KR101497935B1 - 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 루테올린은 간 및 지방 조직에서 결합 조직의 축적을 억제하고 대식세포의 침윤을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있어, 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating fibrosis comprising luteolin}
본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
조직은 세포 외 매트릭스에 결합되어 있고, 혈관 네트워크에 의해 둘러싸여 있는 잘 정돈된 세포 군집을 포함한다. 섬유화 또는 섬유증(Fibrosis)은 다양한 조직의 구조 및 기능을 변화시키는 손상(injury) 또는 염증에 따른 콜라겐 매트릭스의 비정상적인 축적이다. 섬유증의 발생 위치에 무관하게, 섬유증의 대부분의 병인학은 정상 조직을 대체하는 콜라겐 매트릭스의 과도한 축적을 포함한다. 신장, 간, 지방, 폐, 심장, 뼈 또는 골수, 그리고 피부에서의 진행성 섬유화는 사망 또는 고통의 주요한 요인이다(Border, et al., New Engl. J. Med. 331:1286(1994)).
고지방 식이 등에 의해 염증유발 케모카인 및 사이토카인이 분비될 경우, 지방 조직에서는 교원질 (collagen)과 같은 과도한 세포외 기질 (extracellular matrix)의 합성이 유도되어 지방세포 사이에 섬유성 물질 (fibrotic material)의 축적을 야기할 뿐만 아니라, 간 조직의 간성상세포를 활성화시켜 지방조직과 마찬가지로 세포 외 기질이 생성된다. 이때 생성된 세포외 기질은 디세강 (space of Disse) 주위로 흘러들어가 침착되면서 간섬유증을 유발하며, 이 과정이 지속되면 간경변증으로 진행된다 (Henegar, 2008; Mutch, 2009; Bataller, 2005). 또한 지방세포는 대식세포의 동원과 침윤에 의해 세포 외 기질의 합성과 분비를 증가시키며, 이로인해 섬유증이 가속화된다 (Keophiphath, 2009). MMPs(matrix metalloproteinases)는 세포 외 기질의 리모델링을 가능하게 하여 세포 외 기질 발현을 조절하며, MMPs와 함께 lumican (Lum)은 상피세포의 간질세포로의 변이(epithelial-mesenchymal transition)를 유도하여 섬유화 상태를 악화시킨다 (Rada, 1993). 사이토카인 중 TGF-β(transforming growth factor-beta)는 조직의 보수에 중요한 역할을 수행하는 다기능 인자의 일종으로, 대식세포와 같은 침윤세포에 의해서 생산되거나 분비되며, 거의 모든 조직에서 발견된다. 일반적으로 TGF-β의 분비와 활성 증가는 다양한 세포 외 기질 단백질의 생성을 자극하고, 분해를 저해함으로써 조직 섬유증을 촉진한다 (Bonewald, 1999; Border, 1994; Moses, 1990).
한편, 플라보노이드는 식물계에 널리 분포되어 있는 폴리페놀계 화합물로서 약 4000여 종류가 있으며, 산소 고리 주위의 구조적 특징에 따라 안토잔틴(anthoxantin), 안토시아닌 (anthocyanin), 탄닌 (tannin)으로 분류된다. 그 중 플라보노이드를 대표하는 안토잔틴은 플라본(flavones), 플라보놀(flavonols), 플라바논 (flavanones), 플라바노놀 (flavanonols), 이소플라보노이드 (isoflavonoids)의 5종류로 구분된다 (pratt, 1990, Figure 16). 플라보노이드는 식물성 성분으로 다양한 구조적 특성을 가지고 있으며, 페닐기 2개가 C3 사슬을 매개하여 결합한 C6-C3-C6형 탄소골격구조로 되어있다. 플라보노이드는 벤젠 고리에 있는 카보닐기와 -OH기에 의하여 항산화 활성을 갖으며, -OH기의 위치 및 정도에 따라 항산화능은 다르게 나타난다 (Ratty, 1988).
특히, 루테올린(2-(3,4-Dihydroxyphenyl)- 5,7-dihydroxy-4-chromenone)은 플라본에 속하며 타임, 로즈마리, 세이지 같은 허브나, 고추, 파슬리, 샐러리 등과 같은 녹황색 채소류에 많이 분포되어 있다. 루테올린은 항산화, 항알러지, 항암 등의 효능을 나타낸다고 보고되었다. 그러나, 현재까지 루테올린의 섬유증 치료 효과에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 새로운 섬유증 치료 약물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 루테올린이 간 및 지방 조직에서 결합 조직의 축적을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 루테올린은 간 및 지방 조직에서 결합 조직의 축적을 억제하고 대식세포의 침윤을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있어, 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 루테올린이 실험 기간 동안 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 도이다 (섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.).
도 2는 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 간 조직을 나타낸 도이다.
도 3은 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 지방 조직을 나타낸 도이다.
도 4는 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 간 조직에서의 섬유화 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 지방 조직에서의 섬유화 정도를 나타낸 도이다.
도 6은 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 지방 조직 및 간 조직에서 MCP-1의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 7은 정상군, 섬유증 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 지방 조직 및 간 조직에서 CD68의 발현 정도를 나타낸 도이다.
본 발명은 루테올린을 유효성분으로 포함하는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 루테올린 (2-(3,4-Dihydroxyphenyl)- 5,7-dihydroxy-4-chromenone)은 하기 화학식 1의 화학적 구조를 갖는 물질이다.
Figure 112013034385214-pat00001
본 발명의 루테올린은 시판되는 것 또는 천연물로부터 분리한 것 등을 제한 없이 이용할 수 있다. 상기 루테올린은 이에 제한되지 않으나, 타임, 로즈마리, 세이지 같은 허브나, 고추, 파슬리, 샐러리 등과 같은 녹황색 채소류로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 루테올린은 간 및 지방 조직에서 결합 조직의 축적을 억제하고 대식세포의 침윤을 억제하며, MMPs(matrix metalloproteinases), Cd44 (CD antigen 44), Lum(lumican), TGF-β(transforming growth factor-β) 및 카텝신(cathepsin) 등의 발현을 억제하는 우수한 효과를 가지고 있어, 섬유증의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 섬유증 (fibrosis)은 세포 외 기질의 비정상적 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 간 섬유증, 지방 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 심장 섬유증, 관절 섬유증, 신경 섬유증, 근 섬유증, 복막 섬유증 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 투여는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물 내 루테올린의 일일 투여량은 1일 1 mg 내지 5000 mg/kg (BW)이며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 루테올린과 함께 섬유증의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 섬유증의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 섬유증의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품, 음료 등에 첨가될 수 있다.
본 발명에서 건강기능식품이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.
본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물을 음료에 이용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 루테올린의 수득
루테올린은 Sigma Chemical Co. 사 (Product No. L9283)에서 가루분말 형태의 제품을 구매하였다.
실험예 1. 섬유증 동물 모델 디자인
4주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였으며, 1주일간의 적응 기간을 거친 후, 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 정상식이를 급여한 군 (정상군; n=10)군, 고지방식이 (20% fat, 1% cholesterol)를 보충한 군 (섬유증 유도군; n=13)군 및 HFD에 상기 실시예 1의 루테올린을 투여한 군 (실험군; 0.005%, n=13)으로 나누어 총 16주간 실험하였다. 고지방 식이는 지방 세포 사이 및 간 문맥을 중심으로 세포, 섬유질, 세포 외 기질과 체액으로 구성된 결합 조직 (connective tissue)의 축적을 유도함으로써 섬유화를 야기하는 것으로 알려져있다. 동물 사육실의 환경은 항온 (25 ± 2℃), 항습 (50 ± 5%) 그리고 6시부터 18시까지의 암/명 사이클로 일정한 조건을 유지하였고, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고 (ad libitum), 식이는 4℃에서 냉장 보관하였다. 체중은 1주일 간격으로 측정하였다. 실험 종료 후, 12시간 절식한 후 에테르 흡입을 통해 가벼운 1차 마취를 시켰고 케타민을 근육 주사하여 2차 마취를 시킨 후, 복부 하대 정맥 (inferior vena cava)으로부터 공복 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 헤파린으로 처리한 후, 1,000×g, 4℃에서 15 분간 원심 분리한 후 혈장을 수집하였고 시료 분석 시까지 -70℃에서 보관하였다. 실험동물의 간 및 지방 조직을 분리한 후, PBS (phosphate buffered saline) 용액에 수 차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였고, 액체질소에 급냉시켜 시료 분석 시까지 -70℃에서 보관하였다. 또한 간 및 지방 조직 일부는 현미경 분석을 위해 10 % 포름알데히드 용액에 고정시켰다.
실험예 2. 체중 변화 분석
실험 기간 동안 마우스의 평균 체중 변화를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 전체 실험기간 동안 섬유증 유도군의 체중은 정상군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 실험식이 급여 12주 째부터 섬유증 유도군에 비해 체중이 낮게 나타났다.
실험예 3. 간 독성 분석
간세포 손상과 밀접한 관련이 있는 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)와 GPT(glutamic pyruvic transaminase) 활성도를 Reitman 등의 비색 분석법에 준한 효소법을 응용하여 분광 광도계로 분석하였다. 혈청 GOT의 경우 L-아스파테이트(aspartate)와 α-케토글루타레이트(ketoglutarate), GPT의 경우 D,L-알리닌(alanine)과 α-케토글루타레이트(ketoglutarate)를 첨가하면 혈장의 효소에 의해 기질이 피루베이트(pyruvate)로 전환되며, 이 피루베이트를 2,4-디니트로페닐하이드라진 (dinitrophenylhydrazine)과 반응시켜 0.4 N NaOH를 가하면 비색반응으로 발색이 일어나고 이를 490-530 nm에서 흡광도를 측정하여 피루브산 리튬 (pyruvic acid lithium)의 표준곡선과 비교하여 활성도를 측정하였다. 보다 구체적으로, GOT 또는 GPT용 기질액을 1 mL씩 취해 37℃에서 5 분간 방치한 다음, 혈장 200 μL를 넣어 GOT는 37℃에서 60 분, GPT는 37℃에서 30 분간 반응시키고, 디니트로페닐하이드라진 발색 용액을 1 mL씩 가하여 실온에 다시 20분간 반응시켰다. 0.4 N NaOH 용액 10 mL와 혼합하여 10 분간 반응시킨 다음 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 혈청 아미노기 전이효소 (transaminase) 측정용 시약 (Asan kit, Korea) 중 검량선용 시약을 사용하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
GOT GPT
Karman/mL
정상군 56.97 ± 5.79 17.93 ± 1.92
섬유증 유도군 169.30 ± 9.32*** 191.04 ± 11.44***
실험군 121.00 ± 8.54&& 141.48 ± 6.08&&&
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
표 1에 나타낸 바와 같이, 혈장 GOT 및 GPT 활성도는 섬유증 유도군이 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 섬유증 유도군에 비해 혈장 GOT 및 GPT 활성도가 유의적으로 감소되어, 간 독성이 개선된 것을 확인하였다
실험예 4. 간 조직 및 지방 조직의 형태학적 분석
조직의 형태학적 관찰을 위해, 간 조직 및 지방 조직을 10% 포름알데히드 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올로 탈수하여 파라핀에 포매하였다. 이후, 폴리-L-라이신(lysine)으로 처리된 5 μm 두께의 조직절편을 제작한 다음, 공지된 방법에 따라 H&E (hematoxylin-eosin) 염색한 후, 광학현미경으로 200 배율에서 관찰하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 간 조직을 관찰한 결과, 섬유증 유도군은 간 조직의 간문맥 (portal vein)을 중심으로 가장 많은 지방구 (lipid droplet) 축적을 보였으며, 지방구의 크기가 큰 것으로 나타났고, 루테올린을 섭취한 실험군은 섬유증 유도군에 비해 지방구 크기와 수가 감소된 것으로 나타났다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 지방 조직을 관찰한 결과, 정상군에 비해 섬유증 유도군의 지방세포 크기가 큰 것으로 관찰되었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 섬유증 유도군에 비해 지방세포의 크기가 작은 것으로 관찰되었다.
실험예 5. 간 조직 및 지방 조직의 섬유화 분석
실험예 4와 동일한 샘플을 이용하여, 공지된 방법에 따라 콜라겐과 근섬유를 염색하는 Masson‘s Trichrome 염색을 수행한 후, 광학현미경으로 400배 배율에서 관찰하였다. Masson's trichrome 염색법에서 결합조직 (connective tissue, CT)은 파란색, 핵은 검붉은색, 세포질은 분홍빛으로 염색된다. 파란색으로 염색되는 CT는 세포, 섬유질 (fibers), 세포 외 기질 (extracellular matrix)과 체액으로 구성되며 섬유화의 지표로 사용된다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 섬유증 유도군은 간 조직의 CT가 간문맥 주변으로 많이 축적되어 있었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 이러한 섬유화 정도가 크게 억제되어 있음을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 섬유증 유도군은 지방 세포 사이에 CT가 많이 축적되어 있었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 이러한 섬유화 정도가 크게 억제되어 있음을 확인하였다.
실험예 6. 간 조직 및 지방 조직의 대식세포 침윤 분석
실험예 4에서 제조한 5 μm 두께의 조직절편을 크실렌과 알코올에 처리하여 파라핀을 제거하고, 증류수로 함수시킨 후, 3% 과산화수소에 10분간 처리해 내인성 퍼옥시다아제 활성을 억제시켰다. 그 후 0.1M TBS(Tris buffered saline, pH 7.6)으로 10분간 3회 세척하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위하여 단백질 차단제 (protein blocking agent, Lipshow Co, USA)에 20분간 작용시킨 다음 여분의 용액을 제거한 후 rabbit antihuman MCP-1 및 Cd68 다클론 항체를 증류수에 1:50으로 희석하여, 항온기에서 각각의 조직에 1시간 동안 반응시킨 후 TBS로 수세하였다. 그 후 바이오틴이 부착된 이차 항체를 가한 후 실온에서 20분간 반응시킨 다음 TBS로 수세하고 알칼리성 인산가수분해효소 (alkaline phosphatase)가 결합된 스트렙타아비딘을 가한 후 실온에서 20분간 반응시켰다. TBS 완충액에 5분간 3회 수세한 후 New fuchsin (DAKO co.)으로 발색시킨 후, 광학 현미경으로 400배 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 섬유증 유도군은 지방 조직 및 간 조직에서 대식세포 침윤 정도를 나타내는 지표인 MCP-1이 지방 세포 사이 및 간문맥 주변에서 높게 발현되었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 이러한 MCP-1의 발현이 현저하게 억제되어 있음을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 섬유증 유도군은 지방 조직 및 간 조직에서 대식세포 침윤 정도를 나타내는 지표인 CD68이 지방 세포 사이 및 간문맥 주변에서 높게 발현되었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 이러한 CD68의 발현이 현저하게 억제되어 있음을 확인하였다.
실험예 7. 간 조직 및 지방 조직의 섬유화 관련 전사체 발현 분석
루테올린이 간 조직 및 지방 조직에서 섬유화 관련 전사체 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, ECM(extracellular matrix)과 관련된 전사체 및 카텝신(cathepsin) 전사체 발현을 분석하였다. 그 결과를 표 2 내지 표 7에 나타내었다.
간 정상군 섬유증 유도군 실험군
Col1a1 1.00 ± 0.03 2.85 ± 0.59* 2.85 ± 0.35
Col4a1 1.00 ± 0.02 1.67 ± 0.13** 1.43 ± 0.11
Col4a2 1.01 ± 0.09 1.71 ± 0.08** 1.43 ± 0.09
Col5a1 1.00 ± 0.00 1.68 ± 0.21* 1.73 ± 0.11
Col6a3 1.00 ± 0.03 2.10 ± 0.26* 2.42 ± 0.34
Col12a1 1.00 ± 0.03 1.30 ± 0.01*** 1.14 ± 0.06&
Col14a1 1.00 ± 0.06 1.64 ± 0.19* 1.38 ± 0.09
Col16a1 1.00 ± 0.03 1.46 ± 0.05*** 1.50 ± 0.06
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
지방 정상군 섬유증 유도군 실험군
Col1a1 1.01 ± 0.08 2.03 ± 0.14** 1.26 ± 0.02&&
Col1a2 1.00 ± 0.03 1.40 ± 0.05** 0.97 ± 0.04&&
Col3a1 1.01 ± 0.09 2.64 ± 0.10*** 1.55 ± 0.05&&&
Col4a1 1.00 ± 0.05 1.34 ± 0.06* 1.07 ± 0.05&
Col4a2 1.00 ± 0.05 1.69 ± 0.08** 1.40 ± 0.03&
Col4a5 1.01 ± 0.11 1.27 ± 0.03 0.85 ± 0.01&&&
Col5a1 1.00 ± 0.06 1.32 ± 0.02** 1.25 ± 0.01&
Col5a2 1.00 ± 0.05 1.46 ± 0.10* 1.08 ± 0.05&
Col6a1 1.00 ± 0.06 1.68 ± 0.06*** 1.34 ± 0.03&&
Col6a2 1.01 ± 0.12 1.95 ± 0.09** 1.62 ± 0.05&
Col6a3 1.00 ± 0.07 1.74 ± 0.11** 1.19 ± 0.02&&
Col8a1 1.00 ± 0.05 1.42 ± 0.07** 1.00 ± 0.01&&
Col12a1 1.00 ± 0.06 3.27 ± 0.04*** 2.13 ± 0.05&&&
Col16a1 1.02 ± 0.14 2.31 ± 0.04*** 2.47 ± 0.10
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 섬유화를 야기하는 ECM에서 가장 풍부하게 존재하는 성분인 콜라겐과 관련된 전사체의 발현을 분석한 결과, 루테올린을 섭취한 실험군은 섬유증 유도군에 비해 간 조직에서 Col12a1의 발현이 감소되었으며, 지방 조직에서 Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a1, Col4a2, Col4a5, Col5a1, Col5a2, Col6a1, Col6a2, Col6a3, Col8a1, Col12a1의 발현이 감소되었다.
간 정상군 섬유증 유도군 실험군
Cd44 1.01 ± 0.08 1.55 ± 0.10* 1.57 ± 0.12
Mmp13 1.00 ± 0.06 3.39 ± 0.45** 3.70 ± 0.26
Mmp23 1.00 ± 0.03 1.35 ± 0.05** 1.41 ± 0.10
Tgfbi 1.00 ± 0.05 1.51 ± 0.08** 1.19 ± 0.04&
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
지방 정상군 섬유증 유도군 실험군
Cd44 1.00 ± 0.01 3.42 ± 0.23*** 1.67 ± 0.06&&
Lum 1.02 ± 0.14 2.21 ± 0.10** 0.93 ± 0.02&&&
Mmp2 1.02 ± 0.14 1.86 ± 0.10** 1.11 ± 0.02&&
Mmp3 1.00 ± 0.01 1.62 ± 0.05*** 0.93 ± 0.06&&&
Mmp9 1.01 ± 0.11 0.61 ± 0.01* 0.62 ± 0.02
Mmp12 1.01 ± 0.08 15.14 ± 1.43*** 9.85 ± 0.73&
Mmp13 1.01 ± 0.09 2.03 ± 0.19** 1.44 ± 0.11
Mmp23 1.00 ± 0.05 1.19 ± 0.03* 0.98 ± 0.02&&
Tgfb1 1.00 ± 0.02 1.49 ± 0.02*** 1.19 ± 0.02&&&
Tgfbi 1.00 ± 0.01 1.20 ± 0.04* 0.76 ± 0.00&&&
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 염증 유도성 사이토카인 및 케모카인과 함께 ECM의 발현을 조절하는 인자인 Cd44 (CD antigen 44), Lum(lumican), MMPs(matrix metalloproteinases) 및 TGFβ(transforming growth factor β) 유전자의 발현을 분석한 결과, 루테올린을 섭취한 실험군은 섬유증 유도군에 비해 간 조직에서 Tgfbi의 발현이 감소되고, 지방 조직에서 Cd44, Lum, Mmp2, Mmp3, Mmp12, Mmp23, Tgfb1, Tgfbi 유전자의 발현이 감소되었다.
간 정상군 섬유증 유도군 실험군
Ctse 1.00 ± 0.02 1.70 ± 0.10** 1.37 ± 0.06
Ctsk 1.00 ± 0.03 1.28 ± 0.07* 1.40 ± 0.04
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.)
지방 정상군 섬유증 유도군 실험군
Ctsa 1.01 ± 0.09 2.40 ± 0.12*** 1.60 ± 0.02&&
Ctsd 1.00 ± 0.03 1.43 ± 0.01*** 1.40 ± 0.04
Ctsh 1.00 ± 0.02 0.63 ± 0.02*** 0.92 ± 0.03&&&
Ctsk 1.01 ± 0.07 4.60 ± 0.32*** 2.58 ± 0.09&&
Ctsl 1.00 ± 0.02 1.82 ± 0.10*** 1.23 ± 0.05&&
Ctss 1.01 ± 0.11 3.74 ± 0.15*** 2.63 ± 0.12&&
(섬유증 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
섬유증 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, &p<0.05, &&p<0.01, &&&p<0.001.)
표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, ECM의 리모델링에 관여하는 단백질 가수분해성 리소좀 효소 (lysosome)인 카텝신의 전사체 발현을 분석한 결과, 루테올린을 섭취한 실험군은 간 조직 및 지방 조직에서 정상군과 비슷한 수준으로 카텝신 발현이 조절되었다.
이상의 실험 결과를 통하여, 루테올린은 간 및 지방 조직에서 결합 조직의 축적을 억제하고, 대식세포의 침윤을 억제하며, ECM(extracellular matrix)과 관련된 전사체 및 카텝신(cathepsin) 전사체의 발현을 억제함으로써, 우수한 섬유증 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
이하 본 발명의 상기 조성물을 함유하는 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제제
1-1. 산제의 제조
루테올린 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
루테올린 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
루테올린 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
루테올린 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
루테올린 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 식품 조성물의 제제
2-1. 건강식품의 제조
루테올린 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2-2. 건강음료의 제조
루테올린 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (5)

  1. 루테올린을 유효성분으로 포함하는 지방 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 루테올린은 MMPs(matrix metalloproteinases), Cd44 (CD antigen 44), Lum(lumican), TGF-β(transforming growth factor-β) 및 카텝신(cathepsin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 지방 섬유증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 루테올린을 유효성분으로 포함하는 지방 섬유증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. 삭제
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