 단백질 A 결정은 글루타르알데히드에 의해 가교 결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 결정은 약 0.02 내지 약 4 중량/부피%의 글루타르알데히드에 의해 가교 결합된다. 다른 실시양태에서, 단백질 A 결정은 약 1.00 중량/부피%의 글루타르알데히드에 의해 가교 결합된다.

본 명세서에 개시된 조성물은 보다 높은 결합 능력을 갖기 때문에 단백질 A의 비결정형보다 더 높은 활성을 나타낸다. 이의 한 실시양태에서, 단백질 A의 결정형의 결합 능력은 pH 7에서 가용성 고정화된 형태의 결합 능력보다 약 100% 이상 더 높다. 또 다른 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 A 결정은 단백질 A의 비결정질 고정화된 형태의 결합 능력의 약 150% 이상의 결합 능력을 갖는다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 A 결정은 약 pH 2 내지 약 pH 12에서 안정하다(그의 결합 능력을 보유한다).

또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 단백질 A 결정은 고정화된 비결정질 단백질 A와 비교할 때 0.0%의 단백질 침출을 나타낸다.

컬럼 재료로서 사전 충전 컬럼(pre-packed column)에서, (함침된) 막에서 또는 체외 장치에서 결정질 단백질 A 조성물의 용도 또한 본 명세서에 개시된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 결정질 단백질 A 조성물을 포함하는 키트가 본 명세서에 개시된다. 이러한 기트는 다른 시약, 정제 장치, 및 본 명세서에 기재된 결정질 단백질 A 조성물의 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 결정질 단백질 A는 컬럼 내에 사전 충전되어, 항체 및 항체 단편의 정제 물질, 예를 들면, 포유동물 세포 배양물로부터 단백질 항체의 정제 물질, 또는 트랜스제닉 모유에서 발현된 단일클론 항체 또는 혈청에서 생성된 다클론 항체의 정제 물질로서 사용될 수 있다.

또한, 재조합 가용성 단백질 A로부터 단백질 결정을 제조하는 방법이 개시된다. 단백질 A 결정 및 이의 가교 결합된 형태("CLPC")를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물도 개시된다.

한 양태에서, 본 발명은 가교 결합된 단백질 A 결정을 제공한다. 가교 결합제는 다작용성 물질일 수 있고, 일부 실시양태에서, 상기 가교 결합제는 이작용성 물질, 예컨대, 글루타르알데히드이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 결정은 결합 능력을 실질적으로 변경하지 않는 농도, 예를 들면, 약 0.02 중량/부피% 이상의 농도의 글루타르알데히드에 의해 가교 결합된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 결정의 가교 결합 수준은 0.02 중량/부피%의 글루타르알데히드를 사용한 처리에 의해 제조된 단백질 A 결정의 가교 결합 수준과 동등하다. 가교 결합 수준은 당업계에 공지되어 있거나 본 명세서에 개시된 방법, 예를 들면, 단백질 침출 수준의 측정에 의해 측정될 수 있다.

본 발명은 단백질 A 결정, 예를 들면, 가용성 단백질 A에 비해 더 높은 결합 능력, 예를 들면, 약 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 더 높은 결합 능력을 갖는 단백질 A 결정을 추가로 제공한다.

본 발명은 안정화된, 예를 들면, 가교 결합된 단백질 A 결정을 추가로 제공하는데, 이때 상기 안정화된 결정은 유사한 산성 조건(예를 들면, 약 2 내지 3의 산성 pH)에서 가용성 단백질 A에 의해 보유된 결합 능력 및/또는 안정성보다 2 내지 3배 이상 더 높은 결합 능력 및/또는 안정성을 산성 조건에서 보유한다. 일부 실시양태에서, 안정화된 단백질 A 결정은 산성 조건에서 가용성 단백질 A보다 약 200%, 300% 또는 400% 이상 더 높은 결합 능력 및/또는 안정성을 갖는다.

본 발명은 안정화된, 예를 들면, 가교 결합된 단백질 A 결정을 추가로 제공하는데, 이때 상기 안정화된 결정은 유사한 조건에서 가용성 단백질 A에 의해 보유된 결합 능력 및/또는 안정성보다 2 내지 3배 이상 더 높은 결합 능력 및/또는 안정성을 단백질분해효소(protease)의 존재 하에서 보유한다. 일부 실시양태에서, 안정화된 단백질 A 결정은 단백질분해효소의 존재 하에서 가용성 단백질 A보다 약 200%, 300% 또는 400% 이상 더 높은 결합 능력 및/또는 안정성을 갖는다. 단백질분해효소는 예를 들면, 펩신(pepsin), 키모트립신(chymotrypsin) 및 판크레아틴(pancreatin) 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.

다른 실시양태에서, 안정화된 또는 가용성 단백질 A의 결합 능력은 안정화된 결정 또는 가용성 단백질 A를 예정된 시간, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5 시간 이상 동안 산성 조건 및/또는 단백질분해효소에 노출시킨 후 측정된다.

관련된 양태에서, 본 발명은 다양한 pH 조건에서(예를 들면, 약 pH 2.0 또는 3 내지 약 pH 7.5 또는 약 pH 8.5 내지 약 pH 10-14), 및/또는 단백질분해효소, 예를 들면, 펩신, 키모트립신 및 판크레아틴 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있는 단백질분해효소의 존재 하에서 실질적으로 안정한 가교 결합된 단백질 A 결정을 특징으로 한다. 다른 실시양태에서, 가교 결합된 결정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 산성 조건(예를 들면, 약 2 내지 3의 산성 pH)에서 및 단백질분해효소의 존재 하에서 가용성 단백질 A에 의해 보유된 결합 능력보다 약 2 내지 3배 이상 더 높은 그의 결합 능력을 보유한다. 다른 실시양태에서, 안정화된 단백질 A 결정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 산성 조건(예를 들면, 약 2 내지 3의 산성 pH)에서 및 단백질분해효소의 존재 하에서 가용성 단백질 A보다 200%, 300% 또는 400% 이상 더 안정하다.

상기 결정 및/또는 가교 결합된 단백질 A 결정을 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물도 본 명세서에 개시된다.

일부 실시양태에서, 상기 결정은 천연 공급원, 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스 또는 관련 종에서 발견된 단백질 A 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 서열을 갖는 단백질 A를 포함한다. 다른 실시양태에서, 단백질 A는 재조합 수단에 의해 제조된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 가교 결합된 단백질 결정으로 함침된 막; 및 예를 들면, 항체 및 항체 단편의 정제 및 투석 요법 동안 면역글로불린의 제거를 포함하는 다양한 적합한 용도를 위해 상기 막을 제조하고 사용하는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 본 발명의 단백질 A로 함침된 막은 항체 및 항체 단편에 결합할 수 있다. 이것은 정제에 필요한 완충제의 양을 효과적으로 최소화하여 비용을 최소화할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 약 3.25 mg/㎠ 이하의 가교 결합된 단백질 결정으로 함침된 막을 포함하는 물질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 막은 가교 결합된 단백질 A 결정("단백질 A-CLPC")으로 함침된다. 단백질 A-CLPC로 함침된 막은 면역글로불린의 단리 및 정제에 사용될 수 있고 고정화된 단백질 A와 유사하게 재사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 가교 결합된 단백질 결정, 바람직하게는 단백질 A-CLPC로 함침된 막을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 막 캐스팅(casting) 용액의 제조를 포함한다. 상기 캐스팅 용액은 용매, 예컨대, 1-메틸-2-피롤리디논("NMP"), 디메틸포름아미드("DMF") 등 또는 이들의 조합 중에 중합체성 염기 물질, 예컨대, 폴리우레탄을 포함한다. 상기 막 캐스팅 용액은 증량제(bulking agent), 예컨대, 산화지르코늄, 및 막이 보다 높은 친수성을 나타내게 하는 물질, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈("PVP")도 포함할 수 있다.

그 다음, 상기 막이 약 3.25 mg/㎠의 단백질 A-CLPC로 함침되도록 상기 캐스팅 용액을 적합한 양의 단백질 A-CLPC와 혼합한다. 그 다음, 상기 용액을 지지체 물질, 예컨대, 합성 메쉬 물질 상에 스프레딩하고 적합한 조건 하에서 수성 매질 내로 침지시켜 막 침전물을 형성한다. 이어서, 상기 막 침전물을 글리세롤 용액, 바람직하게는 40:60 비율의 글리세롤과 물의 혼합물 중에서 건조한다.

본 발명의 이점은 다양한 상이한 용도, 예컨대, 항체 정제 및 면역침전에서의 사용에 적합한 개선된 단백질로 함침된 막을 제공한다는 것이다.

본 발명의 추가 이점은 고정화된 단백질 A와 달리 임의의 불활성 지지체를 요구하지 않으면서 항체에 결합할 수 있는 개선된 물질을 제공한다는 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 단백질 A 결정, 예컨대, 가교 결합된 단백질 A 결정을 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 투여함으로써 대상체에서 면역글로불린 농도(상승된 면역글로불린 농도와 관련된 질환)를 감소시키는 방법을 제공한다. 이 양태의 한 실시양태에서, 단백질 A 결정은 가교 결합제, 예컨대, 글루타르알데히드에 의해 안정화된다. 상기 조성물의 투여는 면역글로불린 농도를 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상 또는 약 40% 이상 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 경구 투여되거나 체외 장치를 통해 투여된다. 추가 실시양태에서, 체외 장치는 카테터, 예를 들면, 단백질 A 결정으로 코팅된 카테터이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물에서 면역글로불린 농도를 감소시키는 방법은 상기 포유동물의 생물학적 샘플, 예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플 중 면역글로불린 농도를 분석하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 단백질 A 결정, 예를 들면, 가교 결합된 단백질 A(예를 들면, 본 명세서에 개시된 바와 같은 결정 및/또는 가교 결합된 결정)를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 단백질 A 결정, 예를 들면, 가교 결합된 단백질 A 결정(예를 들면, 본 명세서에 개시된 바와 같은 결정 및/또는 가교 결합된 결정)을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 투석 장치(체외 장치) 내의 흡착제로서 투여하여 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 결정화 단계는 정제된 단백질을 농축한 후 침전제를 첨가하여 결정화된 단백질을 형성하는 것을 포함한다. 결정화 단계는 결정화된 단백질을 가교 결합제, 예를 들면, 본 명세서에 개시된 가교 결합제(예를 들면, 글루타르알데히드)와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 사용되는 가교 결합제의 농도는 약 0.01 내지 20 중량/부피%, 전형적으로 약 0.02 내지 10 중량/부피%, 보다 전형적으로 약 0.02, 0.5 또는 1 중량/부피%의 범위 내에 있을 수 있다.

다른 실시양태에서, 제조에 있어서 결정화된 단백질의 수율은 가용성 단백질 A 현탁액에서 발견된 특정 단백질의 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상이다. 다른 실시양태에서, 결정화된 단백질의 수율은 가용성 제제에서 발견된 수율의 약 90% 또는 95% 이상이다. 다른 실시양태에서, 결정화된 단백질의 수율은 가용성 제제에서 발견된 수율의 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상이다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 단백질 결정(예를 들면, 단백질 A 결정)을 추가로 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 결정을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이 가교 결합된 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 결정 및 또 다른 성분(예를 들면, 완충제, 예를 들면, 트리스 완충제)을 함유하는 조성물을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC) 및 또 다른 성분(예를 들면, 완충제, 예를 들면, 트리스 완충제)을 함유하는 조성물을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 결정을 제조하는 방법을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 제조하는 방법을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 결정 및 또 다른 구성요소(예를 들면, 사용 설명서)를 포함하는 키트를 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC) 및 또 다른 구성요소(예를 들면, 사용 설명서)를 포함하는 키트를 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 면역글로불린, 예를 들면, 항체, 예컨대, 치료 항체를 정제하기 위해 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 결정을 사용하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A의 침출(leaching)은 비결정 형태의 단백질 A가 동일한 조건 하에서 사용되는 경우 침출 양에 비해 방지되거나 감소된다(예를 들면, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%, 또는 약 2배, 약 5배 또는 약 10배까지 감소됨).

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 면역글로불린, 예를 들면, 항체, 예컨대, 치료 항체를 정제하기 위해 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 사용하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A의 침출은 비결정 형태의 단백질 A 또는 비가교 결합된 형태의 단백질 A 결정이 동일한 조건 하에서 사용되는 경우 침출 양에 비해 방지되거나 감소된다(예를 들면, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%, 또는 약 2배, 약 5배 또는 약 10배까지 감소됨).

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 면역글로불린, 예를 들면, 항체, 예컨대, 치료 항체를 정제하기 위해 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 결정을 사용하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, ㎖당 단백질 A의 결합 능력은 비결정 형태의 단백질 A가 고정화 조건(예를 들면, 지지체의 사용) 하에서 사용되는 경우 결합 양에 비해 증가된다(예를 들면, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 이상, 또는 약 2배, 약 5배 또는 약 10배 이상까지 증가됨).

일부 양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 면역글로불린, 예를 들면, 항체, 예컨대, 치료 항체를 정제하기 위해 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 사용하는 방법을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A의 결합 능력은 비결정 형태의 단백질 A 또는 비가교 결합된 형태의 단백질 A 결정이 고정화 조건(예를 들면, 지지체의 사용) 하에서 사용되는 경우 결합 양에 비해 증가된다(예를 들면, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 이상, 또는 약 2배, 약 5배 또는 약 10배 이상까지 증가됨).

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 결정을 함유하는 컬럼(예를 들면, 크로마토그래피 컬럼)을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 함유하는 컬럼(예를 들면, 크로마토그래피 컬럼)을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 결정을 함유하는 막(예를 들면, 홀로섬유 시스템)을 특징으로 한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단백질 A 가교 결합된 단백질 결정(CLPC)을 함유하는 막(예를 들면, 홀로섬유 시스템)을 특징으로 한다.

단백질 A를 가용화시키거나 농축하고 침전제를 가용화된 또는 농축된 단백질에 첨가하여 결정을 형성하는 단백질 A의 결정화 방법이 본 명세서에 개시된다.

(a) 면역글로불린을 함유하는 매질을, 약 pH 7.0 내지 pH 10의 범위 내의 pH를 가지고 양이온과 음이온의 조합을 함유하는 완충제 용액과 혼합하여, 완충된 면역글로불린 매질을 제공하는 단계; (b) 상기 완충된 면역글로불린 매질을 고정화된 단백질 A(단백질 A-CLPC: 단백질 A는 결정화 및 단백질 A 분자와의 가교 결합에 의해 고정화됨) 흡착제와 접촉시켜 상기 완충된 면역글로불린 매질에 존재하는 면역글로불린을 상기 고정화된 단백질 A 흡착제에 흡착시키는 단계; (c) 흡착된 면역글로불린을 갖는 단백질 A-CLPC 흡착제를 상기 완충제 용액으로 세척하는 단계; (d) 흡착된 면역글로불린을 갖는 상기 단백질 A-CLPC 흡착제를, 약 pH 2 내지 pH 6의 범위 내의 pH를 갖는 완충제 용액과 접촉시켜 상기 단백질 A-CLPC 흡착제로부터 흡착된 면역글로불린을 제거하는 단계; 및 (e) 제거된 면역글로불린을 실질적으로 순수한 형태로 회수하는 단계를 포함하는 면역글로불린의 정제 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 방법의 추가 실시양태에서, 본 방법은 본 명세서에 기재된 단백질 A의 결정질 조성물을 포함하는 컬럼에서 수행된다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 완충된 면역글로불린 매질과 단백질 A-CLPC 흡착제의 접촉은 단백질 A-CLPC 흡착제를 포함하는 컬럼에서 수행된다. 본 방법의 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린을 함유하는 매질은 정상 포유동물 혈청, 또는 면역 포유동물 혈청, 예컨대, 혈장 또는 복수액이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 매질은 하이브리도마, 조직 배양액, 세포 배양액, 포유동물 세포 배양액, 박테리아 세포 배양액, 트랜스제닉 공급원 액(transgenic source fluid), 식물 추출물 또는 효모 배양액으로부터 얻는다.

본 정제 방법의 일부 실시양태에서, 완충제 용액은 약 pH 7.0 내지 약 pH 10의 범위 내의 pH를 가질 것이고 상기 완충제는 글리신 완충제, 붕산염 완충제, 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 완충제 또는 인산염 완충제이다. 본 정제 방법의 다른 실시양태에서, 완충제 용액의 농도 범위는 약 0.01 내지 약 0.2 M, 또는 약 0.05 내지 약 0.5 M이다.

본 정제 방법의 다른 실시양태에서, 완충제 용액은 약 pH 2 내지 약 pH 6의 범위 내의 pH를 가지고 약 0.01 내지 0.25 M의 범위 내의 농도를 갖는다. 본 정제 방법의 일부 실시양태에서, 완충제 용액은 아세트산-아세트산염 완충제이고 약 pH 2 내지 약 pH 6의 범위 내의 pH를 갖는다.

본 정제 방법의 또 다른 실시양태에서, 완충제 용액은 약 1.0 내지 약 1.5 M의 농도로 칼륨 이온 및 포스페이트 이온을 함유한다.

본 정제 방법의 또 다른 실시양태에서, 완충제 용액은 약 1.0 내지 약 1.5 M의 농도로 암모늄 이온 및 포스페이트 이온을 함유한다. 본 정제 방법의 또 다른 실시양태에서, 완충제 용액은 약 1.0 내지 약 1.5 M의 농도로 암모늄 이온 및 설페이트 이온을 함유한다. 본 정제 방법의 일부 실시양태에서, 완충제 용액은 약 1.0 내지 약 1.25 M의 농도로 나트륨 이온 및 설페이트 이온을 함유한다. 다른 실시양태에서, 완충제 용액은 약 1.0 내지 약 1.25 M의 농도로 나트륨 이온, 포스페이트 이온 및 클로라이드 이온을 함유한다.

본 정제 방법의 추가 실시양태에서, 고정화된 단백질 A 흡착제는 임의의 지지체를 갖지 않는 결정질 가교 결합된 단백질 A이다. 다른 실시양태에서, 상기 흡착제는 자기 입자에 부착된 임의의 지지체를 갖지 않는 결정질 가교 결합된 단백질 A이다.

(a) 정제하고자 하는 단백질을 고정화된 고체상인 결정화되고 가교 결합된 단백질 A에 흡착시키는 단계; (b) 약 5 내지 약 7의 범위 내의 pH를 가지고 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 염화테트라에틸암모늄(TEAC), 염화테트라프로필암모늄 및 염화테트라부틸암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 전해질을 함유하는 전해질 용매로 상기 고체상을 세척함으로써 상기 고체상에 결합된 오염물질을 제거하는 단계; 및 (c) 상기 고체상으로부터 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 오염된 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 정제하고자 하는 단백질은 면역글로불린, 항체 또는 이들의 단편이다. 이 방법의 추가 실시양태에서, 정제하고자 하는 단백질은 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 키메라 항체, 또는 이들의 단편이다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 고체상은 컬럼 내의 결정질 단백질 A이거나 컬럼 내의 결정질 가교 결합된 단백질 A이다.

오염된 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법의 일부 실시양태에서, 전해질 용매는 염화테트라메틸암모늄(TMAC) 또는 염화테트라에틸암모늄(TEAC)을 함유한다. 이 방법의 추가 실시양태에서, 전해질 용매 중 전해질의 농도는 약 0.1 내지 약 1.0 M의 범위 또는 약 0.25 내지 약 0.5 M의 범위 내에 있다.

오염된 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법의 다른 실시양태에서, 오염물질은 중국 햄스터 난소 단백질(CHOP)이다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 오염된 용액은 재조합 항체를 포함하는 회수된 세포 배양액(HCCF)을 포함한다.

오염된 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법의 실시양태에서, 단계 (c)의 용출 완충제는 약 2.0 내지 약 5.0 또는 약 2.5 내지 약 3.5의 범위 내의 pH를 갖는 용출 완충제를 사용하여 단백질을 용출하는 것을 포함한다.

단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생성된 단백질을 정제하는 방법으로서, 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시된다: (a) 상기 단백질을, 단백질 A를 결정화시키고 가교 결합시켜 고체상을 생성함에 의해 고정화된 단백질 A에 흡착시키는 단계; (b) 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 염화테트라에틸암모늄(TEAC), 염화테트라프로필암모늄 및 염화테트라부틸암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 전해질을 포함하는 전해질 용매로 상기 고체상을 세척함으로써 상기 고체상에 결합된 중국 햄스터 난소 단백질(CHOP) 오염물질을 제거하는 단계; 및 (c) 상기 단백질을 상기 고체상으로부터 회수하는 단계.

단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생성된 단백질을 정제하는 방법으로서, 하기 단계 (a) 내지 (c)를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시된다: (a) 상기 단백질을, 단백질 A를 결정화시키고 가교 결합시켜 고체상을 생성함에 의해 고정화된 단백질 A에 흡착시키는 단계; (b) 약 5 내지 약 7의 범위 내의 pH를 가지고 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 염화테트라에틸암모늄(TEAC), 염화테트라프로필암모늄 및 염화테트라부틸암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 전해질을 함유하는 전해질 용매로 상기 고체상을 세척함으로써 상기 고체상에 결합된 중국 햄스터 난소 단백질(CHOP) 오염물질을 제거하는 단계(이때, 상기 전해질 용액 중 전해질의 농도는 약 0.25 내지 약 0.5 M의 범위 내에 있음); 및 (c) 상기 단백질을 상기 고체상으로부터 회수하는 단계.

상승된 면역글로불린 농도와 관련된 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키기에 충분한 양으로 단백질 A 결정을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 상승된 면역글로불린 농도와 관련된 질환을 치료하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 상기 질환은 면역 기능과 관련되어 있다.

(a) 용매 중 중합체성 염기 물질로 구성된 캐스팅 용액을 제조하는 단계; (b) 충분한 양의 가교 결합된 단백질 결정을 상기 캐스팅 용액에 첨가하는 단계; (c) 상기 막 캐스팅 용액을 지지체 물질에 도포하는 단계; (d) 상기 막 캐스팅 용액 및 상기 지지체 물질을 수성 매질에 침지시키는 단계; (e) 막 복합 물질을 형성하는 단계; 및 (f) 상기 막 복합 물질을 유체 매질로 건조하는 단계를 포함하는 막 제조 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 중합체성 염기 물질은 폴리우레탄을 포함하는 적합한 중합체로 구성된다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 용매는 1-메틸-2-피롤리디논, 디메틸포름아미드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 유체 매질은 글리세롤을 포함한다.

(a) 용매 중에 폴리우레탄 및 증량제를 포함하는 막 캐스팅 용액을 형성하는 단계; (b) 단백질 A-CLPC를 상기 막 캐스팅 용액에 첨가하는 단계; (c) 상기 막 캐스팅 용액을 수성 매질 중에서 가공하는 단계; 및 (d) 단백질 A-CLPC로 함침된 막 침전물을 형성하는 단계를 포함하는, 단백질 A로 함침된 막의 제조 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 증량제는 산화지르코늄, 인산지르코늄, 탄소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 함침된 막의 제조 방법은 막 침전물을 글리세롤 용액으로 건조하는 추가 단계를 포함한다.

투석 요법 동안 투석물 또는 체액으로부터 면역글로불린을 제거할 수 있는 물질로서, 가교 결합된 단백질 결정으로 함침되고 유체 매질로 건조된 막을 포함하는 물질이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 한 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 막은 산화지르코늄, 인산지르코늄, 탄소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 증량제를 포함한다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 유체 매질은 글리세롤을 포함한다.

투석 요법 동안 사용된 투석액 또는 체액으로부터 면역글로불린을 제거하는 장치로서, 가교 결합된 단백질 결정으로 함침되고 유체 매질로 건조된 막의 층을 함유하는 내부를 입구 및 출구로 한정하는 본체를 포함하는 장치가 본 명세서에 개시된다. 이 장치의 일부 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 이 장치의 다른 실시양태에서, 유체 매질은 글리세롤을 포함한다.

투석 요법을 제공하기 위한 시스템으로서, 투석 동안 면역글로불린을 제거할 수 있는 장치를 포함하는 시스템이 본 명세서에 개시되는데, 이때 상기 장치는 입구 및 출구로 내부를 한정하는 본체를 포함하고, 상기 내부는 가교 결합된 단백질 결정으로 함침되고 유체 매질로 건조된 막의 층을 함유한다. 이 시스템의 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 다른 실시양태에서, 유체 매질은 글리세롤을 포함한다.

(a) 투석액 또는 체액을, 가교 결합된 단백질 결정으로 함침되고 글리세롤 용액으로 건조된 막의 층을 포함하는 장치에 통과시키는 단계; 및 (b) 치료 유효량의 면역글로불린을 상기 투석액 또는 체액으로부터 제거하는 단계를 포함하는 투석 요법을 제공하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 한 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 포함한다.

단백질 A의 결정형을 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A의 공급원은 스타필로코커스 아우레우스 균주로부터 유래된다. 다른 실시양태에서, 단백질 A는 재조합 수단에 의해 제조되거나 화학적으로 합성된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 전장 천연 단백질 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 단백질 A는 하나 이상의 항체 결합 도메인을 함유한다. 다른 실시양태에서, 단백질 A는 화학적으로 변형된다. 다른 실시양태에서, 단백질 A는 돌연변이를 갖거나 천연 단백질 A의 기능성 유도체이다.

단백질 A의 가교 결합된 결정형을 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 글루타르알데히드에 의해 가교 결합된다.

면역글로불린을, 단백질 A의 결정형 및/또는 단백질 A의 가교 결합된 결정형을 포함하는 조성물에 결합시키는 단계를 포함하는, 상기 면역글로불린의 정제 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시양태에서, 면역글로불린은 항체, 단일클론 항체, Fab 단편, Fc 단편, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 완전 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 클래스 IgG에 속한다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 화학적으로 변형된다. 현적 증기 확산 결정화법(hanging-drop vapor diffusion crystallization method) 또는 회분 결정화법(batch crystallization method)을 이용하여 단백질 A의 결정형을 제조하는 방법으로서, 하기 단계 (a) 및 (b)를 포함하는 방법이 본 명세서에 개시된다: (a) 단백질 A를 1:1의 단백질:시약 비로 탈이온수에 넣는 단계로서, 이때 상기 시약이 2 M 황산암모늄, 0.1 M 카코딜산염(cacodylate) 완충제(pH 6.5) 및 0.2 M NaCl을 함유하는 조성물, 시트르산염 완충제(pH 5.5) 중 2 M 황산암모늄을 함유하는 조성물, 1 M 시트르산나트륨, 0.1 M 트리스-HCl 완충제(pH 7) 및 0.2 M NaCl을 함유하는 조성물, 0.1 M 아세트산염 완충제(pH 4.5) 중 0.8 M NaH₂PO₄/1.2 M K₂PO₄를 함유하는 조성물, 및 2 M 황산나트륨, 트리스-HCl 완충제(pH 7) 및 0.2 M 황산리튬을 함유하는 조성물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및 (b) 결정이 나타날 때까지 인큐베이트하는 단계. 이 방법의 일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 단백질 A는 탈이온수 중에 약 10 mg/㎖ 또는 약 300 mg/㎖의 농도로 존재한다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 단계 (a)에서 단백질 A는 탈이온수 중에 약 50 mg/㎖ 또는 약 120 mg/㎖의 농도로 존재한다.

단백질 A의 결정형을 글루타르알데히드와 혼합하는 단계를 포함하는, 단백질 A의 가교 결합된 결정형의 제조 방법이 본 명세서에 개시된다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 글루타르알데히드는 약 0.2% 내지 약 4%의 최종 농도로 사용된다. 이 방법의 다른 실시양태에서, 글루타르알데히드는 약 1%의 최종 농도로 사용된다.

본 명세서에 언급된 모든 공개문헌, 특허출원, 특허 및 다른 참고자료는 온전히 그대로 본 명세서에 참고로 도입된다. 불일치하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시를 위한 것일 뿐이고 한정하기 위한 것이 아니다.

본 발명의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 설명에 기재되어 있다.

도 1: 현적 중 단백질 A 결정. 재조합 단백질 A(탈이온수(DI H₂O) 중 120 mg/㎖)를 위자드(Wizard) II 결정화 스크린을 사용하여 현적 중에서 결정화시켰다.
도 2: 회분 중 단백질 A 결정. 재조합 단백질 A(H₂O 중 53 mg/㎖)를 위자드 II 결정화 스크린을 사용하여 1 ㎖ 회분 중에서 결정화시켰다.
도 3: 가교 결합된 단백질 A 결정. 단백질 A 결정을 글루타르알데히드 1%와 20 분 동안 가교 결합시키고 글루타르알데히드 0.33%와 1 시간 동안 가교 결합시켰다.

본 발명은 결정질 단백질 A 및 가교 결합된 단백질 A를 포함하는 조성물, 이러한 결정질 조성물을 제조하는 방법, 및 미생물, 혈청, 혈장 또는 포유동물 세포 배양물로부터 면역글로불린/항체 또는 Fc-단편, Fab 단편, 단일쇄 항체 및 단일클론 항체를 분리하기 위해 상기 결정질 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 결정질 조성물은 다른 물질들과의 혼합물 상태로 면역글로불린을 함유하는 액체로부터 상기 면역글로불린의 Fc-부분을 통해 하나 이상의 면역글로불린에 결합하는 능력을 갖는다.

임의의 특정한 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 본 발명은 상기 면역글로불린/항체를 함유하는 액체가 이 액체 중에서 불용성을 나타내고 하나 이상의 면역글로불린 또는 이의 Fc-단편 결합 영역을 갖는 결정질 가교 결합된 단백질 A 물질로 구성된 고체상과 접촉됨을 특징으로 한다. 면역글로불린의 Fc-부분 또는 Fc-단편은 상기 단백질 A-CLPC가 상기 면역글로불린/항체의 Fc-부분 또는 Fc-단편에 결합되되 상기 액체 중 오염물질에는 결합되지 않아 잔류 오염물질을 갖는 액체가 상기 고체상으로부터 분리되고 결합된 항체도 임의적으로 상기 고체상으로부터 분리되도록 상기 단백질 A-CLPC에 결합할 수 있다.

본 발명의 방법은 특히, 이온 교환 크로마토그래피 및 추가 고체 지지체, 예컨대, 아가로스 등을 사용하는 복잡한 다단계 작업을 피한다는 점에서 동일한 목적을 위해 이용되는 공지된 방법들과 구별된다. 이 신규 방법에 의해, 해당 면역글로불린/항체/단편은 편리한 조건 하에서 높은 수율로 매우 단순한 방식으로 놀라울 정도로 순수한 형태로 수득된다. 해당 단백질 A-CLPC는 결합이 면역글로불린의 Fc-부분에서 이루어지기 때문에 보편적인 고정화된 단백질 A에 비해 매우 높은 결합 능력으로 면역글로불린에 특이적으로 가역적으로 결합할 수 있기 때문에 매우 귀중하다.

해당 면역글로불린은 상이한 동물 종들, 주로 척추동물, 바람직하게는 포유동물로부터 유래될 수 있다. 공지되어 있는 바와 같이, 면역글로불린은 상이한 면역글로불린 클래스들, 예컨대, 클래스 A(IgA), D(IgD), E(IgE), G(IgG) 및 M(IgM)에 속할 수 있다. 본 발명의 한 귀중한 양태는 본 발명이 IgG 클래스에 속하는 면역글로불린에 그 자신을 결합시킬 수 있는 단백질 A-CLPC와 관련하여 적용될 수 있다는 것인데, 이는 상기 클래스가 특히 면역글로불린들 중에서 양적으로 우세하기 때문이다. 면역글로불린의 Fc-부분은 공지된 효소적 방법에 의해 면역글로불린으로부터 절단될 수 있고, 이에 의해 자유 Fc-단편이 얻어진다. 특정 면역글로불린의 Fc-부분은 상이한 동물 종들에서 종종 구조적으로 유사하다. 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스로부터의 단백질 A는 IgG의 Fc-부분과 반응하기 때문에, 본 발명의 방법은 종종 상이한 동물 종들로부터의 IgG들이 서로 대체될 수 있게 한다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드(단백질 A-CLPC)는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 소위 단백질 A 또는 상기 단백질의 단편일 수 있고, 상기 단편은 폴리펩티드 성질을 갖고 면역글로불린의 Fc-부분에서 하나 이상의 면역글로불린에 결합하는 능력을 갖는다. 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래된 상기 폴리펩티드(단백질 A 및 단편)는 그의 Fc-부분에서 IgG-클래스에 속하는 면역글로불린에 결합할 수 있다. 다른 예는 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis)로부터의 폴리펩티드 및 다른 박테리아 균주로부터의 폴리펩티드이다.

본 발명에 따르면, 본 방법을 실시할 때 액체 중에서 불용성을 나타내는 단백질 A-CLPC(중합체성 물질)가 사용되어야 하고, 이에 따라 상기 중합체성 물질은 하나 이상의 면역글로불린 또는 이의 Fc-단편 결합 영역을 갖는다. 따라서, 단백질 A-CLPC는 세척 작업 동안 고체상으로부터 용해되어 사라지거나 고체상으로부터 제거되지 않을 수 있다. 바람직하게는, 단백질 A-CLPC는 공유결합 성질을 갖는 결합에 의한 단백질 A 결정의 가교 결합에 의해 형성된다.

단백질 A-CLPC는 다양한 공급원으로부터 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 Fab 단편의 용이한 친화성 정제를 제공하는 컬럼 내에 사전 충전된 결정질 미립자 형태의 가교 결합된 단백질 A로 구성된 컬럼에서 사용될 수 있다. 결정질 가교 결합된 단백질 A는 뛰어난 단백질 안정성 및 결합 특성을 발생시키는 가교 결합 방법을 이용하여 제조한다. 상기 컬럼은 전통적인 중력 유동 절차를 위해 사용된다.

대안적으로, 단백질 A-CLPC는 폴리펩티드, 예를 들면, 단백질을 중합체성 물질에 결합시킬 때 보편적으로 이용되는 방법, 예를 들면, 할로겐화시아노겐, 이소시아네이트 등에 의해 중합체(고체 표면) 또는 자기 입자에 결합될 수 있다. 사용되는 불용성 중합체성 물질은 예를 들면, 유사한 목적을 위해 일반적으로 사용될 수 있는 중합체, 즉 단백질을 중합체에 결합시킬 때 사용될 수 있는 작용기를 갖는 중합체일 수 있다. 이러한 작용기의 예는 히드록실 기, 머캡토 기, 1차 아미노 기 및 2차 아미노 기, 카르보닐 기, 히드라지드 기, 디아조 기 및 카르복실 기이다. 이 기들은 보편적인 방법으로 중합체부터 단백질까지 가교를 형성할 때 사용될 수 있고, 이 경우 상기 단백질은 단백질 A-CLPC이다. 그러나, 사용되는 액체 중에서 불용성을 나타내는 중합체는 상기 액체 중에서 팽윤될 수 있다. 예를 들면, 상기 중합체는 수성 액체가 사용되는 경우 물 중에서 팽윤될 수 있다. 상기 중합체는 예를 들면, 중합체, 예컨대, 폴리사카라이드를 가교 결합시킴으로써 얻은 3차원적 네트워크로 구성될 수 있다. 따라서, 매우 상이한 중합체들, 예를 들면, 셀룰로스, 아가로스, 폴리아미노스티렌, 가교 결합된 중합체(예를 들면, 가교 결합된 폴리사카라이드, 예컨대, 에피클로로히드린(세파덱스^®) 또는 디에폭시드(예를 들면, 1,4-부탄디올 디글리시드 에테르)와 가교 결합된 덱스트란), 또는 에피클로로히드린 또는 디에폭시드와 가교 결합된 전분 또는 셀룰로스 유도체 또는 폴리비닐 알코올이 사용될 수 있다. 다른 예들은 테트라에틸렌펜타민 또는 헥사메틸렌디아민을 에피클로로히드린 또는 디에폭시드와 반응시킴으로써 얻은 불용성 중합체이다. 또 다른 예는 p-아미노페닐 기(엔자크릴(Enzacryl)^®)로 치환된 가교 결합된 폴리아크릴아미드 중합체이다.

고체상은 결정질 가교 결합된 단백질 A로 존재할 수 있거나 중합체성 물질 또는 막 내에 묻혀 있을 수 있다. 많은 경우, 미립자 형태의 단백질 A를 사용하는 것이 적합할 수 있다. 다른 예는 면역글로불린 또는 이의 Fc-단편, 예를 들면, IgG 또는 이의 Fc-단편을 정제하기 위해 단백질 A-CLPC가 결합된 중합체성 시험관 벽을 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법에 의해 분리되는 관련 면역글로불린/항체/단편을 갖는 물질은 광범위하게 상이한 특성을 가질 수 있다. 따라서, 이러한 면역글로불린은 관련 항체를 생성하는 미생물로부터의 폴리펩티드(예를 들면, 단백질), 폴리사카라이드, 핵산 또는 저분자량 물질로부터 정제하고자 하는 수 있다.

본 발명의 방법은 액체의 존재 하에서 수행된다. 사용되는 액체는 주로 수성 액체, 예를 들면, 적합한 pH, 예를 들면, 중성점에 가까운 pH를 갖는 완충된 NaCl 수용액이다.

본 발명에 따라 단백질 A-CPLC에 결합된 관련 항체/이의 단편은 예를 들면, pH 또는 이온 강도를 변화시킴에 의해 온화한 조건 하에서 상기 CLPC로부터 용이하게 방출될 수 있다.

본 명세서에 기재된 단백질 A 결정(단백질 A-CLPC)은 항체 또는 이의 Fab 단편에 결합할 수 있고 임의의 고체 지지체를 요구하지 않으면서 다양한 공급원으로부터 정제에서 또는 면역학 또는 면역침전 연구에서 사용될 수 있다. 또한, 단백질 A의 결정(단백질 A-CLPC)은 포유동물에서 체외 장치에서 면역흡착을 통해 혈장으로부터 면역 순환하는 착물 또는 IgG를 감소시킬 수 있다. 항체를 정제하기 위해 단백질 A/CLPC 결정을 사용하는 방법이 본 명세서에 기재된다. 또한, 단백질 A 결정 및 가교 결합된 결정(CLPC)이 이를 포함하고 사용하는 조성물로서 제공된다. 또한, 단백질 A의 가용성 형태로부터 대량의 단백질 결정/CLPC를 제조하는 방법이 개시된다.

정의. 본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있게 하기 위해, 일부 용어들이 먼저 정의된다. 추가 정의는 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "전장 항체 또는 항체 단편"은 본 발명에 따른 전장 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, 단일쇄 Fv 단편 또는 Fab 항체 단편이 기능성 항체 또는 항체 단편, 즉 시험관 내에서 또는 생체 내에서 그의 특이적 항원을 인식하여 상기 항원에 결합할 수 있고 항체 결합과 관련된 임의의 후속 작용, 예를 들면, 직접적 세포독성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 개시할 수 있는 항체 또는 항체 단편임을 의미한다.

용어 "항체"는 체내에서 외래 분자의 존재에 반응하여 척추동물의 면역 시스템의 체액성 아암(arm)에 의해 제조된 약 MW 150 kD의 당단백질을 의미한다. 항체는 미생물, 예를 들면, 기생충, 박테리아 및 바이러스에 의한 감염의 예방 및 해결에 필수적이다. 항체는 항원(또는 에피토프)으로 지칭되는 단백질(또는 종종 폴리사카라이드, 당단백질, 지질 또는 핵산을 포함하는 다른 유기 분자) 구조체(침윤 미생물 또는 이의 생성물 상의 항원을 포함함)를 매우 특이적인 방식으로 인식하여 결합함으로써 이 작용을 수행한다. 항체는 항체 상의 초가변 도메인(항원 결합 부위로 지칭됨)과 그의 에피토프 사이의 매우 특이적인 상호작용을 통해 그의 표적 항원에 결합한다. 항체는 항원에 결합되었을 때 감염 미생물 또는 다른 항원 함유 물질, 예를 들면, 암세포의 중화, 파괴 및 제거에 기여하는 면역 시스템의 많은 이펙터(effector) 시스템들 중 하나 이상의 시스템을 활성화시킨다.

또한, 항체는 질환 상태에 관여하는 세포 표적물에의 그의 특이적 결합 및 후속 중화를 통해 암, 염증, 심혈관 질환 및 이식 거부의 치료에 사용된다. 예를 들면, 단일클론 항체 인플릭시맙(Infliximab)은 종양 괴사 인자에 결합하고 세포 표면 수용체와 상기 인자의 상호작용을 차단함으로써 염증에서 상기 인자의 역할을 중화시키는 반면, 리툭시맙(Rituximab)은 악성 B 림프구의 세포 표면 CD20 항원에 결합함으로써 상기 악성 B 림프구를 표적화한다.

단일 항체 분자는 서로 공유결합된 2개의 동일한 중쇄(각각 약 MW 50 kD) 및 상기 중쇄들 중 하나에 각각 공유결합된 2개의 동일한 경쇄(각각 약 MW 25 kD)로 구성된 구조를 갖는다. 상기 4개의 쇄는 고전적인 "Y" 모티프로 정렬되어 있다. "Y"의 하부 "다리"는 Fc 영역("c"는 "결정화가능한" 또는 "보체 결합"을 의미함)으로 지칭되고 항체를 세포막 내에 고착시키는 데에 사용되고 대식세포에 결합하고 보체를 활성화시키는 데에도 사용된다. "Y"의 상부에 있는 2개의 "아암"은 Fab 영역("ab"는 "항원 결합"을 의미함)으로 지칭된다. 각각의 Fab 영역은 (Fab 영역과 Fc 영역의 연접부에서) 불변 영역 및 ("Y"의 정점까지 연장되어 있는) 가변 영역을 함유한다. 각각의 가변 영역은 "Y"의 각각의 정점에서 ("초가변" 영역으로 지칭되는 가변 영역 내의 영역에서) 동일한 항원 결합 부위를 함유한다. 따라서, 각각의 Fab 영역은 하나의 항원 결합 부위를 가지므로, 완전한 항체 분자는 2개의 항원 결합 부위를 갖는다(즉, "2가"임). 천연 발생 항체 상의 2개의 항원 결합 부위는 서로 동일하므로 항체는 하나의 항원에 대해 특이적이다(즉, "1가"임).

항체 분자의 다수의 분자 단편들이 현재까지 단리되었다. 이들은 천연적으로 발생하지 않으나 하나 이상의 완전한 항체 분자로부터 개조된다. 이 단편들은 Fab 단편(효소 파파인(papain)을 사용한 분해에 의해 완전한 항체로부터 단리된 단일 Fab), 및 F(ab')₂ 단편(효소 펩신으로 항체를 분해함에 의해 생성된, 서로 공유결합된 2개의 Fab)을 포함한다. Fab 단편은 단일특이적이지만, F(ab')₂ 단편은 이중특이적이다. 최근에, 다수의 개조된 항체 단편들이 소개되었다. 이들은 이중 가닥 Fv(dsFv) 단편 및 단일쇄 Fv(scFv) 단편을 포함한다(두 경우에서 "v"는 "가변"을 의미함). dsFv 단편은 불변 영역을 갖지 않는 Fab 단편으로, 즉 서로 공유결합된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역만으로 구성된다. scFv 단편은 펩티드 링커를 통해 경쇄의 가변 영역에 결합된 중쇄의 가변 영역으로 구성된 단일 폴리펩티드 쇄이다. 고전적으로, dsFv 단편 및 scFv 단편 둘다 1가이다(따라서 단일특이적임). 그러나, 2개의 dsFv 단편 또는 2개의 scFv 단편은 스스로 결합되어 (불변 영역을 갖지 않는 F(ab')₂ 단편과 유사한) 이중특이적 단편을 형성한다. 나아가, 상이한 항원 결합 부위들(즉, 상이한 특이성)을 갖는 2개의 dsFv 단편 또는 scFv 단편을 연결하여 이중특이적 단편을 형성할 수 있다. 이러한 단편들은 연구 수단으로서 또는 치료 또는 진단 시약으로서 사용될 수 있다.

인간에는 5개 클래스의 항체(면역글로불린으로도 지칭됨)가 존재한다: 각각 자신의 독특한 특성 및 기능을 갖는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE. IgG, IgD 및 IgE는 모두 하나의 항체 분자로 구성되지만, IgA는 1, 2 또는 3개의 항체 분자로 구성될 수 있고, IgM은 5개의 항체 분자로 구성된다. 더욱이, 인간에는 4개 서브클래스의 IgG(IgG_l, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄) 및 각각 2개 서브클래스의 IgM 및 IgA(각각 1 및 2)가 존재한다. 예를 들면, 단일클론 항체 리툭시맙(리툭산™)은 IgG₁ 항체이다.

천연 발생 항체는 단일 종으로부터 유래되지만, 개조된 항체 및 항체 단편은 하나 초과의 동물 종으로부터 유래될 수, 즉 키메라일 수 있다. 현재까지, 마우스(뮤린)/인간 키메라 항체가 발생되었지만, 다른 종들의 조합도 가능하다. 키메라 항체는 2종의 하위종, 즉 키메라 항체와 인간화 항체로 더 분류된다. 키메라 뮤린/인간 항체는 약 75%의 인간 아미노산 서열 및 25%의 마우스 아미노산 서열을 함유한다. 인간 서열은 항체의 불변 영역을 나타내지만, 마우스 서열은 항체의 가변 영역을 나타낸다(이로써, 항원 결합 부위를 함유함). 이러한 키메라를 사용하는 근거는 마우스 항체의 항원 특이성을 보유하되 마우스 항체(뮤린 항체는 마우스 이외의 종에서 그에 대한 면역 반응을 야기할 것임)의 면역원성을 감소시키므로 인간 치료에서 상기 키메라를 사용할 수 있다는 것이다. 키메라 항체는 상이한 인간 항체들로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체도 포함한다. 초가변 영역으로도 지칭되는 CDR 영역은 항원 결합 부위를 발생시키는 항체 분자의 가변 영역 내의 서열이다. CDR 영역은 결합 부위가 형태 및 전하 분포에 있어서 항원 상의 인식되는 에피토프에 상보적이기 때문에 그와 같이 명명된다.

대안적으로, 키메라 항체는 하나의 항체로부터의 골격 영역 및 또 다른 항체로부터의 CDR 영역을 포함한다. 키메라 항체는 2종 이상의 상이한 인간 항체들로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체도 포함한다. 인간화 항체는 약 90%(또는 그 이상)의 인간 아미노산 서열을 함유한다. 존재하는 유일한 뮤린 서열은 초가변 영역(가변 영역 내에 함유된 실제 항원 결합 부위임)에 대한 서열이다. 인간화 항체는 키메라 항체에 비해 최소한의 마우스 면역원성을 갖는다.

일반적으로 항체의 특이성에 의해 구별될 수 있는 2종의 항체, 즉 다클론 항체 및 단일클론 항체가 존재한다. 다클론 항체는 혈액의 면역글로불린 분획으로서 발견되는 항체이고 본질적으로 개체에게 노출된 상이한 항원들에 대해 특이적인 많은 상이한 종류의 항체들의 다클론 혼합물이다(즉, 다클론 항체는 항체를 생성하는 세포인 B 림프구(또는 B 세포)의 많은 상이한 클론들로부터 유래됨).

단일클론 항체는 단일 특이성을 갖는 항체, 즉 B 림프구(B 세포)의 단일 클론으로부터 유래된 항체이다. 이 항체는 그의 표적 항원에 대한 정교한 특이성을 갖고 많은 양으로(즉, 높은 역가로) 생성될 수 있다. 단일클론 항체는 특정 항원(예를 들면, 암 항원)에 대한 마커, 진단 시약(예를 들면, HIV-1과 같은 바이러스를 검출하기 위한 분석에서) 및 치료제로서 유용하다. 전장 단일클론 항체는 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 고전적인 분자 구조를 갖는 항체이다. 이것은 항체 단편, 예컨대, Fab, F(ab')₂, Fc 단편, dsFv 단편 및 scFv 단편과 구별된다.

전통적으로, 단일클론 항체는 항체 생성 B 세포를 불멸 하이브리도마 세포와 융합시켜 세포 배양물 중에서 단일클론 항체를 연속적으로 생성하는 B 세포 하이브리도마를 발생시킴에 의해 생성된다. 단일클론 항체를 발생시키기 위해 전통적으로 이용되는 또 다른 방법은 파지-디스플레이 기술을 이용하여 박테리아 세포 배양물 중에서 단일클론 항체를 발현시키는 것을 포함한다. 그러나, 현재, 단일클론 항체는 유전적으로 변형된 동물, 예컨대, 소 및 염소(젠자임 트랜스제닉스(Genzyme Transgenics)), 돼지 및 토끼(메다렉스(Medarex), 피피엘 쎄라퓨틱스(PPL Therapeutics)) 및 닭(트랜세노겐(Tranxenogen)), 및 식물, 예컨대, 담배 및 옥수수(에피사이트(Epicyte), 인티그레이티드 프로테인 테크놀로지스(Integrated Protein Technologies), 메리스템 크롭테크(Meristem Croptech) 등)에서 대량으로 생체내 제조될 수 있다. 예를 들면, 대량의 단일클론 항체가 유전적으로 변형된 염소(젠자임 트랜스제닉스)의 모유에서 발견될 수 있다. 단백질 A-CLPC는 본 발명에 따라 이러한 모든 공급원들로부터 항체를 정제하는 데에 사용될 수 있다. 나아가, 트랜스제닉 기술로 인해 마우스는 전체 인간 B 세포 게놈(인간 항체를 코딩함)을 함유하고 발현하도록 변형되었다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 마우스(애브제닉스(Abgenix))는 본 발명에 따른 단백질 A-CLPC를 사용하여 정제할 수 있는 인간 항체의 공급원이다. 글리코실화가 항체를 생성하는 동물에 대해 특이적임을 주목해야 한다. 예를 들면, 인간 이외의 공급원으로부터의 인간 항체는 미묘하게 상이한 글리코실화 프로파일을 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 전장 항체 또는 단일쇄 Fv 항체 단편 또는 Fab 항체 단편은 변형된 글리코실화를 나타낼 수 있거나 탈글리코실화될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질 A-CLPC를 사용하여 정제할 수 있는 항체는 유도체화된 항체도 포함한다. 이러한 항체는 폴리에틸렌 글리콜 또는 하나 이상의 탄수화물 부분 또는 하나 이상의 메틸 또는 에틸 기로 유도체화된 항체를 포함한다.

임상적으로 관련된 항체는 이 항체가 사용될 치료 영역에 따라 분류될 수도 있다. 이러한 항체는 예를 들면, 암(예를 들면, 췌장암), 염증 질환(예를 들면, 자가면역 질환, 관절염), 심혈관 질환(예를 들면, 졸중), 감염 질환(예를 들면, HIV/AIDS), 호흡 질환(예를 들면, 천식), 조직 이식 거부 및 기관 이식 거부를 치료하기 위한 항체를 포함한다. 이러한 항체는 방사선면역요법용 항체도 포함한다. 본 발명에 따라 정제하고자 하는 수 있는 항체는 예를 들면, 애브식시맙(Abciximab), 팔리비주맙(Palivizumab), 무루모납(Murumonab)-CD3, 젬투주맙(Gemtuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 바실릭시맙(Basiliximab), 닥클리주맙(Daclizumab), 에타네르셉트(Etanercept) 및 이브리투모마브 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "수성-유기성 용매 혼합물"은 n%의 유기 용매 및 m%의 물을 포함하는 혼합물을 의미하고, 이때 n은 1 내지 99이고, m은 100-n이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생체적합성 중합체"는 비항원성(보조제로서 사용되지 않는 경우), 비발암성 및 무독성을 나타내고 살아 있는 유기체와 다른 방식으로 본질적으로 상용불가능하지 않은 중합체를 의미한다. 예에는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드(depsipeptide)), 폴리(에스테르), 예컨대, 폴리(락트산) 또는 PLA, 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤) 및 폴리(디옥산온), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리((히드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리[(유기)포스파젠], 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산염화된 폴리사카라이드, 및 이들의 블렌드 및 공중합체가 포함된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생체분해성 중합체"는 가수분해 또는 가용화에 의해 분해되는 중합체를 의미한다. 분해는 불균질한(주로 입자 표면에서 일어남) 또는 균질한(중합체 매트릭스 전체에서 균일하게 분해됨) 분해일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "생물학적 샘플"은 예를 들면, 분석물을 검출하기 위해 세포, 조직, 기관 또는 유기체로부터 수집된 생물학적 물질이다. 예시적 생물학적 샘플은 유체, 세포 또는 조직 샘플을 포함한다. 생물학적 유체는 예를 들면, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 소변 또는 땀을 포함한다. 세포 또는 조직 샘플은 생검, 조직, 세포 현탁액, 또는 다른 표본 및 샘플, 예컨대, 임상적 샘플을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 공중합체는 하나 초과의 단량체 종으로 만들어진 중합체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유화제(emulsifier)는 중합체 코팅된 결정과 용액 사이의 계면장력을 감소시키는 표면 활성제이다.

"결정"은 3차원에서 주기적으로 반복되는 패턴으로 정렬된 원자를 포함하는 물질의 고체 상태의 한 형태이다(예를 들면, 문헌(Barret, Structure of Metals, 2^nd ed., McGraw-Hill, New York (1952)) 참조). 예를 들면, 폴리펩티드의 결정 형태는 제2 형태, 즉 비결정질 고체 상태와 상이하다. 결정은 형태, 격자 구조, % 용매 및 광학적 성질, 예컨대, 굴절 지수를 포함하는 특징적인 특징을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질의 "가교 결합된 결정형"은 가교 결합된 단백질 결정이 용액에 첨가될 때 불용성 및 고체 상태로 남아 있는 성질을 갖는다.

"체외 장치(extracorporeal device)"는 개체의 치료에서 체액을 단백질 A 결정과 접촉시키기 위한, 체내에 존재하지 않는 구조체이다. 바람직하게는, 체외 장치는 신장 투석을 포함하는 투석을 위해 사용되는 장치, 연속적 동정맥 혈액여과를 위한 장치, 체외순환 막 산소발생기, 또는 혈류로부터 폐기물을 여과하는 데에 사용되는 다른 장치이다. 유사하게, 폐기물을 여과하는 장치의 구성요소(예를 들면, 튜브, 다공성 물질 또는 막을 포함함)도 상기 용어에 포함된다. 구체적으로, 체외 장치는 투석 장치일 수 있다. 체외 장치는 투석 장치의 막일 수도 있다.

단백질 A의 "기능성 단편"은 단백질 A의 항체 또는 이의 FAb 단편에 대한 하나 이상의 결합 활성, 예컨대, 항체의 정제에서 이용되는 능력을 보유하는 단백질 A 폴리펩티드의 일부이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 기능성 단편은, 달리 명시되지 않은 한, 한 말단 또는 양 말단으로부터의 말단 절두(truncation)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 기능성 단편은 단백질 A 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 결실된 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20개 이상의 잔기를 가질 수 있다. 바람직하게는, 절두는 한 말단 또는 양 말단으로부터 20개 아미노산을 초과하지 않는다. 기능성 단편은 임의적으로 하나 이상의 이종 서열에 연결될 수 있거나 단백질 A의 본래의 천연 서열에서 임의의 아미노산으로의 돌연변이를 가질 수 있다.

용어 "개체" 또는 "대상체"는 인간, 비인간 영장류, 영장류, 개코원숭이, 침팬지, 원숭이, 설치류(예를 들면, 마우스, 래트), 토끼, 고양이, 개, 말, 소, 양, 염소, 돼지 등을 포함하는, 그 자체로 분류된 임의의 동물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 동물을 의미한다.

단백질의 불용성 및 안정성 형태는 수성 용매, 유기 용매 또는 수성-유기 용매 혼합물 중에서 불용성을 나타내고 상기 단백질의 가용성 형태보다 더 높은 안정성을 나타내는 단백질의 한 형태이다. 본 발명의 대안적 실시양태에 따르면, 어구 "단백질의 불용성 및 안정성 형태"는 건조 제제 및 습윤 제제에서 불용성을 나타내는 단백질일 수 있다. 임의의 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 결정은 불용성 형태에서 활성을 나타낼 수 있다.

용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 실질적으로 자유로운 분자를 의미한다. 예를 들면, 단리된 단백질은 그가 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 단백질로부터 실질적으로 자유롭다. 상기 용어는 단리된 단백질이 치료 조성물로서 투여되기에 충분히 순수하거나 70 내지 80 중량/중량% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 80 내지 90 중량/중량% 이상 순수한, 훨씬 보다 바람직하게는 90 내지 95 중량/중량% 순수한, 가장 바람직하게는 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.8 또는 100 중량/중량% 이상 순수한 경우의 제제를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 이 용어에 의해 제한되는 값의 최대 ± 10%를 의미한다. 예를 들면, 약 50 mM은 50 mM ± 5 mM을 의미하고, 약 4%는 4% ± 0.4%를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "거대분자 기질"은 가교 결합된 단백질 결정의 단백질 성분에 의해 촉진되는 반응에 대한 기질이기도 한 큰 생체분자, 예컨대, 분자량이 600 내지 700 달톤 이상인 단백질 또는 탄수화물을 의미한다.

용어 "유기 용매"는 비수성 유래의 임의의 용매를 의미한다.

본 발명의 가교 결합된 단백질 결정 제제의 단백질 성분은 천연적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다. 이 단백질 성분은 당단백질 또는 비변형된 단백질일 수 있거나 다른 변형을 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단백질 활성"은 결합, 촉매작용, 및 단백질이 사용되는 환경 내에서 기능적 반응을 발생시키는 활성, 예컨대, 면역글로불린의 결합, 면역침전 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 활성을 의미한다.

용어 "단백질의 가용성 형태"는 용액 중에 존재하고 결정 격자로부터 해리된 개개의 단백질 분자를 의미한다.

용어 "치료 유효 투여량" 또는 "치료 유효량"은 면역 관련 상태의 증상, 예컨대, 성인 혈소판감소성 자반증을 예방하거나, 증상의 발병을 지연시키거나, 또는 완화시키는 화합물의 양을 의미한다. 예를 들면, 치료 유효량은 상승된 면역글로불린/IgG 또는 이의 하위클래스 농도와 관련된 질환의 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 심각도의 감소, 발병의 지연 및/또는 발병 위험의 감소에 충분할 것이다. 상기 유효량은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

용어 "치료", "치료 방법" 및 이들의 동족어는 기존 질환의 치료 및/또는 예방적/방지적 조치를 의미한다. 치료가 필요한 개체는 특정한 의학적 질환을 이미 갖는 개체뿐만 아니라, 상기 질환을 가질 위험에 있는 개체 또는 상기 질환을 궁극적으로 획득할 수 있는 개체도 포함할 수 있다. 치료의 필요성은 예를 들면, 질환의 발달과 관련된 하나 이상의 위험 인자의 존재, 질환의 존재 또는 진행, 또는 질환을 갖는 대상체의 치료에 대한 감수성에 의해 평가된다. 치료는 질환의 진행을 늦추거나 역행시키는 것을 포함할 수 있다.

용어 "중합체"는 작고 단순한 화학적 단위체(unit)의 반복에 의해 구축된 큰 분자를 의미한다. 반복 단위체는 상호연결된 네트워크를 형성하도록 선형 또는 분지형일 수 있다. 반복 단위체는 통상적으로 단량체와 동등하거나 거의 동등하다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 중합체성 담체는 정제를 위한 단백질 A-CLPC의 캡슐화 또는 이러한 단백질 A-CLPC의 전달(생물학적 전달을 포함함)을 위해 사용되는 중합체를 의미한다. 이러한 중합체는 생체적합성 및 생체분해성 중합체를 포함한다. 중합체성 담체는 단일 종류의 중합체일 수 있거나 다양한 종류의 중합체의 혼합물로 구성될 수 있다. 중합체성 담체로서 유용한 중합체는 예를 들면, 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 예컨대, 폴리(락트산) 또는 PLA, 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤) 및 폴리(디옥산온), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리((히드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리[(유기)포스파젠], 폴리(오르토에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 천연 및 합성 폴리펩티드, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산염화된 폴리사카라이드, 변형된 전분, 예컨대, 아밀로스 전분, 아밀로펙틴 전분, 히드록시에틸 전분, 메타크릴레이트 전분 및 다른 전분, 및 단백질 결정을 캡슐화하는 임의의 보편적인 물질을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질 A는 스타필로코커스 아우레우스 균주로부터의 폴리펩티드를 의미한다. 단백질 A는 면역글로불린 또는 이의 Fc-단편에 결합할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 폴리펩티드로 구성된 군이다. 단백질 A는 분자량이 42,000인 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되고 탄수화물을 거의 또는 전혀 함유하지 않는, 스타필로코커스 아우레우스의 여러 균주에 의해 생성되는 세포벽 성분이다. 단백질 A는 6개의 영역으로 구성되고, 이들 중 5개의 영역은 IgG에 결합한다. 단백질 A는 면역글로불린 분자, 특히 IgG의 Fc 영역에 특이적으로 결합한다. 단백질 A 분자는 여러 종의 Fc 영역과 상호작용할 수 있는 4개의 고친화성(Ka = 10⁸/M) 결합 부위를 함유한다. 상기 분자는 열 안정성을 나타내고 변성 시약, 예컨대, 4 M 우레아, 4 M 티오시아네이트 및 6 M 구아니딘 히드로클로리드에 노출되었을 때 그의 천연 구조를 보유한다.

고정화된 단백질 A는 포유동물의 여러 종으로부터 IgG를 단리하는 데에 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 단백질 A와 IgG 사이의 상호작용은 모든 종에 대해 동등하지 않다. 한 종 내에서조차도 단백질 A는 IgG의 일부 하위군과 상호작용하지만 다른 하위군과는 상호작용하지 않는다. 예를 들면, 인간 IgG₁, IgG₂ 및 IgG₄는 단백질 A에 강하게 결합하는 반면, IgG₃은 단백질 A에 결합하지 않고 마우스 IgG₁은 단백질 A에 약하게 결합한다. 또한, 대다수의 래트 면역글로불린처럼 단일클론 항체가 단백질 A에 결합하지 않는 많은 경우가 존재한다. 단백질 A는 그의 가변 결합 특성에도 불구하고 그를 IgG의 친화성 정제를 위한 이상적인 수단으로 만든 IgG 결합 성질을 보유한다. 고정화된 단백질 A의 한 분자는 IgG의 2개 이상의 분자에 결합할 수 있다.

또 다른 단백질, 즉 군 G 스트렙토코커스의 세포 표면 단백질인 단백질 G는 III형 Fc 수용체이고 단백질 A와 유사한 비면역 기작으로 IgG에 결합한다. 이. 콜라이에서 생성된 상기 단백질의 재조합 형태(상기 단백질로부터 천연 단백질의 알부민 결합 영역이 유전적으로 결실되어 있음)도 IgG의 정제에 사용될 수 있다. 재조합 단백질 G는 2개의 Fc 결합 영역을 함유한다.

또 다른 항체 결합 단백질인 단백질 L은 박테리아 종 펩토스트렙토커스 매그너스(Peptostreptoccus magnus)의 세포 표면 단백질이고 L 쇄 상호작용을 통해 Ig에 결합한다. 단백질 L은 719개의 아미노산 잔기로 구성된다. 펩토스트렙토커스 매그너스의 세포벽으로부터 정제된 단백질 L의 분자량은 환원제 2-머캡토에탄올의 존재 하에서 SDS-PAGE에 의해 처음 95 kD으로서 평가되었지만, 상기 분자량은 6 M 구아니딘 HCl의 존재 하에서 겔 크로마토그래피에 의해 76 kD인 것으로 측정되었다. 면역글로불린(항체)의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A 및 단백질 G와 달리, 단백질 L은 경쇄 상호작용을 통해 항체에 결합한다. 중쇄의 어떠한 부분도 결합 상호작용에 관여하지 않기 때문에, 단백질 L은 단백질 A 또는 G보다 더 넓은 범위의 항체 클래스에 결합한다. 단백질 L은 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD를 포함하는 모든 항체 클래스의 대표물에 결합한다. 단일쇄 가변 단편(scFv) 및 Fab 단편도 단백질 L에 결합한다. 단백질 L 결합은 카파 경쇄를 함유하는 항체로 한정된다. 효과적인 결합을 위한 구체적인 요건들이 주어지면, 고정화된 단백질 L의 주요 용도는 카파 경쇄를 갖는 것으로 공지되어 있는, 복수액 또는 세포 배양물 상청액으로부터의 단일클론 항체의 정제이다.

본 발명은 단백질 A의 동형체(isoform) 및 이 동형체의 당형태(glycoform)에도 적용된다.

단백질 A는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 결정을 제조하는 데에 사용된다. 단백질 A는 예를 들면, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 천연 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "로부터 유래된"은 상기 공급원에서 천연적으로 발생하는 아미노산 또는 핵산 서열을 가짐을 의미한다. 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래된 단백질 A는 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 폴리펩티드의 1차 서열을 포함하거나 단백질 A 또는 이의 축퇴물을 코딩하는, 스타필로코커스 아우레우스에서 발견되는 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 것이다. 공급원으로부터 유래된 단백질 또는 핵산은 상기 공급원으로부터 단리되고/되거나, 재조합적으로 제조되고/되거나 화학적으로 합성되거나 변형된 분자를 포함한다. 본 명세서에 제공된 결정은 단백질 A의 아미노산 서열, 또는 항체 결합 영역(들)을 보유하는 단백질 A의 기능성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 A는 천연 발생 단백질 A의 하나 이상의 기능적 결합 특성, 즉 하나 이상의 항체에 결합하는 하나 이상의 능력을 보유한다.

단백질 A는 이미 단리되어 있으므로 뉴만(Newman), 코완(Cowan) 등을 포함하는 스타필로코커스 아우레우스의 많은 균주들로부터 입수가능하다. 단백질 A는 상업적 공급처, 예컨대, 시그마(Sigma), 레플리겐(Repligen) 및 지이(GE)로부터 구입될 수도 있다. 천연 공급원으로부터 단백질 A를 단리하는 방법은 예를 들면, 하기 문헌들에 기재되어 있다: 문헌("Nucleotide sequence analysis of the gene for protein A from Staphylococcus aureus Cowan 1 (NCTC8530) and its enhanced expression in Escherichia coli. "Shuttleworth H.L., Duggleby C.J., Jones S.A., Atkinson T., Minton N.P. Gene 58:283-295(1987)); 및 문헌("Structural studies on the four repetitive Fc-binding regions in protein A from Staphylococcus aureus." Sjoedahl J. Eur. J. Biochem. 78:471-490(1977)). 이들 단리된 단백질 A는 본 명세서에 기재된 결정 및 방법을 형성하는 데에 사용될 수 있다.

대안적으로, 재조합 단백질 A가 본 명세서에 제공된 결정 및 방법을 형성하는 데에 사용될 수 있다. 일부 경우, 재조합 단백질 A는 천연 발생 단백질 A 서열로부터의 서열들을 포함하거나 이 서열들에 의해 코딩된다. 또한, 천연 발생 서열과 상동성이 있는 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질 A가 본 명세서에 기재되어 있다. 또한, 천연 발생 단백질 A-코딩 핵산과 상동성이 있는 또는 실질적으로 동일한 핵산에 의해 코딩된 단백질 A가 제공되고 본 명세서에 기재된 바와 같이 결정화되고/되거나 투여될 수 있다.

본 명세서에서 "재조합"으로서 지칭된 폴리펩티드는 인공 재조합 방법에 의존하는 절차, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한효소를 사용한 벡터 내로의 클로닝에 의해 발생된 폴리펩티드를 포함하는, 재조합 DNA 방법에 의해 제조된 폴리펩티드이다. 또한, "재조합" 폴리펩티드는 변경된 발현을 갖는 폴리펩티드, 예컨대, 세포, 예컨대, 숙주 세포 내에서 재조합적으로 변형된 발현을 갖는 천연 발생 폴리펩티드이다.

한 실시양태에서, 단백질 A는 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 핵산 서열과 상동성이 있는 핵산으로부터 재조합적으로 제조되고, 종종 예를 들면, 이종 숙주 내에서의 재조합 제조를 증가시키거나 최적화하도록 변형된다.

단백질 A 결정을 형성하는 데 있어서 유용한 단백질 A 폴리펩티드는 숙주 세포, 예컨대, 단백질 A 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 단백질 A의 발현에 적합한 숙주 세포는 예를 들면, 효모, 박테리아, 진균, 곤충, 식물 또는 포유동물 세포, 또는 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 동물 또는 무세포 시스템일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 필요한 경우 단백질 A 폴리펩티드를 글리코실화시킬 수 있고/있거나, 디설피드 결합을 형성할 수 있고/있거나, 단백질 A를 분비시킬 수 있고/있거나, 단백질 A 폴리펩티드의 다량체화를 지지할 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이(이. 콜라이 오리가미(Origami) B 및 이. 콜라이 BL21을 포함함), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 아스퍼길러스(Aspergillus), Sf9 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 293 세포(인간 배아 신장), 및 다른 인간 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또한, 트랜스제닉 식물; 및 돼지, 소, 염소, 말, 닭 및 토끼를 포함하는 트랜스제닉 동물이 단백질 A의 제조에 적합한 숙주이다.

단백질 A의 재조합 제조를 위해, 숙주 또는 숙주 세포는 단백질 A 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 파지미드, 또는 전사 또는 발현 카세트의 형태로 구축물을 포함해야 한다. 단일 카피 또는 다중 카피로 유지되는 구축물 또는 숙주 세포 염색체 내로 통합되는 구축물을 포함하는 다양한 구축물이 입수될 수 있다. 재조합 발현을 위한 많은 재조합 발현 시스템, 성분 및 시약이 예를 들면, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation)(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), 유에스 바이올로지칼(U.S. Biological)(미국 매사추세츠주 스왐프스코트 소재), 비디 바이오사이언시스 파민겐(BD Biosciences Pharmingen)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재), 노바겐(Novagen)(미국 위스콘신주 매디슨 소재), 스트라타진(Stratagene)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재), 및 독일생물자원센터(DSMZ)(독일 브라운슈베이그 소재)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.

단백질 A의 재조합 발현은 임의적으로 구성적(constitutive) 프로모터 및/또는 유도성(inducible) 프로모터를 포함하는 이종 프로모터에 의해 조절된다. 예를 들면, T7, 알코올 산화효소(oxidase)(AOX) 프로모터, 디히드록시-아세톤 합성효소(DAS) 프로모터, Gal 1,10 프로모터, 포스포글리세레이트 인산화효소(kinase) 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(dehydrogenase) 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 구리 메탈로티오네인(CUPI) 프로모터, 산성 인산분해효소(phosphatase) 프로모터, CMV 및 프로모터 폴리헤드린(polyhedrin)과 같은 프로모터들도 적합하다. 구체적인 프로모터는 숙주 또는 숙주 세포를 기초로 선택된다. 또한, 예를 들면, 메탄올, 황산구리, 갈락토스, 낮은 인산염, 알코올, 예를 들면, 에탄올에 의해 유도될 수 있는 프로모터도 사용될 수 있고 당업계에 잘 공지되어 있다.

단백질 A를 코딩하는 핵산은 임의적으로 이종 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서 단백질 A 폴리펩티드의 N-말단에서 분비 서열이 포함된다. 신호 서열, 예컨대, α 교배 인자(Mating Factor), BGL2, 효모 산성 인산분해효소(PHO), 자일라나제(xylanase) 또는 알파 아밀라제로부터 유래된 신호 서열, 다른 효모 분비된 단백질로부터 유래된 신호 서열, 및 숙주 세포로부터의 분비를 지시할 수 있는 다른 종으로부터 유래된 분비 신호 펩티드가 유용할 수 있다. 유사하게, 다른 이종 서열, 예컨대, 링커(예를 들면, 절단 또는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위를 포함하는 링커) 및 하나 이상의 발현 조절 요소, 인핸서, 종결자(terminator), 리더 서열, 및 하나 이상의 번역 신호가 이 설명의 범위 내에 있다. 이 서열들은 임의적으로 구축물 내에 포함될 수 있고/있거나 단백질 A를 코딩하는 핵산에 연결될 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, "연결된" 서열은 서로 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.

유사하게, 에피토프 또는 친화성 태그, 예컨대, 히스티딘, HA(헤마글루티닌 펩티드), 말토스 결합 단백질, 아비태그(AviTag)^®, FLAG 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(-S-transferase)가 임의적으로 단백질 A 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 태그는 단백질 A가 생성되거나 정제된 후 단백질 A로부터 임의적으로 절단될 수 있다. 당업자는 적절한 이종 서열, 예를 들면, 일치하는 숙주 세포, 구축물, 프로모터 및/또는 분비 신호 서열을 용이하게 선택할 수 있다.

단백질 A 상동체(homolog) 또는 변이체는 하나 이상의 잔기에 의해 단백질 A 기준 서열과 상이하다. 예를 들면, 특정 아미노산들 중 일부가 구조적으로 유사한 아미노산으로 치환될 수 있다. 구조적으로 유사한 아미노산은 (I, L 및 V); (F 및 Y); (K 및 R); (Q 및 N); (D 및 E); 및 (G 및 A)를 포함한다. 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 또한 본 명세서에 기재된 단백질 A 상동체에 포함된다. 이러한 상동체 및 변이체는 (i) 다형성(polymorphic) 돌연변이체 및 천연 또는 인공 돌연변이체, (ii) 하나 이상의 잔기가 변형되어 있는 변형된 폴리펩티드 및 (iii) 하나 이상의 변형된 잔기를 포함하는 돌연변이체를 포함한다.

단백질 A 폴리펩티드 또는 핵산은 이것이 기준 서열과 약 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이상 동일한 경우 "상동성"이 있다(또는 "상동체"이다). 상동체가 기준 서열과 동일하지 않은 경우, 상기 상동체는 "변이체"이다. 상동체의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 8개, 10개, 20개, 50개 또는 이보다 많은 수 이하의 잔기에 의해 (예를 들면, 절두, 결실, 치환 또는 부가에 의해) 기준 서열과 상이하고 면역글로불린/항체 또는 이의 Fab 단편에 결합하는 능력을 보유하는(또는 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는) 경우 상기 상동체는 기준 단백질 A 서열과 "실질적으로 동일"하다. 단백질 A의 단편은 변이체 및/또는 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 상동체일 수 있다. 예를 들면, 상동체는 단백질 A의 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 절두, 결실, 치환 또는 부가 돌연변이에 의해 기준 서열로부터 유도될 수 있거나 기준 서열과 관련될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 % 동일성은 표준 정렬 알고리즘, 예컨대, 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))에 기재된 기본 국소 정렬 수단(BLAST), 문헌(Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970))의 알고리즘, 또는 문헌(Meyers et al., Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988))의 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 이러한 알고리즘은 BLASTN, BLASTP 및 "BLAST2 서열" 프로그램(문헌(McGinnis and Madden, Nucleic Acids Res. 32: W20-W25, 2004)에 논의되어 있음) 내로 도입된다. 이러한 프로그램이 이용되는 경우, 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열의 경우, "BLAST2 서열"에 대해 하기 셋팅이 사용될 수 있다: 프로그램 BLASTN, 일치에 대한 보상 2, 불일치에 대한 벌점 2, 개방 갭(gap) 벌점 및 연장 갭 벌점 각각 5 및 2, 갭 x_드롭오프(dropoff) 50, 기대치 10, 워드 크기 11, 필터 온(ON). 아미노산 서열의 경우, "BLAST2 서열"에 대하여 하기 셋팅이 사용될 수 있다: 프로그램 BLASTP, 매트릭스 BLOSUM62, 개방 갭 벌점 및 연장 갭 벌점 각각 11 및 1, 갭 x_드롭오프 50, 기대치 10, 워드 크기 3, 필터 온. 본 명세서에 기재된 결정을 형성하기에 적합한 단백질 A의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 상동성 서열, 변이체 서열 또는 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다.

가교 결합된 단백질 결정의 제조 - 단백질 결정화

단백질 결정은 수용액 또는 수용액 함유 유기 용매의 조절된 단백질 결정화에 의해 성장된다. 조절될 조건은 예를 들면, 용매의 증발 속도, 적절한 보조 용질 및 완충제의 존재, pH 및 온도를 포함한다. 단백질의 결정화에 영향을 미치는 다양한 인자들의 포괄적인 검토는 문헌(McPherson, Methods Enzymol., 114, pp. 112-20 (1985))에 의해 공개되었다. 문헌(McPherson and Gilliland, J. Crystal Growth, 90, pp. 51-59 (1988))에는 결정화된 단백질 및 핵산의 포괄적인 목록뿐만 아니라 이들이 결정화되는 조건이 편집되어 있다. 결정 및 결정화 방법의 개요뿐만 아니라 용해된 단백질 및 핵산 구조의 배위체에 대한 정보 또한 브룩하벤(Brookhaven) 국립 연구소[http//www.pdb.bnl.gov; Bernstein et al., J. Mol. Biol., 112, pp. 535-42 (1977)]의 단백질 데이터 은행에 의해 유지된다. 이 문헌들은 적절한 가교 결합된 단백질 결정의 형성에 대한 준비행위로서 단백질의 결정화에 필요한 조건을 결정하는 데에 사용될 수 있고 다른 단백질에 대한 결정화 전략을 안내할 수 있다. 대안적으로, 지능적인 시도 및 오류 검색 방법이 대부분의 경우 많은 단백질들에 대한 적합한 결정화 조건을 생성할 수 있되, 이들에 대하여 허용가능한 순도 수준이 달성될 수 있어야 한다[예를 들면, 문헌(C.W. Carter, Jr. and C.W. Carter, J. Biol. Chem., 254, pp. 12219-23 (1979)) 참조].

X-선 회절 분석을 위해 필요한 큰 단일 결정은 본 명세서에 기재된 방법에서의 사용을 위해 요구되지 않는다. 미세결정질 샤워(shower)가 적합하다.

예를 들면, 가교 결합된 단백질 결정은 약 0.01 내지 약 500 ㎛, 대안적으로 0.1 내지 약 50 ㎛의 가장 긴 치수를 가질 수 있다. 또한, 상기 결정은 구, 바늘, 막대, 판, 예컨대, 육각형 및 정사각형, 장사방형, 입방형, 양추형 및 프리즘형으로 구성된 군으로부터 선택된 형태를 가질 수 있다.

일반적으로, 결정은 결정화될 단백질을 적절한 수성 용매, 또는 적절한 결정화제, 예컨대, 염 또는 유기 용매를 함유하는 수성 용매와 조합시킴에 의해 제조된다. 상기 용매는 단백질과 조합되고, 결정화의 유도에 적합하고 단백질 활성 및 안정성의 유지에 대해 허용가능한 것으로 실험적으로 측정된 온도에서 교반될 수 있다. 상기 용매는 임의적으로 보조 용질, 예컨대, 2가 양이온, 보조 인자 또는 무질서화제(chaotrope) 및 pH를 조절하기 위한 완충제 종을 포함할 수 있다. 보조 용질의 필요성 및 이의 농도는 결정화를 촉진하도록 실험적으로 측정된다.

산업적 규모의 공정에서, 결정화를 초래하는 조절된 침전은 단백질, 침전제, 보조 용질 및 임의적으로 완충제를 회분 공정에서 단순히 조합함에 의해 가장 잘 수행될 수 있다. 또 다른 방법으로서, 단백질 침전물을 출발 물질로서 사용하여 단백질을 결정화시킬 수 있다. 이 경우, 단백질 침전물은 결정화 용액에 첨가되고 결정이 형성될 때까지 인큐베이트된다. 대안적 연구실 결정화 방법, 예컨대, 투석 또는 증기 확산도 채택될 수 있다. 상기 맥퍼슨(McPherson)의 문헌 및 상기 길리랜드(Gilliland)의 문헌은 그들의 결정화 문헌의 평론에서 적합한 조건의 포괄적인 목록을 포함한다.

종종, 가교 결합제와 결정화 매질 사이의 상용불가능성이 결정을 보다 적합한 용매 시스템 내로 교환할 것을 요구할 것이다.

결정화 조건이 이미 기재되어 있는 단백질들의 대다수는 본 발명에 따른 가교 결합된 단백질 결정을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 그러나, 상기 인용된 참고자료들 중 대다수에서 보고된 조건들은 대부분의 경우 소수의 큰 회절 품질 결정을 수득하도록 최적화된 것임을 주목해야 한다. 따라서, 당업자는 가교 결합된 단백질 결정의 제조에서 사용되는 보다 작은 결정의 대규모 제조를 위한 높은 수율 공정을 제공하기 위한 상기 조건들의 어느 정도의 조절이 필요할 수 있음을 인식할 것이다.

가교 결합된 단백질 결정의 제조 - 단백질 결정의 가교 결합

안정화된 결정. 일단 단백질 A 결정이 적합한 매질 중에서 성장되면, 이 결정은 예컨대, 가교 결합에 의해 임의적으로 안정화될 수 있다. 가교 결합은 상기 결정의 성분 단백질 분자들 사이에 공유결합을 도입함으로써 결정 격자를 안정화시킨다. 이것은 결정 격자의 존재 또는 심지어 온전한 단백질의 존재와 상용불가능할 대안적 환경 내로의 단백질의 전달을 가능하게 한다. 단백질 A 결정은 예를 들면, 라이신 아민 기, 티올(설프히드릴) 기 및 탄수화물 부분을 통해 가교 결합될 수 있다. 가교 결합된 결정은 본 명세서에서 "단백질 A-CLPC", "CLPC-단백질 A" 또는 "CLPC"로도 지칭된다.

가교 결합된 결정은 안정성(예를 들면, pH, 온도, 기계적 및/또는 화학적 안정성), 항체 결합의 pH 프로파일, 가용성, 결정 크기 또는 부피의 균일성, 결정으로부터 결합된 항체의 방출 속도, 및/또는 기저 결정 격자 내의 개개의 분자들 사이의 공극 크기 및 형태를 변경할 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 가교 결합 또는 안정화는 결정이 겔의 ㎖당 고정화된 단백질 A에 비해 결정의 ㎖당 약 60%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250% 또는 300% 이상의 결합 능력(항체의 결합)을 보이는 단백질 A를 포함하는 방식으로 수행된다. 안정성은 가용성 또는 고정화된 단백질 A에 비해 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250% 또는 300% 이상까지 증가될 수 있다. 안정성, 예컨대, pH 안정성, 온도 안정성, 단백질분해효소에 대한 안정성, 용해 안정성 및 시험관내 컬럼 안정성은 저장 조건 하에서 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 가교 결합은 결정 형태의 단백질 A 폴리펩티드의 용액 내로의 용해를 늦추어 단백질 분자를 미세결정질 입자 내로 효과적으로 고정화시킨다. 가교 결합된 단백질 결정 주변 환경에서 유발자(trigger)에의 노출시, 예컨대, 저장보다는 사용 조건 하에서 단백질 분자는 서서히 용해되어 활성 단백질 A 폴리펩티드를 방출하고/하거나 단백질 A 활성을 증가시킨다. 용해 속도는 예를 들면, 하기 인자들 중 하나 이상의 인자에 의해 조절된다: 가교 결합 정도, 가교 결합제에의 단백질 결정의 노출 시간 길이, 단백질 결정에의 가교 결합제의 첨가 속도, 가교 결합제의 성질, 가교 결합제의 쇄 길이, pH, 온도, 설파히드릴 시약, 예컨대, 시스테인 또는 글루타치온의 존재, 가교 결합된 단백질 결정의 표면적, 가교 결합된 단백질 결정의 크기 및 가교 결합된 단백질 결정의 형태.

가교 결합은 다작용성 물질(multifunctional agent)을 포함하는 매우 다양한 가교 결합제들 중 하나 또는 이들의 조합을 동시에(병렬로) 또는 순차적으로 사용함으로써 달성할 수 있다. 주변 환경에서 유발자에의 노출시 또는 주어진 시간 동안, 이러한 다작용성 가교 결합제에 의해 가교 결합된 단백질 결정들 사이의 가교 결합은 감소되거나 약화되어, 단백질 용해 또는 활성의 방출을 유발한다. 대안적으로, 가교 결합은 부착점에서 파괴되어 단백질 용해 또는 활성의 방출을 유발할 수 있다. 미국 특허 제5,976,529호 및 제6,140,475호를 참조한다.

일부 실시양태에서, 가교 결합제는 2, 3, 4 또는 5개 이상의 활성 부분을 갖는 다작용성 가교 결합제이다. 다양한 실시양태에서, 가교 결합제는 글루타르알데히드, 석신알데히드, 옥탄디알데히드, 글리옥살, 디티오비스(석신이미딜프로피오네이트), 3,3'-디티오비스(설포석신이미딜프로피오네이트), 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트·HCl, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, 헥사메틸렌디아민, 디아미노옥탄, 에틸렌디아민, 석신산 무수물, 페닐글루타르산 무수물, 살리실알데히드, 아세트이미데이트, 포르말린, 아크롤레인, 석신 세미알데히드, 부티르알데히드, 도데실알데히드, 글리세르알데히드 및 트랜스-옥트-2-에날로부터 선택될 수 있다.

추가 다작용성 가교 결합제는 트리아진, 예를 들면, 염화시아누르; 할로-피리미딘, 예를 들면, 2,4,6-트리클로로/브로모 피리미딘; 방향족 또는 지방족 모노카르복실산 또는 디카르복실산의 무수물 또는 할로겐화물, 예를 들면, 말레산 무수물, 염화(메트)아크릴오일, 염화클로로아세틸; N-메틸올 화합물, 예를 들면, N-메틸올 클로로-아세트아미드; 디-이소시아네이트 또는 디-이소티오시아네이트, 예를 들면, 페닐렌-1,4-디-이소시아네이트; 및 아지리딘을 포함한다. 다른 가교 결합제는 에폭시드, 예컨대, 디-에폭시드, 트리-에폭시드 및 테트라-에폭시드를 포함한다. 한 실시양태에서, 가교 결합제는 이작용성 물질인 글루타르알데히드이고, 글루타르알데히드는 단독으로 사용되거나 에폭시드와 함께 순차적으로 사용된다. 다른 가교 결합제(예를 들면, 피어스 케미칼 캄파니의 1996년 카탈로그 참조)도 동시에(병렬로) 사용될 수 있거나 가역적 가교 결합제, 예컨대, 이하에 기재된 것들과 함께 순차적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 대안적 실시양태에 따르면, 가교 결합은 가역적 가교 결합제를 병렬로 또는 순차적으로 사용하여 수행할 수 있다. 생성된 가교 결합된 단백질 결정은 유발자가 별개의 기로서 도입되어 있는 반응성 다작용성 링커를 특징으로 한다. 반응성 작용기는 단백질 내의 반응성 아미노산 측쇄와 함께 결합에 관여하고, 유발자는 주변 환경에서 하나 이상의 조건(예를 들면, pH, 환원제의 존재, 온도 또는 열역학적 물 활성)을 변경함에 의해 파괴될 수 있는 결합으로 구성된다.

가교 결합제는 동종작용성(homofunctional) 또는 이종작용성 가교 결합제일 수 있다. 반응성 작용기(또는 부분)는 예를 들면, 하기 작용기들 중 하나로부터 선택될 수 있다(이때, R, R', R" 및 R'"는 알킬, 아릴 또는 수소 기일 수 있음):

I. 반응성 아실 공여체, 예컨대, 카르복실산염 에스테르 RCOOR', 아미드 RCONHR', 아실 아지드 RCON₃, 카르보디이미드 R-N=C=N-R', N 히드록시이미드 에스테르 RCO-O-NR', 이미도에스테르 R-C=NH₂ ⁺(OR'), 무수물 RCO-O-COR', 카르보네이트 RO-CO-O-R', 우레탄 RNHCONHR', 할로겐화산 RCOHal(이때, Hal = 할로겐), 아실 히드라지드 RCONNR'R" 및 O 아실이소우레아 RCO-O-C=NR'(-NR"R"');

II. 반응성 카르보닐 기, 예컨대, 알데히드 RCHO 및 케톤 RCOR', 아세탈 RCO(H₂)R' 및 케탈 RR'C0₂R'R"(단백질 고정화 및 가교 결합의 분야에서 잘 숙련된 자에게 공지된 작용기를 함유하는 반응성 카르보닐은 문헌(Pierce Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company, Rockford, III. (1994)); 및 문헌(S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1991))에 기재되어 있음);

III. 알킬 또는 아릴 공여체, 예컨대, 할로겐화알킬 또는 할로겐화아릴 R-Hal, 아지드 R-N₃, 황산염 에스테르 RSO₃R', 인산염 에스테르 RPO(OR'₃), 알킬옥소늄 염 R₃O+, 설포늄 R₃S+, 질산염 에스테르 RON0₂, 마이클 수용체 RCR'=CR'"COR", 불소화아릴 ArF, 이소니트릴 RN+=C-, 할로아민 R₂N-Hal, 알켄 및 알킨;

IV. 황 함유 기, 예컨대, 디설피드 RSSR', 설프하드릴 RSH 및 에폭시드 R₂C_^OCR'₂; 및

V. 염, 예컨대, 알킬 또는 아릴 암모늄 염 R₄N+, 카르복실산염 RCOO-, 황산염 ROS0₃-, 인산염 ROP0₃" 및 아민 R₃N.

가역적 가교 결합제는 예를 들면, 유발제를 포함한다. 유발제는 알킬, 아릴, 또는 가교 결합될 단백질과 반응할 수 있는 활성화 기를 갖는 다른 쇄를 포함한다. 이 반응성 기는 임의의 다양한 기, 예컨대, 특히 할로겐화물, 알데히드, 카르보네이트, 우레탄, 잔탄 및 에폭시드를 포함하는, 친핵성, 자유 라디칼 또는 친전자성 치환에 대해 민감한 기일 수 있다. 예를 들면, 반응성 기는 산, 염기, 불화물, 효소, 환원, 산화, 티올, 금속, 광분해, 라디칼 또는 열에 불안정할 수 있다.

가역적 가교 결합제의 추가 예는 문헌(T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons (Eds.) (1981))에 기재되어 있다. 가역적 보호기를 위해 이용되는 임의의 다양한 방법이 가역적으로 조절되게 가용화될 수 있는 가교 결합된 단백질 결정의 제조에 적합한 가교 결합제로 도입될 수 있다. 다양한 방법이 이 주제에 대한 발트만(Waldmann)의 평론인 문헌(Angewante Chemie Inl. Ed. Engl, 35:2056 (1996))에 나열되어 있다.

다른 종류의 가역적 가교 결합제는 디설피드 결합 함유 가교 결합제이다. 이러한 가교 결합제에 의해 형성된 가교 결합을 파괴하는 유발자는 가교 결합된 단백질 결정의 환경에의 환원제, 예컨대, 시스테인의 첨가이다. 예시적 디설피드 가교 결합제는 문헌(Pierce Catalog and Handbook (1994-1995))에 기재되어 있다. 이러한 가교 결합제 및 방법의 예는 관련 부분이 본 명세서에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,541,606호에 개시되어 있다.

또한, 탄수화물 부분들 사이 또는 탄수화물 부분과 아미노산 사이를 가교 결합시키는 가교 결합제도 사용될 수 있다.

가교 결합제의 농도는 용액 중 약 0.01 내지 20 중량/부피%, 약 0.02 내지 10 중량/부피% 또는 약 0.05 내지 5 중량/부피%일 수 있다. 전형적으로, 가교 결합제는 약 0.5 내지 약 1 중량/부피%이다. 예를 들면, 가교 결합제의 농도는 예를 들면, 용액 중 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20 중량/부피%일 수 있다. 가교 결합 전에 완충제를 교환하는 것이 필요할 수 있다. CLPC를 포함하는 결정은 임의적으로 동결건조될 수 있거나 제제화될 수 있다.

본 명세서에 기재된 가교 결합된 결정을 포함하는 결정은 치료 방법, 및 예컨대, 면역 혈소판감소성 자반증에서 순환하는 면역 복합체의 IgG 수준을 감소시키는 방법에서 유용하다. 단백질 A 결정은 정제 과정(예를 들면, 단일클론 항체 정제, 다클론 항체 정제, 또는 컬럼 형식, 막 또는 중합체 내에 함침된 상태 또는 지지체 상에 코팅되거나 고정화된 상태에서 다양한 공급원으로부터 면역글로불린, IgG 및 이의 하위종, Fab 단편, 단일쇄 항체 등의 정제)과 관련된 방법에서도 유용하다. 본 명세서에 기재된 결정은 전술한 안정화된 단백질 A 결정의 하나 이상의 성질을 기초로 이 용도들에 적용될 수 있다.

단백질 A의 결정/ CLPC 의 건조. 단백질 A의 결정은 N₂, 대기 또는 불활성 기체를 사용한 건조, 진공 오븐 건조, 동결건조, 휘발성 유기 용매를 사용한 세척 후 상기 용매의 증발, 발연 후드에서의 증발, 트레이 건조, 유동상 건조, 분무 건조, 진공 건조 또는 롤러 건조를 포함하는 건조 수단에 의한 물, 유기 용매 또는 액체 중합체의 제거에 의해 건조된다. 전형적으로, 결정이 자유 유동성 분말이 될 때 건조가 달성된다. 건조는 습윤 결정 상에 기체 스트림을 통과시킴에 의해 수행될 수 있다. 상기 기체는 질소, 아르곤, 헬륨, 이산화탄소, 대기 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

원칙적으로, 건조된 결정은 동결건조에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 이 기법은 물질의 신속한 냉각을 수반하고 안정한 생성물을 냉동하는 데에만 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 결정성/CLPC 단백질 A를 함유하는 수용액은 먼저 -40℃ 내지 -50℃로 냉동된 후 진공 하에서 제거된다.

단백질 A/CLPC의 결정, 또는 이 결정을 포함하는 제제 또는 조성물의 제조. 한 양태에서, 단백질 A/CLPC의 결정, 또는 이 결정을 포함하는 제제 또는 조성물이 개시된다. 이러한 조성물은 하기 과정에 따라 제조될 수 있다:

먼저, 단백질 A를 결정화시킨다. 다음으로, 당, 당 알코올, 점도 증가제, 습윤화제 또는 가용화제, 완충제 염, 유화제, 항균제, 항산화제 및 코팅제로부터 선택된 부형제 또는 성분을 모액에 직접 첨가한다. 대안적으로, 상기 모액을 제거한 후, 결정을 최소 1 시간 내지 최대 24 시간 동안 부형제 용액에 현탁시킨다. 상기 부형제 농도는 전형적으로 약 0.01 내지 약 10 중량/중량%이다. 상기 성분 농도는 약 0.01 내지 약 90 중량/중량%이다. 결정 농도는 약 0.01 내지 약 99 중량/중량%이다.

이어서, 여과 또는 원심분리로 모액을 결정 슬러리로부터 제거한다. 그 후, 상기 결정을 임의적으로 실온에서 또는 약 -20℃ 내지 약 25℃의 온도에서 약 50 내지 100 중량/중량%의 하나 이상의 유기 용매, 예컨대, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트의 용액으로 세척한다.

그 다음, 상기 결정 상에 질소, 대기 또는 불활성 기체의 스트림을 통과시켜 상기 결정을 건조한다. 대안적으로, 대기 건조, 분무 건조, 동결건조 또는 진공 건조로 상기 결정을 건조한다. 건조는 세척 후 최소 약 1 시간 내지 최대 약 72 시간 동안 최종 생성물의 수분 함량이 약 10 중량% 미만, 가장 바람직하게는 약 5 중량% 미만일 때까지 수행된다. 마지막으로, 필요한 경우 상기 결정의 미분화(크기 감소)를 수행할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에 따르면, 단백질 A/CLPC의 결정, 또는 이 결정을 포함하는 제제 또는 조성물을 제조할 때 향상제, 예컨대, 계면활성제를 결정화 동안 첨가하지 않는다. 결정화 후 부형제 또는 성분을 약 1 내지 약 10 중량/중량%의 농도로, 대안적으로 약 0.1 내지 약 25 중량/중량%의 농도로, 대안적으로 약 0.1 내지 약 50 중량/중량%의 농도로 모액에 첨가한다. 상기 부형제 또는 성분을 약 0.1 내지 약 3 시간 동안 모액 중에서 상기 결정과 함께 인큐베이트하고, 대안적으로 상기 인큐베이트를 약 0.1 내지 약 12 시간 동안 수행하거나, 대안적으로 상기 인큐베이트를 약 0.1 내지 약 24 시간 동안 수행한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 성분 또는 부형제를 모액 이외의 용액에 용해시키고, 상기 결정을 모액으로부터 제거하고 부형제 또는 성분 용액에 현탁시킨다. 상기 성분 또는 부형제 농도 및 인큐베이트 시간은 전술한 바와 동일하다.

본 발명의 또 다른 이점은 중합체성 담체 내에 캡슐화되어 미세구를 포함하는 조성물을 형성하는 단백질 A/CLPC의 결정 또는 이의 제제가 동결건조에 의해 건조될 수 있다는 점이다. 동결건조 또는 냉동-건조는 물이 상기 조성물로부터 분리되게 한다. 단백질 A/CLPC 결정 조성물을 먼저 냉동시킨 후 고진공 하에 놓는다. 진공 하에서, 결정성 물이 승화되어 단단히 결합된 물만을 함유하는 단백질 A/CLPC 결정 조성물을 남긴다. 이러한 가공은 조성물을 더 안정화시키고 전형적으로 만나는 주위 온도에서 보다 용이한 저장 및 수송을 허용한다.

분무 건조는 물이 결정 제제로부터 분리되게 한다. 이것은 용액, 유액 및 펌프가능한 현탁액과 같은 액체 공급원료로부터 분말, 과립 또는 응집체 형태로 건조 고체를 연속적으로 제조하는 데에 매우 적합하다. 분무 건조는 소적 분무기 내로의 액체 공급원료의 분사 및 건조 챔버 내에서의 소적과 고온 대기의 접촉을 포함한다. 분무는 회전(휠) 또는 노즐 분사기에 의해 생성된다. 소적으로부터의 수분의 증발 및 건조 입자의 형성은 조절된 온도 및 기류 조건 하에서 진행된다. 분무 건조 작업을 위해 비교적 높은 온도가 요구된다. 그러나, 임계적 건조 기간 동안 증발 냉각 효과가 있고 건조 물질의 고온에의 노출의 후속 시간이 매우 짧을 수 있기 때문에 생성물에 대한 열 손상은 일반적으로 단지 경미하다. 분말은 건조 챔버로부터 연속적으로 배출된다. 작업 조건 및 건조기 디자인은 생성물의 건조 특성 및 분말 요건에 따라 선택된다. 분무 건조는 최종 생성물이 입자 크기 분포, 잔류 수분 함량, 용적 밀도 및 입자 형태에 대한 정밀한 품질 표준을 충족시켜야 하는 경우 이상적인 공정이다.

본 발명의 방법에서 유용한 단백질 A-CLPC는 부형제와 조합될 수 있다. 본 발명에 따르면, "부형제"는 약학 조성물에서 사용되는 충전제 또는 충전제의 조합으로서 작용한다. 부형제의 예는 미국 제약 협회 및 영국 제약 협회에 의해 공동으로 공개된 문헌(Handbook of Pharmaceutical Excipients)에 기재되어 있고, 추가 예는 이하에 기재되어 있다. 이 카테고리에 포함되는 바람직한 부형제는 다음과 같다: 1) 아미노산, 예컨대, 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아스파라긴, 글루타민 및 프롤린의 염; 2) 탄수화물, 예를 들면, 모노사카라이드, 예컨대, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 아라비노스, 자일로스 및 리보스; 3) 디사카라이드, 예컨대, 락토스, 트레할로스, 말토스 및 수크로스; 4) 폴리사카라이드, 예컨대, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 및 글리코겐; 5) 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 락티톨 및 소르비톨; 6) 글루쿠론산 및 갈락투론산; 7) 시클로덱스트린, 예컨대, 메틸 시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등; 8) 무기 분자, 예컨대, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 나트륨 및 칼륨의 인산염, 붕산, 탄산암모늄 및 인산암모늄; 9) 유기 분자, 예컨대, 아세트산염, 시트르산염, 아스코르브산염 및 락트산염; 10) 유화제 또는 가용화제/안정화제, 예컨대, 아카시아, 디에탄올아민, 글리세릴 모노스테아레이트, 레시틴, 모노에탄올아민, 올레산, 올레일 알코올, 폴록사머, 폴리소르베이트, 라우릴 황산나트륨, 스테아르산, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 및 다른 소르비탄 유도체, 폴리옥실 유도체, 왁스, 폴리옥시에틸렌 유도체 및 소르비탄 유도체; 및 11) 점도 증가제, 예컨대, 아가, 알긴산 및 이의 염, 구아 검, 펙틴, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 옥시드, 셀룰로스 및 이의 유도체, 프로필렌 카르보네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜 및 틸옥사폴(tyloxapol). 부형제의 추가 바람직한 군은 수크로스, 트레할로스, 락토스, 소르비톨, 락티톨, 이노시톨, 나트륨 및 칼륨의 염, 예컨대, 아세트산염, 인산염, 시트르산염, 붕산염, 글리신, 아르기닌, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 폴리라이신 및 폴리아르기닌을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 부형제는 염, 알코올, 탄수화물, 단백질, 지질, 계면활성제, 중합체 및 폴리아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 부형제는 프로타민, 폴리비닐알코올, 시클로덱스트린, 덱스트란, 폴리아미노산, 예컨대, 폴리아르기닌, 폴리라이신 및 폴리글루타메이트, 폴리에틸렌 글리콜 및 덴드리머(dendrimer), 중합체, 예컨대, 폴리카르보필, 및 알기네이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

조성물. 가교 결합된 결정을 포함하는 단백질 A 결정은 조성물, 예컨대, 약학 조성물로서 제공된다(예를 들면, 단백질 결정의 제제 및 조성물을 기술하는 미국 특허 제6,541,606호 참조). 단백질 A 결정을 포함하는 약학 조성물은 당 및 생체적합성 중합체를 포함하나 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 성분 또는 부형제와 함께 단백질 A 결정을 포함한다.

단백질 A-CLPC는 다양한 생리학적으로 허용가능한 염 형태들 중 임의의 염 형태로서, 및/또는 약학 조성물의 일부로서 허용가능한 약학 담체 및/또는 첨가제와 함께 조성물 중 결정으로서 투여될 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 염 형태 및 표준 약학 제제 기법 및 부형제는 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Physician's Desk Reference (PDR) 2003, 57^th ed., Medical Economics Company, 2002) 및 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20^th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000) 참조). 본원의 목적을 위해, "제제"는 "결정 제제"를 포함한다. 단백질 A 결정 조성물을 위한 다른 유용한 성분 및 부형제는 하기 물질을 포함한다:

생체적합성 중합체. 생체적합성 중합체는 비항원성(보조제로서 사용되지 않는 경우), 비발암성, 및 무독성을 나타내고 살아 있는 유기체와 본질적으로 달리 상용불가능하지 않은 중합체로서, 본 명세서에 기재된 단백질 A 결정 조성물에서 사용될 수 있는 중합체이다. 예에는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 예컨대, 폴리(락트산) 또는 PLA, 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤) 및 폴리(디옥산온), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리((히드록시프로필)메타크릴아미드), 폴리[(유기)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산염화된 폴리사카라이드, 및 이들의 블렌드 및 공중합체가 포함된다.

생체분해성 중합체, 즉 가수분해 또는 가용화에 의해 분해되는 중합체가 단백질 A 결정 조성물에 포함될 수 있다. 분해는 불균질한(주로 입자 표면에서 일어남) 또는 균질한(중합체 매트릭스 전체에서 균일하게 분해됨) 분해일 수 있다.

성분, 예컨대, 하나 이상의 부형제 또는 약학 성분 또는 부형제가 단백질 A 결정 조성물에 포함될 수 있다. 성분은 불활성 또는 활성 성분일 수 있다.

본 발명은 공급원과 관계없이 일반적으로 IgG에 적용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 바람직한 IgG는 인간 및 마우스 IgG 클래스이다. 관심 있는 종이 분리될 수 있는 단백질은 다른 면역글로불린, 예컨대, IgM 및 IgE, 및 다른 단백질, 예컨대, 알부민이다. 단백질 A에 대한 이 단백질들의 결합 친화성은 IgG의 결합 친화성보다 훨씬 낮은 것으로 공지되어 있다.

수성 매질 중에서 가용성을 나타내는 임의의 무기 염이 사용될 수 있다. 예에는 알칼리 및 알칼리 토금속 할로겐화물 및 황산염이 포함된다. 금속성 이온을 양으로 하전된 이온, 예컨대, 암모늄으로 치환할 수 있다. 상기 염은 면역글로불린, 단백질 A 또는 단백질 A가 결합되는 임의의 지지체에 대한 비반응성도 나타내어야 한다. 염 농도는 약 0.5 M 내지 가용성 한계, 바람직하게는 약 1.0 내지 약 4.0 M일 수 있다. 용액의 정확한 pH는 중요하지 않지만 약 중성 내지 약한 알칼리성의 범위 내에서 광범위하게 변경될 수 있다. 따라서, 상기 pH는 약 7.0 이상, 바람직하게는 약 8.5 내지 약 9.5일 수 있다.

상기 염은 바람직하게는 완충제 용액의 일부로서 사용되고, 완충 효과는 상기 염 자체에 의해 또는 혼합물 중 별도의 성분에 의해 생성된다. 원하는 pH를 달성하기 위해 적절하게 선택된 보편적인 완충제가 사용될 수 있다.

면역화 목적을 위해, 단백질 A를 결정화시키고 임의의 고체 지지체, 예컨대, 친화성 크로마토그래피 컬럼 내의 충전 물질을 사용하지 않고 가교 결합시킨다.

본 발명이 친화성 크로마토그래피에서 분리를 향상시키기 위해 사용되는 경우, 높은 염 농도를 함유하는 완충제 용액을 사용한 반복된 세척으로 컬럼 충전을 평형화시키고 샘플 혼합물을 컬럼에 첨가하기 전에 상기 샘플 혼합물을 동일한 완충제 용액으로 희석하는 것이 바람직할 수 있다. 약 1:1 내지 약 1:20의 범위 내의 희석비가 바람직하지만 희석비는 광범위하게 변경될 수도 있다. 완충제 용액이 컬럼을 통과할 때, 비 결합 단백질은 상기 완충제 용액과 함께 운반되고, 이에 의해 상기 비 결합 단백질은 결합된 면역글로불린으로부터 분리된다. 이어서, 바람직하게는 약 2.0 내지 약 5.0, 보다 바람직하게는 약 2.5 내지 약 4.0의 범위 내의 pH를 갖는 산성 완충제로 용출함으로써 면역글로불린의 회수를 달성한다.

컬럼의 성질은 중요하지 않고 개방 컬럼부터 가압된 컬럼까지 광범위하게 변경될 수 있다. 본 발명에 내재된 강한 결합은 효과적인 분리가 개방 컬럼의 사용에 의해 달성되게 한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "표적 단백질을 함유하는 샘플"은 천연적으로 유래된 또는 인공적으로 제조된 표적 단백질을 함유하는 임의의 샘플을 의미한다. 상기 샘플은 상이한 액체들, 액체 및 고체, 또는 상이한 고체들의 혼합물을 포함할 수 있다. 표적 단백질을 함유하는 샘플의 예에는 혈액, 혈청, 복수액, 모유, 조직 샘플, 세포 배양물, 세포 용해물 또는 세포 배양의 상청액이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "지지체"는 그의 형태 또는 그의 제조에 사용된 재료와 관계없이 친화성 크로마토그래피 매질을 얻기 위해 단백질 A가 고정화될 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 예에는 친화성 크로마토그래피에 종종 사용되는 아가로스; 셀룰로스; 및 폴리아크릴아미드가 포함된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "크로마토그래피 매질"은 그의 구성(컬럼 또는 평면), 상태(액체 또는 고체) 또는 그의 제조에 사용된 재료와 관계없이 크로마토그래피 정제에 사용되는 정지상을 의미한다. 단백질 정제에 사용되는 크로마토그래피 매질의 통상적인 예에는 이온 교환 수지, 친화성 정지상 및 겔 투과 정지상이 포함된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "커플링된"은 직접적인 접촉뿐만 아니라 2종 이상의 유전자 또는 단백질 사이의 링커 유전자 또는 단백질의 배치를 의미한다. 이 용어는 공유결합 또는 비공유결합을 통한 커플링도 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "표적 단백질"은 정제하고자 하는 임의의 단백질을 의미한다. 표적 단백질의 일례는 항체일 수 있다.

"융합 단백질"은 본 명세서에서 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들의 임의의 조합을 의미한다. 융합 단백질은 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들이 공유결합되어 있는 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들의 조합을 포함한다. 융합 단백질은 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들이 비공유결합되어 있는 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들의 조합을 포함한다. 상기 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들은 임의의 매개자 없이 서로 직접 접촉할 수 있다. 상기 2종 이상의 별개의 폴리펩티드들은 매개자, 예컨대, 링커 펩티드에 의해 매개될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법은 단백질 A와 표적 단백질, 예컨대, 항체 사이의 높은 결합 특이성을 이용한다.

한 실시양태에서, 본 방법은 표적 단백질을 함유하는 샘플을 고정화된 결정질 가교 결합된 단백질 A를 갖는 지지체와 접촉시키는 단계; 결합되지 않은 샘플의 성분들을 제거하는 단계; 및 표적 단백질/항체를 상기 지지체로부터 제거하는 단계를 포함하는데, 이때 상기 표적 단백질은 항체이고, 단백질 A-CLPC는 상기 항체에 대한 특이적 결합 친화성을 갖고, 상기 접촉은 단백질 A가 상기 항체에 결합하도록 하는 조건 하에서 이루어진다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 용해물, 세포 배양물, 세포 배양물의 상청액, 또는 표적 단백질을 함유하는 생물학적 유체이다. 일부 실시양태에서, 고정화된 가교 결합된 단백질 A를 갖는 지지체는 친화성 크로마토그래피 컬럼으로서 구성된다.

본 명세서에 개시된 단백질의 정제를 위한 방법 및 컬럼에서, 일회용 컬럼이 사용될 수 있다. 일회용 컬럼은 약 0.1 내지 약 1.0 ㎜, 약 0.3 내지 약 0.7 ㎜ 또는 약 0.5 ㎜의 직경을 가질 수 있다. 상기 컬럼은 약 16x125 ㎜의 유리 시험관 내에 배치될 수 있다. 한 실시양태에서, 0.5 ㎜의 직경을 갖는 일회용 컬럼이 16x125 ㎜ 유리 시험관 내에 배치된다. 크로마토그래피 매질, 예를 들면, 단백질 A-CLPC는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 상기 컬럼 내에 충전될 수 있다. 일회용 컬럼을 사용하는 한 실시양태에서, 충분한 부피의 탈기된 완충제/물을 상기 컬럼에 첨가하여 상기 컬럼을 저장기(넓은 입구) 부분까지 충전시킨 후, 임의의 기포를 상기 컬럼으로부터 제거한다. 그 후, 실온에서 겔(단백질 A-CLPC)을, 탈기된 50% 겔 슬러리 및 탈기된 완충제 용액(또는 물)과 함께 컬럼 내로 충전할 수 있다. 충분한 부피의 탈기된 겔 슬러리를 첨가하여 원하는 정치된 겔 부피를 얻을 수 있다. 상기 겔이 컬럼 내에서 30 분 이상 동안 정치되게 할 수 있다. 팩킹된 컬럼을 4℃에서 저장하고 사용할 수 있다.

지지체로부터 표적 단백질을 제거하는 것은 지지체로부터 표적 단백질을 용출하는 것을 포함할 수 있다. 표적 단백질의 용출은 표적 단백질/항체가 지지체(단백질 A-CLPC)로부터 제거되도록 단백질 A-CLPC와 항체 사이의 결합 친화성을 낮추는 pH에서의 용출에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 과정에서 제1 단계는 약 pH 7.0 내지 pH 10의 범위 내의 pH를 갖는 완충제, 및 약 0.01 내지 2 M의 농도의, 1가 양이온과 다염기성 음이온의 조합을 필요로 한다. 원하는 pH를 제공하기 위해 임의의 완충제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 인산염 완충제, 글리신 완충제, 붕산염 완충제 또는 트리스 완충제가 사용될 수 있다. 완충제의 농도는 약 0.01 내지 0.25 M의 범위 내에 있어야 한다. 또한, NaCl, KCl, 염화테트라메틸암모늄(TMAC), 염화테트라에틸암모늄(TEAC), 염화테트라프로필암모늄 및 염화테트라부틸암모늄 등의 염이 약 0.05 내지 2.0 M의 농도로 완충제에 첨가될 수 있다.

1가 양이온이 칼륨 이온 또는 나트륨 이온이고 다염기성 음이온이 포스페이트 이온인, 경우, 칼륨 이온 및 포스페이트 이온은 제3 인산칼륨(K₃PO₄), 제2 인산수소칼륨(K₂HPO₄) 또는 제1 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 형태의 인산칼륨의 사용에 의해 제공될 수 있는데, 이는 매질의 pH가 존재하는 다양한 포스페이트 이온의 비율을 조절하기 때문이다. 칼륨 이온 및 포스페이트 이온은 약 0.6 내지 1.75 M의 범위 내의 농도로 존재해야 한다. 약 1.0 내지 1.5 M의 농도가 특히 만족스러운 것으로 발견되었다.

본 발명에서 사용되는 고농도에서 적절한 가용성을 나타내는, 1가 양이온과 다염기성 음이온의 다른 조합은 약 1.0 내지 1.5 M 농도의 인산암모늄, 약 1.0 내지 1.5 M 농도의 황산암모늄 및 약 1.0 내지 1.25 M 농도의 황산나트륨을 포함한다. 염이 사용된 농도에서 침전되지 않는 한 다른 조합도 사용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 정제하고자 하는 면역글로불린과의 접촉을 촉진하기 위해 바람직하게는 흡착제(단백질 A-CLEC)가 컬럼에서 사용된다. 불순한 면역글로불린을 함유하는 매질을 컬럼에 로딩하기 전에, 상기 조합물을 함유하는 여러 층 부피의 완충제로 단백질 A-CLEC를 함유하는 컬럼을 평형화시키고, 약 0.01 내지 4 M의 농도로 1가 양이온과 다염기성 음이온의 조합을 함유하는 여러 층 부피의 완충제로 상기 컬럼을 평형화시킨다. 이것은 환경이 면역글로불린과 컬럼의 결합을 위해 최적 상태가 되게 한다. 정제하고자 하는 면역글로불린을 함유하는 매질, 예컨대, 면역 혈청 또는 면역글로불린의 다른 공급원을, 1가 양이온과 다염기성 음이온의 조합을 함유하는 완충제와 혼합한다. 이어서, 생성된 혼합물을 컬럼에 로딩하여 면역글로불린이 상기 컬럼에 흡착되게 한다. 이어서, 상기 컬럼에 강하게 흡착되지 않는 컬럼 불순물로부터 용출하기 위해 1가 양이온과 다염기성 음이온의 조합을 함유하는 추가 완충제로 상기 컬럼을 세척한다. 다른 한편으로, 면역글로불린은 1가 양이온과 다염기성 음이온의 조합을 함유하는 완충제의 존재의 결과로서 면역글로불린에 대한 흡착제의 향상된 친화성으로 인해 컬럼에 강하게 흡착된다. 동일한 완충제 용액으로 세척하여 원치 않는 불순물을 제거한 후, 산성 pH를 갖는, 즉 약 pH 2.0 내지 pH 6.0의 범위 내의 pH를 갖는 완충제를 사용하여 정제된 면역글로불린을 컬럼으로부터 용출한다. pH 6.0에서 면역글로불린의 일부, 주로 IgG₁ 분획이 용출된다. pH가 낮아짐에 따라 IgG_2a 분획 및 IgG_2b 분획을 포함하는 면역글로불린의 잔류물이 용출된다. 면역글로불린의 전부를 용출하기에 효과적인 pH 2.0 완충제를 사용하여 면역글로불린을 용출할 수 있다. 그러나, 원하는 경우, 면역글로불린의 분획을 pH 6.0에서 용출할 수 있다. 원하는 경우 pH를 pH 6.0 내지 pH 2.0으로 낮춤으로써 다양한 다른 분획들을 용출할 수 있다. pH를 단계적으로 낮춤으로써, 원하는 특정 면역글로불린을 함유하는 면역글로불린의 정제된 분획을 단리할 수 있다. 임의의 완충제가 용출을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 아세트산-아세트산염 완충제 또는 글리신.HCl 완충제가 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 약 0.01 내지 0.25 M의 범위 내의 완충제 농도가 사용될 수 있다. 약 0.1 내지 0.2 M의 완충제 농도가 특히 바람직하다.

면역글로불린 또는 이의 분획은 지지체, 예를 들면, 아가로스에 결합된 고정화된 단백질 A에 비해 단백질 A-CLEC의 짧은 컬럼에 결합될 수 있다. 단리된 면역글로불린 또는 이의 분획은 90퍼센트(90%)만큼 높은 수율로 회수될 수 있다. 종래 이용가능한 대다수의 복잡한 기법들을 이용하여 얻은 결합조차도 2% 내지 10%만큼 많이 개선될 수 있다.

일부 실시양태에서, 1차 회수 샘플에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행하여 관심 있는 항체를 HCP로부터 추가로 정제한다. 일부 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 관심 있는 항체에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 크로마토그래피 물질의 비제한적 예에는 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L이 포함된다. 특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 1차 회수 샘플을, 적합한 단백질 A 수지를 포함하는 컬럼에 로딩하는 것을 포함한다. 단백질 A 수지는 다양한 항체 동형체, 특히 IgG₁, IgG₂ 및 IgG₄의 친화성 정제 및 단리에 유용하다.

단백질 A-CLPC로 충전된 적합한 컬럼의 비제한적 예는 약 1.0 cm 직경 x 약 21.6 cm 길이 컬럼(약 17 ㎖ 층 부피)이다. 이 크기의 컬럼은 소규모 정제를 위해 사용될 수 있고 규모 증가를 위해 사용되는 다른 컬럼과 비교될 수 있다. 예를 들면, 층 부피가 약 6.6 ℓ인 20 cm x 21 cm 컬럼이 보다 큰 정제를 위해 사용될 수 있다. 컬럼과 관계 없이 컬럼을 단백질 A-CLPC를 사용하여 충전할 수 있다.

일부 실시양태에서, 정제를 관심 있는 특정 항체에 맞추기 위해 단백질 A 수지의 동적 결합 능력(DBC)을 확인하는 것이 유리할 것이다. 예를 들면(그러나, 한정되는 것은 아님), 단백질 A-CLPC 컬럼의 DBC를 단일 유속 로딩 또는 이중 유속 로딩 방법으로 측정할 수 있다. 단일 유속 로딩은 전체 로딩 기간 동안 약 300 cm/hr의 속도에서 평가될 수 있다. 이중 유속 로딩 방법은 약 300 cm/hr의 선속도(linear velocity)에서 컬럼을 약 35 mg 단백질/㎖ 수지까지 로딩한 후 상기 선속도를 절반으로 감소시켜 로딩의 마지막 부분에 대한 보다 긴 체류 시간을 허용함으로써 측정할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단백질 A 컬럼을 샘플 로딩 전에 적합한 완충제로 평형화시킬 수 있다. 적합한 완충제의 비제한적 예는 pH 약 7.2 내지 7.4의 PBS 또는 트리스/NaCl 완충제이다. 적합한 평형화 조건의 비제한적 예는 pH 7.4의 PBS 완충제 또는 pH 약 7.2의 25 mM 트리스 및 100 mM NaCl이다. 이 평형화 후, 샘플을 컬럼 상에 로딩할 수 있다. 컬럼의 로딩 후, 상기 컬럼을 예를 들면, 평형화 완충제를 사용하여 1회 또는 다회 세척할 수 있다. 상이한 완충제들을 사용하는 세척을 포함하는 다른 세척을 컬럼 용출 전에 이용할 수 있다. 예를 들면, 약 6.0의 pH에서 하나 이상의 컬럼 부피의 20 mM 시트르산/시트르산나트륨 및 0.5 M NaCl을 사용하여 컬럼을 세척할 수 있다. 이 세척 후, 임의적으로 평형화 완충제를 사용하는 1회 이상의 세척을 수행할 수 있다. 이어서, 적합한 용출 완충제를 사용하여 단백질 A 컬럼을 용출할 수 있다. 적합한 용출 완충제의 비제한적 예는 pH 약 3.5의 아세트산/NaCl 완충제이다. 적합한 조건은 예를 들면, pH 약 3.5의 0.1 M 아세트산 또는 pH 2.0의 0.2 M 글리신.HCl 완충제이다. 당업자에게 잘 공지된 기법을 이용하여 용출물을 모니터링할 수 있다. 예를 들면, OD₂₈₀에서의 흡광도를 측정할 수 있다. 약 0.5 AU의 초기 편향(deflection)으로 시작하여 용출 피크의 후연(trailing edge)에서 약 0.5 AU의 판독치까지 컬럼 용출물을 회수할 수 있다. 이어서, 추가 가공을 위해 관심 있는 용출 분획(들)을 준비할 수 있다. 예를 들면, 회수된 샘플을 약 10의 pH에서 트리스(예를 들면, 1.0 M)를 사용하여 약 5.0의 pH까지 적정할 수 있다. 임의적으로, 이 적정된 샘플을 여과하여 추가로 가공할 수 있다.

본 발명은 예를 들면, 정제 또는 면역침전 동안 혈액, 혈장, 혈청 또는 세포 배양물로부터의 면역글로불린의 제거를 포함하는 다양한 용도에서의 사용에 적합한 단백질로 함침된 물질, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 이러한 단백질로 함침된 막은 치료, 진단 및 다른 산업 용도에서도 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 가교 결합된 단백질 결정으로 함침된 막을 포함한다. 가교 결합된 단백질은 다양한 적합한 단백질로부터 만들어진 임의의 적합한 가교 결합된 단백질을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 가교 결합된 단백질은 혈청, 혈장, 혈액 또는 세포 배양물로부터 항체 등을 제거할 수 있는 단백질, 예컨대, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 유사 단백질 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 가교 결합된 단백질 결정은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 A-CLPC이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 다른 가교 결합된 단백질 결정, 예컨대, 단백질 G 또는 단백질 L과 함께 또는 단독으로 가교 결합된 단백질 결정, 바람직하게는 단백질 A-CLPC로 함침된 중합체성 막을 포함한다. 단백질 A-CLPC로 함침된 막의 사용은 현재 이용가능한 고정화 기술보다 하기 1) 내지 4)를 포함하는 다수의 이점을 제공할 것으로 생각된다: 1) 임의의 침출 없이 보다 우수한 단백질 A 봉입; 2) 사용 용이성을 향상시키는 감소된 카트리지/컬럼 크기; 3) 카트리지/컬럼 제조 동안 사용 용이성; 및 4) (카트리지 내의 단백질 A의 보다 우수한 봉입으로 인한) 기존 시스템에 비해 증가된 안전성.

본 발명의 가교 결합된 단백질로 함침된 막은 다양한 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 먼저 중합체에 기초한 막 캐스팅 용액을 제조한 후 원하는 양 및 종류의 가교 결합된 단백질 결정과 혼합한다. 상기 막 캐스팅 용액은 임의의 적합한 중합체에 기초한 물질로부터 제조될 수 있음을 인식해야 한다. 일단 상기 막 캐스팅 용액이 형성되고 가교 결합된 단백질과 혼합되면, 상기 막 캐스팅 용액을 예를 들면, 지지체 물질 상에 스프레딩함으로써 상기 지지체 물질에 도포하고 1회 이상 침전시키고 세척하여, 사용 전 추후 건조될 수 있는 복합 막을 형성한다.

한 실시양태에서, 상기 캐스팅 용액은 예를 들면, 1-메틸-2-피롤리디논("NMP"), 디메틸포름아미드("DMF") 등 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 적합한 용매 중 중합체성 염기 물질, 예컨대, 폴리우레탄 등으로 구성된다. 상기 캐스팅 용액은 추가의 다른 성분, 예컨대, 증량제, 친수성화제(예를 들면, 막이 보다 높은 친수성을 나타내게 할 수 있는 물질) 등 또는 이들의 조합도 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 증량제는 산화지르코늄, 인산지르코늄, 탄소 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 증량제는 상기 막의 다공도를 조절하기에 충분한 양으로 첨가될 수 있다. 증량제는 상기 막의 총 건조 중량의 약 80% 이하, 바람직하게는 상기 막의 총 건조 중량의 약 50% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 증량제 및 가교 결합된 단백질 결정은 동등한 양 또는 적어도 거의 동등한 양으로 첨가된다.

한 실시양태에서, 친수성화제는 폴리비닐피롤리돈("PVP") 등 또는 이들의 조합이다. 친수성화제는 상기 막의 친수성을 향상시키기에 충분한 임의의 적합한 양으로 첨가될 수 있다.

그 다음, 상기 캐스팅 용액을 적합한 양의 가교 결합된 단백질 A와 혼합한다. 한 실시양태에서, 가교 결합된 단백질 A-CLPC는, 원하는 수준의 결합 활성을 제공하기에 효과적인 양으로 상기 막에 첨가된다. 한 실시양태에서, 상기 막은 약 3.25 mg/㎠ 이하의 가교 결합된 단백질로 함침된다. 이와 관련하여, 가교 결합된 단백질 결정은 상기 막의 중량의 약 80% 이하를 차지할 수 있다.

그 다음, 생성된 막 용액을 지지체, 예컨대, 합성 메쉬 물질에 도포하고 물 또는 다른 적합한 매질, 예컨대, 이소프로필 알코올("IPA")과 물의 혼합물, 바람직하게는 이소프로필 알코올 대 물의 비율이 50:50인 혼합물에 침지시킨다. 이어서, 중합체 막 복합 물질을 적합한 조건 하에서 침전시킬 수 있다. 예를 들면, 적합한 양의 NMP를 물 침전 동안 첨가하여 침전 속도를 조절할 수 있다. 이와 관련하여, 침전 속도는 감소될 수 있고, 이에 따라 다공도가 보다 높은 중합체성 막 매트릭스가 생성될 수 있다.

본 발명의 단백질 A-CLPC는 예컨대, 단백질 A-CLPC의 전달을 위한 체외 장치 또는 카테터를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 카테터, 예를 들면, 요로 카테터를, 단백질 A-CLPC 결정을 함유하는 조성물로 코팅할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 예시적 실시양태를 제공한다. 당업계에서 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상 또는 범위를 변경하지 않으면서 수행될 수 있는 다수의 변형 및 변경을 인식할 것이다. 이러한 변형 및 변경은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하지 않는다.

실시예

실시예 1

도입

항체를 정제를 위한 혁신적인 단백질 A 크로마토그래피 시스템을 개발하기 위해 단백질 A 가교 결합된 결정(CLPC)을 제조하였다. 단백질 A CLPC는 높은 안정성 및 내화학성과 함께 고도로 농축된 단백질 A 활성이라는 이점을 제공할 것이다. 응축된 단백질 A 농축은 컬럼 크기, 완충제 부피 및 공정 시간을 감소시킬 것이다. 더욱이, 단백질 A 결정의 가교 결합은 크로마토그래피 동안 단백질 A의 침출을 방지할 것이다. 더불어, 이것은 항체 제조 시간 및 비용을 감소시킬 것이다.

본 명세서의 실시예는 결정화(현적 및 회분 둘 다에서) 및 재조합 단백질 A의 가교 결합을 기술한다.

목적

항체 정제를 위한 가교 결합된 단백질 A 결정을 개발하는 것이다.

장치 및 재료

ㆍ 재조합 단백질 A, 레플리겐 코포레이션, 카탈로그 번호 rPA50.

ㆍ 재조합 단백질 A, 피츠제랄드 인터내셔날(Fitzgerald International), 카탈로그 번호 30-AP75.

ㆍ 아미콘 울트라-4 원심분리 필터 유니트, 필리포어(Millipore), 카탈로그 번호 UFC801008.

ㆍ 날진(Nalgene) MF75 시리즈 일회용 멸균 필터 유니트, 0.2 마이크론, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 카탈로그 번호 09-740-36K.

ㆍ pH 전도성 측정기, 덴버 인스트루먼트(Denver Instrument), 모델 220.

ㆍ 실리콘화된 원형 덮개 슬라이드, 햄프톤 리서치(Hampton Research), 카탈로그 번호 HR3-233.

ㆍ VDX™ 플레이트, 햄프톤 리서치, 카탈로그 번호 HR3-140.

ㆍ 8453 UV-가시 분광계, 아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies).

ㆍ 황산암모늄, 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 BP212R-1.

ㆍ 염산 용액, 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 A481-212.

ㆍ 카코딜산나트륨 삼수화물, 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 C0250.

ㆍ 염화나트륨, 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 S271-3.

ㆍ 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(트리즈마 염기), 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 T-4661.

ㆍ DI(역삼투암 & 탈이온화) H₂O.

ㆍ 결정 스크린 키트, 햄프톤 리서치, 카탈로그 번호 HR2-110.

ㆍ 결정 스키린 2 키트, 햄프톤 리서치, 카탈로그 번호 HR2-112.

ㆍ 제이비스크린 클래식(JBScreen Classic) 1, 제나 바이오사이언스(Jena Bioscience), 카탈로그 번호 CS-101L.

ㆍ 제이비스크린 클래식 2, 제나 바이오사이언스, 카탈로그 번호 CS-102L.

ㆍ 제이비스크린 클래식 3, 제나 바이오사이언스, 카탈로그 번호 CS-103L.

ㆍ 제이비스크린 클래식 4, 제나 바이오사이언스, 카탈로그 번호 CS-104L.

ㆍ 위자드 I 랜덤 희소 행렬 결정화 스크린, 에머랄드 바이오시스템스(Emerald BioSystems).

ㆍ 위자드 II 랜덤 희소 행렬 결정화 스크린, 에머랄드 바이오시스템스.

절차

재조합 단백질 A의 결정화를 현적 증기 확산 결정화법을 이용하여 수행하였다. 단백질 A 결정을 1 ㎖ 회분 크기까지 확대시키고 가교 결합시켰다.

용액 제조

3.5 M 황산암모늄

46.2 g의 황산암모늄을 100 ㎖의 DI H₂O에 용해시키고, 용액을 멸균 여과하였다.

1 M 카코딜산나트륨(pH 6.5)

21.4 g의 카코딜산나트륨을 80 ㎖ DI H₂O에 용해시켰다. 진한 HCl 용액으로 pH를 6.5로 조절하였다. 이어서, DI H₂O로 완충제 용액을 100 ㎖로 조절하고, 0.2 마이크론 날진 필터 유니트로 멸균 여과하였다.

5 M 염화나트륨

29.2 g의 염화나트륨을 100 ㎖ DI H₂O에 용해시키고, 용액을 멸균 여과하였다.

위자드 II 결정화 스크린의 인하우스(in-house) 제제 4

2.86 ㎖의 3.5 M 황산암모늄을 0.5 ㎖의 1 M 카코딜산나트륨(pH 6.5), 0.2 ㎖의 5 M 염화나트륨 및 1.44 ㎖의 여과된 DI H₂O와 혼합하여 위자드 II 스크리닝 키트의 인하우스 제제 #4를 제조하였다.

10 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7)

12.11 g의 트리즈마 염기를 80 ㎖ DI H₂O에 용해시켰다. 진한 HCl 용액으로 pH를 7로 조절하였다. DI H₂O로 완충제 용액을 100 ㎖로 조절하고 멸균 여과하였다. 이어서, 1 M 트리스-HCl 완충제를 여과된 DI H₂O로 100배 희석하였다.

현적에서의 단백질 A 결정화

피츠제랄드 인터내셔날의 재조합 단백질 A를 DI H₂O 중 50.6 mg/㎖의 농도로 사용하여 초기 결정화 스크리닝을 수행하였다. 햄프톤 리서치(참고자료 참조)의 현적 증기 확산 결정화법을 이용하여, 하기 8개의 상이한 스크리닝 키트를 사용하여 실온에서 1:1의 단백질/시약 비로 24웰 플레이트 내에서 단백질 A 샘플을 스크리닝하였다: 제이비스크린 클래식 1, 제이비스크린 클래식 2, 제이비스크린 클래식 3, 제이비스크린 클래식 4, 위자드 I, 위자드 II, 햄프톤 결정 스크린 및 햄프톤 결정 스크린 2. 또한, 아미콘 원심분리 필터 유니트를 사용하여 120 mg/㎖까지 농축시킨 단백질 A 샘플을 사용하여 결정 스크리닝을 수행하였다(단백질 농도는 280 nm에서 분광계에 의해 측정됨).

회분에서의 단백질 A 결정화

피츠제랄드 인터내셔날의 재조합 단백질 A, 및 초기 현적 결정화 스크리닝에서 결정을 생성한 조건들 중 하나(즉, 2 M 황산암모늄, 0.1 M 카코딜산염 완충제(pH 6.5) 및 0.2 M NaCl을 함유하는, 위자드 II 매트릭스 결정화 스크린의 제제 #4)를 사용하여 단백질 A 결정화를 회분에서 설정하였다. 피츠제랄드의 단백질 A 샘플을 "현적에서의 단백질 A 결정화" 단락에 기재된 바와 같이 120 mg/㎖로 농축하고, 결정 스크리닝을 전술한 결정화 시약을 사용하여 30 ㎕ 미세회분에서 수행하였다. 회분을 텀블링 없이 실온에서 6 내지 15 일 동안 인큐베이트하였다. 또한, 회분 결정화를 동일한 결정화 조건 하에서 레플리겐 코포레이션의 재조합 단백질 A를 사용하여 준비하였다. 이어서, 레플리겐의 재조합 단백질 A(53 또는 120 mg/㎖) 및 위자드 II 결정화 스크린의 인하우스 제제 #4를 사용하여 단백질 A 결정화를 0.5 ㎖ 회분까지 확대하였다. 회분을 실온에서 6 일 동안 인큐베이트하였다. 또한, 53 mg/㎖의 레플리겐의 단백질 A를 사용하여 단백질 A 결정을 1 ㎖ 회분까지 확대하였다. 단백질 A 샘플을 위자드 II 결정화 스크린의 인하우스 제제 #4와 혼합하였다. 샘플을 텀블링하면서 실온에서 4 주 동안 인큐베이트하였다.

단백질 A 결정의 가교 결합

15 mg/㎖의 단백질 A 결정을 함유하는 500 ㎕의 샘플(위자드 II 스크리닝 키트의 제제 #4 중 50% 슬러리)을 20 ㎕의 글루타르알데히드 25%(최종 글루타르알데히드 농도는 1%임)에 의해 가교 결합시켰다. 상기 샘플을 5 초 동안 즉시 볼텍싱하고 교반 없이 실온에서 20 분 동안 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 1 ㎖의 위자드 II 결정화 스크린의 제제 #4를 상기 샘플에 첨가하고(최종 글루타르알데히드 농도는 0.33%임), 착물을 5 초 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 상기 샘플을 실온에서 교반 없이 1 시간 동안 인큐베이트하였다. 가교 결합 후, 단백질 A 샘플을 1 ㎖의 10 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7)로 3회 세척하고(원심분리를 4,500 rpm에서 5 분 동안 수행함), 단백질 A 가교 결합된 결정(CLPC)을 1 ㎖의 10 mM 트리스-HCl 완충제(pH 7)에 재현탁시켰다.

결과

단백질 A의 현적 결정

현적 결정화법을 이용하여, 50.6 또는 120 mg/㎖의 단백질 샘플 및 위자드 II 결정화 스크린의 제제 #4를 사용하여 피츠제랄드 인터내셔날의 단백질 A 결정을 생성하였다(도 1). 또한, 위자드 I 결정화 스크린의 제제 #8(시트르산염 완충제(pH 5.5) 중 2 M 황산암모늄)뿐만 아니라 하기 위자드 II 결정화 스크리닝 제제들을 사용하여 결정을 제조하였다(데이터는 나타내지 않음): #31(1 M 시트르산나트륨, 0.1 M 트리스-HCl 완충제(pH 7), 0.2 M NaCl), #35(0.1 M 아세트산염 완충제(pH 4.5) 중 0.8 M NaH₂P0₄/1.2 M K₂P0₄) 및 #41(2 M 황산암모늄, 트리스-HCl 완충제(pH 7), 0.2 M 황산리튬). 모든 조건에서, 연질 입방형을 갖는 결정의 크기는 약 5 마이크론이었다.

단백질 A의 회분 결정

도 2에 나타낸 바와 같이, 레플리겐 코포레이션의 재조합 단백질 A를 위자드 II 결정화 스크린의 제제 #4와 함께 1 ㎖ 회분에서 결정화시켰다. 회분에서의 결정화는 입방형 결정 및 침상형 결정을 생성하였다. 입방형 결정의 크기는 약 10 마이크론인 반면, 침상형 결정의 크기는 보다 작았다. 레플리겐 코포레이션 및 피츠제랄드 인터내셔날의 단백질 A를 사용하여 30 ㎕ 회분에서 및 레플리겐의 단백질 A를 사용하여 500 ㎕ 회분에서 유사한 결정들을 얻었다.

가교 결합된 단백질 A 결정

레플리겐 코포레이션의 단백질 A 결정을 가교 결합제 글루타르알데히드에 의해 가교 결합시켰다. 단백질 A 결정의 가교 결합은 결정의 형태 또는 크기를 변화시키지 않았다(도 3).

참고자료

- 문헌(Crystal Growth 101 Literature, Hanging Drop Vapor Diffusion Crystallization (2001), Hampton Research Corporation).

실시예 2

침출: 가교 결합된 단백질 A 결정의 pH 조절된 가용성

pH가 7.5에서 2.0으로 감소된 후 다양한 가교 결합된 단백질 A 결정들의 가용성을 조사한다. 가교 결합된 결정을 50 mM 글리신.HCl(pH 2.0) 중 1 mg/㎖에서 인큐베이트한다. 교반하면서 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이트한 후 분액을 제거한다. 2000 rpm에서 원심분리하고 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과함으로써 용해되지 않은 가교 결합된 결정을 분리한 후 가용성 단백질 농도를 OD₂₈₀ nm에서 측정한다.

실시예 3

목적

본 실험의 목적은 인간 IgG를 사용하여 가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력을 측정하는 것이었다.

장치 및 재료

장치:

테이블 탑 원심분리기: 에펜도르프 원심분리기 5415D

에펜도르프 튜브 1 ㎖

진공 펌프

와트만 필터지 원반: 25 mm 카탈로그 번호 1825025

저울: 메틀러 톨레도(Mettler Toledo) AG285

원추형 플라스크

재료:

가교 결합된 단백질 A 결정: 인하우스 제조됨

인간 IgG: 아이씨엔 바이오메다킬 인코포레이티드(ICN Biomedical, Inc.) 카탈로그 번호 64145

인산염 완충 식염수(PBS) 정제: 시그마 카탈로그 번호 P-4417

글리신: 플루카 카탈로그 번호 50046

0.1 N NaOH: 아크로스(Acros) 카탈로그 번호 12419-0010

절차

완충제 제조

인산염 완충 식염수(PBS):

1개의 정제를 200 ㎖의 증류수에 용해시켜 인산염 완충 식염수를 얻었다.

0.2 M 글리신( pH 2.0):

7.5 g의 글리신을 90 ㎖의 물에 용해시켰다. 1 N HCl로 pH를 2.0으로 조절하였다. DI 물을 사용하여 부피를 100 ㎖까지 조절하였다. 이어서, pH를 확인하고 필요한 경우 다시 2.0으로 조절하였다.

실험 절차:

본 실험에서 사용된 가교 결합된 단백질 A 결정(CLPC)은 10 mM 트리스(pH 7.0) 중에 존재하였다. 50 ㎕의 CLPC를 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 PBS로 3회 세척하여, 항체 결합을 위해 PBS 중에서 CLPC를 평형화시켰다.

100 ㎕ 부피의 2 mg IgG를 반응 튜브 내의 50 ㎕의 PBS 중 CLPC에 첨가하였다. 튜브의 내용물을 약하게 혼합하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 튜브를 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(통과액)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다.

펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시키고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(세척)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 총 3회 세척을 위해 2회 더 반복하였다. PBS(100 ㎕ X 3)를 사용한 3회 세척물을 하나의 튜브 내에 모았다(300 ㎕의 총 세척 부피).

펠릿을 83 ㎕의 0.2 M 글리신(pH 2.0)에 재현탁시켰다. 재현탁액을 약하게 혼합하고 10 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 재현탁액을 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액(용출)을 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 2회 더 반복하고, 3회 글리신 용출물을 하나의 튜브 내에 모았다(249 ㎕의 총 용출 부피).

세 번째 용출 후, 펠릿을 250 ㎕의 0.1 N NaOH에 재현탁시켜 0.2 M 글리신(pH 2.0)으로 용출되지 않은 임의의 잔류 단백질을 용출하였다. 재현탁액을 15 분 동안 인큐베이트하고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(NaOH 재생)을 분석을 위해 보관하였다.

통과액, 세척액, 용출액 및 NaOH 재생액의 흡광도를 280 nm에서 판독하였다.

이어서, 본 실험에서 사용되는 단백질 A의 양을 결정하기 위해 CLPC 펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시켜 건조 중량 측정을 수행하였다.

와트만 필터지 원반의 중량을 측정하고, 중량을 기록하였다. 필터지를 진공에 부착된 원추형 플라스크 상에 놓았다.

진공을 가하여 플라스크 내의 액체를 배출하면서 100 ㎕의 PBS 중 CLPC를 상기 필터지 상에 첨가하였다. CLPC를 물로 5회 세척하였다. 필터지를 일정 시간 동안 진공 상에 놓아 상기 필터지가 건조되게 한 후 상기 필터지를 밤새 오븐 내에 넣어 두었다.

다음 날, 상기 필터지의 중량을 측정하고, 본 실험에서 사용되는 CLPC의 양(mg)을 계산하였다.

결과

가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력은 CLPC의 g당 결합되고 용출된 인간 IgG의 양으로서 계산되었다. 본 실험의 단계 각각에서 IgG 농도는 하기 표 1에 기재되어 있다.

상이한 분획들 중 IgG 농도
	실험 1
IgG 로딩(mg)	2.00
통과액(mg)	0.410
세척액(mg)	0.093
용출액(mg)	1.131
NaOH 재생액(mg)	0.162
총	1.796

하기 수학식을 이용하여 CLPC의 건조 중량 및 상기 CLPC로부터 용출된 인간 IgG로부터 결합 능력을 계산하였다:

결합 능력(인간 IgG의 mg/CLPC의 g) = 용출된 인간 IgG x 1000/CLPC의 건조 중량

이 데이터는 하기 표 2에 요약되어 있다.

결합 능력 계산
	실험 1
용출된 IgG(mg)	1.131
CLPC의 건조 중량(mg)	0.47
결합 능력(IgG의 mg/CLPC의 g)	2406.38

결론

이 실험들로부터 결합 능력이 가교 결합된 단백질 A 결정의 g당 2406.38 mg의 인간 IgG인 것으로 계산되었다.

실시예 4

목적

본 실험의 목적은 인간 IgG를 사용하여 가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력을 측정하는 것이었다.

장치 및 재료

장치:

테이블 탑 원심분리기: 에펜도르프 원심분리기 5415D

에펜도르프 튜브 1 ㎖

진공 펌프

와트만 필터지 원반: 25 mm 카탈로그 번호 1825025

저울: 메틀러 톨레도 AG285

원추형 플라스크

재료:

가교 결합된 단백질 A 결정: 인하우스 제조됨.

인간 IgG: 아이씨엔 바이오메디칼 인코포레이티드 카탈로그 번호 64145

인산염 완충 식염수(PBS) 정제: 시그마 카탈로그 번호 P-4417

글리신: 플루카 카탈로그 번호 50046

0.1 N NaOH: 아크로스 카탈로그 번호 12419-0010

절차

완충제 제조

인산염 완충 식염수( PBS ):

1개의 정제를 200 ㎖의 증류수에 용해시켜 인산염 완충 식염수를 얻었다.

0.2 M 글리신(pH 2.0):

7.5 g의 글리신을 90 ㎖의 물에 용해시켰다. 1 N HCl로 pH를 2.0으로 조절하였다. DI 물을 사용하여 부피를 100 ㎖로 조절하였다. 이어서, pH를 확인하고 필요한 경우 2.0으로 다시 조절하였다.

실험 절차:

본 실험에서 사용되는 가교 결합된 단백질 A 결정(CLPC)은 10 mM 트리스(pH 7.0)에 존재하였다. 50 ㎕의 CLPC를 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 PBS로 3회 세척하여, 항체 결합을 위해 PBS 중에서 CLPC를 평형화시켰다.

100 ㎕ 부피의 2 mg IgG를 반응 튜브 내의 50 ㎕의 PBS 중 CLPC에 첨가하였다. 상기 튜브의 내용물을 약하게 혼합하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 튜브를 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(통과액)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다.

펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시키고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(세척)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 총 3회 세척을 위해 2회 더 반복하였다.

PBS(100 ㎕ X 3)를 사용한 3회 세척물을 하나의 튜브 내에 모았다(300 ㎕의 총 세척 부피).

펠릿을 83 ㎕의 0.2 M 글리신(pH 2.0)에 재현탁시켰다. 재현탁액을 약하게 혼합하고 10 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 재현탁액을 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액(용출)을 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 2회 더 반복하고, 3회 글리신 용출물을 하나의 튜브 내에 모았다(249 ㎕의 총 용출 부피).

세 번째 용출 후, 펠릿을 250 ㎕의 0.1 N NaOH에 재현탁시켜 0.2 M 글리신(pH 2.0)으로 용출되지 않은 임의의 잔류 단백질을 용출하였다. 재현탁액을 15 분 동안 인큐베이트하고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(NaOH 재생)을 분석을 위해 보관하였다.

통과액, 세척액, 용출액 및 NaOH 재생액의 흡광도를 280 nm에서 판독하였다.

이어서, 본 실험에서 사용되는 단백질 A의 양을 결정하기 위해 CLPC 펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시켜 건조 중량 측정을 수행하였다.

와트만 필터지 원반의 중량을 측정하고, 중량을 기록하였다. 필터지를 진공에 부착된 원추형 플라스크 상에 놓았다.

진공을 가하여 플라스크 내의 액체를 배출하면서 100 ㎕의 PBS 중 CLPC를 상기 필터지 상에 첨가하였다. CLPC를 물로 5회 세척하였다. 필터지를 일정 시간 동안 진공 상에 놓아 상기 필터지가 건조되게 한 후 상기 필터지를 밤새 오븐 내에 놓아 두었다.

다음 날, 상기 필터지의 중량을 측정하고, 본 실험에서 사용되는 CLPC의 양(mg)을 계산하였다.

결과

가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력은 CLPC의 g당 결합되고 용출된 인간 IgG의 양으로서 계산되었다. 실험의 단계 각각에서 IgG 농도는 하기 표 3에 기재되어 있다.

상이한 분획들 중 IgG 농도
	실험 1	실험 2	실험 3
IgG 로딩(mg)	2.00	10.00	10.00
통과액(mg)	1.34	8.80	9.23
세척액(mg)	0.24	0.64	0.42
용출액(mg)	0.32	0.62	0.18
NaOH 재생액(mg)			0.03
총	1.90	10.06	9.83

하기 수학식을 이용하여 CLPC의 건조 중량 및 상기 CLPC로부터 용출된 인간 IgG로부터 결합 능력을 계산하였다:

결합 능력(인간 IgG의 mg/CLPC의 g) = 용출된 인간 IgG x 1000/CLPC의 건조 중량

이 데이터는 하기 표 4에 요약되어 있다.

결합 능력 계산
	실험 1	실험 2	실험 3
용출된 IgG(mg)	0.32	0.62	0.18
CLPC의 건조 중량(mg)	1.55	2.75	0.79
결합 능력(IgG의 mg/CLPC의 g)	206.45	225.4	227.8
평균 결합 능력(IgG의 mg/CLPC의 g)	219.86

결론

이 실험들로부터 평균 결합 능력이 가교 결합된 단백질 A 결정의 g당 219.86 mg의 인간 IgG인 것으로 계산되었다.

실시예 5

목적

본 실험의 목적은 인간 IgG를 사용하여 가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력을 측정하는 것이었다.

장치 및 재료

장치:

테이블 탑 원심분리기: 에펜도르프 원심분리기 5415D

에펜도르프 튜브 1 ㎖

진공 펌프

와트만 필터지 원반: 25 mm 카탈로그 번호 1825025

저울: 메틀러 톨레도 AG285

원추형 플라스크

재료:

가교 결합된 단백질 A 결정: 인하우스 제조됨.

인간 IgG: 아이씨엔 바이오메디칼 인코포레이티드 카탈로그 번호 64145

인산염 완충 식염수(PBS) 정제: 시그마 카탈로그 번호 P-4417

글리신: 플루카 카탈로그 번호 50046

0.1 N NaOH: 아크로스 카탈로그 번호 12419-0010

절차

완충제 제조

인산염 완충 식염수(PBS):

1개의 정제를 200 ㎖의 증류수에 용해시켜 인산염 완충 식염수를 얻었다.

0.2 M 글리신(pH 2.0):

7.5 g의 글리신을 90 ㎖의 물에 용해시켰다. 1 N HCl로 pH를 2.0으로 조절하였다. DI 물을 사용하여 부피를 100 ㎖로 조절하였다. 이어서, pH를 확인하고 필요한 경우 2.0으로 다시 조절하였다.

실험 절차:

본 실험에서 사용되는 가교 결합된 단백질 A 결정(CLPC)은 10 mM 트리스(pH 7.0)에 존재하였다. 50 ㎕의 CLPC를 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 PBS로 3회 세척하여, 항체 결합을 위해 PBS 중에서 CLPC를 평형화시켰다.

100 ㎕ 부피의 2 mg IgG를 반응 튜브 내의 50 ㎕의 PBS 중 CLPC에 첨가하였다. 상기 튜브의 내용물을 약하게 혼합하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 튜브를 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(통과액)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다.

펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시키고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(세척)을 제거하고 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 총 3회 세척을 위해 2회 더 반복하였다.

PBS(100 ㎕ X 3)를 사용한 3회 세척물을 하나의 튜브 내에 모았다(300 ㎕의 총 세척 부피).

펠릿을 83 ㎕의 0.2 M 글리신(pH 2.0)에 재현탁시켰다. 재현탁액을 약하게 혼합하고 10 분 동안 인큐베이트하였다. 상기 재현탁액을 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액(용출)을 분석을 위해 별도로 보관하였다. 이 단계를 2회 더 반복하고, 3회 글리신 용출물을 하나의 튜브 내에 모았다(249 ㎕의 총 용출 부피).

세 번째 용출 후, 펠릿을 250 ㎕의 0.1 N NaOH에 재현탁시켜 0.2 M 글리신(pH 2.0)으로 용출되지 않은 임의의 잔류 단백질을 용출하였다. 재현탁액을 15 분 동안 인큐베이트하고 4500 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상청액(NaOH 재생)을 분석을 위해 보관하였다.

통과액, 세척액, 용출액 및 NaOH 재생액의 흡광도를 280 nm에서 판독하였다.

이어서, 본 실험에서 사용되는 단백질 A의 양을 결정하기 위해 CLPC 펠릿을 100 ㎕의 PBS에 재현탁시켜 건조 중량 측정을 수행하였다.

와트만 필터지 원반의 중량을 측정하고, 중량을 기록하였다. 필터지를 진공에 부착된 원추형 플라스크 상에 놓았다.

진공을 가하여 플라스크 내의 액체를 배출하면서 100 ㎕의 PBS 중 CLPC를 상기 필터지 상에 첨가하였다. CLPC를 물로 5회 세척하였다. 필터지를 일정 시간 동안 진공 상에 놓아 상기 필터지가 건조되게 한 후 상기 필터지를 밤새 오븐 내에 놓아 두었다.

다음 날, 상기 필터지의 중량을 측정하고, 본 실험에서 사용되는 CLPC의 양(mg)을 계산하였다.

결과

가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력은 CLPC의 g당 결합되고 용출된 인간 IgG의 양으로서 계산되었다. 본 실험의 단계 각각에서 IgG 농도는 하기 표 5에 기재되어 있다.

상이한 분획들 중 IgG 농도
	실험 1
IgG 로딩(mg)	2.00
통과액(mg)	1.066
세척액(mg)	0.179
용출액(mg)	0.592
NaOH 재생액(mg)	0.109
총	1.946

하기 수학식을 이용하여 CLPC의 건조 중량 및 상기 CLPC로부터 용출된 인간 IgG로부터 결합 능력을 계산하였다:

결합 능력(인간 IgG의 mg/CLPC의 g) = 용출된 인간 IgG x 1000/CLPC의 건조 중량

이 데이터는 하기 표 6에 요약되어 있다.

결합 능력 계산
	실험 1
용출된 IgG(mg)	0.592
CLPC의 건조 중량(mg)	0.55
결합 능력(IgG의 mg/CLPC의 g)	1076.4

결론

이 실험들로부터 결합 능력이 가교 결합된 단백질 A 결정의 g당 1076.4 mg의 인간 IgG인 것으로 계산되었다.

실시예 6

본 실험은 회분 및 컬럼에서 단백질 A CLPC의 인간 면역글로불린 G(IgG) 결합 능력의 측정을 기술한다.

장치 및 재료

5415C 원심분리기: 에펜도르프 인터내셔날 인코포레이티드

울트라프리(Ultrafree)^®-MC 원심분리 필터 유니트: 듀라포어(Durapore)^® PVDF 0.2 ㎛, 밀리포어

유리 미세섬유 필터: 와트만, 슈레이혀 & 슈엘(Schleicher & Schuell), 카탈로그 번호 1825-025

빈 셉-팩(Empty Sep-Pak)^® 백(Vac) 컬럼: 워터스 코포레이션(Waters Corporation)

pH 전도성 측정기: 덴버 인스트루먼트, 모델 220

8453 UV-가시 분광계: 아질런트 테크놀로지스

단백질 A 가교 결합된 결정: 알투스(Altus)의 독점 기술을 이용하여 제조함

DI(역삼투 & 탈이온화) H₂O

염산 용액, 인증된 1 N: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 SA48-1

수산화나트륨 용액 N/2, 0.5 N: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 SS270-1

수산화나트륨 용액, 인증된 1 N: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 SS266-1

인산염 완충 식염수 정제: 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 P-4417

시트르산 무수물: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 A940-1

글리신: 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 G48-500

트리스(히드록시메틸) 아미노메탄(트리즈마 염기): 시그마-알드리치, 카탈로그 번호 T-4661

절차

용액 제조

인산염 완충 식염수 용액

하기 PBS 용액을 제조하기 위해 시그마-알드리치의 1개의 인산염 완충 식염수(PBS) 정제를 200 ㎖의 DI H₂O에 용해시켰다: 0.01 M 인산염 완충제, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4.

1 M 트리스 - HCl 완충제 ( pH 8.5)

12.11 g의 트리즈마 염기를 80 ㎖의 DI H₂O에 용해시켰다. 1 N HCl 용액으로 pH를 8.5로 조절하고, DI H₂O로 상기 용액을 100 ㎖로 조절하였다.

0.2 M 글리신 완충제(pH 2)

1.5 g의 글리신을 80 ㎖의 DI H₂O에 용해시켰다. 1 N HCl 용액으로 pH를 2로 조절하고, DI H₂O로 용액을 100 ㎖로 조절하였다.

0.1 M 시트르산 완충제(pH 3)

1.9 g의 시트르산 무수물을 80 ㎖의 DI H₂O에 용해시켰다. 1 N NaOH 용액으로 pH를 3으로 조절하고, DI H₂O로 용액을 100 ㎖로 조절하였다.

0.1 N NaOH 용액

100 ㎖의 0.5 N NaOH 용액을 400 ㎖의 DI H₂O로 희석하였다.

단백질 A CLPC의 인간 IgG 결합 능력

컬럼에서의 IgG 결합 능력의 측정

빈 워터스 셉-팩^® 백 컬럼을 단백질 A CLPC로 충전하였다(단백질 A CLPC를 갖는 층 부피는 약 500 ㎕임).

컬럼을 5 ㎖ PBS로 평형화시키고, 아이씨엔 바이오메디칼스의 인간 IgG 2000 mg을 PBS 중 20 mg/㎖의 농도로 로딩하였다.

통과액을 10 ㎖ 분액들로 수집하여, 280 nm에서 분광계로 단백질 농도를 측정하였다.

이어서, 상기 컬럼을 5 ㎖ PBS로 세척하고, 1 ㎖ 분획들을 수집하였다.

인간 IgG를 5 ㎖의 0.2 M 글리신 완충제(pH 2)로 용출하고, 글리신 용출물을 1 ㎖ 분액으로 회수하고 280 nm에서 분광계로 단백질 농도에 대해 분석하였다. 100 ㎕의 1 M 트리스-HCl 완충제(pH 8.5)를 사용하여 각각의 용출된 분획을 생리학적 pH로 조절하였다.

글리신 용출 후, 5 ㎖의 0.1 M 시트르산/NaOH 완충제(pH 3)를 사용하여 컬럼을 재생시켰고, 상기 완충제를 컬럼으로부터의 그의 용출 후에 회수하였다.

마지막으로, 컬럼을 3 ㎖의 0.1 M NaOH 용액으로 세정하였다. 1 ㎖ 분획들을 수집하고, 컬럼을 5 ㎖의 PBS로 세척하였다.

A280 분광계 분석 후, 통과액 분획뿐만 아니라 PBS 세척액 분획 및 NaOH 세척액 분획도 별도로 모았다.

결과

가교 결합된 단백질 A 결정의 결합 능력은 CLPC의 g당 결합되고 용출된 인간 IgG의 양으로서 계산되었다. 본 실험의 단계 각각에서 IgG 농도는 하기 표 7에 기재되어 있다.

상이한 분획들 중 IgG 농도
	실험 1
IgG 로딩(mg)	2000
통과액(mg)	1445.51
세척액(mg)	439.3
용출액(mg)	75.1
NaOH 재생액(mg)	0.0
총	1959.91

하기 수학식을 이용하여 CLPC의 건조 중량 및 상기 CLPC로부터 용출된 인간 IgG로부터 결합 능력을 계산하였다:

결합 능력(인간 IgG의 mg/CLPC의 g) = 용출된 인간 IgG x 1000/CLPC의 건조 중량

이 데이터는 하기 표 8에 요약되어 있다.

결합 능력 계산
	실험 1
용출된 IgG(mg)	75.1
CLPC의 건조 중량(mg)	389.4
결합 능력(IgG의 mg/CLPC의 g)	192.86

결론

이 실험들로부터 결합 능력이 가교 결합된 단백질 A 결정의 g당 192.86 mg의 인간 IgG 또는 단백질 A 컬럼의 ㎖당 150.2 mg의 인간 IgG인 것으로 계산되었다.

본 발명의 다수의 실시양태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 실시양태들도 하기 특허청구범위 내에 있다.

실시예 7

본 실험에서, 단백질 A-CLPC의 결합 능력에 대한 후 처리의 효과가 평가된다. 특정한 종류의 용매 중 폴리우레탄을 사용하여 막 캐스팅 용액을 형성하고, 단백질 A-CLPC를 상기 캐스팅 용액에 첨가하고, 함침된 막 복합 물질을 적합한 매질 중에서 침전시키고, 임의적으로 상기 복합 물질을 사용 전에 건조하여 가공함으로써 단백질 A-CLPC로 함침된 막을 제조한다. 시험 함침된 막 각각에 대한 구체적인 가공 조건, 예컨대, 막 캐스팅 용매의 종류, 예를 들면, DMF, 단백질 A-CLPC의 양, 침전 배쓰(bath) 매질(50/50 IPA/물) 및 후 처리 조건(결코 건조되지 않는 습윤 상태)을 확인하고 시험한다. 시험 함침된 막 각각에 대한 단백질 A-CLPC 결합 능력을 시험한다.

실시예 8

본 실험에서, 2개의 시험 함침된 막 군, 즉 군 A 및 B가 제조된다. 군 A 막(예를 들면, A1-A2)은 NMP 용매 중 폴리우레탄으로부터 제조된다. 군 B 막(예를 들면, B1-B2)은 DMF 용매 중 폴리우레탄으로부터 제조된다. 함침된 막의 직경은 약 1 인치이다. 시험 함침된 막 각각에 대한 구체적인 가공 조건, 예컨대, 막 캐스팅 용매의 종류, 예를 들면, DMF 또는 NMP, 단백질 A-CLPC의 양, 침전 배쓰 매질(50/50 IPA/물 또는 물 단독) 및 후 처리 조건(결코 건조되지 않는 습윤 상태 또는 40% 글리세롤로 건조된 상태), 감마 방사선에의 노출(15 내지 40 kGy)을 확인하고 시험한다. 일단 군 각각의 막이 형성되면 상기 군 각각의 막을 일정 투여량의 감마 방사선에 노출시킨다. 군 각각의 다른 막은 감마 방사선에 노출시키지 않고 대조군으로서 사용된다. 이어서, 막 각각의 항체 결합 능력을 항체 시험 용액으로 시험한다. 결과는 단백질 A-CLPC의 결합 능력의 보유, 및 유기 용매 및 감마 방사선 노출에 대한 단백질 A-CLPC의 안정성을 제공할 것이다.

서열:

스타필로코커스 아우레우스의 cDNA 서열은 이하에 기재되어 있다(진뱅크 수탁 번호: X61307)(서열 번호 1):

스타필로코커스 아우레우스 서열로부터 번역된 단백질 A 단백질은 이하에 기재된다(진뱅크 수탁 번호: CAA43604)(서열 번호 2):

SEQUENCE LISTING <110> Shenoy, Bhami Baladi, Sibyl Patel, Reena McGrath, Margaret Khalaf, Nazer Randhawa, Chanchal <120> PROTEIN A CRYSTALS AND CROSS-LINKED CRYSTALS AND METHODS <130> ALTH-024/01WO <140> PCT/US10/48664 <141> 2010-09-13 <150> US 61/242,537 <151> 2009-09-15 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1365 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 atgatgactt tacaaataca tacagggggt attaatttga aaaagaaaaa catttattca 60 attcgtaaac taggtgtagg tattgcatct gtaactttag gtacattact tatatctggt 120 ggcgtaacac ctgctgcaaa tgctgcgcaa cacgatgaag ctcaacaaaa tgctttttat 180 caagtgttaa atatgcctaa cttaaacgct gatcaacgta atggttttat ccaaagcctt 240 aaagatgatc caagccaaag tgctaacgtt ttaggtgaag ctcaaaaact taatgactct 300 caagctccaa aagctgatgc gcaacaaaat aagttcaaca aagatcaaca aagcgccttc 360 tatgaaatct tgaacatgcc taacttaaac gaagagcaac gcaatggttt cattcaaagt 420 cttaaagacg atccaagcca aagcactaac gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa 480 tctcaagcac cgaaagctga caacaatttc aacaaagaac aacaaaatgc tttctatgaa 540 atcttgaaca tgcctaactt gaacgaagaa caacgcaatg gtttcatcca aagcttaaaa 600 gatgacccaa gtcaaagtgc taacctttta gcagaagcta aaaagctaaa tgatgcacaa 660 gcaccaaaag ctgacaacaa attcaacaaa gaacaacaaa atgctttcta tgaaatttta 720 catttaccta acttaactga agaacaacgt aacggcttca tccaaagcct taaagacgat 780 ccttcagtga gcaaagaaat tttagcagaa gctaaaaagc taaacgatgc tcaagcacca 840 aaagaggaag acaacaacaa gcctggcaaa gaagacaaca acaagcctgg taaagaagac 900 ggcaacaaac ctggtaaaga agacaacaaa aaacctggca aagaagacgg caacaaacct 960 ggtaaagaag acaacaaaaa acctggtaaa gaagatggca acaaacctgg taaagaagac 1020 ggcaacaagc ctggtaaaga agatggcaac aagcctggta aagaagacgg caacggagta 1080 catgtcgtta aacctggtga tacagtaaat gacattgcaa aagcaaacgg cactactgct 1140 gacaaaattg ctgtagataa caaattagct gataaaaaca tgatcaaacc tggtcaagaa 1200 cttgttgttg ataagaagca accagcaaac catgcagatg ctaacaaagc tcaagcatta 1260 ccagaaactg gtgaagaaaa tccattcatc ggtacaactg tatttggtgg attatcatta 1320 gcgttaggtg cagcgttatt agctggacgt cgtcgcgaac tataa 1365 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Met Met Thr Leu Gln Ile His Thr Gly Gly Ile Asn Leu Lys Lys Lys 1 5 10 15 Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile Ala Ser Val Thr 20 25 30 Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro Ala Ala Asn Ala 35 40 45 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 50 55 60 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 65 70 75 80 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 85 90 95 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe 100 105 110 Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn 115 120 125 Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 130 135 140 Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu 145 150 155 160 Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 165 170 175 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg 180 185 190 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala 210 215 220 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 225 230 235 240 His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser 245 250 255 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys 260 265 270 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro 275 280 285 Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 290 295 300 Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 305 310 315 320 Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 325 330 335 Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro 340 345 350 Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr 355 360 365 Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala 370 375 380 Val Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu 385 390 395 400 Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys 405 410 415 Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr 420 425 430 Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala 435 440 445 Gly Arg Arg Arg Glu Leu 450

Claims (42)

1. 단백질 A의 가교 결합된 결정형을 포함하는, 면역글로불린의 정제에 유용한 조성물로서, 상기 단백질 A의 가교 결합된 결정형은 상응하는 양의 단백질 A의 고정화된 형태보다 더 큰 결합 능력을 갖는 것인 조성물.
2. 삭제
3. 제1항의 조성물을 이용하여 면역글로불린을 접촉시키는 단계를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 항체인 정제 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 치료 항체인 정제 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 정제 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 Fab 단편인 정제 방법.
8. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 Fc 단편인 정제 방법.
9. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 단일쇄 항체인 정제 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 키메라 항체인 정제 방법.
11. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 완전 인간 항체인 정제 방법.
12. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 인간화 항체인 정제 방법.
13. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 클래스 IgG에 속하는 것인 정제 방법.
14. 제1항에 있어서, 글루타르알데히드에 의해 가교 결합되는 것인 조성물.
15. 제1항의 조성물을 포함하는 키트.
16. 제15항에 있어서, 단백질 A의 가교 결합된 결정형의 사용을 설명하는 서면 설명서를 포함하는 것인 키트.
17. 제1항의 조성물을 포함하는 컬럼.
18. 제1항에 있어서, 상기 결정형이 단백질 A의 고정화된 형태보다 더 높은 활성을 갖는 것인 조성물.
19. 제1항에 있어서, 상기 결정형이 pH 2 내지 pH 12에서 활성이 있고 안정한 것인 조성물.
20. 제1항에 있어서, 상기 결정형이 고정화된 단백질 A와 비교할 때 0.0%의 단백질 침출(leaching)을 나타내는 것인 조성물.
21. 제1항에 있어서, 사전 충전 컬럼(pre-packed column)에서 컬럼 재료로서 사용되는 것인 조성물.
22. 제1항에 있어서, 막 내에 함침되는 것인 조성물.
23. 제1항에 있어서, 체외 장치에 사용되는 것인 조성물.
24. (a) 면역글로불린을 함유하는 매질을, pH 7.0 내지 pH 10의 범위 내의 pH를 가지고 양이온과 음이온의 조합을 함유하는 완충제 용액과 혼합하여, 완충된 면역글로불린 매질을 제공하는 단계;
    (b) 상기 완충된 면역글로불린 매질을 단백질 A의 가교 결합된 결정형을 포함하는 흡착제와 접촉시켜, 상기 완충된 면역글로불린 매질 중에 존재하는 면역글로불린을 흡착시키는 단계;
    (c) 흡착된 면역글로불린을 갖는 흡착제를 상기 완충제 용액으로 세척하는 단계;
    (d) 흡착된 면역글로불린을 갖는 흡착제를, pH 2 내지 pH 6의 범위 내의 pH를 갖는 완충제 용액과 접촉시켜, 흡착된 면역글로불린을 흡착제로부터 제거하는 단계; 및
    (e) 제거된 면역글로불린을 실질적으로 순수한 형태로 회수하는 단계
    를 포함하는, 면역글로불린의 정제 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 완충된 면역글로불린 매질과 상기 흡착제의 접촉이 상기 흡착제의 컬럼 내에서 이루어지는 것인 정제 방법.
26. 제24항에 있어서, 면역글로불린을 함유하는 상기 매질이 정상 포유동물 혈청인 정제 방법.
27. 제24항에 있어서, 면역글로불린을 함유하는 상기 매질이 면역 포유동물 혈청인 정제 방법.
28. 제24항에 있어서, 상기 매질이 포유동물 혈장인 정제 방법.
29. 제24항에 있어서, 상기 매질이 포유동물 복수액인 정제 방법.
30. 제24항에 있어서, 상기 매질이 하이브리도마로부터 얻은 것인 정제 방법.
31. 제24항에 있어서, 상기 매질이 조직 배양액인 정제 방법.
32. 제24항에 있어서, 상기 매질이 세포 배양액인 정제 방법.
33. 제24항에 있어서, 상기 매질이 포유동물 세포 배양액인 정제 방법.
34. 제24항에 있어서, 상기 매질이 박테리아 세포 배양액인 정제 방법.
35. 제24항에 있어서, 상기 매질이 트랜스제닉 공급원 액(transgenic source fluid)인 정제 방법.
36. 제24항에 있어서, 상기 매질이 면역글로불린을 함유하는 식물 추출물인 정제 방법.
37. 제24항에 있어서, 상기 매질이 효모 배양액인 정제 방법.
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 정제하고자 하는 면역글로불린을 제1항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 면역글로불린의 정제 방법.

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