KR101476218B1 - 작두콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
작두콩 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 작두콩(Canavalia gladiata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 위장 점막 보호 또는 위장 점막 손상을 개선시키고, 위장에서의 염증반응을 억제함으로써 위장질환의 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다. 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
Description
본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알코올은 기호품이지만 또한 약물이므로 습관성 알코올 중독은 세계에서 가장 빈도가 높은 약물 중독의 하나이다. 이러한 알코올의 소비는 점차 증가하고 있으며 이로 인한 각종 질환도 증가하고 있는 추세이다. 특히 알코올 섭취로 인한 위 점막 손상은 위염의 원인이 되며 위궤양과 위암으로 악화되기도 한다(Franke A et al., Alcohol-related diseases of the esophagus and stomach, Dig Dis, 23: 204-13(2005)).
위염은 위장 점막 염증성 질환을 총칭하는 것으로 헬리코박터 파일로리균 감염, NSAID(non-steroid anti-inflammator drugs), 스트레스, 알코올 등에 의해 위장 점막을 보호하는 방어인자와 손상시키는 공격인자 사이의 균형이 깨져 발생이 된다. 위장 점막을 손상시키는 공격인자의 하나인 알코올 과다 섭취는 위장의 출혈과 염증발생을 유발시켜 급성위염을 일으킬 수 있다. 이러한 알코올의 급성위염 발병은 알코올 농도 의존적으로 병변을 일으키며 위장에 직접적인 손상을 일으키게 된다. 따라서, 높은 농도의 알코올 처리는 동물을 이용한 위염 및 위장 점막 손상 유발 모델에서 널리 사용되고 있다(D. Bilici et al., Melatonin prevents ethanol-induced gastric mucosal damage possibly due to its antioxidant effect, Dig Dis Sci, 47:856861(2002), Bujanda L, The effects of alcohol consumption upon the gastrointestinal tract, Am J Gastroenterol, 95:3374-82(2000), Szabo S et al., Early vascular injury and increased vascular permeability in gastric mucosal injury caused by ethanol in the rat, Gastroenterology, 88:228236(1985)).
알코올성 위염은 위장 점막 보호물질 감소, 산화적 스트레스, 히스타민 분비의 증가 등에 의한 위장 손상이 염증을 악화시킨다고 알려져 있다. 하지만 아직 알코올에 의한 위염 발생의 분자학적인 기전에 대해서는 정확하게 규명이 되지 않았으며, 이에 따라 특이적 치료방법도 없는 실정이다. 많은 연구에서 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)이 알코올성 위염의 발병에서 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 과다한 활성산소종의 증가는 세포의 과산화지질 형성 증가로 인하여 세포벽의 손상을 일으켜 위장 점막의 손상을 유발시킨다. 또한, 활성산소종은 세포내 NF-κB의 발현을 자극시켜 COX-2(cyclooxygenase-2)와 사이토카인의 증가를 유발시켜 염증반응을 일어나게 한다. 그러므로 세포내의 항산화 작용의 증가는 알코올성 위염의 발병을 감소시킬 수 있으며 위장 점막을 보호하는 역할을 할 수 있다(Hogg et al., Production of hydroxyl radicals from the simultaneous generation of superoxide and nitric oxide, Biochem. J., 281:419424(1992), Hernet al., Gastric mucosal cell proliferation in ethanol-induced chronic mucosal injury is related to oxidative stress and lipid peroxidation in rats, Lab. Invest., 80:11611169(2000), Guo JS et al., Differential effects of selective and non-selective inhibition of nitric oxide synthase on the expression and activity of cyclooxygenase-2 during gastric ulcer healing. Eur J Pharmacol., 536:301-308(2006), D'Acquisto et al., Involvement of NF-κB in the regulation of cyclooxygenase-2 protein expression in LPS-stimulated J774 macrophages, FEBS Lett., 418:175178(1997)).
천연 항산화제 개발의 일환으로 국내에서 재배되는 작두콩(Canavalia gladiata)의 항산화 효능에 대해 연구된 바 있으며 특히 작두콩 추출물에는 페놀성 화합물인 플라보노이드의 함량이 다른 콩과 식물에 비하여 높게 나타났다는 연구결과가 있다. 작두콩은 콩과의 한해살이 덩굴성식물로서 남쪽지방에 잘 자라며 한방에서는 도두(刀豆) 또는 협검두(挾劍豆)라고 한다(Kim JP et al., Chemical Properties and DPPH Radical Scavenging Ability of Sword Bean(Canavalia gladiata) Extract, Korean J. Food sci. Technol. 44:441-446(2012)). 중국의 <본초강목>이나 <본초비요> 같은 의학책에는 장, 위를 보하고 속을 따뜻하게 하며 신장의 기능을 돕고 원기를 보하는 약효가 있다고 기록되어 있다(Joo SJ et al., Characteristics of yougurt prepared with ‘Jinpum’ bean and sword bean (Canavalin gladiata), Korean J. Postharv. Sci. Technol., 8:308-312(2001), Cho YS et al., Chemical components in different parts of Korean sword bean (Canavalia gladiata). Korean J. Postharv. Sci. Technol., 6:475-480(1999)). 이러한 작두콩의 위장 보호 기록과 항산화 관련 연구를 통하여 알코올성 위염으로부터 위장 보호 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 위장질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 작두콩 추출물이 위장 점막을 보호하고 염증반응을 억제시킴으로써 위장질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유효하다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 위장질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 작두콩 추출물이 위장 점막을 보호하고 염증반응을 억제시킴으로써 위장질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.
본 발명의 조성물은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서 이용되는 작두콩은 아시아 열대지방이 원산지로서 중국남부, 인도, 동남아시아 일대에서 널리 재배되고 있으며, 우리나라에서는 남부지방에서 노지재배하고, 중부 이북에서는 시설재배 하고 있다. 작두콩은 이름 그대로 작은 작두만큼 큰 콩으로 꼬투리 길이가 20-30cm 정도나 되는 콩 중에서 가장 큰 콩이다.
본 명세서에서 작두콩을 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 작두콩에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 추출 결과물 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 작두콩 추출물은 작두콩 분말에 추출용매를 처리하여 수득한다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 작두콩 추출물을 작두콩에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 작두콩에 처리하여 수득한 것이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물 및 에탄올의 조합을 작두콩에 처리하여 수득한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 작두콩 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 작두콩 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 작두콩 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “위장질환”은 그 발생 원인 및 기전과 무관하게 위 점막의 손상을 동반하거나, 손상을 야기할 가능성이 있는 모든 질환 및 병태를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다. 상기 위장관 질환은 급성 위염, 만성 활동성 위염, 만성 위축성 위염과 같은 만성 위염, 십이지장염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 위 천공, 위 출혈, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)과 연관된 소화 장애, 비궤양성 소화불량증, 위 식도 역류 질환(역류성 식도염), 급성 상부 위장 출혈, 스트레스 궤양화, 헬리코박터 파일로리 감염, 조린거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome, ZES), 베르너 증후군(Werner's syndrome) 및 전신 비만세포증 및 상기 질환들로 인한 위점막의 미란, 출혈, 발적 및 부종과 같은 증상을 포함한다.
본 발명의 작두콩 추출물을 포함하는 조성물의 효능은 위 점막의 보호 효과 또는 위장 점막 손상을 개선에 기초하므로, 특정한 원인 또는 기전으로 인한 위장질환에 국한되지 않는다. 본 발명에서 위장질환은 알코올, 육체적 및 정신적 스트레스, 산화적 스트레스, 위산, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드 제제, 담배, 자극적인 음식, 헬리코박터 파일로리의 감염을 포함한 다양한 원인 및 기전에 의해 발병한 것일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 작두콩 추출물이 예방 또는 치료효과를 나타내는 위장질환은 알코올에 의해 유발되는 위장질환이다.
본 발명의 조성물은 항산화 효과를 나타내며, 위장 점막 보호 또는 위장 점막 손상을 개선시키고, 위장에서의 염증반응을 억제시키는 작용을 하며, 이러한 작용을 통하여 다양한 위장질환을 예방 또는 치료한다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 작두콩 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 작두콩 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 작두콩 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 작두콩 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 작두콩 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에서, ‘건강기능식품’이란 질병의 예방 및 치료, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다. 본 발명의 작두콩 추출물이 상기와 같은 위장질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 건강기능식품은 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 작두콩 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 위장질환의 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g로 포함되며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 위장질환의 예방 또는 개선 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 조성물은 위장 점막 보호 또는 위장 점막 손상을 개선시키고, 위장에서의 염증반응을 억제함으로써 위장질환의 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다.
(ⅲ) 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
(ⅳ) 본 발명은 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 위장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
도 1은 알코올에 의해 유도된 위 손상 랫트의 위벽 단면 관찰을 통해 위점막 손상에 대한 작두콩 추출물의 효과를 확인한 결과이다.
G1: 정상대조군, G2: 알코올성 위염 유발군, G3: 알코올성 위염 유발 전 란소프라졸 30 mg/kg(b.w) 투여군, G4: 알코올성 위염 유발 전 작두콩 추출물 250 mg/kg(b.w) 투여군, G5: 알코올성 위염 유발 전 작두콩 추출물 500 mg/kg(b.w) 투여군(이하, G1 내지 G5군에 대한 설명 동일).
도 2는 알코올에 의해 유도된 위 손상 랫트의 위점막 손상 면적을 측정하여 작두콩 추출물의 효과를 확인한 결과이다. 결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 3은 위 점막세포의 손상으로 인한 위액 분비량의 변화를 측정한 결과이다.
결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 4는 실험동물의 위 점막조직 손상정도를 H&E 염색을 통해 조직병리학적으로 관찰한 결과이다.
도 5는 실험동물에서 작두콩 투여에 의한 염증 반응 감소 효과를 규명하기 위해 면역조직화학법을 실시하여 염증 발현 인자인 COX-1, COX-2, NF-κB의 발현을 측정한 결과이다.
도 6은 실험동물의 위 조직에서 MDA 양을 측정한 결과이다.
결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 7은 실험동물의 위 조직에서 염증 관련 사이토카인의 발현정도를 측정한 결과이다.
G1: 정상대조군, G2: 알코올성 위염 유발군, G3: 알코올성 위염 유발 전 란소프라졸 30 mg/kg(b.w) 투여군, G4: 알코올성 위염 유발 전 작두콩 추출물 250 mg/kg(b.w) 투여군, G5: 알코올성 위염 유발 전 작두콩 추출물 500 mg/kg(b.w) 투여군(이하, G1 내지 G5군에 대한 설명 동일).
도 2는 알코올에 의해 유도된 위 손상 랫트의 위점막 손상 면적을 측정하여 작두콩 추출물의 효과를 확인한 결과이다. 결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 3은 위 점막세포의 손상으로 인한 위액 분비량의 변화를 측정한 결과이다.
결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 4는 실험동물의 위 점막조직 손상정도를 H&E 염색을 통해 조직병리학적으로 관찰한 결과이다.
도 5는 실험동물에서 작두콩 투여에 의한 염증 반응 감소 효과를 규명하기 위해 면역조직화학법을 실시하여 염증 발현 인자인 COX-1, COX-2, NF-κB의 발현을 측정한 결과이다.
도 6은 실험동물의 위 조직에서 MDA 양을 측정한 결과이다.
결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
도 7은 실험동물의 위 조직에서 염증 관련 사이토카인의 발현정도를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 작두콩 추출물의 제조
작두콩 분말 50 g에 1 L의 80% 알코올을 가하여 3시간 동안 250℃에서 환류(reflux)하여 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 여과지(ADVANTEC FILTER PAPER 6, 150 mm)로 여과한 후, 여과액을 회전진공농축기(Sunil EYELA, Rotatory evaporator, N-1N)로 감압 농축하였다. 그 다음, 동결건조하여 작두콩 80% 알코올 가용 추출물(5.02 g)을 수득하고 이후 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
실시예 2: 위 손상 동물모델
본 시험에 사용하는 SD 랫트는 유효성평가 시험에 적당한 실험동물로서 위 손상 동물모델에 널리 사용되고 있으며, 풍부한 시험기초자료가 축적되어 있어 시험결과의 해석 및 평가에 이러한 자료를 이용할 수 있기에 선정하였다. ㈜ 오리엔트바이오로부터 공급받은 180 g 내외의 6주령 SD 랫트 수컷을 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3°C 습도 50±5%에서 광주기 12시간으로 유지하였다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하였다.
본 실험은 정상대조군(G1), 알코올성 위염 유발군(G2), 양성대조군(란소프라졸 30 mg/kg)(G3), 작두콩 80% 알코올 추출물(80% alcohol extract of Canavalia gladiata, CGE) 250 mg/kg 투여 군(G4), 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg 투여 군(G5), 총 5군으로 군당 SD 랫트 10 마리씩 구성하여 실험을 진행하였다. 제공된 시험물질은 순도 100%로 가정하고 시험하였으며 투여 바로 전, 0.5% CMC(carboxymethylcellulose)를 이용하여 조제하여 경구투여 하였다. G1과 G2 그룹은 0.5% CMC를, G3, G4, G5 그룹은 시험물질을 각각 매일 1회씩 총 7일 동안 경구투여 한 후, 7일 동안 시험물질과 40% 알코올을 1 ml씩 경구 투여하여 위점막 손상을 통한 위염을 유발시켰다. 마지막 날 시험물질 투여 2시간 후, G2, G3, G4, G5 그룹에 150 mM HCl의 70% 알코올을 1 ml씩 경구투여 하여 급성 위 손상을 유발한 후 1시간 뒤 부검하였으며, 모든 시험 동물은 부검 전 24시간 절식시켰다.
실시예 3: 체중측정
시험기간 중 개체 별 체중을 측정하였고 부검 시 체중을 측정하였다. 본 시험 결과 정상 대조군(G1)의 군 분리 시 평균 체중은 261.9 ± 2.33 g, 부검 시 평균 체중은 279.0 ± 2.8 g이며 시험대조군(G2)의 군 분리 시 평균 체중은 257.0 ± 1.15 g, 부검 시 평균 체중은 270.4 ± 1.79 g, 대조물질 란소프라졸 30 mg/kg 투여군(G3)의 군 분리 시 평균 체중은 255.1 ± 2.5 g, 부검 시 평균 체중은 272.8 ± 3.37 g, 작두콩 80% 알코올 추출물 250 mg/kg 투여한 G4군의 군 분리 시 평균 체중은 264.9 ± 2.13 g, 부검 시 평균 체중은 282.2 ± 4.09 g, 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg 투여한 G5군의 군 분리 시 평균 체중은 251.8 ± 3.29 g, 부검 시 평균 체중은 273.4 ± 3.71 g로 측정되었다. 모든 군의 부검 시 체중이 다소 감소하는 경향을 보였으나, 이는 부검 전 실시한 절식의 영향으로 보이며 체중변화는 모든 군간의 유의적인 차이를 보이지 않았다(표 1).
실시예 4: 위벽 단면 관찰 및 위 점막 손상 면적 측정
실험 종료 후 동물을 희생시킨 후 개복하여 방혈한 다음 위를 적출하였다. 적출한 위는 대만부를 따라 절개를 한 후 내용물을 제거하고 식염수에 씻어 면봉으로 잘 펴서 핀으로 고정한 뒤 사진 촬영을 하였다. 촬영한 사진은 이미지 프로그램(AxioVs V 4.8.2., Axiovision, Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 위 손상 부위 및 위 전체면적을 측정하였고 Ulcer Index (%) = 손상면적 / 전체면적 * 100으로 계산하였다.
위 손상 면적 측정 결과 정상대조군(G1)에서는 위 점막 손상이 관찰되지 않은 반면, 알코올성 위염을 유발시킨 시험대조군(G2)에서는 위 점막의 손상과 점막출혈을 관찰되었다(도 1). 이에 따라 알코올성 위염을 유발시킨 군(G2)에서의 위 점막 손상면적은 전체 면적의 5.40 ± 1.877%를 차지하였다. 대조물질 란소프라졸을 30 mg/kg 투여한 G3그룹에서 점막 손상 부위의 면적이 현저히 감소하였음을 관찰하였고 위 손상면적은 전체 면적의 1.13 ± 0.797%로 시험대조군(G2)과 비교하여 통계적으로 유의적인 감소를 보였다(p<0.05). 작두콩 80% 알코올 추출물을 투여한 군(G4, G5)에서도 G2군에 비하여 위점막 손상과 출혈이 감소하였다. 위 손상면적은 작두콩 80% 알코올 추출물 250 mg/kg 투여한 G4군에서 3.34 ± 1.926%, 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg 투여한 G5군에서는 2.44 ± 2.106% 로 나타났으며 농도의존적인 결과는 나타나지 않았으나, 알코올성 위염 유발군인 G2군과 비교하여 유의적으로 감소시켰다(p<0.05)(도 2).
실시예 5: 위액 분비량
위 점막세포의 손상으로 인해 증가되는 위액 분비량을 측정함으로써 간접적으로 시험 물질의 위 손상 억제 효과를 측정하였다. 적출한 위의 유문부를 조금 절개하여 15 ml 튜브에 위액을 수집하고 3,000 rpm에 20분 원심분리한 후 상층액을 수집하여 위액량(ml)을 측정하였다.
위액 분비량 측정 결과 정상 대조군(G1)에서는 0.06 ± 0.058 ml로 위액이 거의 분비되지 않은 반면, HCl+알코올을 투여하여 알코올성 위염을 유발시킨 시험대조군(G2)에서는 위 점막손상으로 위액 분비량이 증가하여 1.93 ± 0.535 ml로 측정되었으며, 이는 통계적으로 유의적인 차이를 보였다(p<0.05). 대조물질 란소프라졸 30 mg/kg 투여한 G3군의 위액분비량은 0.38 ± 0.248 ml로 시험대조군(G2)에 비해 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(p<0.05). 작두콩 80% 알코올 추출물 250 mg/kg을 투여한 G4군의 위액분비량은 1.02 ± 0.397 ml, 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg을 투여한 G5군은 0.76 ± 0.469 ml로 측정되었다. 따라서 이러한 결과로 작두콩 80% 알코올 추출물이 농도 의존적으로 위액 분비량을 감소시켰음을 확인할 수 있었다(p<0.05)(도 3).
실시예 6: 병리학적 검사
조직병리학적은 관찰을 위하여 헤마톡실린&에오신 염색을 실시하였다. 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매하여 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, 독일)를 이용하여 4 μm의 두께로 절단한 다음 폴리리신으로 코팅된 슬라이드에 붙였다. 조직절편은 자일렌과 알코올을 이용하여 탈파라핀과 함수 과정을 거친 후 흐르는 물에 3분간 수세하였다. 헤마톡실린 용액에 5분간 핵 염색 후 다시 수세하여 에오신 용액으로 3분간 세포질 염색을 실시하였으며, 알코올 농도 순으로 탈수과정을 거친 후 자일렌을 이용한 청명과정을 거친 다음, 봉입을 실시하였다. 봉입한 조직은 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
실험 결과 정상 대조군(G1)에서는 특이할 만한 조직병리학적 소견은 관찰되지 않았으며, G2-G5 군에 대한 위염 관련 이상소견을 점수화한 결과 HCl+알코올을 투여하여 알코올성 위염을 유발시킨 시험대조군(G2)은 3.75 ± 0.957로 유의적으로 가장 높았으며, 양성대조군(G3)은 1.50 ± 1.291로 G2군과 비교하여 유의적으로 감소되었다. 작두콩 80% 알코올추출물 250 및 500 mg/kg 투여한 군은 각각 3.00 ± 0.816 및 2.50 ± 0.577로 측정되었다(표 2). 이는 G2군과 비교하였을 때 통계적으로 유의적인 감소를 보이지는 않았으나 감소하는 경향은 관찰할 수 있었다. 헤마톡실린&에오신 염색을 통하여 위조직의 병리학적인 관찰을 실시한 결과, 알코올성 위염을 유발한 군(G2)에서 위 점막조직의 손상이 깊게 발생하였음을 확인 할 수 있었다. 반면, 대조물질 란소프라졸 30 mg/kg 투여한 G3군에서는 위 점막조직의 손상이 눈에 띄게 줄었음을 볼 수 있으며, 작두콩 80% 알코올 추출물 250 및 500 mg/kg 투여한 군들에서 G2군과 비교하여 손상이 깊지 않음을 확인할 수 있었다(도 4).
| 군 | 약물 및 투여량 | 위염 스코어 |
| G1 | 0.5% CMC(carboxymethylcellulose) | 0 |
| G2 | 0.5% CMC | 3.75 ± 0.957a |
| G3 | 란소프라졸 30 mg/kg b.w | 1.50 ± 1.291b |
| G4 | 작두콩추출물 250 mg/kg b.w | 3.00 ± 0.816ab |
| G5 | 작두콩추출물 500 mg/kg b.w | 2.50 ± 0.577ab |
G1: 정상대조군, G2: 알코올성 위염 유발군, G3: 란소프라졸 30 mg/kg(b.w) 전투여 후 알코올성 위염 유발군, G4: 작두콩 80% 알코올 추출물 250 mg/kg(b.w) 투여 후 알코올성 위염 유발군, G5: 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg(b.w) 투여 후 알코올성 위염 유발군.
결과값은 ±표준편차로 기재하였음. 다른 문자들(different letters)은 던칸의 다중범위검정에서 현저한 차이를 나타낸 것임(p<0.05).
실시예 7: 염증 발현 인자 측정
알코올 처리에 의하여 증가한 ROS에 의하여 NF-κB의 발현이 활성화 되고 이에 따라 사이토카인과 COX의 발현이 증가되면서 염증 반응이 조절된다. 따라서 염증 발현 관련하여 중요한 마커인 COX-1, COX-2와 NF-κB의 발현을 면역조직화학법으로 측정하였다. 파라핀 블록을 만든 후 COX-1(1:1000 희석, Santa Cruz Biotechnology, 미국), COX-2(1:400 희석, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 NF-κB(1:150 희석, Santa Cruz Biotechnology, 미국) 항체와 반응시킨 후, ABC(avidin-biotin-peroxidase complex) 방법을 사용하여 발색 변화를 유도한 다음 광학현미경으로 관찰하여 비교하였다.
실험결과, HCl+알코올을 투여하여 알코올성 위염을 유발시킨 시험대조군(G2)에서 정상대조군(G1)보다 COX-2와 NF-κB의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 반면 대조물질 란소프라졸 30 mg/kg 투여한 G3군에서는 COX-2와 NF-κB의 발현이 감소하는 것을 확인 할 수 있었으나 작두콩 80% 알코올 추출물을 투여한 G4, G5군에서는 시험대조군(G2)에 비해 미미한 감소를 보였다(도 5).
실시예 8: 산화적 손상 측정
위 손상 유도로 인해 증가된 산화적 손상을 측정하기 위해 MDA (Malondialdehyde)를 측정하였다. 위 조직을 절취하여 트리스-HCl 버퍼를 사용하여 균질화한 다음, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 300 μl 취하였다. 상등액에 동량의 TCA를 처리하고 원심분리한 후 상등액을 수득하였다. 상등액에 TBA(2-thiobarbituric acid) 500 μl 넣고 95°C에서 20분간 가열시켰다. TBA 반응산물을 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
산화적 손상의 척도가 되는 MDA의 양을 측정한 결과, 정상대조군(G1) 2.43 ± 0.392 nmol/g, 시험대조군(G2) 6.62 ± 0.444 nmol/g으로 정상대조군(G1)에 비해 HCl+알코올을 투여하여 알코올성 위염을 유발시킨 시험대조군의 MDA 양이 통계적으로 유의성 있는 증가를 보였다. 란소프라졸 30 mg/kg 투여한 군(G3)은 3.52 ± 1.282 nmol/g 으로 시험대조군에 비해 감소하였으며 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 반면 작두콩 80% 알코올 추출물 250 mg/kg을 투여한 G4 군은 6.36 ± 2.220 nmol/g으로 G2 군과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 작두콩 80% 알코올 추출물 500 mg/kg을 투여한 G5군은 4.06 ± 0.782 mol/g 으로 대조물질 란소프라졸 30 mg/kg 투여군과 유의적인 차이가 없는 정도로 감소되었다(도 6).
실시예 8: 염증 관련 사이토카인 어레이
실험 종료 후 부검 시, 위 점막을 채취하여 위 손상 유도로 인해 증가된 염증 마커들의 발현 양을 측정하기 위해 랫트 사이토카인 어레이 패널 A 어레이 키트(R&D Systems)를 이용하여 사이토카인의 발현 양을 측정하였다. 위 조직에서 염증관련 사이토카인의 상대적인 발현 양을 측정한 결과 정상대조군(G1)에 비하여 시험대조군(G2)에서 프렉탈카인(Fractalkine, 혈관내피세포에서 생산되는 염증유발물질), L-셀렉틴(염증반응 시 혈액 내 백혈구가 염증부위로 모집되도록 이끄는 물질), TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases, 염증과 세포손상의 정도를 알 수 있는 내인성 억제 단백질), VEGF(vascular endothelial cell growth factor, 혈관내피세포에 백혈구와 같은 단핵구 세포결합을 증가시키는 인자), IL-1α(염증반응 매개하는 인자), RANTES(대식 세포 주화성 인자 중 하나), MIP-3α(대식세포 염증 단백질)의 발현이 증가되었다. 란소프라졸 30 mg/kg 투여한 군(G3)의 발현은 정상대조군(G1)과 비슷하거나 G2군과 비교하여 감소하는 경향을 보였다. 프렉탈카인, L-셀렉틴, MIP-3α, RANTES 항목에서 작두콩 80% 알코올추출물 투여군(G4, G5)은 두 가지 농도 모두 시험대조군(G2)보다 감소하였으며 TIMP-1, VEGF, IL-1α 항목의 경우 농도 의존적인 감소효과를 나타냈다(도 7).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 작두콩(Canavalia gladiata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 위염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 작두콩에 처리하여 수득한 것을 특징으로 하는 알코올성 위염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 위장 점막 보호 또는 위장 점막 손상을 개선시키는 것을 특징으로 하는 알코올성 위염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 염증반응을 억제시키는 것을 특징으로 하는 알코올성 위염의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- (a) 상기 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알코올성 위염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 작두콩 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 위염의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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