KR101465341B1 - 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하는 신규 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

랭클과 랭크의 상호작용을 억제하는 신규 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 고리형태로 존재하지 않으면서 아미노산 서열 개수가 10개 이하로 구성되어 종래의 랭클-랭크 상호작용 억제를 위한 펩타이드에 비해 생체 안정성이 우수하고, 합성 시 가격 면에서도 유리할 뿐만 아니라, 랭클-랭크 상호작용 억제능도 더 우수하여, 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하는 조성물의 유효성분으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 랭클과 랭크가 결합하는 대신에 랭클과 본 발명에 따른 펩타이드가 결합함으로써, 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하여 파골세포의 분화를 억제할 수 있는바, 그 결과 파골세포의 분화 및 활성화로 인한 골 질환을 예방 또는 치료하는데 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

랭클과 랭크의 상호작용을 억제하는 신규 펩타이드 및 이의 용도{NEW PEPTIDE INHIBITING RANKL-RANK INTERACTION AND THE USE THEREOF}
본 발명은 랭클(RANKL)과 랭크(RANK)의 상호작용을 억제하는 신규 펩타이드 및 그 용도에 관한 것이다.
뼈는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호하고 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기물을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나로서, 파골세포(osteoclast)를 통한 뼈의 재흡수(bone resorption)와 조골세포(osteoblast)를 통한 뼈생성(bone formation) 간의 균형에 의해 유지되는 특별한 기관이다. 랭크(RANK, receptor activator of NF-kB), 랭클(RANKL, receptor activator of NF-kB ligand) 및 OPG(osteoprotegerin) 시스템은 뼈 생물학에 있어서 획기적인 발전을 가져왔다. 조골세포, 기질세포의 랭클과 파골세포의 랭크 수용체 간의 상호작용은 파골세포의 성숙화와 그에 따른 뼈의 재흡수의 결과를 낳게된다(Yasuda, H., et al. 1998. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95:3597-602). OPG는 랭클에 대한 수용성 유도 수용체로 기능하고 랭클과 결합하기 위해 랭크와 경쟁한다. 즉, 랭클이 파골전구세포 표면에 있는 수용체인 랭크에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 성숙화되어 뼈의 재흡수가 일어나는데, OPG가 랭클과 결합하면 랭클과 랭크간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 뼈의 재흡수가 일어나지 않게 된다. 따라서 OPG는 생체 내(in vivo)에서나 시험관 내(in vitro)에서 파골세포의 성숙과 활성화의 효과적인 억제제로 알려져 왔다(Simonet, W.S., et al. 1997. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell. 89:309-19; Yasuda, H., et al. 1998. Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology. 139:1329-337). 게다가 조골세포/기질세포(stromal cell) 및 파골세포 전구체(osteoclast precursors), 랭클/랭크/OPG는 다양한 피부 세포로 발현될 수 있고 따라서 그것들의 역할은 다른 많은 생물학적 기능과 연관되어 있다. 랭클/랭크의 결합은 림프절 기관형성과 임신 기간 동안에 유선 형성을 조절하고 여성의 체온을 조절하는 것으로 알려져 왔다(Fata, J.E., et al. 2000 The osteoclast differentiation factor osteoprotegerin-ligand is essential for mammary gland development. Cell 103:41-50).
랭클과 OPG 간의 비율은 뼈 생성 또는 뼈의 재흡수에 의한 뼈 대사를 조절한다. 따라서 이 비율이 제대로 조절되지 않으면 뼈 형성과 뼈 재흡수 간의 불균형을 일으키고 골다공증, 류마티스 관절염, 골 변형과 같은 골질환을 유발시킨다(Vega, D., Maalouf, N.M., and Sakhaee, K. 2007. CLINICAL Review #: the role of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 92(12):4514-21.). 인간에게서 밝혀진 랭크, OPG 및 랭클의 돌연변이는 Autosomal recessive osteopetrosis (ARO), expansile skeletal hyperphosphatasia (ESH), familial expansile osteolysis (FEO), early-onset Paget's disease, 청소년성 파젯병(Juvenile Paget's disease (JPD))과 같은 매우 드문 유전적 골격 이상과 관련이 있다. 뼈 대사에 있어서 랭클/랭크/OPG 단백질들의 역할이 중요하기 때문에 그들 간의 결합은 뼈 대사관련 질병을 억제하기 위한 중요한 목표로 여겨지고 있다.
이에, 현재 OPG-Fc, RANK-Fc, 항-랭클 항체(anti-RANKL antibody), 랭클 백신(RANKL vaccine)과 같은 많은 치료법들이 개발되고 있을 뿐만 아니라, 랭클 신호전달과정을 방해하는 효과를 가진 OPG 또는 TNF 수용체의 랭클 결합 루프를 본뜬 펩타이드(OP3-4, WP9QY)가 개발되었다.
한편, 랭클-랭크는 TNF(tumor necrosis factor) 리간드-수용체 과에 속하는 것으로, 이들 리간드와 수용체는 비슷한 결합 방식을 갖고 있다. 즉, 그 방식은 수용체들이 단량체의 서브유닛들의 edge-to-face packing에 의해 형성된 삼량체의 리간드의 모노머들의 결합부위의 홈(groove)에 결합하는 것이다. 본 발명자들은 이전 특허(대한민국 등록특허공보 제10-1180431호 참조)에서 랭클-랭크의 상호작용을 억제하는 펩타이드를 개발하였는데, 상기 종래의 펩타이드는 아미노산 서열 개수가 10개 이상일 뿐만 아니라, RANK 펩타이드와 유사한 구조를 만들기 위해 펩타이드 끝에 시스테인(Cys)을 달아서 펩타이드가 고리형태로 존재하도록 설계하였는바, 생체 내 안정성이 떨어지는 문제점이 있으며, 합성 시 가격 면에서도 불리한 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 고리형태로 존재하지 않으면서 아미노산 서열 개수가 10개 이하로 구성되어 생체 안정성이 우수하면서 랭클-랭크 상호작용 억제능이 우수한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
더욱이, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 펩타이드는 3번과 5번 아미노산이 서로 연결되어 이황화 결합을 이루는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 펩타이드는 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하여 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 골 질환은 파골세포의 분화 및 활성화로 인해 유발되는 질환인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 골 질환은 골다공증, 골형성 부전증, 고칼슘혈증, 골연화증, 류마티스 관절염, 파젯병, 암에 의한 골 소실 및 골 괴사증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
더욱이, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 고리형태로 존재하지 않으면서 아미노산 서열 개수가 10개 이하로 구성되어 종래의 랭클-랭크 상호작용 억제를 위한 펩타이드에 비해 생체 안정성이 우수하고, 합성 시 가격 면에서도 유리할 뿐만 아니라, 랭클-랭크 상호작용 억제능도 더 우수하여, 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하는 조성물의 유효성분으로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 랭클과 랭크가 결합하는 대신에 랭클과 본 발명에 따른 펩타이드가 결합함으로써, 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하여 파골세포의 분화를 억제할 수 있는바, 그 결과 파골세포의 분화 및 활성화로 인한 골 질환을 예방 또는 치료하는데 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 eRANK, eRANKL 및 eRANK-eRANKL 결합체의 전체적인 구조를 나타낸 도면이다(A:eRANK-eRANKL 결합체의 3차구조, B:eRANK-eRANKL 결합체의 결합면, C:자유 eRANKL 및 eRANK가 결합된 RANKL의 중첩, 루프1(빨간색), 루프2(녹색), 루프3(파란색), D: RANK의 구조).
도 2는 eRANK, eRANKL 및 eRANK-eRANKL 결합체의 도식을 나타낸 도면이다(A: eRANK-eRANKL 결합체, B: eRANKL 삼량체, C: eRANK).
도 3은 리간드-수용체의 특이적 인식부위를 나타낸 도면이다(A: 랭클의 루프1(빨간색), 루프2(녹색), 루프3(파란색), B: 랭클과 랭크의 결합 면, C: 랭클과 랭크 결합면의 정전기적 표시).
도 4는 eRANK-eRANKL 결합체의 결합면에 존재하는 잔기들간의 상호작용을 나타낸 도면이다(A:루프1, B:루프2, C:루프3이고, 초록색부분은 RANKL을 나타내고 빨간색 부분은 RANK를 나타낸다).
도 5는 루프3의 기능 잔기들의 볼 앤드 스틱(ball-and-stick) 모델을 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 6에서, L3-3, L3-3S, L3-3A, L3-3B, L3-3N의 세포 독성 및 파골세포 분화억제 효능 결과를 나타낸 도면이다(A는 각 펩타이드의 세포 독성을 MTT assay를 통해 확인한 것이고 B는 파골세포 분화정도를 TRAP assay를 통해 확인한 결과임).
도 7은 실시예 6에서, L3-3A, L3-3B 및 L3-3S의 파골세포 분화억제 효능을 확인하기 위해, RANKL에 의한 파골세포의 분화정도 및 펩타이드에 의한 분화 저해 정도를 현미경으로 관찰한 다핵세포의 개수 및 TRAP assay 분석 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 특이적인 리간드-수용체간의 인식을 결정하는 구조적인 결정요소를 밝히고 따라서 뼈와 관련된 질병에 대한 계속적인 연구와 새로운 약제의 개발을 위한 분자수준의 기초를 제공하기 위하여 연구를 진행한 결과, 2.5Å 크기의 생쥐의 랭클-랭크 결합체의 결정 구조를 규명함과 아울러 랭클-랭크 결합체의 구조 및 결합에 관여하는 특이적인 구조를 밝히고, 이러한 구조로부터 고리형태를 형성하지 않으면서 랭클-랭크의 상호작용을 효과적으로 억제하는 신규한 펩타이드(L3-3B)를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 "Ser-Asp-Cys-Glu-Cys-Ser-Arg-Arg" 의 8개의 아미노산 서열을 가지며, 3번 및 5번 아미노산 자리에 시스테인(Cys)이 위치함으로써, 서로 연결되어 이황화 결합(disulfide bond)을 이룬다. 여기서, "이황화 결합(disulfide bond)"이란 두 개의 황 원소가 산화(탈수소)하여 생기는 공유결합을 의미한다.
본 발명에 따른 펩타이드를 투여하면, 랭클과 랭크가 결합하는 대신에 랭클과 본 발명에 따른 펩타이드가 결합함으로써, 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하여 파골세포의 분화를 억제할 수 있는바, 그 결과 파골세포의 분화 및 활성화로 인한 골 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 랭클과 랭크결합에 의한 골세포 분화에 대한 펩타이드 저해 활성을 측정하기 위해 파골세포 분화 분석을 수행한 결과, 본 발명에 따른 펩타이드가 대조군에 비해 우수한 파골세포의 분화 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 6 참조).
이에, 본 발명은 상기 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 골 질환은 파골세포의 분화 및 활성화로 인해 유발되는 질환이며, 보다 구체적으로, 골다공증, 골형성 부전증, 고칼슘혈증, 골연화증, 류마티스 관절염, 파젯병, 암에 의한 골 소실 및 골 괴사증으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 약학적으로 허용가능한 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 이소프로필미리스테이트 및 에탄올 등이 있으나 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명에 따른 펩타이드에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 펩타이드는 이에 한정되는 것은 아니나 일반적인 화학합성, 예컨대 고체상 펩타이드 합성기술(solid-phase peptide synthesis)에 의해 제조할 수 있고, 아울러 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 상기 펩타이드를 발현시킨 다음, 통상의 방법으로 정제하여 제조할 수도 있다.
이에, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용되며, 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
본 발명에서, "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로서, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환방법에는 전기천공법(electroporaton), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 형질전환된 재조합 미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명의 실시예에서 랭클-랭크 결합체의 구조를 확인하기 위하여 생쥐의 랭크 엑토도메인(RANK ectodomain), 랭클 엑토도메인(RANKL ectodomain)을 활용하였고, "eRANK 및 eRANKL"은 각각 랭크의 엑토도메인, 랭클의 엑토도메인을 의미하며, 편의상 eRANK 및 eRANKL은 랭크 및 랭클로 표현되기도 하였다.
실시예 1. 랭클-랭크 결합체의 구조 분석
랭클과 랭크의 상호작용을 억제하는 펩타이드를 제작하기 위해서 랭클과 랭크 결합체의 구조를 하기와 같이 결정하였다.
즉, 랭크-랭클 결합체의 구조는 랭클의 결정 구조를 서치프로브 (search probe)로 사용하여 분자치환방법(molecular replacement method)에 의해 결정되었다. 결합체의 최종적인 모델은 랭클 잔기(residue) 161-315와 랭크 잔기 35-198로 구성되었다. 대략 60Å x 70Å x 100Å 크기의 결합체는 삼량체 랭클의 서브유닛 경계면에 형성된 세 개의 틈 속에 삽입되어 있는, 네 개의 시스테인이 풍부한 도메인(cysteine-rich domains (CRDs))을 포함하는 세 개의 랭크 분자로 구성되어 있음을 확인하였다(도 1A, 도 1B, 도 2A 참조). 다른 TNF 계열 리간드와 마찬가지로, 랭클 단량체는 하나의 젤리롤-베타 샌드위치(jellyroll β-sandwich)와 두 개의 역평행-베타 플릿티드 쉬트(antiparallel β-pleated sheets)로 구성되어 있고, 랭클의 삼량체 자체 집합(self-assembly)은 대부분 방향족 잔기들에 의해 성립되는 보존된 소수결합(hydrophobic interaction)과 특정한 내부 서브유닛(inter-subunit)의 수소결합에 의해 유도된 것이다(도 1D, 도 2A, 도 2B 참조). 랭크가 랭클에 결합하면, AA', CD 및 EF루프의 구조를 변화시키고 결국 스트랜드(strand)D, E의 N-, C- 말단을 변형시킴을 확인하였다(도 1C 참조).
실시예 2. 랭크의 구조 분석
본 실시예에서는 랭클과 랭크의 상호작용에 관여하는 랭크의 특이적인 구조를 확인하였다.
랭크는 네 개의 CRDs 부위를 포함하고(도 1C 참조), 다른 일반적인 TNF 계열의 수용체와는 구별되는 구조적 특징이 있음을 확인하였다. 일반적인 TNF 계열 수용체의 각 CRD에서는 여섯 개의 보존된 Cys 잔기가 이황화(disulfide) 쌍을 형성하는 반면에, 랭크의 CRD2-CRD4에서는 세 번째와 네 번째 Cys 잔기가 존재하지 않음을 확인하였다(도 1C 참조). 또한, CRD3 내에 일반적이지 않은 이황화결합(disulfide bond)인 Cys125-Cys127이 존재함을 확인하였고(도 1D 참조), 이 특이적인 이황화결합은 랭클-랭크 인식특이성에 관여하는 것으로 예상할 수 있다.
실시예 3. 랭클-랭크 결합 면의 주요 결합(bonding)들의 확인
본 실시예에서는 랭클-랭크의 결합 면에 존재하는 결합들을 살펴보았다. 즉, 랭클-랭크 결합체에 있어서, CDR2의 두 개의 루프(루프1, 루프2)와 CDR3의 한 개의 루프(루프3)는 랭클과 상호작용을 함을 확인하였다(도 3 참조). 랭크의 랭클에 대한 결합은 용액과 접촉가능한 면적(solvent accessible surface area )을 7680Å2 감소시키고, 그것은 결합하지 않은 상태의 수용체와 리간드의 용액과 접촉가능한 전체 면적의 15.4%에 해당하는 것이다. 수용체와 리간드의 전기를 띄는 잔기(charged residues)들은 수용체-리간드의 인식특이성을 결정 짓는 정전기적 네트워크를 제공함을 확인하였다(도 3C 참조).
루프1에서, 랭크의 Asp85는 랭클의 스트랜드(strand) F의 Lys281, Arg283과 이온결합, 수소결합으로 상호작용을 하고, 랭클의 AA' 루프에서 Arg190과 Gly191은 Pro74의 백본(backbone) 카보닐 그룹과 Glu76의 곁사슬(side chain) 각각과 수소결합을 형성함으로써 랭클-랭크 결합을 더욱 안정화시킨다(도 4A, 표 1 참조). 더욱이, 랭크의 Asp75는 랭클의 Arg190과 이온결합, 물을 매개로 한 수소결합(water-mediated hydrogen bonds)을 형성하고, Leu88(eRANK)-His252(eRANKL) 및 Leu89(eRANK)-Gln302(eRANKL)에서의 반 데르 발스(van der Waals) 결합은 결합체의 인식특이성을 더욱 높여준다(도 4A, 표 1 참조).
루프2의 세 개의 잔기(Asp94, Gly96, Lys97)는 랭클과 넓게 접촉하고 있고, 폭넓은 상호작용은 랭크의 Asp94 및 Lys97과 랭클의 Arg222, Asp299 및 Asp301 사이에서 형성되고, Asp94는 Arg222와 charge-enhanced 수소결합을 형성하고, Lys97은 두 개의 산성 잔기(acidic residues)인 Asp299, Asp301과 상호작용한다. 동시에, Asp94, Lys97은 루프2의 전체적인 모양을 결정하는 데 중요한 서브유닛 내의 솔트 브릿지(intra-subunit salt bridge)에 관여하고 있었다. 게다가, Gly96, Lys97의 백본 카보닐 산소와 백본(backbone), His224의 곁사슬(side chain) 질소 사이에서 추가적인 수소결합이 존재한다(도 4B, 표 1 참조).
루프3은 가장 큰 결합 면을 제공하고 있었다. Tyr119와 Ser123의 백본(backbone) 카보닐 원자는 랭클의 Glu225, Lys180과 각각 수소결합을 형성하고(도 4C, 표 1 참조), 곁사슬과 랭크 Asp124의 백본 카보닐 산소는 His179와 솔트 브릿지(salt bridge), Lys180과 수소결합을 각각 형성하고 있었다. Cys125와 Cys128의 백본 카보닐 그룹은 랭클의 Gln236/Tyr240, His224와 각각 수소결합을 형성하고 있었다. 광범위한 수소결합, 솔트 브릿지(salt bridge)는 랭크의 Arg129, Arg130와 랭클의 Glu225, Glu268, Asn266 사이에서 관찰되었다(도 4C, 표 1 참조).
루프3의 가장 주목할 만한 특징은 Cys125과 Cys127 사이에 형성되어 있는 루프 끝에 있는 특이한 이황화결합(disulfide bond)의 존재이다. 이 특이적인 이황화결합(disulfide bond)은 루프3의 모양을 결정하는 중요한 요소이고 Glu126이 랭클의 많은 잔기들과 광범위하게 상호작용할 수 있도록 하는 요소로써, Glu126은 랭클의 Lys180과 상호작용을 할 뿐만 아니라(도 5 참조), 한 쪽 면에서 Lys256, Asp301, Asp303과, 다른 쪽 면에서는 Asn253, Gln291과 바이덴테이트(bidentate) 물을 매개로 하는 수소결합(water-mediated hydrogen bonds)을 형성하고 있었다. 또한, Glu126은 Tyr240과 반데르 발스 결합을 하고 있음을 확인하였다(도 5 참조).
루프1, 루프2 및 루프3이 랭클과 결합하는 방식을 살펴본 결과, 루프2는 상대적으로 작은 크기이지만 Asp94, Gly96, Lys97을 통해 랭클과 폭넓게 결합하고 있었고, 루프3은 가장 넓은 결합면을 제공하면서 랭클과 가장 많은 결합을 형성하고 있었다. 이에, 본 발명자들은 이러한 구조적 정보를 토대로 랭클과 결합할 수 있을 것으로 예상되는 몇몇 펩타이드를 루프3의 아미노산 서열로부터 제작하였다.
랭클-랭크 상호작용에 관여하는 주요 잔기
랭크 랭클 결합의 종류


루프 1


Pro74 Arg190 hydrogen bond
Asp75 Arg190 ionic, hydrogen bond
Glu76 Gly191 hydrogen bond
Asp85 Lys281, Arg283 ionic, hydrogen bond
Leu88 His252 hydrophobic
Leu89 Gln302 hydrophobic

루프 2
Asp94 Arg222 ionic, hydrogen bond
Gly96 His224 hydrogen bond
Lys97 Asp301, Asp299 ionic, hydrogen bond





루프 3



Tyr119 Glu225 hydrogen bond
Ser123 Lys180 hydrogen bond
Asp124 His179, Lys180 ionic, hydrogen bond
Cys125 Tyr240, Gln236 hydrogen bond
Glu126 Lys180 ionic, hydrogen bond
Glu126 Tyr240 hydrophobic
Cys128 His224 hydrogen bond
Arg129 Tyr234 hydrophobic
Arg129 Glu268 ionic, hydrogen bond
Arg130 Glu225, Asn266 ionic, hydrogen bond
실시예 4. 랭클 엑토도메인(eRANKL)과 랭크 엑토도메인(eRANK)을 코딩하는 유전자의 클로닝 , eRANKL eRANK 단백질의 발현 및 정제
랭클-랭크 결합체를 얻기 위하여, 생쥐의 랭클(eRANKL, residues 157-316)과 랭크(eRANK, residue 32-201)의 엑토도메인(extodomains)을 동일한 방법으로 발현시키고 정제하였다. 랭클과 랭크의 엑토도메인을 코딩하는 유전자들을 N-terminal 6His-thioredoxin (Trx)과 삽입된 cDNA 사이에 단백질 분해효소 Tobacco Etch Virus (TEV)의 절단부위를 가지고 있는 pVFT3S 벡터(대한민국 등록특허 제10-0690230호)에 클로닝하였다. 제조된 6His-Trx-eRANKL과 6His-Trx-eRANK는 15℃에서 24 시간 동안 0.2 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG)로 인덕션(induction)시킨 후에, Escherichia coli BL21 (DE3)과 Origami cells (Novagen, WI, USA)에서 각각 발현되었다. 각각의 융합 단백질은 Ni-NTA column (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 금속 친화 정제법(metal affinity purification)에 의해 정제되었고, TEV 단백질 분해효소에 의해 분해되었다. 분해된 랭클과 랭크를 NTA column에 다시 넣고, 통과된 부분은 완충용액(25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl)과 평형이 되는 Superdex-200 gel filtration chromatography (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)로 주입하여 정제하였다.
실시예 5. 폴리펩타이드 L3-3, L3-3S, L3-3N, L3-3A 및 L3-3B 제조
랭클과 상호작용을 하고 랭크-랭클간의 상호작용을 방해함으로써, 파골세포의 분화 및 활성화로 인한 골 질환의 치료제를 제공하기 위하여, RANK-RANKL의 결합체 구조에서 RANKL에 결합하는 RANK의 루프(루프3)의 아미노산 서열로부터 펩타이드를 제작하였으며, 제작된 펩타이드의 구체적인 아미노산 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
구분 아미노산 서열
L3-3 YC WNSDCEC CY RR(서열번호 5)
L3-3s YC SNSDCEC CY RR(서열번호 4)
L3-3n YC WNSDCEC C RR(서열번호 3)
L3-3A SDCECS(서열번호 2)
L3-3B SDCECSRR(서열번호 1)
RANKL에 결합하는 RANK의 루프부분(루프3)에 Cys125와 Cys127이 이황화 결합을 하고 있는바(도 4C 참조), 합성된 펩타이드에서도 이 두 개의 시스테인이 이황화 결합을 유지할 수 있도록 하였다. 다만 128번 Cys는 이웃한 Cys와 이황화 결합을 방지하기 위해 Ser으로 치환하였다.
실시예 6. 폴리펩타이드의 파골세포 분화 억제능 검증
실시예 5에서 제조된 폴리펩타이드의 파골세포 분화 억제능을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
즉, 생쥐의 파골세포 전구체를 5-8주 된 생쥐(male)의 경골과 대퇴부로부터 추출하고 정제하였다. 파골세포 전구체는 30 ng/ml의 M-CSF, 10% FBS를 함유하는 α-MEM 에서, 96 well plates (1 x 105/ml, 200 μl/well)에서 배양되었다. 세포는 5%의 CO2를 함유하는 축축한 공기에서 37℃에서 배양되었다. 파골세포 전구체의 분화는 인 비트로(in vitro)에서 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 활성의 수치에 의해 측정되었다. TRAP staining assay는 100mM 아세트산 나트륨(sodium acetate)(pH 5.2)에서 기질 Naphthol AS phosphate를 사용하여 수행되었다. TRAP-positive 다핵세포(multinucleated cells)는 현미경을 이용하여 osteoclast-like 다핵세포로 계산되었고, 통계적 데이터를 얻기 위해 각각 3번씩 반복하였다.
RANKL에 의해 파골세포분화되는 조건에서, 실시예 5를 통해 제조된 다섯 개의 펩타이드(L3-3, L3-3S, L3-3N, L3-3A, L3-3B)를 각각 농도별로 처리하여 파골세포의 억제 정도를 관찰하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 펩타이드는 모두 세포독성이 없었고(도6A 참조), 함량에 따라 파골세포의 분화 억제(dose-dependent inhibition) 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6B 참조). 특히, L3-3B가 대조군으로 사용된 기존에 보고된 펩타이드 (L3-3과 Ls-3S)보다 더 좋은 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 종래(기존의 특허)에는 RANK 펩타이드와 유사한 구조를 만들기 위해 L3-3 및 L3-3S 펩타이드 끝에 Cys를 달아서 펩타이드가 고리형태로 존재하도록 설계하여 생체 내 안정성이 떨어지는 반면, 본 발명에 따른 펩타이드는 고리화된 펩타이드가 아닌바, 생체 내 안성성도 우수할 뿐만 아니라 파골세포 분화 억제능도 우수한 장점이 있다. 또한 L3-3B는 L3-3A에 비해 월등히 높은 저해 효과를 보임을 확인할 수 있었고, 이로부터 C-term 끝에 Arg-Arg 이 활성에 매우 중요하다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
특히, 전술한 실시예에서는 생쥐의 랭클-랭크 결정체의 구조만을 대상으로 하였으나, 시퀀스(sequence)는 인간과 생쥐에서 거의 동일하고 특히 결합에 관여하는 루프 부분의 시퀀스는 완전히 동일하므로, 당업자라면 생쥐의 랭클-랭크 결정체 구조로부터 인간의 랭클-랭크 결정체 구조를 당연히 예측할 수 있고 본 발명에 따른 펩타이드 및 약학조성물을 인간에게 적용하여 파골세포 분화 억제효능을 얻을 수 있음은 자명한 사항이다. 또한, 전술한 실시예에서는 신규 펩타이드 L3-3A 및 L3-3B의 아미노산 서열 및 펩타이드의 파골세포 분화 억제 효능만을 확인하였으나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열을 이용하여 디제너레이트(degenerate) 프라이머를 제작한 다음, 제작된 프라이머를 이용하여 PCR 함으로써 유전자 단편 및 이를 포함하는 벡터를 얻고, 나아가 적절한 숙주세포를 선택하여 형질전환된 미생물을 얻을 수 있다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> NEW PEPTIDE INHIBITING RANKL-RANK INTERACTION AND THE USE THEREOF <130> PB13-11441 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L3-3B <400> 1 Ser Asp Cys Glu Cys Ser Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L3-3A <400> 2 Ser Asp Cys Glu Cys Ser 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L3-3n <400> 3 Tyr Cys Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L3-3s <400> 4 Tyr Cys Ser Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Tyr Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L3-3 <400> 5 Tyr Cys Trp Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Tyr Arg Arg 1 5 10

Claims (8)

  1. 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지되, 3번과 5번 아미노산이 서로 연결되어 이황화 결합을 이루며, 상기 펩타이드는 랭클과 랭크의 상호작용을 억제하여 파골세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 랭클과 랭크의 상호작용 억제용 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 따른 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 골 질환은 파골세포의 분화 및 활성화로 인해 유발되는 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골형성 부전증, 고칼슘혈증, 골연화증, 류마티스 관절염, 파젯병, 암에 의한 골 소실 및 골 괴사증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제1항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
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