KR101493336B1 - 생물학적 샘플의 분석을 위한 장치 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포생물학 및 이식 의학의 기술적 영역에 관련된다. 본 발명은 또한 생물학적 샘플의 신속하고 비-침습적인 분석 또는 제어, 특히 멸균 제어, 생물학적 샘플에 포함된 감염성 입자 및 미생물의 특성화, 그리고 조직 세포와 이식물의 특성화를 위한 장치 및 방법과 관련된다. 본 발명의 주요 적용 분야는 약물학적 활성 물질 및 치료제의 생물공학적 생산, 그리고 이식 의학이다.
생물학적 샘플, 분석, 제어, 특성화, 장치, 방법
Description
본 발명은 세포 생물학 및 이식 의학의 기술 분야에 관련된다. 본 발명은 생물학적 샘플의 신속하고 비-침습적인 분석 또는 제어, 특히 멸균 제어, 생물학적 샘플에 포함된 감염성 입자 및 미생물의 특성화, 그리고 조직 세포와 이식물의 특성화를 위한 장치 및 방법과 관련된다. 본 발명의 주요 적용 분야는 약물학적 활성 물질 및 치료제의 생물공학적 생산, 그리고 이식 의학이다.
본 발명의 제 1 양상은 특히 이식 의학에서의 오염과 품질 관리와 관련된다. 기관-유사 조직 배양, 예를 들어 피부 또는 연골 이식에 의한 기관 장애의 치료에서, 생물학적 이식물의 병균 제거는 이식을 위한 발매시 법적으로 규정된 조건이다. 공지의 검출 방법에서 세균 및 진균과 같은 오염 미생물의 검출은 시간 지연이 있어야만 가능하다. 따라서, 생물학적 이식물의 멸균 및 오염 점검은 알려진 액체 샘플의 접촉 및 도말에 이어지는 배양 검사를 통해서 실시된다. 때때로 느리게 성장하는 병균이기도 한 오염 미생물의 특성화와 분석 결과가 환자의 이식을 위한 생물학적 이식물의 발매 이후 약 2 주가 지나서만 가능하다는 것이 단점이다. 그 이후에야 검출된 오염에 대한 해당 치료 단계, 예를 들어 특이적 항생물질 치료가 개 시될 수 있다. 따라서 생물학적 이식물의 오염이 단시간 내에 감도 높고 선택적으로 검출될 수 있고 존재하는 오염된 미생물을 특성화하고 필요에 따라 확인하는 수단 및 방법이 요망된다.
생물학적 이식물, 조직 준비 또는 이식물의 품질 관리를 위해서는, 적용 전 뿐 아니라 이식물의 배양 중에도 이식물의 배양 조직 세포, 예를 들어 인간 연골 세포를 특성화할 수 있을 것이 요망된다. 다음에 세포의 분화 및/또는 생존력의 정도를 우선적으로 측정하여야 한다. 이것은 (자가) 인간 세포로부터의 이식에서 특히 중요한데, 이들 세포는 배양 중에 탈분화 할 수 있기 때문으로, 이 경우 치료에 필요한 조직-특이적 특성을 잃게 된다. 이 경우 이식물의 품질은 감소된다. 또한 탈분화된 세포는 종종 증가된 증식률을 나타내는 경향을 갖는데, 이 때문에 이들은 잠재적 암세포로서 간주된다. 이에 따라 조직 세포 및 조직 세포의 세포외 매트릭스의 특성화 및 유형화를 위한, 따라서 생물학적 이식물의 품질 제어를 위한 수단 및 방법이 요망된다.
현재 생물학적 이식물의 품질 관리는 법적으로 일관되게 제어되지 않고 있는데, 다양한 조직 세포 타입에 대하여 표준으로서 동등하게 적용할 수 있는 공지의 방법이 없기 때문이다. 그 품질이 주로 채용된 항체의 특이성에 의존하고 정상화 또는 표준화할 수 없는 면역 세포학적 방법이 사용된다고 알려져 있다. 생물학적 재료의 특성화를 위한 공지의 방법은 검사하는 세포의 재사용이 불가능한 "침습적" 방법이다. 예를 들어, 공지의 유동세포분석법에서 세포는 어떤 표면 분자의 발현에 의해 특성화된다(CD 항원 시험). 현재, 이러한 절차적 결함으로 인해 배양된 조직 의 일부만이 이식을 위한 생물학적 이식물로서 제시될 수 있다. 다른 부분은 세포의 침습적 특성화를 위해 "희생"되어야 한다. 따라서, 검사 세포의 비침습적이고 비파괴적인 생물학적 특성화가, 가능하다면, 액체 배지에서 실시될 수 있는 수단 및 방법이 요망된다. 또한, 측정 중에 조직에 가해지는 부하를 최소화하는 것도 요구된다.
본 발명의 다른 양상은 본질적으로 생물공학적 방법에 따른 약물 또는 활성 성분의 생산에서의 멸균 제어와 관련된다. 이러한 방법에서, 활성 성분은 소위 생물반응기에서 미생물 및/또는 조직 세포와 같은 생물학적 세포 또는 세포 시스템에 의해 생산된다. 50 리터 이상의 용적을 갖는 산업적 규모의 생물반응기가 사용된다. 활성 성분의 회수는 종종 반응기 내에서 수 주일에 걸친 배양 시간이 요구된다. 보통 다단계 정제가 생산 라인의 생물반응기에 연결되고, 이로부터 원하는 활성 성분 조성물이 궁극적으로 얻어질 수 있다.
따라서, 반응기 충전시 어떠한 외부 오염도 일어나지 않는 것과 반응기로부터 회수되는 활성 성분 조성물의 멸균이 보장되는 것이 필수적이다. 공지의 방법에서는 반응기 배양의 개시 및 종결시 또는 생산 변경의 종결시 충전물은 외부 오염 및 멸균을 검사받는다. 오염의 경우, 전체 생산 용량을 폐기하여야 한다.
공지의 멸균 시험에서, 생물학적 샘플은 가동중인 생산 공정으로부터 작은 용량의 액체 형태로 채취하여 영양 배지에서 통상적인 미생물학적 방법에 따라 배양한 후 분화시켜 오염 타입을 결정하게 된다. 결과는 수 일이 지난 후에야 예상할 수 있다. 단점은 공정의 관리 조절 가능성이 제한된다는 것이다. 대부분의 경우, 적어도 액체 샘플링 시간과 오염의 양성 검출 시간 사이에 생산 공정의 연속을 위해 채용된 원료는 손실된다.
생산 공정을 개선하고 비용 손실을 피하기 위해 전체 생산 공정 동안, 그리고/또는 전체 생산 라인을 따라, 전체 배양 시간에 걸쳐 멸균 또는 오염에 대한 계속적 시험이 요구된다. 짧은 검출 시간을 제공하는 신속한 검출 방법과 이러한 방법을 수행하기 위한 수단이 요망된다. 동시에, 높은 특이성과 감도가 있어야 한다. 이러한 검출 방법은 또한 바람직하게는 오염의 타입을 명백하게 규정, 특히 오염 미생물을 결정하기에 적합하여야 한다. 손실되는 원료에 대한 비용을 절약하는 것에 추가하여, 시간 절약도 이와 연관되는데, 시기 적절하게 오염된 공정을 신속하게 종료하고 새로운 공정이 개시될 수 있기 때문이다.
라만 분광법(Raman spectroscopy)은 화학적 분석 및 표면 특성화에서 주로 사용되는 공지된 방법이다. 이 방법은 또한 생물학적 샘플의 특성화를 위해 생물학적 액체의 검사에서 사용이 증가하고 있다. 생물학적 샘플이 어떤 파장 또는 파장 범위의 여기 방사선으로 조사될 때, 탄성 및 비탄성 산란 과정이 샘플 내 조사되는 분자에서 일어난다. 도입된 여기 광의 주요 분율은 샘플 내에서 탄성적으로 산란된다(본질적으로, 소위 Rayleigh 산란). 또한, 적은 정도의 비탄성 산란이 분자에서 일어나는데, 소위 Raman 산란 방사선이다. 라만 산란 방사선은 에너지 양에서, 따라서 도입된 여기 방사선으로부터의 파장에서 차이가 난다. 라만 산란 방사선은 단파장으로 변경된 분율(anti-Stokes lines) 및 장파장 분율(Stokes lines) 모두를 갖는다. 장파장으로 변경된 라만 산란 방사선 분율의 스펙트럼 분포가 통상 라만 스펙트럼(Stokes lines)으로 이해된다. 라만 스펙트럼은 주로 조사되는 샘플의 분자 조성물 또는 조사되는 분자의 특성을 갖는다. 주로 통계적 산법에 기초한 방법을 가지고, 이러한 스펙트럼이 조사되는 샘플의 어떤 분자에 명확히 할당될 수 있어 분자 조성물, 생물학적 세포, 세포 분획 및 어떤 세포 구조가 특성화되고 필요에 따라 특정될 수 있다.
WO 2004/099763 A1으로 공지된 방법에서, 라만 분광법은 생물학적 세포를 검사 및 분석하기 위해 사용되는데, 여기에서 검사받는 미생물은 배양, 분리, 여기 방사선에 노출되고 세포에 의해 방출되는 라만 산란 방사선이 분광학적으로 분석된다. 방출된 라만 산란 방사선의 기록된 스펙트럼 분포로부터, 상응하는 미생물에 대한 특징적 값이 통계적 분석에 의해, 예를 들어 스펙트럼에서의 어떤 밴드가 기록되고 데이터베이스에 저장된 공지의 미생물의 상응하는 특성과 비교된다. 이 분석 방법은 침습적인데, 검사받는 미생물이 세포로부터 방출되고 제조되기 때문이다. 분석된 세포의 예비배양은 규정되어 있지 않다.
이 방법의 단점은 침습적 접근으로서, 이는 분석되는 세포의 파괴를 유도한다. 다른 단점은 공지의 라만 분광법과 관련된 긴 측정 시간이다.
선행기술로부터 출발하여, 본 발명에 내재된 기술적인 문제는 주로 생물학적 샘플, 바람직하게는 세포 조합, 조직, 세포 현탁액 또는 생물학적 액체에서 생물학적 세포의 다루기 쉽고, 신속하고 비침습적이며 비파괴적인 검출 및 특성화 수단 및 방법을 제공하는 것으로 구성된다.
본 발명은 내재된 기술적 문제를 광학-분광학 원리에 근거하여 적어도 다음을 포함하는 생물학적 샘플의 분석 방법을 제공하는 것에 의해 해결한다: 바람직하게는 액체로서 존재하거나 주로 액체 샘플(생물학적 액체)인 생물학적 샘플을 샘플 홀더 유닛에, 바람직하게는 가역적으로, 즉 다시 제거 가능하게, 그리고 비침습적으로, 즉 안전하게 고정하고; 생물학적 샘플에 포함된 어떠한 입자라도 다음에 의하여 분류하고: 생물학적 샘플 및/또는 샘플 내에 포함된 입자의 현미경사진 기록 및 자동 샘플 인식 공정에 의한 이미지 데이터의 분석; 그리고, 특히 생물학적 샘플의 영역에 위치할 수 있는 측정 구역 내에서, 여기 방사선 초점을 모아 측정 구역에서 라만 산란 방사선을 여기 또는 발생시키고 측정 구역에서 생물학적 샘플에 의해 방출된 라만 산란 방사선을 검출하고 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포를 분석하는 것에 의해, 생물학적 샘플을 라만 분광법에 의해 분석하는데, 여기에서 적어도 하나의 생물학적 샘플의 라만 스펙트럼이 얻어진다.
다음에 이 방법은 본 발명에 따라, 적어도 하나의 자동적으로 위치한 측정 구역의 영역으로 제한된 라만 분광학적 분석 및 설정된 기준에 따른 현미경사진 범주화의 결과에 의해, 측정 구역이 생물학적 샘플의 입자 또는 특정 부위에 자동적으로 위치한다는 사실을 특징으로 한다.
본 발명은 바람직하게는 생물학적 샘플의 라만 분광학적 분석을 예정된 범주와 관련된 곳에 존재하는 입자로 공간적으로 제한하도록 제안한다. 이는 바람직하게는 본 발명에 따라 측정 구역을 생물학적 샘플의 특정 입자에 자동적으로 위치시키고 거기에서 라만 분광학적 분석을 시행하는 것에 의하여 실시된다. 측정 구역의 범주화-제어된 위치 지정은 바람직한 변형에서는 다른 범주 기준 및/또는 샘플의 다른 영역에서 수 회 반복된다.
본 발명과 관련하여 "생물학적 샘플(biological sample)"은 별개의 또는 세포 조합으로서의 하나 또는 그 이상의 생물학적 세포, 조직, 이식체(transplants, implants), 기관 및 조직 대체물 제제 및 이들의 일부를 의미하는 것으로 이해된다. 대부분의 동물 및 인간 세포는 여기에서 조직, 배아세포 또는 줄기세포, 세균 세포 및 세균 포자, 마이코플라즈마, 진균 세포, 균사 및 포자와 마찬가지로 생물학적 세포로 간주된다. 생물학적 샘플은 반드시 어떤 세포를 포함할 필요는 없으며; 생물학적 샘플에 잠재적으로 포함된 세포의 검출이 본 발명이 목적이다. 생물학적 샘플은 적어도 하나의 생물학적 세포를 잠재적으로 포함하는 조성물이며; 이것은 또한 조직, 이식물, 기관 및 조직 대체 제제 및 그 일부, 그리고 멸균 여과 잔류물로부터의 액체 및 대부분의 비액체 생물학적 샘플뿐 아니라 임상적 샘플, 생체조직을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명과 관련하여 "입자(particle)"는 생물학적 샘플에, 예를 들어 액체의 형태로 존재할 수 있는 생물학적 세포 또는 생물학적 세포의 일부를 의미하는 것으로 이해된다. "입자"는 또한 생물학적 샘플, 특히 세포 조합, 조직, 이식물(transplants, implants), 기관 및 조직 대체 제제 또는 이들의 일부에 존재하는 모든 개별화 또는 범주화 가능한 세포 또는 세포 단편을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명과 관련하여 "생물학적 액체(biological fluid)"는 특정 형태의 생물학적 샘플, 잠재적 비멸균 액체 또는 현탁액 또는 주로 생물학적 세포의 배양과 관련하여 일어나는 생물학적 세포로 오염된 것을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 생물학적 액체에 존재하는 생물학적 세포는 단순히 오염원일 뿐 아니라; 이들은 배양된 생물학적 세포, 예를 들어 조직 세포를 의미하는 것으로도 이해된다. 이들 세포는 다음에 세포 조합 또는 조직 또는 세포 현탁액으로서 배양된다. 생물학적 액체는 바람직하게는 다음으로부터 선택된다: 주로 생물학적으로 생산된 약학적 활성 성분 또는 활성 성분 조성물, 생물발효조의 배지, 혈액, 뇨, 액체, 뇌척수액, 혈장, 혈청, 림프액, 수성액, 점액 도말, 기관지 세척액 등과 같은 임상 샘플뿐 아니라, 액체 배양 배지 및 조직 배양 상등액, 주로 수송 배지, 해동 배지, 세척 배지 및 저장 배지를 포함하는 생물학적 이식물, 기관 및 조직 대체 제제의 배양물.
따라서, 본 발명은 현미경 이미지 분석을 분광학적 분석법과 조합하여 현미경 분석되는 샘플 면적을 표적으로 의도적으로 감축함으로써 많은 시간 이득을 허용한다. 생물학적 샘플의 현미경 이미지 분석에 의한 범주화에 의해, 생물학적 샘플의 시간-집약적인 라만 분광학적 분석이 샘플의 특이적 측정 구역으로 공간적으로 유리하게 제한될 수 있다. 공지의 방법과 관련된 총 분석 시간이 이 때문에 실질적으로 유리하게 단축된다. 본 용도에 따라, 측정 시간(생물학적 샘플의 도입으로부터 측정 데이터의 획득 종결 또는 분석 결과의 획득까지의 시간)은 48, 24 및 12 시간까지 단축된다.
바람직하게는 예비-설정된 기준에 의한 측정 구역의 선택은 자동적으로 실시되어, 대응하는 분석에서 필수적인 관심사에 대하여 선택되는 것이 주로 규정된다: 분석의 문제가 일차적으로 샘플의 병원균 오염 체크에 대한 것이라면, 세균 및 진균 세포 또는 포자와 같이 현미경 이미지로 검출된 병원균의 범주화에 의한 예비 선택이 이러한 병원균의 표적화된 현미경 분석을 허용한다.
분석의 문제가 일차적으로 조직 세포의 분화 단계 또는 생명력의 특성화에 대한 것이라면, 예를 들어 연골세포(chondrocytes)와 같이 현미경 이미지로 검출된 조직 세포의 범주화에 의한 예비 선택이, 라만 스펙트럼 사진의 특이적 특성값에 의해 인식 가능한 "생명력 마커" 또는 "조직 타입 마커"를 위한 이들 세포의 표적화된 분광학적 분석을 허용한다.
입자의 현미경사진 범주화는 바람직하게는 "생물학적 세포" 및 "비생물학적 세포, 인공물"의 범주에서 일어난다. "생물학적 세포" 범주 내의 범주화는 바람직하게는 "세균 세포", "진균 세포", "세균 포자", "진균 포자" 및 "(인간) 조직 세포" 범주에서 일어난다. "(인간) 조직 세포" 범주 내의 범주화는 바람직하게는 "생체 세포" 및 "비생체 세포" 범주에, 그리고/또는 바람직하게는 "분화된 세포" 및 "탈분화된 세포" 범주에서 일어난다.
라만 산란 방사선을 발생시키기 위해서는 근적외선, 바람직하게는 785±60 ㎚의 파장 또는 200±50 ㎚의 UV 범위의 파장을 갖는 여기 방사선이 바람직하게 사용된다.
바람직하게는 선형 여기 구역의 형태로 초점을 맞춘 여기 방사는 분석 중에, 바람직하게는 고정된 입자로 단계적으로 이동하도록 바람직하게 규정된다. 각 단계 이후 새로운 측정 사이클이 바람직하게 수행된다. 여기 구역으로부터 기록된 라만 스펙트럼 개개의 연속적인 측정 사이클에서 얻어진 분석 데이터는 다음에 국소적 라만 스펙트럼의 위치-해상된 이미지로 조합된다. 이 목적을 위해, 라만 산란 방사의 위치-해상된 스펙트럼 분석이, 2-차원 CCD 어레이 검출기로 여기 구역의 라만 산란 방사선을 분리하고 그것을 검출하는 것에 의해 본 발명에 따라 바람직하게 수행된다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 생물학적 샘플에서 측정 구역 내에 몇 개의 선형 여기 구역 [i...i+n] 의 형태로 여기 방사의 순차적 초점화에 의해 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분석을 실시하는 것을 제안한다. 스펙트럼 분석의 측정 시간은 선형 초점화에 의해 더욱 단축되는데, 몇 개의 국소적 라만 스펙트럼의 기록 및 병행 검출이 여기 구역의 선형 범위를 따라 동시에 가능하기 때문이다.
라만 산란 방사선의 스펙트럼 분석은 바람직하게는 2-차원 CCD 어레이 검출기에 의해 위치-해상된 스펙트럼 분석에 의해 시행되는데, 여기에서 (제 1) 선형 여기 구역 i는 CCD 어레이의 제 1 차원에서 그의 종방향 길이를 따라 위치하도록 실제로 이미지화되고 이 (제 1) 여기 구역의 종방향 길이에 따른 각 점으로부터의 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포는 CCD 어레이의 제 2 차원에서 이미지화되고 국소적 라만 스펙트럼은 위치에 따라 별개로 해상되어 기록된다.
전 측정 구역의 위치-해상된 스펙트럼 분석은 반복 과정으로 일어나고, 국소적 라만 스펙트럼의 제 1 군은 제 1 여기 구역 i에서 제 1 측정 사이클에 기록되고 국소적 라만 스펙트럼의 제 2 군은 제 1 여기 구역 i와 국소적으로 인접한 제 2 여기 구역 i+1의 다음 제 2 측정 사이클에 기록된다. 이러한 목적으로, 여기 방사의 선형 초점은 측정 구역에 고정된 생물학적 샘플에 대한 제 1 위치로부터 제 2 위치까지 측정 사이클 사이로 이동한다. 추가적인 측정 사이클은 추가의 국소적으로 인접한 여기 구역 i+n 에서 반복되어, 선형 초점은 항상 측정 사이클 사이의 다음 위치로 안내된다. 모든 여기 구역 [i...i+n]의 국소적 라만 스펙트럼의 군들은 다음에 측정 구역에 고정된 생물학적 샘플의 위치-해상된 스펙트럼 분포 패턴의 모든 그림으로 조합된다(선 스캔).
본 발명은 입자의 현미경 이미지 데이터에 의하여, 개개의 입자를 샘플 비교에 의해 국소화, 특성화 및 임의로 확인하도록 제안한다. 기록된 이미지 데이터는 바람직하게는 기하학적으로 분석되는데, 이 경우 이미지 특성이 얻어진다. 이미지 분석은 공지의 양식으로, 바람직하게는 소프트웨어-시행되는 특징 검출기 및 샘플 인식에 의해 실시된다. 입자의 제 1 범주화 또는 유형화는 주로 이미지 특성으로부터 일어날 수 있다.
또한, 이미지 데이터는 이와 같이 국소화된 입자와 병행하여 기록된 국소적 라만 스펙트럼과 상호 관련되도록 제안된다. 광학적으로 국소화된 입자의 라만 스펙트럼은 바람직하게는 입자의 특성화를 위해 사용된다. 특징적인 라만 스펙트럼에 기초하면서, 특징적인 형태에 근거하고 바람직하게는 이미지 분석 및 스펙트럼 분석으로부터 얻어진 발견의 조합으로부터의 입자의 개별화된 특성화 및 임의 확인은 특성화, 구체화 및 확인된다.
적어도 하나의 추가된 단계에서 얻어진 적어도 하나의 라만 스펙트럼 및 현미경 이미지 데이터로부터, 측정 구역에서 분석된 입자 또는 생물학적 샘플이 바람직하게 특성화된다. 이는 바람직한 변형에서, 적어도 하나의 라만 스펙트럼으로부터의 유형별 특성 값을 결정하고 결정된 유형별 스펙트럼 특성 값을 저장된 공지의 스펙트럼 특성과 비교하는 것에 의하여 일어난다. 다른 하나의 바람직한 변형에서는, 현미경 이미지 데이터로부터의 유형별 특성을 결정하고 결정된 이미지 특성을 저장된 이미지 특성과 비교하는 것에 의하여 특성화가 일어난다. 다른 하나의 바람직한 변형에서는, 스펙트럼 특성과 이미지 특성의 특성 비교의 결과를 조합하는 것에 의하여 특성화가 일어난다.
그 안에 포함된 입자 또는 생물학적 샘플의 특성화는 바람직하게는 결정된 특성의 비교로부터 예비-설정된 기준에 따라 일어난다. 특성화의 바람직한 변수는 다음과 같다: 속, 종, 분화의 정도, 생명력 및 화학적 조성.
제 2 양상에서 본 발명은 적어도 다음 단계를 포함하는 생물학적 액체의 분석을 위한 광학 분광학적 방법을 제공한다: 바람직하게는 샘플 홀더 유닛 내에서 생물학적 샘플의 가역적 고정; 다음에 의한 생물학적 샘플에 포함된 모든 입자의 특성화: 생물학적 샘플 및/또는 포함된 입자의 현미경적 기록 및 자동 샘플 인식 과정에 의한 이미지 데이터의 분석; 그리고 생물학적 샘플의 영역 내에 지정 가능한 측정 구역 내에서 생물학적 입자의 라만-분광학적 분석: 측정 구역에서 여기 방사의 초점화에 의한 라만 산란 방사선의 여기 및 측정 구역의 생물학적 샘플에 의해 방출되는 라만 산란 방사선의 검출 및 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포의 분석, 여기에서 생물학적 샘플의 적어도 하나의 라만 스펙트럼이 얻어지는데, 이 방법은 생물학적 샘플의 가역적 고정이 생물학적 샘플의 샘플 홀더 유닛 또는 그 안의 샘플 주입을 통한 유동에 의해 일어나는 것을 특징으로 하며, 이 경우 생물학적 샘플에 포함된 모든 입자가 적어도 분석기간 동안 측정 구역에 보존되고 거기에서 가역적으로 고정된다. 본 발명에 따라, 생물학적 샘플이 생물학적 액체이고 샘플 홀더 유닛이 소위 유체 셀(fluid cell)로 고안될 것이 제안된다.
입자는 유체 셀 내의 생물학적 액체로 세척되고 거기에서 유체 셀 내의 적절한 수단에 의해 보존 또는 고정된다. 본 발명은 라만 분광법에 의해, 바람직하게는 추가로 광학 현미경에 의해, 바람직하게는 DIC(differential interphase contrast)로서, 유체 셀 내의 보존 또는 고정된 입자 또는 입자들을 검출하고 바람직하게는 추가로 특성화하는 것을 제안한다.
본 방법은 또한 입자가 유체 셀 내에서 예비분류될 것을 제안한다. 이는 바람직하게는 다음에 의하여 실시된다: 유동 방향으로 연속적으로 유체 셀와 연결되고 다른 천공 직경을 갖는 몇 개의 천공된 플레이트 상에서 크기에 따른 입자의 분리. 따라서, 이 방법은 예비선택의 분광학적 분석 전, 후 또는 동시에 이들 샘플 영역 또는 입자의 대략 2- 또는 다단계 예비선택을 제안한다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 변형에서, 예비선택은 제 1 단계에서 크기에 따라, 그리고 마지막 단계의 선택에서는 범주에 따라 일어난다.
추가의 바람직한 단계에서, 생물학적 액체의 모든 오염의 검출이 본 발명에 따라 측정된 스펙트럼 및/또는 이미지 특성을 참고하여 실시되는데, 여기에서 특성의 충분한 일치가 생물학적 액체 내 감염성 입자의 존재를 나타내고 특성의 일치가 없으면 생물학적 액체의 오염이 없는 것으로 검출된다.
따라서, 본 발명은 다음을 제안한다: 유체 셀이 분석되는 생물학적 액체를 통과하고 생물학적 액체, 즉 특히 생물학적 세포에 함유된 입자가 바람직하게는 유체 셀에 고정되어 보존된다. 이는 일시적으로, 바람직하게는 적어도 분석기간 동안 바람직하게 실시되는데; 분석을 위해 유체 셀 내에 보존 또는 고정된 입자를 조사된 입자에서 비탄성 산란된 방사, 즉 라만 산란 방사를 자극하는 여기 방사선으로 조사한다. 분석을 위해, 조사된 입자에 의해 방출된 라만 산란 방사선을 검출하고 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포를 분석하는데, 이 동안에 적어도 하나의 라만 스펙트럼이 얻어진다. 적어도 하나의 라만 스펙트럼으로부터 하나 및 바람직하게는 몇 개의 바람직하게는 특징적인 값을 측정하고 측정된 특성을 바람직하게는 공지의 분석 방법에 따른 공지의 저장된 특성과 비교한다.
본 발명에 따른 방법은 측정된 특성이 저장된 특성과 충분히 일치하는 동안, 생물학적 액체에서의 입자, 바람직하게는 세균, 세포, 세균 포자, 진균 세포 또는 진균 포자와 같은 감염성 입자의 존재의 검출을 허용하는데; 특성의 일치가 없으면 생물학적 액체의 감염성 입자의 오염이 없는 것, 즉 무균성으로 검출된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 변형에서, 본 발명에 따른 특성값 비교를 통해, 어떤 특성의 충분한 일치를 갖는 보존된 입자는 특성화되는데, 즉 세포 타입, 세포 종 및/또는 세포의 분화 정도가 측정되어 생물학적 액체에서 어떤 정도로 분화가 된 어떤 세포 종 또는 세포의 존재가 검출된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 유리하게는 생물학적 액체에서 계속적인 무균성 제어 및/또는 측정 및 특성화, 특히 생물학적 액체에 함유된 모든 생물학적 세포의 분화 정도의 측정을 위해 작용한다.
본 발명은 유리하게는 의약 개발 중 및 개별 치료제, 즉 생물학적 이식물 및 조직 제제의 제조 중 양쪽에서, 조사되는 생물학적 액체의 조성에 있어서 변화나 저하를 야기하지 않으면서 일차적 생물학적 액체를 조사할 수 있도록 허용한다. 특히, 생물학적 액체, 즉 특히 생물학적 세포, 특히 조직 세포에 함유된 모든 입자는 그 생명 기능에 영향을 받지 않고 그 통합성이 교란되지 않는다. 이것은 무엇보다도 생물학적 세포가 그 "자연적인" 환경, 즉 대부분의 경우 세포의 배양 배지인 생물학적 액체에서 측정될 수 있다는 사실에 의해 가능하며, 여기에서 세포는 바람직하게는 측정 또는 분석 중에만 본 발명에 따라 제안된 유체 셀에서 보존 또는 고정된다.
본 발명은 또한 라만 분광학적 분석이 연속적인 생산 또는 배양 과정에서, 바람직하게는 연속적으로 또는 준연속적으로 과정에서 샘플이나 일부분을 제거하여 이들을 별도로 분석한 후 폐기하지 않고 생물학적 액체에 함유된 생물학적 세포의 임의 특성화 및 검출을 위해 수행될 수 있는 것을 허용한다. 따라서, 바람직한 변형에서 본 발명에 따른 장치는 생산 라인, 바람직하게는 측면 라인으로 통합되어, 생물학적으로 생산된 활성 성분의 생산 또는 정제 동안, 조직 이식물의 발효 공정이나 배양 동안 무균성, 외래 오염원의 존재 또는 세포 분화의 정도가 연속적으로 검사된다.
또한, 환자에서 이미 이식시에 조직 이식물의 무균성 제어 동안 이식물이 오염되는지 여부에 대한 확인이 가능하다는 장점이 있다. 이미 이식된 제제의 오염 검출 동안 비교적 단시간에 구별된 진단을 실시할 수 있고, 필요에 따라 아마도 가장 아픈 환자는 결정된 병원균에 대하여 계획적으로 치료받을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 무균성 시험, 세포 및 이식물의 생명력 또는 생존력의 측정 및 구별된 진단을 하나의 배열이나 조합된 방법으로 통합하는 능력이 다른 장점으로, 자가 이식물의 경우 분석 방법의 전체적으로 필요한 대역폭이 커버된다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 분석되는 생물학적 액체에 함유된 모든 입자가 하나 이상의 천공을 갖고 유체 셀 내에 배열되는 적어도 하나의 천공된 플레이트에 의해 유체 셀 내에 잡히는 것을 제안한다. 이들 천공은 바람직하게는 천공된 플레이트 내에 구조되는 양식으로 배열된다. 아래의 조언은 여기에 참고된다. 이 방법은 입자가 천공된 플레이트의 정상에서 생물학적 액체로부터 보존되는 것을 특히 바람직하게 제안한다. 이는 바람직하게는 천공된 플레이트의 반대쪽에 부분적 진공을 적용함으로써 생물학적 액체에 존재하는 입자가 천공된 플레이트의 정상에서 구멍으로 마치 "흡수되어" 구멍 위 또는 구멍 영역에 고정되는 사실에 의해 보장된다. 입자는 본 발명에 따라 적어도 일시적으로는; 바람직하게는 적어도 분석 동안 천공된 플레이트에 고정된다. 이는 바람직하게는 부분적 진공이 대략 고정 동안 적용되는 사실에 의해 달성된다.
본 방법은 또한 유체 셀 내의 입자가 하나 이상의 천공을 갖고 유체 셀 내에 배열되는 적어도 하나의 천공된 플레이트에 의해 보존되는 것을 제안한다. 바람직하게는 입자는, 임의적으로는 일시적으로, 천공된 플레이트의 반대쪽 "바닥"의 방향으로 동적 및/또는 정적 압력 구배를 적용하는 것에 의해 천공된 플레이트의 "정상"에서 생물학적 액체로부터 고정된다. 이는 천공된 플레이트의 정상과 천공된 플레이트의 반대쪽 바닥 사이에 압력 차이가 생산되어, 이는 천공된 플레이트에 제공되는 적어도 하나의 구멍을 통하여 연통되는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이는 바람직한 변형에서 천공된 플레이트의 정상을 지나 흐르거나 위치하는 입자를 함유하는 생물학적 액체의 적어도 일부가 천공된 플레이트 위에서 적어도 하나의 구멍을 통해 아래로 내려간다는 점에서 달성된다. 다른 변형에서, 천공된 플레이트의 정상에서 가압된 생물학적 액체는 천공된 플레이트 위에서 적어도 하나의 구멍을 통해 적어도 부분적으로 하향 배출된다. 부분적 진공의 적용은 생물학적 액체가 유체 셀을 통과하고 이에 따라 천공된 플레이트의 정상을 따라 흐르는 작업 상태에서 시행한다. 다른 변형에서, 부분적 진공은 생물학적 액체의 어떠한 순 유동도 유체 셀을 통하거나 천공된 플레이트의 표면을 따라 일어나지 않는 작업 상태에서 적용된다.
바람직한 다른 또는 추가의 변형에서, 생물학적 액체에 함유된 모든 입자가 입자 크기와 구멍 직경의 기하학적 상태에 따라 생물학적 액체로부터 "여과된" 천공된 플레이트의 상향 쪽에 고정되도록, 생물학적 액체는 주된 흐름으로 천공된 플레이트를 통과한다. 본 분야의 당업자는 유체 셀의 특이적인 기하학적 구조 및 적용 분야에 따라, 본 발명의 교시로부터 벗어나지 않으면서 적절한 방법 또는 몇 개의 바람직한 방법의 변형을 선택할 것이다.
여기 방사선은 바람직하게는 국소적 여기 구역에서 유체 셀에 보존된 적어도 하나의 입자에 초점을 둔다. 특히 바람직한 여기 구역은 측정 구역, 즉 유체 셀 또는 배양 접시에 보존 또는 고정된 일련의 입자가 라만 산란 방사선의 방출을 위해 상호 접근하여 동시에 여기하도록 선형(선 초점)이다.
본 발명에 내재된 기술적 문제는 또한 상기 언급된 방법의 실행에 특히 적합한 장치를 공급하는 것에 의하여 해결된다. 다음 장치와 관련하여 기술된 방법, 변수 및 공정 단계는 또한 상기 방법의 바람직한 특징이다.
본 발명에 따른 생물학적 샘플의 광학-분광학적 분석을 위한 장치는 적어도 다음 요소와 관련된다:
- 측정 구역에서 생물학적 샘플의 고정을 위한 샘플 홀더 유닛;
- 측정 구역 내의 여기 구역에서 여기 방사에 의한 라만 산란 방사의 여기를 위해 적합한 여기 방사 유닛; 및
- 생물학적 샘플의 여기 구역에서 방출된 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분석을 위해 적합한 분석 유닛.
본 장치는 바람직하게는 다음을 특징으로 한다:
- 생물학적 샘플은 생물학적 액체이고;
- 샘플 홀더 유닛은 유체 셀이 유체 셀의 측정 구역에서 생물학적 샘플에 함유된 모든 입자의 보존 및 가역적인 일시적 고정에 적합한 수단을 갖는 생물학적 샘플에 의해 통과 가능한 유체 셀이다.
따라서, 본 장치는 적어도 다음 요소를 포함한다: 생물학적 액체의 형태로 생물학적 샘플에 의해 통과될 수 있는 적어도 하나의 유체 셀로, 여기에서 유체 셀이 입자의 일시적 보존, 특히 고정을 위한 적어도 하나의 수단을 가지며, 입자는 적어도 분광학적 및 임의로 현미경 분석 동안 이 수단에 고정되며; 라만 산란 방사선이 유체 셀에 보존 또는 고정된 입자에서 여기될 수 있도록 여기 방사가 가능한 적어도 하나의 여기 방사 유닛; 입자에 의해 방출된 라만 산란 방사선을 스펙트럼 분리하고 라만 스펙트럼을 기록(스펙트럼 분석)하는 데 적합한 적어도 하나의 분석 유닛.
본 발명의 이러한 양상에 따라, 유체 셀은 바람직하게는 생물학적 샘플, 즉 오염원이나 조직 세포와 같은 잠재적 생물학적 세포뿐 아니라 잠재적 인공물과 함께 유체 셀에 들어가는 입자가 유체 셀에 보존될 수 있고, 특히 특정 위치에서 거기에 고정될 수 있다. 이는 바람직하게는 유체 셀에서 하나 및 바람직하게는 몇 개의 천공 또는 구멍, 바람직하게는 소위 미소공과 함께 제공되는 구멍 배열 또는 적어도 하나의 천공된 플레이트에 의해 가능하게 된다. 천공 또는 구멍은 바람직하게는 원형 또는 거의 원형의 횡단면을 갖는다. 바람직한 변형에서, 구멍은 선형 또는 틈새-유사하게 만들어진다. 천공된 플레이트는 유체 셀을 통하여 흐르는 액체 생물학적 샘플로부터 입자를 보존하기 위해 여과망과 같은 기능이 있다. 천공된 플레이트에서 구멍의 직경 또는 치수는 바람직하게는 입자 또는 생물학적 세포가 그 크기로 인해 구멍을 통과할 수 없고 유체 셀에 보존될 수 있도록 선택된다. 적어도 하나, 바람직하게는 정확히 하나의 이러한 입자가 각 구멍에 보존 또는 고정될 수 있다.
본 발명에 따른 유체 셀은 특히 적어도 하나의 천공된 플레이트 또는 구멍 배열이 구조된 양식으로 배열된 구멍을 갖는다는 사실을 특징으로 한다. 구멍은 바람직하게는 규칙적인 패턴(배열)로 배열되며, 여기에서 구멍의 직경에 대한 구멍의 상호간 평균 간격 비율(구멍 간격, 격자 치수)은 하나, 바람직하게는 각각의 구멍에 적어도 하나의, 바람직하게는 정확히 하나의 입자가 보존되도록 선택된다. 격자 크기/직경 비율은 바람직하게는 1.1 내지 20, 바람직하게는 5 내지 15이고, 더욱 바람직한 것은 약 10이다. 천공된 플레이트는 바람직하게는 천공 또는 구멍이 선 및 컬럼에서 규칙적인 어드레스 가능한 배열의 형태로 배열되도록 고안된다. 약 1.6 ㎠(약 0.5×0.5 인치)의 구멍 배열 크기에 약 106 구멍이 바람직하게는 미소공의 형태로 배열되고; 1 ㎛의 구멍 직경에서 격자 크기는 약 12 ㎛이다. 이는 구멍에 고정된 생물학적 세포 또는 입자가 이웃하는 구멍에 고정된 세포 또는 입자와 겹치지 않아서 양쪽 세포 또는 입자가 광학적으로 별개로 분석될 수 있는 것을 보장한다. 천공된 플레이트에서 구멍 격자는 세균처럼 작은 생물학적 세포의 고정을 위해, 큰(인간) 포유류 세포의 고정을 위한 천공된 플레이트에서보다 더 작은 값을 갖는 것으로 이해된다. 하나의 변형에서 구멍은 1 ㎛의 직경을 갖고 구멍 배열의 표면적은 10 ㎟(10×10 ㎜)이다. 10 ㎛의 구멍 격자에는 구멍 배열에 약 1,002,000 구멍이 있다. 이 구멍 배열은 주로 세균 세포, 진균 포자 등의 보존 또는 고정을 위해 작용한다. 이러한 천공된 플레이트는 바람직하게는 구멍의 직경이 1 ㎛ 또는 이보다 작은 범위에 있으며, 바람직한 하한은 0.2 ㎛이다. 바람직한 구멍 격자는 2 내지 15 ㎛, 바람직하게는 약 10 내지 12 ㎛이다.
천공된 플레이트의 다른 바람직한 변형에서, 구멍은 2 ㎛의 직경과 20 ㎛의 구멍 격자를 갖는다. 이러한 구멍 배열은 주로 동물 또는 인간 유래의 조직 세포의 보존 또는 고정을 위해 작용한다. 이렇게 천공된 플레이트는 바람직하게는 2 ㎛ 이상, 바람직하게는 약 2 내지 6 ㎛의 구멍 직경을 갖는다. 바람직한 구멍 격자는 15 ㎛ 이상, 바람직하게는 약 15 내지 50 ㎛이다.
상응하는 용도에 적합한 천공된 플레이트의 치수는 궁극적으로는 조사되는 생물학적 액체의 액체 특성에 따라 분석되는 입자와 관련하여 본 발명에 따라 규정된 한도 내에서 본 분야의 당업자에 의해 결정된다.
바람직한 변형에서, 유체 셀은 적어도 제 2 또는 추가의 이러한 천공된 플레이트를 갖는다. 이것 또는 이들은 생물학적 샘플의 유동 방향과 관련하여 유체 셀에서 제 1 천공된 플레이트의 상향으로 배열된다. 제 2 또는 추가의 천공된 플레이트 역시 하나 및 바람직하게는 몇 개의 구멍을 갖는다. 제 2 또는 추가의 천공된 플레이트에서 구멍의 배열을 위해, 상기 제 1 천공된 플레이트와 관련하여 기술된 것이 적용된다. 제 2 또는 추가의 천공된 플레이트의 구멍 직경은 바람직하게는 제 1 천공된 플레이트의 구멍 직경 보다 크다. 제 1 천공된 플레이트 구멍의 제 1 직경과 제 2 및 임의로 추가된 천공된 플레이트 구멍의 제 2 직경의 비율은 바람직하게는 생물학적 액체에 함유된 대형 입자, 예를 들어 인간 세포가 제 2 및 임의로 추가된 천공된 플레이트에 의해 보존되는 한편, 세균 세포, 세균 포자, 마이코플라즈마, 진균 세포 또는 진균 포자와 같은 작은 입자가 제 2 및 임의로 추가된 천공된 플레이트를 통과할 수 있고 (하향의) 제 1 천공된 플레이트에서 보존될 수 있도록 선택된다.
제 1, 제 2 및 임의로 추가된 천공된 플레이트 또는 구멍 배열은 바람직하게는 본질적으로 서로 평행하게 배열된다. 유체 셀 내에서의 이와 같은 규칙적인 여과 또는 체 장치를 통해, 생물학적 액체에 함유된 입자를 크기에 따라 분리하고 이들을 유체 셀에서 천공된 플레이트에 의해 형성된 하나에 위치하는 다른 분리된 제 1, 제 2 및 임의로 추가된 레벨로 배열하는 것이 가능하다. 이는 보존된 입자를 크기에 따라 별도로 조사되도록, 그리고 바람직하게는 라만 분광법 및 또한 광 현미경에 의해 조사되도록 하는 것을 허용한다.
적어도 제 1 천공된 플레이트(하향으로 놓인) 또는 구멍 배열은 바람직하게는 생물학적 액체의 유동의 정 방향과 평행으로 배열되어(정 유동의 벡터에 대한 천공된 플레이트의 정상 표면 각도는 약 90°이다), 유체 셀의 제 1 작동 상태에서 샘플 액체에 존재하는 입자가 천공된 플레이트의 정상을 따라 이동할 수 있고, 제 2 작동 상태에서 입자가 바람직하게는 넘쳐흐르는 액체로부터 천공된 플레이트의 반대쪽에 적용되고 천공된 플레이트의 정상에서 구멍에 고정될 수 있는 부분 진공에 의해 보존될 수 있다. 유체 셀에 보존될 수 있는 입자는 서로의 다음에, 특히 하나의 평면에 배열될 수 있는 것이 바람직하다.
유체 셀은 바람직하게는 제 1 및 적어도 제 2 천공된 플레이트 또는 구멍 배열을 구비하여 적어도 2 ㎛의 크기를 갖는 입자가 제 2 천공된 플레이트에 의해 형성되는 평면에 고정되고 하나의 라인에 배열되어 세포의 측정이 여기 방사선의 초점에서 일어날 수 있다. 2 ㎛ 보다 작고 1 ㎛ 보다 큰 입자는 하향의 제 1 천공된 플레이트에 고정될 수 있으며, 이것은 이미 제 2 천공된 플레이트를 통과한 것이다. 이들은 주로 세균, 진균, 마이코플라스마 뿐 아니라 세균 포자 및 진균 포자로, 이들 모두는 "감염성 입자"로서 조사되는 생물학적 액체의 오염을 표시할 수 있다. 본 발명에 따른 장치의 이러한 변형에서, 여기 방사선은 하향("하부(lower)") 제1 천공된 플레이트에 보존되는 입자에 초점을 맞출 것이 제안된다. 유리하게도, 단일 측정 장치에서, 액체 생물학적 샘플 중 보다 큰 입자, 예를 들어 인간 유래의 조직 세포와 이들로부터 분리된 더 작은 입자, 주로 세균, 진균, 포자와 같은 주로 미생물 양쪽을 분석하는 것이 가능하다.
본 발명의 이러한 양상의 바람직한 추가의 변형에서, 미소액체 유동 채널이 유체 셀에 제공된다. 이 유동 채널은 유체 셀이 생물학적 샘플에 의해 통과되고 입자가 분류 및 특성화를 위해 광학기기로 연속하여 사입되는 때 및 이러한 경우 생물학적 샘플 액체에 존재하는 입자가 연속적으로 또는 주로 연속적으로 유동 채널을 통과하여 이동할 수 있도록 구조된다. 유체 셀에서 분석을 위한 입자의 바람직한 일시적 고정은 주로 유체 셀을 통한 생물학적 액체의 정 유동을 정지시키는 것에 의해 가능하다. 생물학적 액체에 존재하는 입자는 미소액체의 유동 채널에서 바람직하게는 서로의 뒤에, 바람직하게는 상호 바로 뒤에 또는 필수적으로 상호 일정 간격을 두고 배열된다. 채널 폭은 광학기구의 초점 크기에 적합시킨다. 바람직하게는 음파장 및 전자장으로부터 선택되는 동력장을 발생시키기 위한 장치가, 측정 방법의 시행 동안 입자의 위치를 유지하기 위해 바람직하게는 추가로 채널에 제공된다. 본 분야의 당업자는 미소유동의 원리에 익숙하고 본 발명에 따라 언급된 기능을 만족시키기 위한 이러한 유동 채널의 치수를 알 수 있을 것이다.
바람직한 변형에서, 바람직하게는 일정한 간격으로 상호 평행으로 배열된 몇 개의 미소유동 채널이 유체 셀에 제공된다. 몇 개의 유동 채널 중 적어도 두 개는 치수 및/또는 구조가 서로 달라서 이렇게 다른 미소유동 조건이 이들 채널에서 우세할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 디자인은 바람직하게는 현미경 또는 물리적 특성에 따라 생물학적 액체에 존재하는 다른 입자를 분리하여 이들을 분류하고 임의로 별도 분석하기에 적합하다. 적어도 하나의 유동 채널이 본 발명에 따른 천공된 플레이트 또는 구멍 배열 뒤의 유체 셀에 연결되어, 여기에 천공된 플레이트의 구멍보다 작은, 필수적으로는 바로 그 입자, 바람직하게는 배타적으로 그 입자가 분류 및 특성화를 위한 광학장치로 연속하여 사입된다.
본 발명의 다른 양상에 따라, 본 발명에 따른 장치의 샘플 홀더 유닛은 얇고 광학적으로 투명한 재료를 갖는 배양 접시로서 디자인되어 여기 방사선의 초점이 생물학적 샘플로 향하게 된다. 바람직한 변형에서, 얇고 광학적으로 비굴절성인 플라스틱 또는 글라스 바닥을 갖는 페트리 디쉬 또는 현미경용 세포 배양 플레이트 또는 정상에서 개방되는 보통의 세포 배양 플레이트가 작은 세포 샘플(1 내지 2 ㎟)의 분석을 위한 샘플 홀더 유닛으로서 제공된다.
따라서, 본 발명에 따른 장치의 광선 경로에 놓인 배양 디스크 또는 유체 셀의 적어도 일부가 방사선 투명 또는 광 투명 재료로 만들어지도록 규정된다. 바람직한 재료는 다음으로부터 선택된다: 규산염 유리, 석영 유리, 규소 유리, 이산화규소 유리, 질화규소 유리, 불화칼슘 유리, 불화바륨 유리, 셀렌화아연 유리, 황화아연 유리 및 게르마늄 유리. 여기에서 질화규소가 특히 바람직하다. 본 발명은 이들 재료로만 한정되지 않으며; 본 분야의 당업자라면 목적에 적합한 유사한 재료, 특히 광학적으로 투명하고, 가능하다면 단지 약간만 굴절하고, 가능하다면 단지 약간만 색채 분산 재료 및 가능하다면 여기 방사선의 파장 범위 및 방사된 라만 산란 방사선과 검출되는 방사선 범위에서 투명한 재료를 고려할 것이다. 이들은 본 발명에 따른 교시에 의하여 포함된다. 이러한 추가 재료에는 폴리아크릴, 폴리에틸렌, 에틸렌/프로필렌 공중합체, 폴리스티렌, 폴리아미드 및 폴리카보네이트와 같은 합성 고분자가 포함된다.
샘플 홀더 유닛에서 그 표면 및 구체적으로는 적어도 생물학적 샘플 또는 유체 셀 또는 천공된 플레이트의 접촉 영역, 적어도 구멍 또는 기공의 영역을 금속 또는 금속 콜로이드로 코팅 또는 농축하는 것도 규정되는데, 여기에서 입자가 금속 또는 금속 콜로이드와 함께 보존될 수 있다. 금속의 결속은 바람직하게는 표면의 국소적 유도화에 의해 공지의 방식으로 실시된다. 배양 접시 표면 또는 천공된 플레이트 표면을 금 콜로이드로 농축하는 것이 특히 바람직하다. 천공된 플레이트의 영역 또는 어딘가에 위치한 입자와 관련된 구멍의 영역에 보존된 입자의 라만 분광학적 분석을 개선하기 위해, 천공된 플레이트의 구멍 영역에 단독으로 금속 또는 금속 콜로이드를 적용하는 것이 제안된다.
금속의 전자적 특성은 조사된 생물학적 샘플, 생물학적 세포 또는 보존되고 고정된 입자의 라만 방사를 증가시키는 것에 적합하다(SERS, serface-enhanced Raman spectroscopy). 공지의 원리에 따라 강도를 증가시키는 것에 의해, 검출의 통합 시간이 단축될 수 있다. 이는 측정 또는 분석 시간을 단축시키기 위한 본 발명에 따른 해결의 추가적 양상을 나타낸다. 또한, SERS와의 조합은 신호/노이즈 비율의 개선을 허용하고, 따라서 라만 스펙트럼에서 추가적인 가능한 특성 밴드의 검출을 허용한다.
여기 방사 유닛은 바람직하게는 여기 방사선을 발생시키기 위한 적어도 하나의 광원을 갖는다. 이 광원은 바람직하게는 거의 단일 파장의 방사선 스펙트럼을 갖는 적어도 하나의 레이저이다. 대체품으로서, 광원은 가스 방전 램프 및/또는 백열광 방사선 램프, 예를 들어 텅스텐 램프 또는 네른스트 핀(Nernst pin)으로, 여기에서 적절한 단색광기, 예를 들어 광학 격자 또는 몇 개의 광학 격자의 조합이 바람직하게는 이들 램프의 방출 스펙트럼을 좁히도록 연결된다. 여기 방사 유닛은 바람직하게는 주 파장을 여과하기 위한 소위 플라스마 선 필터 또는 상응하는 수단을 갖는다. 여기 방사 유닛은 또한 바람직하게는 레이저 광의 평행화를 위한 적어도 하나의 소위 대역 여파기(band pass filter) 또는 상응하는 수단을 갖는다.
바람직한 변형에서, 여기 방사선은 근적외선 범위에서 스펙트럼 분포를 갖는다. 700 내지 1200 ㎚ 파장이 바람직하다. 여기 방사선은 바람직하게는 약 785±60 ㎚, 더욱 바람직하게는 785±30 ㎚, 785±10 ㎚ 그리고 가장 바람직하게는 785 ㎚의 파장을 갖는다. 이론에 구애받지 않고, 액체 배지 또는 세포 조합이나 조직에서 살아있는 생물학적 세포의 라만 분광법을 위한 이 파장 범위는 다음과 같은 많은 장점을 갖는다: 액체 배지에서는 여기 방사선의 흡수가 허용될 만큼 낮고, 형광 방사선의 원치 않는 방출이 허용될 만큼 낮고, 조사를 받는 살아있는 세포의 광 기능 및 구조에 대한 손상 효과가 최소이다. 동시에, 이 파장 범위에서 여기하는 라만 산란 방사선은 세포-특이적 라만 스펙트럼(소위 지문 범위)의 기록을 용이하게 한다.
본 발명의 다른 변형에서는, UV 범위에서의 여기 방사선이 규정된다. 바람직한 파장은 200±50 ㎚이다. 따라서, 이어지는 조언은 또한 광학 매체의 재료 선택, 방사 강도 및 검출기 감도가 IR 분광학에 따라 적합화되는 UV-라만 분광학에도 적용된다.
라만 스펙트럼의 검출 및 기록을 위한 측정 시간을 더욱 줄이기 위해서는(시간 통합), 가능하다면 더 높은 강도의 여기 방사선이 사용되어야 한다. 이는 바람직하게는 50 ㎽ 보다 높은, 특히 50 내지 500 ㎽ 범위의 여기 에너지를 갖는 고에너지 레이저를 사용하는 것에 의하여 달성된다. 바람직한 변형에서는 약 100 ㎽의 레이저가 사용된다. 다이오드 레이저가 바람직하다. 본 분야의 당업자라면 조사되는 입자에 작용하는 방사 에너지가 특히 채용된 광학 시스템과 광학적 배열에 의존한다는 것을 알 것이다. 광학 디자인에 따라, 더 높거나 상응하는 더 낮은 방사 에너지를 갖는 광원이 요구된다. 측정 중에 생물학적 세포에 작용하는 방사 에너지는 라만 산란 방사를 위해 채용된 검출기의 신호/노이즈 비율 및 측정 시간에 의해 하향 한정된다: 이는 더 높은 에너지에서 일어나는 조사되는 세포의 생체 기능과 통합성에 대한 불리한 효과에 의해 상향 한정된다. 적어도 약 10 Joule에서 최대 300 Joule, 바람직하게는 약 100 내지 200 Joule의 방사선 에너지(조사되는 세포의 위치에 따라 계산되고 노출 시간에 따라 통합된)가 바람직하다.
본 장치는 바람직하게는 적어도 하나의 선 초점 유닛을 갖는다. 이는 필수적으로 선형 여기 구역의 형태로 생물학적 샘플, 특히 샘플 중에서 분석될 생물학적 세포 또는 입자에 여기 방사선 유닛에서 생산된 여기 방사선의 초점을 맞추는 데 적합하다.
따라서, 본 발명에 따른 장치는 측정 시간을 감소시키는 장점을 갖는데, 선형 여기 구역을 따라 동시에 몇 개의 포인트에서 측정이 가능하기 때문이다. 따라서, 조사되는 살아있는 생물학적 세포가 훨씬 더 잘 보호되도록 레이저 동력을 감소시킬 것이 제안된다. 선 초점화는 동시에 소위 선 스캔에 의하여 위치-해상된 측정을 허용하여 궁극적으로 개개의 입자 또는 생물학적 세포가 측정 구역에서 개별화된 방식으로 분석될 수 있게 된다.
선 초점은 바람직하게는 여기 방사선의 빔 경로에 있는 적어도 하나의 원통형 렌즈에 의하여 실행된다. 본 분야의 당업자라면 본 바명에 따라 제안되는 선 초점화 장치를 생산하기 위해, 선 초점을 발생시기기 위한 추가의 측정이 또한 적합하다는 것을 인식할 것이다.
선 초점화 장치는 바람직하게는 여기 방사선의 개선된 초점화를 위한 적어도 하나의 소위 빔 신장기(beam expander)를 갖는다. 초점화 장치는 바람직하게는 여기 방사선의 초점 빔이 측정 구역의 정상 표면에 30 ° 이하의 각도로 충돌하도록 디자인된다.
선 초점화 장치는 바람직하게는 측정 구역에 고정 배열된 입자 또는 생물학적 세포 위에 선형 여기 구역을 이동시키기에 적합하다. 이는 공지의 방식으로 디자인된 선 초점화 장치에 제공되는 적어도 하나의 스캐너 유닛에 의하여 가능하게 된다. 본 분야의 당업자라면 이러한 스캐너 유닛을 실행하기 위한 수단 및 적절한 측정에 익숙할 것이다. 선 초점화 장치는 바람직하게는 선형 여기 구역의 이동이 필수적으로 종방향 길이에 수직이 되도록 스캐너 유닛에 연결된다. 음향광학적 조율 필터(AOTF; acoustooptically tunable filter)가 스캐너 유닛으로 바람직하게 사용된다. 이는 디자인과 기능에 따라 이동하는 광학 부품을 갖지 않는다. 바람직하나 변형에서 측정 구역은 고정된 초점화 빔에 대하여 입자 또는 생물학적 세포와 함께 이동가능하다. 이는 바람직하게는 배양 접시기 연결되는 동력화된 샘플 홀더 또는 목적물 단(stage)에 의해 실행된다. 압력-작동되는 시스템이 여기에 적합하다.
바람직한 변형에서 본 발명에 따른 분석 유닛은 적어도 다음 요소를 포함하는 CCD(charge coupled device)-베이스의 라만 분광기이다:
여기 구역에서 방출되는 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분리를 위한 적어도 하나의 광학 격자 또는 유사한 수단;
임의로 스펙트럼-분리된 산란 방사선의 이미지 기록을 위한 위치-해상된 전기적 검출기를 위한 적어도 2-차원 CCD 어레이; 및
2-차원 CCD 어레이에 스펙트럼 분리된 산란 방사선의 이미지화를 위한 적어도 하나의 광학 장치.
분석 유닛은 바람직하게는 Czerny-Turner에 따른 라만 분광기로서 디자인된다. 대체용으로 라만 분광기는 바람직하게는 렌즈-베이스의 시스템이다. 분석 유닛은 바람직하게는, 선형 여기 구역의 스펙트럼 분리된 산란 방사선의 위치-해상된 이미지화를 위한 광학 장치가 2-차원 CCD 어레이에 이미지화되어, CCD 어레이의 제 1 차원에서 바람직하게는 선형 여기 구역이 종방향 길이를 따라 위치하도록 실제로 이미지화되고 CCD 어레이의 제 2 차원에서는 산란된 방사선의 스펙트럼 분포가 선형 여기 구역의 종방향 길이를 따라 각 포인트로부터 이미지화된다는 사실을 특징으로 한다. 이 디자인은 유리하게도, 특히 선 스캔 방법과 관련하여, 분석되는 입자 또는 생물학적 세포가 배열되는 측정 구역의 위치-해상된 재생을 허용한다. 위치에 대한 실제 측정 구역에서 입자 또는 생물학적 샘플의 국소적 라만 스펙트럼의 데이터 표시는 3- 및 바람직하게는 4-차원 배열의 형태로 나타나는데, 여기에서 첫 번째 2 개의 차원은 측정 구역의 폭과 종방향 길이에 상응한다. 제 3 및 임의로 제 4 차원에서, 분석된 영역의 각 위치로부터의 국소적 라만 스펙트럼은 특성 값 또는 "대역(band)"(제 3 차원), 또는 바람직하게는 여기 파장과 관련하여, 바람직하게는 파장 또는 파수(제 4 차원)에 따른 스펙트럼 강도 분포(제 3 차원)의 형태로 기록된다. 이 목적을 위해, 국소적 라만 스펙트럼(제 3 및 제 4 차원)이 제 1 측정 사이클에서 선 스캔 방법으로 제 1 여기 구역의 종방향 길이(제 2 차원)에 따른 위치에 동시에 기록된다. 추가의 측정 사이클에서, 이것은 전체 측정 구역의 폭 길이(제 1 차원)를 따라 제 2 및 추가의 여기 구역에 대하여 계속될 수 있다.
방출된 라만 산란 방사선의 분석 및 기록/검출을 위한 분석 유닛에 제공되는 CCD 어레이는 바람직하게는 200 내지 3500 ㎝-1의 파수를 갖는 스펙트럼 범위 또는 근적외선 범위에 특히 민감하도록 디자인된다. 본 분야의 당업자라면 이 목적을 위한 공지의 측정법을 제안할 것이다. 양호한 신호/노이즈 비율로 신속한 측정 시간(통합 시간; integration time)을 갖는 CCD 어레이의 디자인이 바람직하며, 특히 소위 개방 전극 CCD(open electrode CCD), 후방-박판 CCD(back-thinned CCD), 딥 디플레션 CCD(deep depletion CCD) 또는 전자 증폭기 CCD(electron multiplier CCD)가 바람직하다. 신호/노이즈 비율을 개선하기 위해, CCD 어레이는 바람직하게는 냉각되고; 바람직한 냉각 온도는 약 -50 ℃ 내지 약 -100 ℃이다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 본 발명에 따른 측정 구역에 고정되거나 보존된 입자의 현미경 또는 광학현미경 분석을 이미지화하기 위하여 장치는 바람직하게는 적어도 하나의 현미경-광학 유닛 또는 장치, 즉 현미경 유닛을 갖는다. 이러한 광학 유닛은 바람직하게는 DIS(differential interface contrast microscopy)를 위한, 바람직하게는 전환 가능한 위상차 광학기를 갖는 투과 현미경, 특히 바람직하게는 형광 현미경이다.
현미경 유닛은 바람직하게는 여기 방사선의 파장 범위 및 방출된 라만 산란 방사선의 파장 범위에서 충분한 투과를 갖는, 특히 이 파장 범위에 최적화된 광학 장치를 갖는다. 바람직하게는, 여기 방사선 유닛은 적절한 수단을 통해 현미경 유닛의 빔 경로에 결합된다. 예를 들어, 형광을 발생시키기 위해 형광 현미경에 보통 제공되는 광원은 본 발명에 따른 여기 방사선 유닛에 의해 보충 또는 대체된다.
적절한 광학적 수단, 특히 차단 필터를 통해, 현미경 유닛에서 여기 방사선이 바람직하게는 현미경 유닛에 의하여 기록된 방출된 라만 산란 방사선으로부터의 빔 경로로부터, 그리고 현미경 유닛의 이미지화 부분의 조명 빔 경로 및 관찰 빔 경로로부터 분리되는 것이 바람직하게 보장된다. 따라서, 보통의 현미경 시스템에서 본 발명에 따른 장치를 통합하는 것이 가능하게 된다. 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포의 분석을 위한 적절한 분석 장치는 또한 바람직하게는 현미경 유닛에 통합된다. 이는 바람직하게는 분석 유닛을 적절한 방식으로 관찰 빔 경로, 예를 들어 카메라 연결에 결합시키는 것에 의하여 달성된다.
여기 방사선 유닛에 추가하여, 현미경 이미지를 생산하기 위한 적어도 하나의 추가 조명원, 특히 형광 현미경을 위한 광원이 현미경 유닛에 통합될 수 있다. 이것은 통상 고압 수은 증기 램프이다. 현미경 유닛은 바람직하게는 형광 현미경의 실행을 위한 공지의 필터가 구비된다.
현미경 유닛은 또한 적어도 하나의 이미지 기록 유닛, 바람직하게는 장치 또는 생물학적 세포의 측정 구역에 배열된 입자로부터 얻어진 현미경 이미지의 추후 분석 및 기록을 위해 적절한 광학 장치를 갖는 CCD 카메라가 구비된다. 특히 바람직한 이미지 기록 유닛은, 현미경 유닛과 함께 기록된 입자 또는 생물학적 세포의 현미경 이미지를 분석하고, 분석의 결과를 표시 및/또는 저장하기 위해, 임의로 적절한 이미지 분석 알고리즘에 의해 적절하게 제공된 컴퓨터 유닛에 연결된다.
바람직한 변형에서, 장치는 적어도 하나의 컴퓨터 유닛을 갖는다. 이것은 방출된 라만 산란 방사선의 분석을 위해 바람직하게는 적어도 분석 유닛에 연결된다. 컴퓨터 장치는 또한 기록된 라만 스펙트럼의 특성(스펙트럼 특성)의 결정 및 기록된 입자의 현미경 이미지(이미지 특성)의 특성화에 적합하다. 컴퓨터는 또한 측정된 스펙트럼 특성 또는 이미지 특성을 저장된, 바람직하게는 예정된 스펙트럼 특성 또는 이미지 특성과 비교하는 데 적합하다. 본 장치는 바람직하게는 또한 적어도 하나의 메모리 요소를 갖는데, 이는 저장된 특성, 컴퓨터 유닛에서 수행되는 특성 비교의 결과 및 컴퓨터 장치에서 측정된 특성의 저장에 특히 적합하다. 본 장치는 또한 바람직하게는 적어도 하나의 출력 요소, 바람직하게는 디스플레이 요소를 갖는데, 이는 분석된 입자 또는 입자들의 분류화, 유형화, 특성화 및/또는 명세를 포함하는 적어도 하나의 특성 비교 결과를 디스플레이하는 데 적합하다. 즉시 수행된 특성 비교의 적어도 하나의 결과가 다음에 바람직하게 디스플레이된다. 대신에, 적어도 하나의 메모리 요소에 저장된 이전 특성 비교의 결과가 출력 또는 디스플레이된다. 본 장치는 또한 바람직하게는 분석된 입자의 현미경 이미지를, 임의로 라만 스펙트럼 및/또는 특성 비교의 결과와 함께 디스플레이하는 데 적합하다.
본 컴퓨터 장치는 또한 라만 스펙트럼의 특성 분석 결과와 함께 이미지 분석 결과를 계산하는 데 적합하여, 유체 셀, 즉 특히 생물학적 세포의 생물학적 액체로부터 보존된 입자의 명확한 특성화가 가능하다. 적어도 하나의 메모리 요소는 바람직하게는 또한 이미지 분석 결과 및 이미지 분석 결과의 계산 결과를 라만 스펙트럼의 특성 비교 결과와 함께 저장하는 데 적합하다. 적어도 하나의 출력 또는 디스플레이 유닛은 라만 스펙트럼의 특성 비교 결과, 및 특히 적어도 하나의 메모리 유닛에 임의로 기록된 이전 특정 또는 분석 결과 및 현재의 결과 모두와 함께, 바람직하게는 또한 광학 이미지 분석의 결과 및/또는 광학 이미지 분석의 결과의 계산 결과의 출력 또는 디스플레이에 적합하다.
본 발명에 따라 수행된 현미경 이미지의 평가를 통해, 현미경 이미지 데이터를 통하여, 국소화된 어떤 입자의 위치-해상된 기록된 국소적 라만 스펙트럼을 할당하는 것이 유리하게도 가능하게 된다. 이러한 방식으로, 어떤 입자, 바람직하게는 생물학적 샘플, 즉 특히 분석된 조직 단편, 세포 조합 또는 이식물에서 조직 세포의 분포, 배열 및 진동에 관한 주장이 가능하다.
본 발명의 다른 목적은 다음 바람직한 응용 또는 이들의 조합을 위한, 본 발명에 따른 상기 장치의 용도 및/또는 본 발명에 따른 상기 방법의 용도이다:
생물학적 샘플, 바람직하게는 멸균 및/또는 오염을 위한 액체의 비침습적, 비파괴적 제어를 위한 용도;
생물학적 샘플에 포함된 생물학적 세포의 선택 및/또는 비침습적, 비파괴적 특성화 또는 유형화를 위한 용도;
생물학적 샘플에 포함된 생물학적 세포의 분화 상태의 비침습적, 비파괴적 특성화를 위한 용도;
타생 또는 자가 이식물의 유형화의 비침습적, 비파괴적 특성화를 위한 용도.
도 1은 생물학적 액체를 위한 적어도 하나의 유입구(101)와 적어도 하나의 유출구(102)를 갖고, 구멍(115)을 갖는 유체 셀에 배열된 천공된 플레이트(110)을 갖는, 본 발명에 따른 유체 셀(100)의 모식도를 보여준다. 모식적으로, 생물학적 액체로부터 천공된 플레이트에 보존된 입자와 압력 구배에 따른 정미(net) 흐름(화살표)이 보여진다.
도 2는 생물학적 액체를 위한 적어도 하나의 유입구(101)와 적어도 하나의 유출구(102) 및 천공된 플레이트의 정상에 대하여 부분적 진공의 적용을 위한 제 1 천공된 플레이트(110)의 하향 바닥에 적어도 하나의 추가의 연결부(103)를 갖고, 유체 셀에서 하나가 다른 하나의 위에 평행하게 배열되고 구멍(115, 125)을 갖는 두 개의 천공된 플레이트(110, 120)를 갖는, 본 발명에 따른 다른 유체 셀(100)의 모식도를 보여준다. 생물학적 액체로부터 천공된 플레이트에 보존된 입자와 정미(net) 흐름(화살표)이 모식적으로 보여진다.
본 발명은 도 1 및 2와 본 발명의 교시에 대하여 제한적으로 해석되지 않는 다음 실시예에 의하여 더욱 구체화될 것이다.
1. 자가 연골 생검으로부터의 이식물의 멸균 및 품질 제어
재료 :
장치: 멸균 유리 피펫(5 또는 10 mL, Eppendorf Co.); 멸균 시린지; 안전 작업대(HERAsave, class Ⅱ, Heraeus Co.); 원심분리기(5810ㄲ, Eppendorf Co.); 유체 셀이 구비된 라만 분광기 뿐 아니라 광과 위상차 현미경이 구비된 본 발명에 따른 장치; 가스발생 인큐베이터(BBD 6220, Heraeus Co.)
용액: 콜라게나제(Worthington Biochemicals); 자가 인간 혈청(화나 자신의 혈액 샘플로부터 추출)
이식물: 환자로부터의 자가 연골 생검
생검의 이송은 생검에 포함된 세포를 위한 영양배지로도 기능하는 이송 배지에서 실시된다. 연골 조직의 저장은 8 ℃에서 24 내지 48 시간 실시한다.
실시 :
1.1 액체 생물학적 샘플의 분석
1. 이송 용기의 이송 배지 상등액 또는 상등액 일부(보통 총 상등액의 10%)의 피펫팅 및 검사. 마이크로홀 어레이에 의해 유체 셀에서 샘플 액체의 분석 전에, 예비필터를 가지고 세균 및 진균 포자 보다 유의적으로 큰 모든 입자(예를 들어, 3 ㎛ 보다 큰)를 임의로 여과한다.
2. 샘플을 멸균 조건에서 유체 셀의 주입 부위에, 임의로 하나 또는 두 개의 격막을 통해 유체 셀로 주입한다(멸균 시린지를 사용하여 멸균 벤치에서). 유체 셀은 임의로 직접 이송 용기에 연결된다.
3. 유체 셀의 천공된 플레이트의 마이크로홀(홀 어레이; 필터 칩)를 샘플 액체 또는 과잉 대체물로 통과시킨다. 미세공의 크기는 분석과 관련된 입자, 세균 세포, 진균 포자 등이 구멍을 통과할 수 없고 그 위에 위치하도록 다음과 같이 선택된다:
- 유체 셀의 제 1 실시예에서 구멍은 1 ㎛의 직경을 갖고 홀 어레이의 표면은 10 ㎜×10 ㎜의 크기를 갖는다. 10 ㎛의 홀 격자를 갖는 홀 그레이에 1,002,001 개의 구멍이 있다.
- 유체 셀의 제 2 실시예에서는, 분광학적으로 특성화될 수 있는 입자의 개수를 최대값으로 증가시키거나 광학적 및 분광학적 특성화 또는 개별 특성(2 ㎛ 보다 작거나 2 ㎛ 보다 크거나 같은)에 따른 분류 전에 입자를 예비분류하기 위해, 다른 구멍 크기(2 ㎛ 및 1 ㎛)를 갖는 홀 어레이가 서로의 뒤에 연결된다.
- 유체 셀의 제 3 실시예에서는 유동 채널이 홀 어레이 뒤에 연결되고, 여기에 홀 어레이의 구멍 보다 작은 입자가 연속하여 분류 및 특성화를 위한 광학기로 사입된다. 채널 폭은 광학기의 초점 크기에 따라 조정된다. 임의로, 입자는 동력장(음장, 전자기장)을 발생시키기 위한 장치에 의한 특성화 동안 위치에 고정된다.
어레이-유사 구멍에 입자를 위치시키는 것은 이러한 방식으로 시행된다.
4. 다음 단계에서는, 유체 셀의 측정 구역에 배열된 입자의 현미경 검사 및 이미지 분석 소프트웨어를 통해 인간 세포, 세균, 진균, 포자 및 다른 입자 뿐 아니라 인공물의 구분/범주화가 실시된다. 이미지 평가는 또한 측정 구역에서 입자/세포의 국소화를 위해서도 작용한다.
이송 배지의 무세포 부분의 라만 스펙트럼의 판독은 임의로 샘플 또는 세포의 실제 라만 신호의 추출을 위한 비교용으로서 시행된다.
5. 데이터베이스의 비교 스펙트럼에 의해 세포 타입(여기에서는: 연골세포 및 섬유모세포) 및 다른 미생물(예를 들어, 클로스트리듐 스포로게네스(Clostridium sporogenes, DSM 1664), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli, DSM 498), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis, DSM 347). 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus, DSM 799, 346). 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa, DSM 1128). 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger, DSM 1957). 칸디다 알비칸스(Candida albicans, DSM 1386))의 구분을 위한 국소화된 세포의 라만 분광학적 조사 및 얻어진 스펙트럼을 상응하는 비교값(특성, 특성 인자, 지시 밴드)과 비교.
세포, 특히 미리 얻어진 생체 세포의 비교 스펙트럼에 의해 제제 중 연골세포의 상태 또는 품질의 제 1 제어를 임의로 실시한다.
측정 지속시간: 필수 요구에 따라 약 1 내지 48 시간. 예를 들어, 멸균 제어는 샘플에 함유된 입자의 현미경 평가를 통해 라만 분광법에 추가하여 실시되고 지속시간은 여기에서 1 내지 12 시간이다. 다음에 어떤 오염의 할당 및 세포 생존력의 제어가 필요에 따라 2 내지 36 시간의 기간에 걸쳐 실시된다.
1.2 혈청의 멸균 시험
자가 혈청을 얻기 위해 기관/조직 공여자로부터 채취한 혈액 샘플의 헤마토크릿(고형 혈액 성분)을 원심분리한 후이식물의 세포 배양을 위해 영양 배지에 넣고 혈청 또는 이로부터 얻은 부분(혈청의 10%가 표준)의 멸균 시험을 1.1의 단계 1 내지 5에 따라 유체 셀에서 실시한다. 측정 지속시간: 약 1-12 시간.
자가 혈청의 회수는 헤마토크릿(고형 혈액 성분)의 원심분리에 의해 실시된다. 다음에 이 혈청을 이식물의 세포 배양을 위한 영양 배지에 넣는다. 추가 단계와 병행하여 다른 혈청학적 시험을 위한 혈액 샘플을 바이러스(예를 들어, HIV)와 세균 독소 오염을 배제하기 위해 외부 구역으로 보낸다(예를 들어, 내독소의 일반 검출을 위한 LAL 시험을 통해).
1.3 이식물 품질의 공정 중 제어
오염의 검출이 음성이고 얻어진 세포가 비교 스펙트럼에 따라 생체 세포의 명세 내에 있음이 입증되면, 분리된 세포의 재배양 및 자가 이식물의 증가를 실시한다.
콜라게나제에 의한 조직-특이적 세포의 분리, 이 세포를 10% 환자 혈청이 포함된 영양 배지로 이송한 후, 이들은 천연 콜라겐 매트릭스(Ars Arthro Co.)로 넣는다. 배양은 인큐베이터에서 개시되며(예를 들어, 최적 및 일정한 배양 조건을 위해서는 온도 37 ℃ 및 CO2 함량 5%); 총 배양 시간은 보통 10 내지 14일이다.
최초 5 내지 7 일이 지난 후, 배지의 상등액으로부터의 샘플의 공정 중 제어는 멸균, 조직-특이적 세포 및 이식물의 생존력을 위해 실시된다. 다음에 공정은 1.1에 따라 실시된다.
1.4 ECM 분석
또한, 배양 동안 세포가 묻힌 매트릭스의 제 1 분석이 실시된다(ECM). 세포가 묻힌 이 매트릭스는, 예를 들어 주로 분리된 콜라겐 타입 Ⅰ로 구성된다. 그러나, 배양에서는 일정 시간 후 생체 연골세포 주위에 내인성 매트릭스가 형성되는데, 이는 주로 콜라겐 타입 Ⅱ로 구성된다. 이들 두 가지 콜라겐 타입은 라만 스펙트럼에서 구분 가능하다.
이 목적을 위해, 배지의 상등액에 용해된 분획을 본 발명에 따른 장치에서 분광학적으로 분석한다.
1.5 전체 제제의 분석
1.1 내지 1.4의 보충으로서, 이식물 표면의 개별 세포를 비교 스펙트럼에 의해 생체 또는 비생체로서 분류한다. 이들 측정은 본 발명에 따라 샘플 홀더 유닛으로 배양 접시에서 직접, 전체 이식물에 대하여 직접 실시된다. 이 목적을 위해, 배 양 접시는 회수되고 본 발명에 따른 장치에 장착되고 측정된다.
1.6 최종 제어
이식물의 생산 후에는 최종 제어가 필요하며, 이는 1.4에 기술된 방법에 따른다.
결과 :
여기에서 측정 시간은 24 시간까지 감소된다. 이식물이 환자에게 24 내지 48 시간 이내로 이식될 수 있고 세포의 기능적 능력이 보존되므로, 본 발명에 따라 달성된 속도는 매우 유리하다. 본 발명에 따른 최종 제어에서는, 환자에게 이식하는 시간에 이식물이 오염되지 않는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 주로 생물학적 샘플, 바람직하게는 세포 조합, 조직, 세포 현탁액 또는 생물학적 액체에서 생물학적 세포의 다루기 쉽고, 신속하고 비침습적이며 비파괴적인 검출 및 특성화 수단 및 방법을 제공한다.
Claims (40)
- - 샘플 홀딩 유닛에 생물학적 샘플의 고정화 단계;- 생물학적 샘플, 샘플 내에 포함된 입자 또는 생물학적 샘플 및 샘플 내에 포함된 입자의 현미경사진 이미지 데이터의 분석에 의한, 생물학적 샘플에 포함된 입자의 범주화 단계; 및- 생물학적 샘플의 영역에 위치할 수 있는 측정 구역 내에서 생물학적 샘플의 라만 분광학적 분석 단계를 포함하고,여기에서,측정 구역은, 설정된 기준에 따른 범주화의 결과를 근거로 하여, 생물학적 샘플의 입자 또는 특정 부위에 자동적으로 위치하고,라만 분광학적 분석은 이 측정 구역의 영역으로 제한되며,유체 셀로 구성된 샘플 홀더 유닛을 통해 생물학적 액체인 생물학적 샘플을 흐르게 하여, 생물학적 샘플에 포함된 모든 입자가 적어도 분석기간 동안 측정 구역 내에 보존되고 거기에서 가역적으로 고정됨으로써, 생물학적 샘플이 가역적으로 고정되며,유체 셀 중의 입자는 유체 셀내에 배열되는 하나 이상의 천공을 갖는 적어도 하나의 천공된 플레이트에 의해 보존되고,천공된 플레이트는 선 및 컬럼의 규칙적인 어드레스 가능한 어레이의 형태로 배열된 천공 또는 구멍을 갖는 것을 특징으로 하는,액상의 생물학적 샘플의 광학-분광학적 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 측정 구역이 "생물학적 세포" 및 "비생물학적 세포, 인공물"으로 이루어진 예정된 범주에 속하는 샘플에 존재하는 적어도 하나의 입자에 위치하는 방법.
- 제1항에 있어서, 입자의 범주화가 "생물학적 세포" 및 "비생물학적 세포, 인공물"의 범주로 일어나는 방법.
- 제3항에 있어서, "생물학적 세포" 범주에서의 범주화가 "세균 세포, 진균 세포, 세균 포자, 진균 포자" 및 "조직 세포" 범주로 일어나는 방법.
- 제4항에 있어서, "조직 세포" 범주에서의 범주화가 "생체 세포" 및 "비생체 세포" 범주로 일어나는 방법.
- 제4항에 있어서, "조직 세포" 범주에서의 범주화가 "분화된 세포" 및 "탈분화된 세포" 범주로 일어나는 방법.
- 제1항에 있어서, 라만 산란 방사의 스펙트럼 분석이, 측정 구역 내의 몇 개의 선형 여기 구역 [i...i+n] 의 형태로 생물학적 샘플에 대한 여기 방사선의 순차적 초점화에 의해 행해지는 방법.
- 제7항에 있어서, 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분석이 2-차원 CCD 어레이 검출기에 의한 위치-해상 스펙트럼 분석에 의해 행해지고, 여기에서, CCD 어레이의 제1차원에서는 선형 여기 구역 i가 그의 종방향 길이를 따라 위치하도록 실제로 이미지화되고, CCD 어레이의 제2차원에서는 상기 여기 구역의 종방향 길이에 따라 각 점으로부터 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분포가 이미지화되며, 국소적 라만 스펙트럼을 위치-해상에 의해 기록하여 행해지는 방법.
- 제8항에 있어서,- 제1여기 구역 i에서 국소적 라만 스펙트럼의 제1군이 제1측정 사이클에 기록되고,- 다음 제2측정 사이클에서 제1여기 구역 i와 인접한 제2여기 구역 i+1 에서 국소적 라만 스펙트럼의 제2군이, 여기 방사의 선형 초점을 측정 구역에 고정된 생물학적 샘플에 대한 제1위치로부터 제2위치까지 측정 사이클 사이로 이동시킴으로써 기록되며,- 추가의 국소적으로 인접한 여기 구역 i+n 에 대한 추가적인 측정 사이클이 반복되고, 모든 여기 구역 [i...i+n] 의 국소적 라만 스펙트럼의 군들이 측정 구역에 고정된 생물학적 샘플의 위치-해상된 스펙트럼 분포 패턴의 전체 이미지(라인 스캔)로 조합되는 방법.
- 제1항에 있어서, 적어도 하나의 라만 스펙트럼으로부터의 유형별 특성의 결정 및 결정된 유형별 스펙트럼 특성과 저장된 스펙트럼 특성의 비교에 의한 측정 구역에서 분석된 입자 또는 생물학적 샘플의 특성화 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 현미경 사진 이미지 데이터로부터의 유형별 특성의 결정 및 결정된 이미지 특성과 저장된 이미지 특성의 비교에 의한 측정 구역에서 분석된 입자 또는 생물학적 샘플의 특성화 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 설정된 기준에 따른 결정된 특성의 비교로부터, 생물학적 샘플 또는 그 안에 포함된 입자의 특성화가 속, 종, 분화의 정도, 생명력 및 화학적 조성 중에서 선택되는 변수로 일어나는 방법.
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- 삭제
- 제1항에 있어서, 입자가 천공된 플레이트의 반대쪽 "바닥"의 방향으로 동적 또는 정적 압력 구배의 임의적 일시적 적용에 의해 천공된 플레이트의 "정상"에서 생물학적 액체로부터 고정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 각 입자가 천공된 플레이트의 각 천공에 정확하게 고정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 유동 방향으로 유체 셀에서 다른 것 뒤에 하나와 연결되고 여러 가지 천공 직경을 갖는 몇 개의 천공된 플레이트 상에서 크기에 따른 입자의 분리에 의한 분석될 입자의 예비선택 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 측정된 스펙트럼 또는 이미지 특성에 의해 생물학적 액체에서의 모든 오염의 검출 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 생물학적 액체 내 감염성 입자의 존재가 생물학적 액체의 측정된 특성과 감염성 입자의 저장된 특성 간의 일치로 증명되고, 생물학적 액체의 오염 없음이 생물학적 액체의 측정된 특성과 감염성 입자의 저장된 특성 간의 일치 부족으로 증명되는 방법.
- 제7항에 있어서, 여기 방사선이 785±60 ㎚ 또는 250±50 ㎚의 파장을 갖는 방법.
- - 측정 구역에서 생물학적 샘플의 고정을 위한 샘플 홀더 유닛;- 측정 구역 내의 여기 구역에서 여기 방사에 의한 라만 산란 방사선의 여기를 위한 여기 방사 유닛; 및- 생물학적 샘플의 여기 구역에서 방출된 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분석을 위한 분석 유닛을 포함하고,여기에서,생물학적 샘플이 생물학적 액체이고;샘플 홀더 유닛이 생물학적 액체에 의해 통과 가능한 유체 셀이고, 유체 셀이 유체 셀의 측정 구역에서 생물학적 샘플에 함유된 모든 입자의 보존 및 가역적인 일시적 고정을 위한 수단을 가지며,유체 셀이 유체 셀 내의 입자를 보존하는 수단으로서 제1직경을 갖는 하나 이상의 천공을 포함하는 적어도 하나의 제1천공된 플레이트를 가지며,천공된 플레이트는 선 및 컬럼의 규칙적인 어드레스 가능한 어레이의 형태로 배열된 천공 또는 구멍을 갖는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플의 광학-분광학적 분석 장치.
- 삭제
- 제20항에 있어서, 제1직경이 1 ㎛ 이하인 장치.
- 제20항에 있어서, 유체 셀이 제2직경을 갖는 하나 이상의 천공을 포함하는 제2천공된 플레이트를 갖고, 제2천공된 플레이트가 유체 셀을 통해 생물학적 액체의 유동 방향에서 제1천공된 플레이트의 상향으로 배열되며, 제2직경이 제1직경보다 큰 장치.
- 제23항에 있어서, 제2직경이 2 내지 6 ㎛인 장치.
- 제20항에 있어서, 천공된 플레이트의 천공이 규칙적인 구조로 배열되는 장치.
- 제20항에 있어서, 유체 셀이 유체 셀의 입자를 보존하는 수단으로서 적어도 하나의 미소액체 유동 채널을 갖는 장치.
- 제20항에 있어서, 유체 셀이 적어도 여기 구역의 영역에서 규산염 유리, 석영 유리, 규소 유리, 이산화규소 유리, 질화규소 유리, 불화칼슘 유리, 불화바륨 유리, 셀렌화아연 유리, 황화아연 유리 및 게르마늄 유리 중에서 선택되는 방사선-투명 재료를 갖는 장치.
- 제20항에 있어서, 선형 여기 구역의 형태로 유체 셀에 보존된 입자에 여기 방사 유닛의 여기 방사선의 초점을 맞추는 선 초점화 유닛을 추가로 포함하는 장치.
- 제28항에 있어서, 선 초점화 유닛이 선형 여기 구역을 그 종방향 길이를 가로질러 보존된 입자 위로 이동시키는 스캐너 유닛을 추가로 갖는 장치.
- 제20항에 있어서, 보존된 입자의 광학 이미지가 이미지 기록 시스템에 이미지화되는, 보존된 입자의 현미경 사진 이미지 분석을 위한 현미경 유닛을 추가로 포함하는 장치.
- 제30항에 있어서, 현미경 유닛이 위상차/형광 투과 현미경인 장치.
- 제20항에 있어서, 분석 유닛이 다음을 포함하는 장치:- 라만 산란 방사선의 위치-해상 전기적 검출을 위한 2-차원 CCD 어레이;- 생물학적 샘플의 여기 구역에서 방출되는 라만 산란 방사선의 스펙트럼 분리를 위한 광학 격자; 및- 제1차원에서 여기 구역이 그 종방향 길이를 따라 위치하도록 실제로 이미지화되고 제2차원에서 각 포인트의 스펙트럼 분포가 여기 구역의 종방향 길이를 따라 이미지화되도록, CCD 어레이 상에서 여기 구역으로부터 스펙트럼 분리된 라만 산란 방사선의 위치-해상 이미지화를 위한 광학 장치.
- 제20항에 있어서, 분석 유닛이 렌즈-기반 라만 분광기로서 구성되는 장치.
- 제20항에 있어서, 분석 유닛이 200 내지 3500 ㎝-1의 범위에서 라만 산란 방사선에 대한 최적화된 검출 감도를 갖는 장치.
- 제20항에 있어서, 다음을 추가로 포함하는 장치:- 결정된 특성과 저장된 특성을 비교하고 특성의 비교 결과를 결정하기 위해, 분석 유닛에 의해 기록된 라만 스펙트럼의 특성의 결정을 위한 컴퓨터 유닛;- 저장된 특성, 결정된 특성 및 컴퓨터의 특성 비교 결과의 저장을 위한 메모리 요소; 및- 특성 비교 결과를 디스플레이하기 위한 디스플레이 요소.
- 제20항, 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 및 오염에 대한 생물학적 액체의 비침습적, 비파괴적 제어를 위한 장치.
- 제20항, 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 액체에 포함된 생물학적 세포의 비침습적, 비파괴적 선택 또는 유형의 특성화를 위한 장치.
- 제20항, 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 액체에 포함된 생물학적 세포의 분화 상태의 비침습적, 비파괴적 특성화를 위한 장치.
- 제20항, 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 또는 조직 부위의 비침습적, 비파괴적 특성화 또는 유형화를 위한 장치.
- 제20항, 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 타생 또는 자가 이식물의 비침습적, 비파괴적 특성화 또는 유형화를 위한 장치.
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