KR101489710B1 - 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 자주구슬초를 당 분해효소로 처리하여 추출함으로써 제조되는 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 피부미백용 및 피부자극완화용 화장료조성물이 제공된다.

Description

자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing enzymatic extracts from Pratia nummularia}
본 발명은 자주구슬초(Pratia Nummularia) 추출물을 함유하는 화장료에 관한 것으로서, 구체적으로는 자주구슬초를 당 분해효소 처리하여 제조되는 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부미백 및 피부자극완화 효과가 우수한 화장료를 제조하는 기술에 관한 것이다.
피부 멜라닌 세포의 활동에 의하여 피부에 색소가 침착된다. 이 멜라닌 세포에 의하여 생성되는 멜라닌 색소가 인종간 또는 사람들간의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요소가 된다. 멜라닌은 크게 검은색/갈색을 띄는 유멜라닌(eumelanin)과 빨간색/노란색을 띄는 페오멜라닌(pheomelanin)의 두 가지 종류로 나눌 수 있다. 이들 두 가지 멜라닌의 비율이 피부색을 결정하는데 중요한 역할을 하게 된다. 피부가 까만색에 가까워질수록 유멜라닌의 비율이 많아지게 되고, 피부색이 옅어지게 될수록 유멜라닌은 줄어들고 페오멜라닌의 비율이 많아지게 된다.
한편 멜라닌 세포는 유해한 자외선 중 일부를 흡수하는 기능을 하기도 하며, DNA 수리 효소들을 가지고 있어 UV 피해를 회복하도록 돕는 역할을 담당하므로, 이러한 효소들을 만드는 유전자가 결핍된 사람들은 피부암에 걸릴 확률이 높다. UV 광선으로 인해 생성되는 두드러진 생성물인, 해로운 흑색종은 특별히 위험하여, 매우 빠르게 퍼지고, 종종 사람을 사망에 이르게 할 수도 있다.
멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 세포의 멜라노좀에서 티로시나아제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 멜라닌의 합성은 호르몬, 자외선이나 유전적인 요인에 의해서도 영향을 받는 것으로 알려져 있다.
종래, 아스코르빈산, 하이드로퀴논, 코직산, 알부틴과 같은 물질이 티로시나아제 저해 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀져, 미백 화장료로 이용되어 왔으나, 이들은 화장품 제형 중에서의 안정성이 낮아 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 피부에 대한 안전성 문제 야기 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 이에 따라 화장품 업계에서는 안전하면서도 미백활성이 우수한 천연물을 함유하는 화장료의 개발에 힘을 써 왔다.
일 예로써 대한민국 공개특허 제2012-0036417호에는 참다시마 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2009-0092364호에는 녹두를 효모 또는 유산균으로 배양하여 얻은 녹두 발효액을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있다.
본 발명자들은 미백활성을 가지는 천연물에 대한 연구를 하던 중 자주구슬초에 특정한 생물전환기술을 적용하는 경우 그 미백활성이 우수할 뿐 아니라, 자외선 등에 의한 피부자극을 완화하는 활성을 가지는 추출물이 제조되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명은 자주구슬초의 당분해효소 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 피부자극완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 자주구슬초에 생물전환기술을 적용하여 미백활성 및 피부자극완화활성이 우수한 자주구슬초 추출물 및 이를 함유하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 자주구슬초 당 분해 효소 추출물은 화장료조성물 전체 중량에 대하여 0.001~50중량% 함유된다. 상기 화장료 조성물은 피부미백이나, 피부자극완화를 위하여 사용될 수 있다.
상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 락타아제 및 키시라나제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소에 의하여 처리되어 제조되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 펙티나아제에 의하여 처리되어 제조되는 것이다. 이와 같은 당분해효소 처리에 의한 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 그 활성성분, 특히 리나린(linarin)이 강화된다. 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부미백활성을 가지며, 또한 자외선으로 인한 피부의 염증 매개 인자 발현 억제를 통해 피부의 염증을 억제 및 완화하는 활성을 가진다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
자주구슬초 100중량부에 대하여 1~10 중량부의 당 분해효소를 첨가하여 추출하는 효소추출단계; 잔사를 제거 및 여과하여 얻은 효소추출물을 동결건조하는 단계; 및 상기 동결건조된 효소추출물을 유기용매로 다시 추출하는 단계를 포함하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법이 제공된다. 이 때, 상기 효소추출단계는 pH 4.0~7.0, 30~60℃의 조건에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 당 분해효소는 펙티나아제인 것이 더욱 바람직하다. 상기 유기용매로는 에탄올이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 당 분해효소 처리되어 제조된 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 티로시나제 억제 효과 및 멜라닌 생성 억제효과가 우수할 뿐 아니라, 자외선 등에 의한 염증매개인자의 발현 억제효과를 나타내어 피부미백용 및 피부자극완화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 자주구슬초는 학명이 Pratia Nummularia로 동남아시아와 중국남부지방이 원산지이며, 우리나라에서는 "구슬초, 자주구슬초, 자주구슬붕이, 애기부채꽃" 이라고 불린다. 물을 좋아하며, 강한 태양빛 보다는 부드러운 일조량에서 잘 자라는 반양지 식물이다. 자주구슬초의 열매는 녹색에서 점점 보라빛으로 변하게 되는데, 이때 그 열매를 따서 반으로 자르면 씨앗이 나오고 이 씨앗을 심으면 번식이 가능하며 줄기를 잘라 삽목해도 번식이 잘된다. 자주구슬초에는 디오스민(diosmin), 리나린(linarin), 아피제닌(apigenin), 7-O-루티노사이드(7-O-rutinoside), 루테올린(luteolin), 폴리아세틸렌(lobetyolin) 성분 등이 함유되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~50중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 자주구슬초를 당 분해효소, 구체적으로는 α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 락타아제 및 키시라나제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소로 처리하여 생물전환시킨 추출물이다. 이와 같은 효소처리에 의하여 자주구슬초의 미백활성 및 피부자극완화활성 성분이 강화되었는데, 특히 리나린(Linarin) 성분이 크게 강화됨을 확인할 수 있었다. 상기 당결합 분해효소들은 각각 또는 2 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 특히 펙티나아제를 처리한 경우에 그 활성의 증가가 가장 크게 나타났다.
이하, 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법을 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 먼저 당 분해효소에 의하여 효소추출하는 공정을 먼저 수행한 후에 다시 유기용매로 추출하는 경우에 그 효율이 더욱 우수한 것으로 확인되었다. 구체적으로는 건조된 자주구슬초 100중량부에 대하여 1~10 중량부의 당 분해효소를 첨가하여 추출하는 효소추출단계; 잔사를 제거하고 여과하여 얻은 효소추출물을 동결건조하는 단계; 및 상기 동결건조된 효소추출물을 유기용매로 다시 추출하는 단계를 포함하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법이 제공된다. 이 때, 상기 효소추출단계는 pH 4.0~7.0, 30~60℃의 조건에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 당 분해효소는 펙티나아제인 것이 더욱 바람직하다. 상기 유기용매로는 에탄올이 사용되는 것이 바람직하다.
즉, 자주구슬초를 당 분해효소에 의하여 효소추출하는 공정을 먼저 수행하여 자주구슬초의 세포벽을 효소를 이용하여 분해한 후, 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성억제, 염증매개인자 발현억제 효과가 우수한 활성성분이 잘 추출될 수 있도록 할 수 있다. 특히 자주구슬초를 효소추출하는 경우 당 분해효소로서 펙티나아제를 사용하는 경우에 미백작용 및 피부자극완화 활성이 우수한 활성성분이 더욱 잘 추출되었다. 펙티나아제는 식물의 세포벽 성분인 다당류를 가수분해하는 효소로서 자주구슬초의 세포벽 성분이 효소적 가수분해가 이루어지면서 세포벽이 파괴되어 리나린(Linarin)을 비롯한 유용한 활성물질들이 더욱 잘 추출되도록 할 수 있다. 동결건조된 효소추출물로부터 유기용매 추출하는 경우 에탄올을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 일 구체예에 따르면 동결건조된 효소 추출물 100중량부를 기준으로 에탄올을 500~1000 중량부 첨가하고 상온에서 20~25시간 동안 추출하여 리나린(Linarin)과 같은 활성성분이 강화된 자주구슬초 추출을 얻을 수 있다.
이와 같이 제조된 본 발명의 자주구슬초 추출물은 HPLC 분석을 통해 리나린(Linarin) 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였고(시험예 1), 효소별 추출물의 활성산소 소거효과시험(시험예 2)을 통해 활성산소 소거능이 우수하다는 것을 확인하였다. 또한 자외선 조사에 의한 세포 독성의 완화 효과(시험예 3)와, 염증매개인자의 발현억제효과(시험예 4)도 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한 티로시나제 저해효과(시험예 5), 멜라닌 생성억제 효과(시험예 6)에 있어서도 우수한 효과를 확인 할 수 있었다. 본 발명의 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제조하여 임상 시험을 수행한 결과 피부자극완화 효과(시험예 7)와 미백 효과(시험예 8)가 우수함을 확인하였다.
본 발명의 자주구슬초 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.
[실시예]
이하 실시예와 시험예 들을 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: 자주구슬초 추출물 제조
채취한 자주구슬초를 이물질이 없이 잘 세척한 후에 통풍이 되는 음지에서 반건조를 시킨 후, 세절한 자주구슬초 50 g에 정제수 1 kg을 넣고, 추출기를 이용하여 40 ~ 50℃ 중탕 조건에서 24시간 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과한 후 여액을 3000rpm으로 원심 분리시켜 불순물을 제거한 상층액을 취하여 동결건조시켜 17.86 g의 고형분을 얻었다.
실시예 1 ~ 5: 효소추출공정을 이용한 자주구슬초 효소 추출물 제조
상기 비교예 1에서 준비된 건조 자주구슬초 분말 1g을 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 각각의 효소 종류에 따라 최적 pH가 설정된 완충용액 100ml에 넣고 각각의 효소들을 첨가하여 12시간 동안 효소추출공정을 실시하였다. 사용된 효소는 표 1에서와 같이 5 종류이며 사용된 완충용액은 pH 4.0 ~ 8.0의 인산완충용액을 사용하였다. 효소 추출공정을 통하여 가수분해되지 않은 잔사를 제거하기 위하여 30분간 원심분리를 하여 각각의 효소별 추출물을 얻었다. 또, 자주구슬초 효소추출물을 동결건조시켜 -20℃에서 보관하였다.
효소의 종류 첨가량 pH 온도(℃)
실시예 1 α-아밀라아제 10 mg 4.5 50
실시예 2 펙티나아제 10 mg 6.0 40
실시예 3 셀룰라아제 10 mg 8.0 50
실시예 4 락타아제 10 mg 6.0 50
실시예 5 키시라나제 10 mg 7.0 50
실시예 6 ~ 10: 유기용매 추출 공정을 이용한 자주구슬초 효소 추출물 제조
상기 실시예 1~5의 동결건조된 효소추출물 분말을 유기용매인 에탄올을 사용하여 다시 추출하였다. 즉, 동결건조된 효소추출물 1g에 에탄올을 1kg을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 상온에서 24시간 동안 추출을 하였다. 잔사를 제거하기 위하여 30분간 원심분리하여 유기용매 추출공정을 이용한 자주구슬초 효소 추출물을 얻었다.
시험예 1: HPLC에 의한 리나린(Linarin) 정량 시험
상기 비교예 1 및 실시예 1 ~ 10에서 제조한 자주구슬초 추출물, 효소 처리된 자주구슬초 추출물 및 유기용매 추출 공정을 이용한 자주구슬초 효소 추출물 각각 10㎎/㎖에 대하여 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 통한 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Linarin 함량 (mg/g)
비교예 1 12.5
실시예 1 12.7
실시예 2 18.6
실시예 3 13.8
실시예 4 13.5
실시예 5 14.2
실시예 6 15.8
실시예 7 20.1
실시예 8 15.4
실시예 9 14.3
실시예 10 15.2
상기 표 2에서 나타나는 바와 같이 활성 물질인 리나린(Linarin)이 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리 된 자주구슬초에 높게 포함되어 있음을 알 수 있다. 또한, 효소처리공정을 먼저 수행한 후, 다시 용매추출한 실시예 6~10에서 더욱 높은 함량을 나타내었다. 당 분해효소 중에서는 펙티나아제 처리 된 자주구슬초 추출물에서 리나린(Linarin) 함량이 가장 높음을 알 수 있었다.
시험예 2: 효소별 추출물의 활성 산소 소거 효과 시험
비교예 1 및 실시예 1~10에서 수득한 자주구슬초 추출물, 효소 처리된 자주구슬초 추출물 및 유기용매 추출 공정을 이용한 자주구슬초 효소 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, BHT를 비교샘플로 하여, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. 항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성된 활성산소를 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응시켜 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였으며, 구체적인 활성산소 소거율 측정방법은 다음과 같다. 바이알(5ml vial)에 0.05M Na2CO3 2.4ml, 3mM 크산틴 용액 0.1ml, 3mM EDTA 용액 0.1ml, BSA 용액 0.1ml 및 0.72mM NBT 용액 0.1ml를 가하고, 여기에 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 0.1(wt/v)%농도로 제조한 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 그 후 크산틴 옥시다제 용액 0.1ml을 가하여 빨리 교반하고 25℃ 에서 20분간의 배양을 개시한다. 그 후 6mM CuCl2 용액 0.1ml을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 크산틴 옥시다제 용액 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다. 효과의 결과는 하기 식에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕× 100
St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도
처리농도(w/v%) 항산화효과(%)
비교예 1 0.1 82
실시예 1 0.1 83
실시예 2 0.1 88
실시예 3 0.1 85
실시예 4 0.1 82
실시예 5 0.1 84
실시예 6 0.1 87
실시예 7 0.1 91
실시예 8 0.1 87
실시예 9 0.1 83
실시예 10 0.1 86
BHT(butylated hydroxyanisole,
DUKSAN KOREA)		 0.1 80
상기 표 3에서 나타나는 바와 같이 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리 된 자주구슬초에서 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
시험예 3: 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과 확인
C57/BL6유래의 melanoma cell line인 B16 melanoma 세포를 1×105 cells/well의 농도로 96 well plate에 배양하고 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지 0.2ml를 공급한 후 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 시료용액을 처리 한 다음 2MED의 자외선 양을 10분간 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1ml을 가한 후 4시간 동안 배양한 다음 배지는 제거하고 RPMI 0.2ml를 넣어 형성된 포마잔을 ELISA를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 BHT를 사용하였다.
처리농도(w/v%) 세포 생존율(%)
비교예 1 0.1 85
실시예 1 0.1 86
실시예 2 0.1 90
실시예 3 0.1 87
실시예 4 0.1 85
실시예 5 0.1 87
실시예 6 0.1 87
실시예 7 0.1 92
실시예 8 0.1 87
실시예 9 0.1 86
실시예 10 0.1 88
BHT(butylated hydroxyanisole, DUKSAN KOREA) 0.1 81
상기 표 4에서 나타나는 바와 같이 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리 된 자주구슬초에서 우수한 세포 독성 완화 효과를 나타내었다.
시험예 4: 자외선 조사에 의한 염증매개인자 발현 억제효과 확인
RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×105 cell/well로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 시료를 처리하고 2 MED의 자외선 양을 10분간 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 생성된 TNF-α의 발현양은 RT-PCR을 수행하여 측정한 값을 측정하였다. TNF-α 발현억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
TNF-α 발현억제율(%) = (시료 TNF-α 발현양/ 대조군 TNF-α 발현양)×100
처리농도(w/v%) TNF-α 발현억제율(%)
비교예 1 0.1 83
실시예 1 0.1 84
실시예 2 0.1 88
실시예 3 0.1 86
실시예 4 0.1 85
실시예 5 0.1 84
실시예 6 0.1 84
실시예 7 0.1 90
실시예 8 0.1 87
실시예 9 0.1 88
실시예 10 0.1 86
BHT(butylated hydroxyanisole, DUKSAN KOREA) 0.1 0
상기 표 5에서 확인되는 바와 같이 0.1(w/v)% 농도에서 시험한 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리 된 자주구슬초에서 우수한 TNF-α 발현 억제 효과를 나타내었다. 특히, 펙티나아제 처리 된 자주구슬초 효소 추출물에서 그 효과가 가장 우수하였다.
시험예 5: 티로시나제 저해효과 확인 시험
0.1M Potassium Phosphate Buffer(pH 6.8) 0.1ml, 0.3mg/ml 농도의 L-tyrosinase 수용액 0.1ml, 1250unit/ml의 버섯 티로시나제 0.1ml를 혼합한 후 여기에 시료용액을 농도에 따라 각각 0.1ml를 첨가하여 37℃에서 20분간 효소반응을 진행시켰다. 반응용액의 흡광도를 475nm에서 측정하여 시료의 효소 저해활성을 다음 식에 따라 구하였다. 대조군으로는 알부틴을 사용하였다.
Tyrosinase Inhibition Rate(%) = [(A-B)/A]×100
A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475 nm에서 흡광도
B : 시료를 첨가한 반응용액의 475 nm에서 흡광도
농도(ug/ml) 티로시나제 저해율(%)
비교예 1 50 84.5
실시예 1 50 85.9
실시예 2 50 89.7
실시예 3 50 85.7
실시예 4 50 84.8
실시예 5 50 85.2
실시예 6 50 87.9
실시예 7 50 91.7
실시예 8 50 88.7
실시예 9 50 86.2
실시예 10 50 85.4
알부틴 50 42.5
상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리된 자주구슬초에서 우수한 티로시나제 저해효과를 확인하였다. 특히 펙티나아제 처리 된 자주구슬초 효소 추출물에서 그 효과가 가장 우수하였으며 이는 동일한 농도에서 알부틴보다 우수한 효과를 보였다.
시험예 6: 멜라닌 생성 억제 효과 확인 시험
B16F10 melanoma 세포를 이용한 멜라닌 생합성 저해효과를 측정하였다. B16 melanoma 세포를 1×105 cells/well의 농도로 접종하고 24 시간동안 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후 α-MSH가 처리된 RPMI 10% 배지로 교환한 뒤 각각 비교예 1 및 실시예 1 ~ 10의 추출물을 처리하여 배양하고 멜라닌 양을 측정하기 위해 세포들을 트립신 처리하여 떼어낸 후 배지를 수거하여 15ml tube에 옮겼다. 3000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 1N NaOH 250 ul를 처리하여 끓는 물에서 10분간 처리 후 가볍게 원심 분리하였다. 원심분리 후 10분간 초음파하여 완전히 멜라닌을 용해하여 475nm에서 흡광도를 측정하고 멜라닌 생성 억제 효과는 다음 식에 따라 구하였다. 대조군으로는 알부틴을 사용하였다.
멜라닌 생성 억제율(%) = [(A-B)/A] × 100
A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475 nm에서 흡광도
B : 시료를 첨가한 반응용액의 475 nm에서 흡광도
농도(ug/ml) 멜라닌 생성 억제율(%)
비교예 1 50 82.4
실시예 1 50 86.5
실시예 2 50 90.8
실시예 3 50 87.4
실시예 4 50 87.2
실시예 5 50 83.7
실시예 6 50 86.5
실시예 7 50 90.8
실시예 8 50 87.4
실시예 9 50 87.2
실시예 10 50 83.7
알부틴 50 81.4
상기 표 7에서 확인되는 바와 같이 자주구슬초 추출물에 비해 효소처리 된 자주구슬초에서 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다. 특히 펙티나아제 처리된 자주구슬초 효소 추출물에서 그 효과가 가장 우수하였으며 이는 동일한 농도에서 알부틴보다 우수한 효과를 보였다.
제조 실시예 1 ~ 5: 효소처리된 자주구슬초 추출물을 함유한 제형 제조
자주구슬초 추출물을 함유한 로션을 하기의 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.
성분(중량%) 대조예 비교예 제조 실시예
1 2 1 2 3 4 5
비교예 1 - 0.5 - - - - -
실시예 6 - - 0.5 - - - -
실시예 7 - - - 0.5 - - -
실시예 8 - - - - 0.5 - -
실시예 9 - - - - - 0.5 -
실시예 10 - - - - - - 0.5
밀납 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
폴리솔베이트 60 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
유동 파라핀 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
소르비탄 스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
스테아린산 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
글리세릴스테아레이트/
피이지-400 스테아레이트		 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
프로필렌글리콜 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
카르복시폴리머 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
트리에탄올아민 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
방부제 미량 미량 미량 미량 미량 미량 미량
정제수 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100 To 100
시험예 7: 피부 진정 효과 확인
미백 물질로 알려진 코직산과 본 발명의 자주구슬초 추출물의 사용성을 비교하기 위해 현재 피부 알레르기 증상이 없는 20 내지 30대 남녀 10명을 대상으로 하완의 안쪽 부위에 테입 스트리핑 법(Tape Stripping Method)을 통한 피부자극을 유발한 후 본 발명에 따른 자주구슬초 추출물 또는 자주구슬초 효소 추출물을 함유한 화장료와 함유되지 않는 화장료를 도포하여 유발된 자극이 진정되는 정도를 상대평가 하였다. 먼저 하완의 안쪽 부위 두 곳에 일반 스카치 테잎으로 30회 테이핑을 하여 피부 홍반을 유발하였다. 홍반 유발된 후, 본 발명에 따른 추출물을 함유한 화장료를 도포하였으며, 본 발명에 따른 효소 추출물을 함유하지 않은 화장료를 도포하였다. 도포 후 3시간 후 피부진정 정도를 평가하였다.
<피부자극정도 (홍반) 평가>
0 (무반응) 1 (매우 경미한 홍반흔적) 2 (희미한 또는 가벼운 홍반)
3 (경계가 뚜렷하나 약한 홍반) 4 (뚜렷한 홍반) 5 (심한 홍반)
시료명
 피부자극 정도
좌 우
대조예 1 2 2
비교예 2 1 1
제조 실시예 1 1 1
제조 실시예 2 0 0
제조 실시예 3 1 1
제조 실시예 4 0 1
제조 실시예 5 1 0
코직산 2 1
상기 표 9에서 확인되는 바와 같이 코직산의 경우 약간의 피부 자극을 보였으나 자주구슬초 추출물의 경우 코직산에 비해 피부 자극이 적은 것을 확인하였다.
시험예 8: 미백 효과 확인
20 내지 30대 남녀 10명을 대상으로 본 발명에 따른 자주구슬초 추출물 또는 자주구슬초 효소 추출물을 함유한 화장료와 함유되지 않는 화장료를 매일 아침, 저녁 2회씩 팔의 상박에 1개월 동안 도포하였다. Colormeter를 이용하여 시험 전과 시험 후의 피부 밝기 변화를 측정하였다.
△L = 시험 후 피부 밝기 - 시험 전 피부 밝기
△L
대조예 1 0.8
비교예 2 2.0
제조 실시예 1 3.2
제조 실시예 2 4.0
제조 실시예 3 3.2
제조 실시예 4 3.3
제조 실시예 5 2.8
상기 표 10에서 확인되는 바와 같이 자주구슬초 추출물의 경우 자주구슬초가 함유되지 않은 로션제형에 비해 피부가 밝아진 것을 확인하였고 특히 펙티나아제 처리된 자주구슬초 효소 추출물을 함유한 로션 제형에서 그 효과가 가장 우수하였다.

Claims (11)

  1. 자주구슬초 당 분해효소 추출물을 함유하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부미백용인 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부자극완화용인 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 락타아제 및 키시라나제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소에 의하여 처리되어 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 펙티나아제에 의하여 효소 처리되어 제조되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 자주구슬초 당 분해효소 추출물은 리나린(linarin)이 강화된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 피부자극완화용 화장료 조성물은 자외선으로 인한 피부의 염증 매개 인자 발현 억제를 통해 피부의 염증을 억제 및 완화하는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  8. 자주구슬초 100중량부에 대하여 α-아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 락타아제 및 키시라나제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 당 분해효소를 1~10 중량부의 비율로 첨가하여 추출하는 효소추출단계;
    잔사를 제거 및 여과하여 얻은 효소추출물을 동결건조하는 단계; 및
    상기 동결건조된 효소추출물을 유기용매로 다시 추출하는 단계를 포함하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소추출단계는 pH 4.0~7.0, 30~60℃의 조건에서 수행되는 것임을 특징으로 하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서 상기 당 분해효소는 펙티나아제인 것을 특징으로 하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올인 것임을 특징으로 하는 자주구슬초 당 분해효소 추출물의 제조방법.
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