KR101387142B1

KR101387142B1 - 인산알루미늄의 제조 방법

Info

Publication number: KR101387142B1
Application number: KR1020107002744A
Authority: KR
Inventors: 락슈미 칸드케; 조셉 페레츠
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2007-07-10
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2014-04-25
Also published as: ES2753776T3; HUE036201T2; BRPI0814557B1; EP3301074A1; WO2009009629A1; HK1145168A1; HUE045705T2; KR20100058461A; PL2170767T3; EP3301074B1; CA2692750C; PT3301074T; ES2655456T3; US20090016946A1; PT2170767T; US8540955B2; RU2010100670A; EP2170767A1; JP2010533123A; AU2008275081B2

Abstract

본 발명은 알루미늄 보강제 AlPO₄의 개선된 제조 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 염화알루미늄 용액을 제3인산나트륨 용액과 혼합하여 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계를 포함하는 인산알루미늄의 제조 방법으로서, 개선점은 약 50∼약 70℃ 범위의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 폐쇄계에서 인산알루미늄을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

인산알루미늄의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING ALUMINUM PHOSPHATE}

본 발명은 인산알루미늄의 제조 방법에 관한 것이다.

일부 백신 및 기타 의약은, 백신 항원의 면역원성을 증강시키는 작용을 하는 보강제(adjuvant)라고 부르는 1종 이상의 성분을 포함하여, 백신의 효과를 더 높인다. 연구 결과 여러 알루미늄 함유 백신은 보강제 없이 제제화된 동일한 백신보다 더욱 크고 더욱 연장된 항체 반응을 유발하는 것이 밝혀졌다. 백신 보강제로서 기능하는 여러 종류의 알루미늄 함유 염("명반이라고도 함")이 있다: (i) 인산알루미늄, 즉 AlPO₄, (ii) 수산화알루미늄, 즉 Al(OH)₃, 및 (iii) 황산알루미늄칼륨 AlK(SO₄)₂. 각 알루미늄 함유 보강제의 유효성은 흔히 특정 백신의 특성과 제조자의 백신 제조 방법에 따라 달라진다(Baylor 등, "Aluminum salts in vaccines-US perspective," Vaccine 20:S18-23, 2002). 보강제로서 작용하기 위해서는, 통상적으로 항원을 알루미늄에 흡착시켜 항원을 주사 부위에 유지해야 한다.

알루미늄 보강제를 포함하는 미국에서 허가된 어린이용 백신은 디프테리아-파상풍-백일해(DTaP) 백신, 일부 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza) b형 접합(Hib) 백신, 폐렴 구균 접합 백신, B형 간염 백신, 혼합 DTaP, Tdap, A형 간염 백신, 및 인유두종바이러스 백신을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

와이어쓰가 제조 시판하는 Prevnar^®는 보강제로서 인산알루미늄을 함유하는 접합 폐렴 구균 백신이다. Prevnar^®의 항원은, 각각 캐리어 단백질 CRM₁₉₇에 접합되어 있는 7종의 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 박테리아로부터 얻은 다당류의 혼합물이다. Prevnar^?는 알루미늄 보강제 AlPO₄ 상에 흡착된 항원 - 특이적 방어 면역 반응을 자극하는 물질 - 의 콜로이드 현탁액을 함유하는 투명한 수성 액체로서 제제화되어 있다,

인산알루미늄 보강제의 제조 방법이 개시된 바 있지만, 더욱 효과적이고 및/또는 무균성인 제조 방법, 특히 산업적 규모의 제조 방법이 필요하다. 또한, 임의의 신규한 방법은, 상업용으로 이미 시판되는 인산알루미늄 보강제, 예컨대 Prevnar^®와 유사한 물리적, 화학적 및 기능적 특성을 갖는 인산알루미늄 보강제를 제조하는 것이 바람직하다.

발명의 개요

본 발명은 알루미늄 보강제 AlPO₄의 개선된 제조 방법을 제공한다. 개선된 제법은 다른 방법과 비교하여 효율 증가 및/또는 무균성 증가 측면에서 유리하며, 산업적 규모에서 특히 유용하다.

따라서, 일 측면에서 본 발명은 염화알루미늄 용액을 제3인산나트륨 용액과 혼합하여 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계를 포함하는 인산알루미늄의 제조 방법으로서, 개선점은 약 50∼약 70℃ 범위의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하여 인산알루미늄 현탁액 및 상청액을 형성하는 단계; (ii) 인산알루미늄 현탁액을 침강시켜 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계; 및 (iii) 상청액을 제거하는 단계를 포함하고, 상기 혼합 단계, 침강 단계 및 제거 단계를 폐쇄계에서 실시하는 것인 인산알루미늄의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이들 및 기타 측면은 하기 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

본 발명은 알루미늄 보강제 AlPO₄의 개선된 제조 방법을 제공한다. 이들 방법은 AlPO₄의 산업적 규모의 제조에 특히 유용하다.

도 1은 염화알루미늄(AlCl₃) 및 제3인산나트륨(Na₃PO₄)을 별도로 먼저 제조하는 인산알루미늄의 제조 방법을 도시한다. 염화알루미늄은 염화알루미늄 6수화물의 형태일 수 있다. 그 다음 이들 반응물을 조제 용기에 무균적으로 옮기고, 물(예, 주사용수^TM 또는 WFI^TM)과 혼합한다. 이들 반응물 사이의 반응으로 AlPO₄ 현탁액이 형성된다. 그 다음, 이 현탁액을 25℃에서 침강을 위해 드럼으로 옮긴다. 이 과정을 위한 침강 시간(즉, AlPO₄ 침전물을 드럼 내에서 침강시키는 데 필요한 시간)은 약 7∼10일로서, 전체 공정 중에 가장 느린 반응 단계를 나타낸다. 침강 후에, 각 드럼으로부터 상청액을 제거하고, 침전된 AlPO₄를 현장 멸균(예, ≥ 121℃, 45 분) 및 pH 조정을 위해 조제 용기로 옮긴다. 그 다음 최종 AlPO₄를 저장을 위해 드럼으로 옮긴다. 산업적 규모의 방법의 총 배취 사이클 시간은 약 10∼12일이다. 또한, 이 공정의 공공연한 특성은 클린 에어 환경(예, 클래스 100)에서 복수회의 무균 조작을 실시해야 한다는 것이다. 이것은 비용이 많이 소요되고, 또한 멸균 시험을 필요로 한다.

도 1에 도시된 방법의 효율은, 특히 더 높은 온도에서 침강 단계를 실시함으로써 유의적으로 개선된다. 도 2에 도시된 개선된 방법에 있어서, 염화알루미늄, 제3인산나트륨 및 물을 혼합하여 AlPO₄ 현탁액을 형성한 후에, 이 현탁액을 약 50℃∼70℃(예, 60℃)에서 침강시킨다. 더 높은 온도에서는 침강 시간이 약 7∼10일에서 약 2∼5일로 단축된다.

도 1의 방법과 비교한 또 다른 개선점은 폐쇄계에서 공정의 모든 단계를 실시하는 것을 포함한다. 이것은 (예컨대 박테리아 유래의 오염 등의) 오염 위험을 줄이는 장점이 있어서, 최종 생성물의 멸균 보장성을 증가시키고 멸균 시험의 필요성은 감소시킨다. 따라서, 도 2에서 상청액을 (예컨대 딥 튜브를 사용하여) 조제 용기로부터 분리하고, (여전히 동일한 반응 용기 내에 존재하는) 남은 AlPO₄ 현탁액을 현장 멸균(예, ≥ 121℃, 30분)한 후, pH를 조정한다. 최종 AlPO₄ 생성물을 보관을 위해 드럼으로 옮길 수 있다. 산업적 규모의 이 방법의 총 배취 사이클 시간은 약 3∼6일(즉, 도 1의 방법의 사이클 시간의 1/2)이다. 사이클 시간 단축은 효율 측면에서 유리하다. 표 2는 도 1의 방법과 도 2의 방법 간의 일부 차이를 나란히 비교한 결과를 제공한다.

본 발명은, 부분적으로는 이들 발견에 기초하여 염화알루미늄 용액을 제3인산나트륨 용액과 혼합하여 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계를 포함하는 인산알루미늄의 제조 방법으로서, 개선점은 약 50∼약 70℃ 범위의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 개선점은 약 55∼약 65℃ 범위의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 개선점은 약 62℃의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 개선점은 약 60℃의 온도에서 인산알루미늄 침전물을 침강시키는 것을 포함한다.

상기 논의한 바와 같이, 이들 개선점은 인산알루미늄 침강 시간을 예상 외로 유의적으로 단축한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 침강 단계는 더 낮은 온도에서 약 7∼10일 동안 실시하는 것과 비교하여 약 2∼5일 동안 실시할 수 있다. 한 세트의 구체예에서, 침강 단계는 약 2∼4일, 예컨대 약 2∼3일 또는 약 3∼4일 동안 실시할 수 있다. 침강 단계는 이들 범위 내에서 원하는 시간 또는 그 보다 장기간(예, 5일 또는 그 이상) 또는 그 보다 단기간(예, 2일 미만) 동안 실시할 수 있다. 침강 시간을 길게 하면 일반적으로 침강 시간을 짧게 한 것에 비하여 더 높은 수율을 산출한다; 그러나, 전체 제조 공정 기간의 증가에 따른 효율 감소도 있을 것이다. 따라서, 최적의 침강 시간은 2가지 인자를 모두 고려해야 하며, 정확한 침강 온도에 따라 달라질 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 폐쇄계에서 인산알루미늄을 제조하는 방법에 관한 것이다. 폐쇄계의 사용은 공정의 멸균 보장성을 유의적으로 향상시킨다. 수행해야 하는 멸균 테스트 횟수를 줄일 수 있고 더 이상 클린 에어 환경에서 공정을 수행할 필요가 없기 때문에, 전체 공정의 효율이 더욱 높아진다. 본 명세서에 사용된 용어 "폐쇄계(closed system)"는 하나 이상의 용기 내부에 함유된 반응 혼합물의 외부 환경(예, 공기, 산소, 미생물 등)에의 노출이 감수되거나 방지되는 계를 의미한다. 이 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하여 인산알루미늄 현탁액 및 상청액을 제조하는 단계; (ii) 인산알루미늄 현탁액을 침강시켜 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계; 및 (iii) 상청액을 제거하는 단계를 포함하고, 상기 혼합 단계, 침강 단계 및 제거 단계를 폐쇄계에서 실시한다.

특정 구체예에서, 상기 방법 중 혼합 단계에서 제3인산나트륨 용액을 염화알루미늄 용액에 첨가한다. 통상적으로 제3인산나트륨 용액은, pH가 약 5.0∼약 5.4(즉, 약 5.2 ± 0.2) 범위가 될 때까지 염화알루미늄 용액에 첨가한다. 특정 구체예에서, 제3인산나트륨 용액은, pH가 약 5.1∼약 5.3 범위가 될 때까지 염화알루미늄 용액에 첨가한다.

특정 구체예에서, 상기 방법의 혼합 단계는 약 20℃∼약 30℃ 범위의 온도에서 실시한다. 특정 구체예에서, 혼합 단계는 약 25℃의 온도에서 실시한다.

특정 구체예에서, 상기 방법의 혼합 단계는 약 150 rpm∼약 350 rpm에서 회전하는 임펠러를 사용하여 염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법의 혼합 단계는 약 200 rpm∼약 300 rpm에서 회전하는 임펠러를 사용하여 염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법의 혼합 단계는 약 250 rpm에서 회전하는 임펠러를 사용하여 염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 상기 방법의 침강 단계는 약 50℃∼약 70℃ 범위의 온도에서, 즉 본 발명의 제1 측면에서 개시한 바와 같이 실시한다. 특정 구체예에서, 상기 방법의 침강 단계는 약 55℃∼약 65℃ 범위의 온도에서 실시한다. 또 다른 구체예에서, 침강 단계는 약 62℃의 온도에서 실시한다. 또 다른 구체예에서, 침강 단계는 약 60℃의 온도에서 실시한다.

특정 구체예에서, 침강 단계는 약 2∼5일 동안 실시할 수 있다. 예를 들어, 침강 단계는 약 2∼4일, 예컨대 약 2∼3일, 또는 약 3∼4일 동안 실시할 수 있다. 침강 단계는 이들 범위 내에서 원하는 시간 또는 그 보다 장기간(예, 5일 또는 그 이상) 또는 그 보다 단기간(예, 2일 미만) 동안 실시할 수 있다.

특정 구체예에서, 제거 단계는 상청액을 따라내는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 제거 단계는 딥 튜브를 사용하여 상청액을 제거하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 인산알루미늄 침전물을 멸균하는 단계를 추가로 포함하며, 이 때 상기 혼합 단계, 침강 단계, 제거 단계 및 멸균 단계는 모두 폐쇄계에서 실시한다. 특정 구체예에서, 멸균 단계는 인산알루미늄 침전물을 약 110℃ 이상의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 멸균 단계는 인산알루미늄 침전물을 약 121℃ 이상의 온도로 가열하는 것을 포함한다.

특정 구체예에서, 상기 방법은 인산알루미늄 침전물의 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함하며, 이 때 상기 혼합 단계, 침강 단계, 제거 단계, 멸균 단계 및 조정 단계는 모두 폐쇄계에서 실시한다. 특정 구체예에서, 조정 단계는 인산알루미늄 침전물의 pH가 약 5.6∼약 6.0 범위가 되도록 조정하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 조정 단계는 인산알루미늄 침전물의 pH가 약 5.7∼약 6.0 범위가 되도록 조정하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 조정 단계는 인산알루미늄 침전물의 pH가 약 5.8∼약 6.0 범위가 되도록 조정하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 조정 단계는 인산알루미늄 침전물의 pH가 약 5.9∼약 6.0 범위가 되도록 조정하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법을 이용하여 다양한 농도의 인산알루미늄을 제조할 수 있다; 그러나, 특정 구체예에서, 상기 혼합 단계 이후의 인산알루미늄의 농도는 약 9.0∼16.5 mg/ml 범위이다.

특정 구체예에서, 상기 pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.5](입도 분포값 정의는 하기 실시예 1에 설명되어 있음)가 약 3.0 ㎛∼약 9.0 ㎛, 또는 약 4.5 ㎛∼약 6.5 ㎛ 범위인 입자를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.1]가 약 1.5 ㎛ 이상, 또는 약 2.0 ㎛ 이상인 입자를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 약 25 ㎛ 미만, 약 24 ㎛ 미만, 약 23 ㎛ 미만, 약 22 ㎛ 미만, 약 21 ㎛ 미만, 또는 약 20 ㎛ 미만인 입자를 포함한다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 본 발명은 어떤 방식으로든 이들 실시예에 의해 한정되지 않음을 알아야 한다.

도 1은 AlPO₄ 제법의 흐름도를 도시한다.
도 2는 개선된 AlPO₄ 제법의 흐름도를 도시한다.

실시예

실시예 1 - 시스템/공정 설명

본 실시예는 도 2에 도시된 바와 같은, 본 명세서에 개시된 일부 방법을 수행하기 위한 예시적인 시스템 및 공정을 개시한다. 본 실시예에서, AlPO₄의 제조 및 제조 공정 배취는 Media Preparation System(MPS 또는 Media Preparation Skid)로 조절한다. MPS는 3개의 배취 용기(50 ℓ, 200 ℓ 및 800 ℓ), 필터 하우징 및 위생 연결부를 구비한 도관으로 이루어진다. 본 제조 공정에서는 200 ℓ(V12) 및 800 ℓ(V13) 용기를 이용한다. 이것에 의해 AlPO₄가 800 ℓ(총 부피) 배취에서 생성되어, 350 Kg 인산알루미늄 침전물이 얻어진다. 최종 침전물을 50 ℓ 드럼으로 하적(download)한다.

본 공정에 사용된 원료는 하기를 포함하였다:

· 제3인산나트륨(20.4 Kg)

· (제3인산나트륨 용해를 위한) WFI^TM(107.4 ℓ)

· 염화알루미늄 6수화물(10.1 Kg)

· (염화알루미늄 6수화물 용해를 위한) WFI^TM(91.6 ℓ)

· 5N 수산화나트륨(pH 조정용).

공정의 제1 단계는 제3인산나트륨 20.4 Kg을 칭량하여 원료 보유 용기에 넣고 잘 둔다. 이어서, 염화알루미늄 6수화물 10.1 KG 칭량하여 원료 보유 용기에 놓고 잘 둔다.

인산알루미늄을 위한 자동화된 수단을 개시하고, 시스템에 대해 가압 시험을 실시하였다. 이어서, 용기 V12, V13, 및 연결된 수송 라인을 WFI^TM로 사전 세정하였다. WFI^TM 세정 후에, V12 및 V13 사이의 수송 라인의 "여과면" 및 "정화면"에 일렬로 미립자 제어 필터를 둔다. 현장 시료 채취(sampling bulk) 전에, C-Flex를 포함하는 사전 멸균 샘플 포트를 용기 V13에 연결하였다.

이어서, 시스템에 대해 또 다른 가압 유지 시험을 실시하였다. 가압 유지 완료 후에, 클린 스팀으로 시스템을 씻어내렸다. 스팀으로 씻어내린 후에, 이전에 설치한 필터를 총 50ℓ의 WFI로 씻어내렸다.

이어서, 목표량 162.0 ℓ의 WFI를 V12에 첨가하였다. 그 후, WFI를 V13으로 옮겼다. 추가의 100 ℓ WFI를 V12에 첨가한 다음 V13으로 옮겼다. 중요한 최종 반응 온도 25℃가 V13에서 확립되었다.

목표량 63.0 ℓ WFI를 V12에 첨가하였다. V12와 연결된 교반기로 교반을 시작하고, 목표 350 rpm으로 제어하였다. (35∼45℃의 용해 온도에 도달한 후에) 사전 칭량한 염화알루미늄을 V12에 첨가하였다. 염화알루미늄의 초기 용해 후에, V12를 목표량 91.6 ℓ WFI가 되도록 하고 5∼35분 동안 혼합한 후에 염화알루미늄이 용해되었는지 시각적으로 확인하였다. 이어서, 용기 V13에서 설정점을 250 rpm으로 하여 WFI를 교반하기 시작하였다. 그 후, 염화알루미늄을 V12에서 V13으로 옮겼다.

목표량 150 ℓ WFI를 V12에 첨가하였다. 그 후 WFI를 V13으로 옮기고, 추가의 150 ℓ WFI를 V12에 첨가하고, 다시 V13으로 옮겼다. 중요한 최종 반응 온도 25℃가 V13에서 확립되었다.

목표량 70 ℓ WFI를 V12에 첨가하였다. V12와 연결된 교반기로 교반을 시작하고, 목표 350 rpm으로 제어하였다. (35∼45℃의 용해 온도에 도달한 후에) 사전 칭량한 제3인산나트륨을 V12에 첨가하였다. 제3인산나트륨의 초기 용해 후에, V12를 목표량 107.4 ℓ WFI가 되도록 하고 5∼35분 동안 혼합한 후에 제3인산나트륨이 용해되었는지 시각적으로 확인하였다.

제3인산나트륨을 V12에서 V13으로 옮기고, 목표 pH 5.20이 될 때까지 염화알루미늄과 혼합하였다. 1 시간 후에, 제3인산나트륨을 첨가하여 pH를 다시 목표 pH 5.20으로 조정하였다. 일단 pH가 안정화되면, 교반기의 속도를 150 rpm으로 늦추고 온도 설정점을 60℃로 바꾸었다. 1 시간 동안 혼합한 후에 교반기를 껐다. 남은 제3인산나트륨을 V12로부터 빼낸 다음, 미립자 필터를 제거하고 CIP 캡으로 교체하고, V12 및 수송 라인에 대해 CIP 절차를 진행하였다.

목표 온도 60℃에서 딥튜브 아래까지 인산알루미늄을 V13에서 침강시켰다. 일단 침강이 (딥튜브 아래로) 완료되면, 딥튜브를 통해 V13으로부터 상청액을 따라냈다. 이어서, V13의 샘플 밸브를 ≥121.1℃에서 15분 동안 수동으로 멸균하였다. 일단 샘플 밸브가 멸균되고 60℃ 이하의 온도로 냉각되면, 2개의 25 ㎖ 미생물존재량(bioburden) 샘플을 취하였다.

그 후, V13 중의 인산알루미늄을 30분 동안 ≥121.1℃에서 멸균시킨 다음 베이스 첨가 라인을 멸균(≥ 121.1℃ 온도에서 15)시킨다. 멸균 연결 장치를 사용하여, 5N NaOH의 1 ℓ병을 베이스 첨가 라인에 연결하였다.

인산알루미늄이 목표 온도 25℃로 냉각되면, 인산알루미늄의 pH를 목표 5.95로 조정하였다. 최대 16개의 사전 세정되고 멸균된 50 ℓ 드럼을 각 충전 스테이션 위치에 연결하였다.

이 후, 수송 라인을 ≥121.1℃에서 15분 동안 멸균하였다. V13에 대한 샘플 밸브를 ≥121.1℃에서 15분 동안 멸균하였다. 샘플 밸브가 멸균되고 60℃ 미만으로 냉각되면, 입자 크기, pH, 알루미늄 농도 및 멸균성을 위한 2개의 30 ㎖ 현장 샘플을 취하였다.

샘플을 채취한 후에, 인산알루미늄을 50 ℓ 드럼으로 하적하였다. 이 하적이 완료되면, V13 및 수송 라인에 대해 완전 화학물질 CIP를 실시하였다. 이어서, 모든 50 ℓ 드럼으로부터 알루미늄 농도 및 멸균성을 조사하기 위해서 샘플을 취하였다(그러나, 실제로는 멸균성을 위해서 처음 드럼과 마지막 드럼에서 샘플을 취한다). 자기 안정화기를 각 드럼에 부착하고, 드럼을 2∼8℃의 냉장실에서 보관하였다.

실시예 2 - AlPO ₄ 의 물리적, 화학적 및 기능적 특성의 분석

도 1의 공정에 따라 제조한 3개 AlPO₄ 로트 및 도 2 (및 실시예 1)의 공정에 따라 제조한 3개 물질 로트를 분석하여 양 공정에 의해 제조된 물질을 비교하였다. 사용된 분석법은 AlPO₄의 물리적, 화학적 및 기능적 특성에 기초하여 선택하였다. 방출 시험 외에 이들 특성화 연구를 실시하였으며, 모든 로트는 AlPO₄의 방출 기준에 부합하였다. 동등한 연구로부터 얻은 결과는 하기에 요약되어 있다:

입도 분석: 벌크 보강제 및 제제화된 백신의 입도 분석은 Malvern 입도 분석기(Mastersizer, Serial 2.15)에서 레이저광 산란으로 수행하였다. 용매(예, 이소프로판올) 중의 분말 현탁액은 낮은 각도의 레이저빔으로 측정하였으며, 입도 분포를 계산하였다. 부피 중간 직경 D[v,0.5]는 분포의 50%는 중간값 이상이고 50%는 중간값 이하인 직경이다. 바람직하게는, 평균 입도의 2 측정값이 상대적으로 5% 이상 차이가 나서는 안된다. 2 측정값의 곡선 형상이 동일한 것이 바람직하다. D[v,0.9]은 부피 분포의 90%가 이 값 이하인 직경이다. D[v,0.1]은 부피 분포의 10%가 이 값 이하인 직경이다. 범위(span)는 10%, 50% 및 90% 분위를 기초로 한 분포 폭이다(범위 = {D[v,0.9]- D[v,0.1]}/D[v,0.5]). 이러한 측정 이전에, 2 ㎛ 및 10 ㎛를 나타내는 공지된 분자 크기의 비드를 사용하여 기구를 표준화하였다. 양 공정으로 제조한 AlPO₄의 입도(Prevnar^®로 제제화하기 전후)는 유사하였으며, 그 값은 표 1에 기재된 규격 내에 있다.

입도

제제화전	제제화후
D[v,0.1] = ≥2.0 ㎛	D[v,0.1] = ≥2.0 ㎛
D[v,0.5] = 3.7∼8.4 ㎛	D[v,0.5] = 4.5∼6.4 ㎛
D[v,0.9] = ≤20.0 ㎛	D[v,0.9] = ≤22.0 ㎛

단백질 결합 분석 : AlPO₄에 결합하는 단백질 비율(%)은 알루미늄 펠릿과의 접촉 전에, 그리고 알루미늄 펠릿으로의 처리 후에 총 단백질 농도를 측정하여 결정하였다. 염수 중에 재현탁시킨 후에 펠릿 중의 단백질 함량을 측정하였다. 도 1의 공정으로부터 얻은 AlPO₄로 제제화한 캐리어 단백질 CRM₁₉₇의 평균 결합율(%)(97.5 ± 0.8)과 도 2의 공정으로부터 얻은 AlPO₄로 제제화한 캐리어 단백질 CRM₁₉₇의 평균 결합율(%)(96.1 ± 1.4)은 유사하였다. 도 1의 공정으로부터 얻은 AlPO₄로 제제화한 Prevnar^?의 평균 결합율(%)(91.5 ± 1.6)과 도 2의 공정으로부터 얻은 AlPO₄로 제제화한 Prevnar^?의 평균 결합율(%)(91.7 ± 1.9)도 또한 유사하였다.

비탁 분석: 알루미늄 펠릿을 가용화시키는 한 방법으로서 시트레이션을 사용하여 비탁법으로 항원성에 대해 백신 Prevnar^®를 분석하였다. 이전 연구에 기초하면, 접합 다당류만이 알루미늄에 결합하고 유리 다당류 또는 활성화된 당류는 결합하지 않는 것으로 알려져 있다. 펠릿과 회합된 항원성은 접합 다당류임을 반영한다. 비탁 측정은 토끼에 대해 생성된 항체를 사용하여 Beckman Array 360 System으로 실시하였다. 비탁법을 사용하여 AlPO₄에 대한 각 Prevnar^® 접합체의 결합을 측정하였으며, 도 1 및 도 2의 공정을 이용하여 제조된 물질 데이타는 유사한 것으로 확인되었다.

제타 전위/전기 영동 이동성 : Zetasizer를 사용하여 제타 전위 및 전기 영동 이동성을 측정하였다. 도 1의 공정으로 얻은 AlPO₄의 제타 전위는 평균 4.7 ± 0.2 mV (5.1 ± 0.1, 3.5 ± 0.2 및 5.5 ± 0.2 mV)였다. 도 2의 공정으로 얻은 AlPO₄의 제타 전위는 평균 3.3 ± 0.3 mV (3.6 ± 0.3, 2.6 ± 0.4, 및 3.7 ± 0.1 mV)였다.

침강 시간 : 645 nm 파장에서 분광광도기(Shimadzu UV160-IPC)로 30분 동안 광학 밀도 변화를 측정하여 침강 시간을 모니터링하였다. 도 1의 공정으로 얻은 AlPO₄의 침강 시간/속도(A₆₄₅/분)는 0.024, 0.025 및 0.023이었다. 도 2의 공정으로 얻은 AlPO₄의 침강 시간/속도(A₆₄₅/분)는 0.027, 0.026 및 0.026이었다.

표 2는 도 1 및 도 2의 방법에 사용된 일부 파라미터를 비교한 것이다. 제시된 바와 같이, 인산알루미늄 침전물의 침강 시간은, 침강 온도를 25℃에서 60℃로 증가시킴으로써 약 7∼10일에서 약 2∼5일로 단축되었다. 이는 유의적인 효율 개선을 나타낸다. 실시예 1에 개시된 바와 같이, 양 방법으로 제조된 인산알루미늄 샘플은 물리적, 화학적 및 기능적 특성이 유사하다.

2가지 방법의 파라미터 비교

공정	도 1	도 2
반응 온도	25℃	25℃
반응 중의 혼합 속도	7/14로 설정한 Rheostat	250 rpm
혼합 장비	Vibromixer	Marine impeller
침강을 위한 용기 크기/종류	200 ℓ드럼 x 5	1000 ℓ 탱크-V13
침강 시간	7∼10일	62∼112 시간
침강 온도	25℃	60℃
상청액 제거 절차	드럼 내의 딥 튜브	탱크 내의 딥 튜브
AlPO₄ 공정의 탱크 수	2	2
적재(upload)	드럼에서 탱크 101로 AlPO₄ 적재	필요하지 않음
상청액 제거 후 혼합 속도	8/93로 설정한 Rheostat	250 rpm
현장 멸균(SIP) 조건	≥121℃, 45분	≥121℃, 30분
최종 pH 조정 중의 혼합 시간	25℃에서 1∼2 시간	25℃에서 2∼4 시간
하적용 드럼 크기	50 ℓ x 8	50 ℓ x 13
샘플 채취 시스템	폐쇄	폐쇄
멸균 샘플 채취	모든 드럼	제1 드럼 및 최종 드럼
보관 온도	2∼8℃	2∼8℃
최종 제조 공정 중의 pH 조정	5.6∼6.0	5.6∼6.0

실시예 3 - 매체 자극

TSB(Tryptic Soy Broth)를 사용하여 실시예 1의 MPS(Media Preparation Skid)에서 매체 자극 연구를 실시하였다. 이들 연구는 MPS 멸균 조작이 멸균성을 유지하고 제조, pH 조정, 샘플 채취 및 이후의 드럼으로의 멸균액의 전달 과정 중의 미생물 유입을 방어하는 보장도가 높다는 것을 입증한다. 각 매체 연구 시험은 멸균, 5N 수산화나트륨을 이용한 pH의 멸균 조정 및 TSB의 16개 드럼으로의 멸균 전달로 이루어진다. 멸균 전달은 ≥ 10 시간 멸균 유지 후에 실시한다. 멸균 유지는 멸균 조작이 실시된 후에 시스템이 유지될 수 있는 시간의 총량을 나타낸다(11 시간). 모든 16개의 충전 스테이션 위치로부터 1 ℓ 병에 TSB를 넣고, 완전히 항온처리하였다. 위치 1번 및 16번에서 취한 샘플이 드럼으로의 전체 용액 전달 공정을 대표한다. 실시예 1의 MPS의 폐쇄계 디자인과 이 연구의 성공적인 결과로 인해, 멸균 테스트는, 도 1에 도시된 방법을 이용할 때 필요한 것처럼 모든 드럼에서 실시하기보다는, 상업적 제조 과정에서 제1 및 최종 드럼에서만 실시하면 된다.

등가물

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Claims

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인산알루미늄 백신 보강제의 제조 방법으로서,
염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하여 인산알루미늄 현탁액 및 상청액을 형성하는 단계로서, pH가 5.0∼5.4 범위가 될 때까지 제3인산나트륨 용액을 염화알루미늄 용액에 첨가하는 것인 단계;
인산알루미늄 현탁액을 침강시켜 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계로서, 침강 단계는 60℃의 온도에서 2일∼5일의 기간 동안 실시하는 것인 단계;
상청액을 제거하는 단계를 포함하고, 혼합 단계, 침강 단계 및 제거 단계를 폐쇄계에서 실시하며;
인산알루미늄 침전물을 멸균하는 단계로서, 멸균 단계는 인산알루미늄 침전물을 110℃ 이상의 온도로 가열하는 것을 포함하는 단계; 및
인산알루미늄 침전물의 pH를 5.6∼6.0 범위로 조정하는 단계를 포함하고, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.5]가 3.0 ㎛∼9.0 ㎛ 범위인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
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제4항에 있어서, 인산알루미늄의 최종 현탁액의 pH가 5.1∼5.3 범위가 될 때까지 제3인산나트륨 용액을 염화알루미늄 용액에 첨가하는 것인 제조 방법.
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제4항에 있어서, 혼합 단계는 25℃의 온도에서 실시하는 것인 제조 방법.
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제4항에 있어서, 인산알루미늄 침전물의 pH를 5.9∼6.0 범위로 조정하는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, 혼합 단계 이후 인산알루미늄 현탁액에서 인산알루미늄의 농도는 9.0∼16.5 mg/ml 범위인 제조 방법.
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제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.5]가 4.5 ㎛∼6.5 ㎛ 범위인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
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제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.1]가 2.0 ㎛ 이상인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
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제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 20 ㎛ 미만인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 21 ㎛ 미만인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 22 ㎛ 미만인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 23 ㎛ 미만인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.9]가 24 ㎛ 미만인 입자를 포함하는 것인 제조 방법.
인산알루미늄 백신 보강제의 제조 방법으로서,
염화알루미늄 용액과 제3인산나트륨 용액을 혼합하여 인산알루미늄 현탁액 및 상청액을 형성하는 단계로서, pH가 5.0∼5.4 범위가 될 때까지 제3인산나트륨 용액을 염화알루미늄 용액에 첨가하는 것인 단계;
인산알루미늄 현탁액을 침강시켜 인산알루미늄 침전물을 형성하는 단계로서, 침강 단계는 60℃의 온도에서 2일∼5일의 기간 동안 실시하는 것인 단계;
상청액을 제거하는 단계를 포함하고, 혼합 단계, 침강 단계 및 제거 단계를 폐쇄계에서 실시하며;
인산알루미늄 침전물을 멸균하는 단계로서, 멸균 단계는 인산알루미늄 침전물을 110℃ 이상의 온도로 가열하는 것을 포함하는 단계; 및
인산알루미늄 침전물의 pH를 5.6∼6.0 범위로 조정하는 단계를 포함하고, pH 조정 단계 이후, 인산알루미늄 침전물은 입도 분포 D[v, 0.5]가 3.0 ㎛∼9.0 ㎛ 범위인 입자를 가지는 것인 제조 방법.