KR101373695B1 - 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 가공된 다가 및 다특이적 결합 단백질, 이의 제조 방법, 및 특히 급성 및 만성 염증 및 기타 질환을 예방하고/하거나 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
결합 단백질, 염증, 다특이적 결합 단백질

Description

이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도{Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2005년 8월 19일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/709,911호 및 2005년 11월 2일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/732,892호에 대한 우선권의 이득을 청구한다.
본 발명은 다가 및 다특이적 결합 단백질, 이의 제조 방법 및 특히, 급성 및 만성 염증, 암 및 기타 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다특이적 항체와 같이 가공된 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 당해 다특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 접합 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
이특이적 항체는 이특이적 항체의 목적하는 특이성을 갖는 쥐 모노클로날 항 체를 발현하는 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합을 기초로 하는 쿠아드로마(quadroma) 기술 (문헌참조: Milstein, C. and A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40)을 사용하여 제조되었다. 수득한 하이브리드-하이브리도마(또는 쿠아드로마) 세포주내에서 2개의 상이한 Ig 중쇄 및 경쇄의 무작위 쌍 형성 때문에, 10개 이하의 상이한 면역글로불린 종이 제조되고 이중에 하나만이 기능성 이특이적 항체이다. 잘못된 쌍을 형성한 부산물의 존재 및 상당히 감소된 생산 수율은 정교한 정제 과정이 요구됨을 의미한다.
이특이적 항체는 2개의 상이한 mAb의 화학적 접합에 의해 제조될 수 있다 (문헌참조: Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31). 당해 방법은 균질의 제제를 생성시키지 못한다. 다른 방법은 2개의 상이한 모노클로날 항체 또는 보다 소형의 항체 단편의 화학적 접합을 사용하였다(문헌참조: Brennan, M., et al., Science, 1985. 229(4708): p. 81-3).
또 다른 방법은 이종 이기능성 가교링커를 사용하여 2개의 모 항체를 커플링시키는 것이지만 수득한 이특이적 항체의 제제는 가교링커와 모 항체의 반응이 부위 특이적이지 않기 때문에 분자적으로 상당히 이종성이다. 이특이적 항체의 보다 균질의 제제를 수득하기 위해, 2개의 상이한 Fab 단편은 부위 특이적 방식으로 이들의 힌지 시스테인 잔기에서 화학적으로 가교결합되었다(문헌참조: Glennie, M.J., et al., J Immunol, 1987. 139(7): p. 2367-75). 그러나, 이러한 방법으로는 완전한 IgG 분자가 아닌 Fab'2 단편이 수득된다.
광범위한 기타 재조합 이특이적 항체 포맷이 최근에 개발되었다(문헌참조: Kriangkum, J., et al., Biomol Eng, 2001. 18(2): p. 31-40). 이들중에서, 탠덤(tandem) 단일쇄 Fv 분자 및 이중항체 및 이의 다양한 유도체가 재조합 이특이적 항체를 작제하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 포맷이다. 통상적으로, 이들 분자의 작제는 상이한 항원을 인지하는 2개의 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로부터 시작된다(문헌참조: Economides, A.N., et al., Nat Med, 2003. 9(1): p. 47-52). 탠덤 scFv 분자((taFv)는 추가의 펩타이드 링커를 사용하여 단순히 2개의 scFv 분자를 연결하는 곧은 포맷을 나타낸다. 탠덤 scFv 분자에 존재하는 2개의 scFv 단편은 분리된 폴딩 실체를 형성한다. 다양한 링커를 사용하여 2개의 scFv 단편을 연결시킬 수 있고 링커의 길이는 63개 이하의 잔기이다(문헌참조: Nakanishi, K., et al.,. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 423-74). 모 scFv 단편은 보통 세균에서 가용성 형태로 발현될 수 있지만 탠덤 scFv 분자는 흔히 세균에서 불용성 응집체를 형성하는 것으로 관찰된다. 따라서, 통상적으로 재폴딩 프로토콜 또는 포유동물 발현 시스템이 가용성 탠덤 scFv 분자를 제조하는데 적용된다. 최근 연구에서, CD28 및 흑색종 관련 프로테오글리캔에 대해 지시된 탠덤 scFv의 유전자 전이 래빗 및 소에 의한 생체내 발현이 보고되었다(문헌참조: Gracie, J.A., et al., J Clin Invest, 1999. 104(10): p. 1393-401). 당해 작제에서, 2개의 scFv 분자는 CH1 링커에 의해 연결되고 이특이적 항체의 혈청 농도는 100mg/L 이하인 것으로 밝혀졌다. 도메인 정렬의 변이 및 다양한 길이 또는 유연성을 갖는 중간 링커의 사용을 포함하는 다양한 전략을 사용하여 세균에서 가용성으로 발현시킬 수 있었다. 현재 몇몇 연구가 세균에서, 매우 짧은 Ala3 링커 또는 긴 글라이신/세린 풍부 링커를 사용한 가용성 탠덤 scFv 분자의 발현을 보고하였다(문헌참조: Leung, B.P., et al., J Immunol, 2000. 164(12): p. 6495-502; Ito, A., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4802-9; Karni, A., et al., J Neuroimmunol, 2002. 125(1-2): p. 134-40). 최근 연구에서, 길이가 3개 또는 6개 잔기인 무작위 중간 링커를 포함하는 탠덤 scFv 레퍼토리의 파아지 디스플레이를 사용하여 세균에서 가용성 및 활성 형태로 생성되는 분자를 집적시켰다. 당해 방법으로 6개의 아미노산 잔기 링커를 갖는 바람직한 탠덤 scFv 분자를 분리하였다 (문헌참조: Arndt, M. and J. Krauss, Methods Mol Biol, 2003. 207: p. 305-21). 당해 링커 서열이 탠덤 scFv 분자의 가용성 발현을 위한 일반적인 해결책이 되는지는 불명확하다. 하지만, 당해 연구는 지시된 돌연변이 유발과 병용하여 탠덤 scFv 분자의 파아지 디스플레이가 세균에서 활성 형태로 발현될 수 있는 분자를 집적시키기 위한 강력한 도구임을 입증하였다.
이특이적 이중항체 (Db)는 발현을 위해 이중항체 포맷을 사용한다. 이중항체는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 링커의 길이를 약 5개의 잔기로 감소시킴에 의해 scFv 단편들로부터 제조된다(문헌참조: Peipp, M. and T. Valerius, Biochem Soc Trans, 2002. 30(4): p. 507-11). 당해 링커 크기의 감소는 VH와 VL 도메인의 교차 쌍 형성에 의한 2개의 폴리펩타이드 쇄의 이량체화를 촉진시킨다. 이특이적 이중항체는 동일 세포내에서 VHA-VLB 및 VHB-VLA의 구조 (VH-VL 배열), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA의 구조 (VL-VH 배열) 중 어느 하나를 갖는 2개의 폴리펩타이드 쇄를 발현시킴에 의해 제조된다. 다수의 광범위한 상이한 이특이적 이중항체가 과거에 제 조되었었고 이들 대부분은 세균에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 그러나, 최근 비교 연구는 가변성 도메인의 배향이 활성 결합 부위의 발현 및 형성에 영향을 줄 수 있음을 입증한다(문헌참조: Mack, M., G. Riethmuller, and P. Kufer, Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(15): p. 7021-5). 하지만, 세균에서 가용성 발현은 탠덤 scFv 분자에 비해 중요한 잇점을 나타낸다. 그러나, 2개의 상이한 폴리펩타이드 쇄는 단일 세포내에서 발현되기 때문에, 불활성 동종이량체가 활성 이종이량체와 함께 생성될 수 있다. 이로써, 이특이적 이중항체의 균질의 제제를 수득하기 위해서는 추가의 정제 단계의 수행이 필요하다. 이특이적 이중항체를 생성시키는 한가지 방법은 크놉-인투-홀(knob-into-hole) 이중항체를 생성시키는 것이다(문헌참조: Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14): p. 6444-8.18). 이것은 HER2 및 CD3에 대해 지시된 이특이적 이중항체에 대해 입증되었다. Val37을 Phe로 대체하고 Leu45를 Trp로 대체함에 의해 대형 크놉이 VH 도메인에 도입되었고 항-HER2 또는 항-CD3 가변 도메인에서, Phe98을 Met로 돌연변이시키고 Tyr87을 Ala로 돌연변이시킴에 의해 상보적인 홀을 VL 도메인에 생성시켰다. 당해 방법을 사용함에 의해 이특이적 이중항체의 생산은 모 이중항체에 의한 72%에서 크놉 인투 홀 이중항체에 의해 90% 이상으로 증가될 수 있었다. 중요하게도, 생산 수율은 이들 돌연변이 결과로서 단지 약간 감소하였다. 그러나, 몇몇 분석된 작제물에 대해서 항원 결합 활성의 감소가 관찰되었다. 따라서, 이것은 당해 방법이 결합 활성이 변형되지 않은 이종이량체성 분자를 생산하는 돌연변이를 동정하기 위해 다양한 작제물의 분석을 필요로 함을 시사한다. 또한, 당해 방법은 생체내 안정성이 불량하고 약리역학이 바람직하지 못한 불변 영역에서의 면역글로불린 서열을 돌연변이로 변형시킴에 따라서 면역원성을 증가시킬 수 있는 비고유 및 비천연 형태의 항체 서열을 제조할 필요가 있다.
단일쇄 이중항체 (scDb)는 이특이적 이중항체형 분자(diabody-like molecule)의 형성을 개선시키기 위한 또 다른 전략을 제공한다(문헌참조: Holliger, P. and G. Winter, Cancer Immunol Immunother, 1997. 45(3-4): p. 128-30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36). 이특이적 단일쇄 이중항체는 길이가 약 15개 아미노산 잔기인 추가의 중간 링커를 사용하여 2개의 이중항체 형성 폴리펩타이드를 연결시킴에 의해 제조된다. 결론적으로, 단량체 단일쇄 이중항체에 상응하는 분자량(50-60 kDa)을 갖는 모든 분자는 이특이적이다. 몇몇 연구는 이특이적 단일 쇄 이중항체가 세균에서 가용성 및 활성 형태로 발현되고 다수의 정제된 분자가 단량체로서 존재함을 입증하였다 (문헌참조: Holliger, P. and G. Winter, Cancer Immunol Immunother, 1997. 45(3-4): p. 128-30; Wu, A.M., et al., Immunotechnology, 1996. 2(1): p. 21-36; Pluckthun, A. and P. Pack, Immunotechnology, 1997. 3(2): p. 83-105; Ridgway, J.B., et al., Protein Eng, 1996. 9(7): p. 617-21). 따라서, 단일쇄 이중항체는 탠덤 scFv의 잇점(모든 단량체는 이특이적이다)과 이중항체의 잇점(세균에서 가용성 발현)을 갖는다.
보다 최근에, 이중항체는 Fc로 융합되어 이중-이중항체로 호칭되는 보다 Ig와 유사한 분자를 제조하였다(문헌참조: Lu, D., et al., J Biol Chem, 2004. 279(4): p. 2856-65). 또한, IgG의 중쇄에서 2개의 Fab 반복체를 포함하고 4개의 항원 분자와 결합할 수 있는 다가의 항체 작제물이 보고되었다(문헌참조: WO 0177342A1, and Miller, K., et al., J Immunol, 2003. 170(9): p. 4854-61).
당업계에서는 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 개선된 다가 결합 단백질이 요구된다. 본 발명은 고친화성으로 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 신규 계열의 결합 단백질을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다가 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 고친화성으로 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 신규 계열의 결합 단백질을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공한다. 바람직한 양태에서, 결합 단백질의 VD1 및 VD2는 중쇄 가변 도메인이다. 보다 바람직하게, 중쇄 가변 도메인은 쥐 중쇄 가변 도메인, 사람 중쇄 가변 도메인, CDR 접목 중쇄 가변 도메인 및 사람화된 중쇄 가변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, VD1 및 VD2는 동일한 항원과 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, VD1 및 VD2는 상이한 항원과 결합할 수 있다. 바람직하게, C는 중쇄 불변 도메인이다. 보다 바람직하게, X1은 링커이고, 단 X1은 CH1이 아니다. 가장 바람직하게, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 118); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 119); AKTTPKLGG(서열번호 120); SAKTTPKLGG(서열번호 121); SAKTTP(서열번호 122); RADAAP(서열번호 123); RADAAPTVS(서열번호 124); RADAAAAGGPGS(서열번호 125); RADAAAA(G4S)4(서열번호 126); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 127); ADAAP(서열번호 40); ADAAPTVSIFPP(서열번호 103); TVAAP(서열번호 44); TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); QPKAAP(서열번호 88); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92); AKTTPP(서열번호 38); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 128); AKTTAP(서열번호 129); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 99); ASTKGP(서열번호 42); ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 130); GENKVEYAPALMALS(서열번호 131); GPAKELTPLKEAKVS(서열번호 132); 및 GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 133)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커이다. 바람직하게, X2는 Fc 영역이다. 보다 바람직하게, X2는 변이 Fc 영역이다.
바람직한 양태에서, 상기된 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 결합 단백질의 VD1 및 VD2는 경쇄 가변 도메인이다. 바람직하게, 경쇄 가변 도메인은 쥐 경쇄 가변 도메인, 사람 경쇄 가변 도메인, CDR 접목 경쇄 가변 도메인 및 사람화된 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, VD1 및 VD2는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, VD1 및 VD2는 상이한 항원과 결합할 수 있다. 바람직하게, C는 경쇄 불변 도메인이다. 보다 바람직하게, X1은 링커이고, 단 X1은 CL1이 아니다. 바람직하게, X1은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 118); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 119); AKTTPKLGG(서열번호 120); SAKTTPKLGG(서열번호 121); SAKTTP(서열번호 122); RADAAP(서열번호 123); RADAAPTVS(서열번호 124); RADAAAAGGPGS(서열번호 125); RADAAAA(G4S)4(서열번호 126); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 127); ADAAP(서열번호 40); ADAAPTVSIFPP(서열번호 103); TVAAP(서열번호 44); TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); QPKAAP(서열번호 88); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92); AKTTPP(서열번호 38); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 128); AKTTAP(서열번호 129); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 99); ASTKGP(서열번호 42); 및 ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커이다. 바람직하게, 결합 단백질은 X2를 포함하지 않는다.
바람직한 양태에서, 상기된 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]을 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질을 제공하고, 이때, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다]를 포함하고; 제2 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]를 포함한다. 가장 바람직하게, 이원 가변 도메인 (DVD) 결합 단백질은 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 이때, 제1의 2개의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영 역이다]을 포함하고; 제2의 2개의 폴리펩타이드 쇄는 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이것은 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]를 포함한다. 당해 이원 가변 도메인(DVD) 단백질은 4개의 항원 결합 부위를 갖는다.
또 다른 바람직한 양태에서, 상기된 결합 단백질은 하나 이상의 표적과 결합할 수 있다. 바람직하게, 당해 표적은 사이토킨, 세포 표면 단백질, 효소 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 결합 단백질은 하나 이상의 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있다. 보다 바람직하게, 결합 단백질은 하나 이상의 표적을 중화시킬 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 림포킨, 모노킨 및 폴리펩타이드 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 사이토킨과 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 결합 단백질은 IL-1α와 IL-1β; IL-12와 IL-18, TNFα와 IL-23, TNFα와 IL-13; TNF와 IL-18; TNF와 IL-12; TNF와 IL-1베타; TNF와 MIF; TNF와 IL-17; 및 TNF와 IL-15; TNF와 VEGF; VEGFR와 EGFR; IL-13과 IL-9; IL-13과 IL-4; IL-13 과 IL-5; IL-13과 IL-25; IL-13과 TARC; IL-13과 MDC; IL-13과 MIF; IL-13과 TGF-b; IL-13과 LHR 효능제; IL-13과 CL25; IL-13과 SPRR2a; IL-13과 SPRR2b; IL-13과 ADAM8; 및 TNFα와 PGE4, IL-13과 PED2, TNF와 PEG2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합쌍의 사이토킨과 결합할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 CD138과 CD20; CD138과 CD40; CD19과 CD20; CD20과 CD3; CD38과 CD138; CD38과 CD20; CD38과 CD40; CD40과 CD20; CD-8과 IL-6; CSPG 과 RGM A; CTLA-4와 BTNO2; IGF1과 IGF2; IGF1/2과 Erb2B; IL-12와 TWEAK; IL-13과 IL-1β; MAG와 RGM A; NgR과 RGM A; NogoA와 RGM A; OMGp와 RGM A; PDL-1과 CTLA-4; RGM A와 RGM B; Te38과 TNFα; TNFα와 Blys; TNFα와 CD-22; TNFα와 CTLA-4; TNFα와GP130; TNFα와 IL-12p40; 및 TNFα와 RANK 리간드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합쌍의 표적과 결합할 수 있다.
하나의 양태에서, 사람 IL-1α 및 사람 IL-1β 와 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57 및 서열번호 59로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DVD 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58 및 서열번호 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 쥐 IL-1α 및 쥐 IL-1β와 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 105의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 109의 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, IL-12 및 IL-18과 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 83, 서열번호 90, 서열번호 93, 서열번호 95 및 서열번호 114로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 86, 서열번호 91, 서열번호 94, 서열번호 46, 서열번호 96 및 서열번호 116으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 DVD 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 양태에서, CD20 및 CD3과 결합할 수 있는 결합 단백질은 서열번호 97 의 DVD 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 101의 DVD 경쇄를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FIL1, FIL1 (엡실론), FIL1 (ZETA), IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL17B, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-a ), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (아프릴), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, FIGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN 및 THPO로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 2개 이상의 사이토킨, 사이토킨 관련 단백질 및 사이토킨 수용체와 결합할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 CCL1 (I-309), CCL2 (MCP -1 / MCAF), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (SLC / 엑소더스 -2), CCL22 (MDC / STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 / 에오탁신 -2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신 -3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCL1 (GRO1), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO3), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP 10), CXCL11 (I-TAC), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYD1), SCYE1, XCL1 (림포탁틴), XCL2 (SCM-1b), BLR1 (MDR15), CCBP2 (D6 / JAB61), CCR1 (CKR1 / HM145), CCR2 (mcp-1RB / RA), CCR3 (CKR3 / CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5 / ChemR13), CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6), CCR7 (CKR7 / EBI1), CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5 / CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HIF1A, IL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 케목킨, 케목킨 수용체 및 케목킨 관련 단백질과 결합할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 인테그린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 단백질과 결합할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 키나제 및 프로테아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효소와 결합할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 림포킨 수용체, 모노킨 수용체 및 폴리펩타이드 호르몬 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용체와 결합할 수 있다.
바람직한 양태에서, 결합 단백질은 다가이다. 보다 바람직하게, 결합 단백질은 다특이적이다. 상기된 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 특히 치료학적 관점에서 바람직한 성질을 갖는다. 예를 들어, 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 (1) 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가의 항체 보다 신속하게 내재화( 및/또는 동화)될 수 있고; (2) 효능제 항체일 수 있고/있거나 (3) 다가의 항체가 결합할 수 있는 항원을 발현하는 세포의 아폽토시스 및/또는 세포 사멸을 유도할 수 있다. 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질의 하나 이상의 항원 결합 특이성을 제공하는 "모 항체"는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화( 및/또는 동화)되는 것일 수 있고/있거나 효능제, 세포 사멸 유도 항체 및/또는 아폽토시스 유도 항체 일 수 있고, 상기된 바와 같은 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질은 당해 성질중 하나 이상이 개선된 것일 수 있다. 더욱이, 모 항체는 당해 임의의 성질중 하나 이상이 결여된 것일 수 있지만 본원에 기재된 바와 같은 다가 결합 단백질로서 작제되는 경우 당해 성질들을 부여받을 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상 및 약 106M-1s-1 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합율 상수(Kon)를 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 102M-1s-1 내지 103M-1s-1; 103M-1s-1 내지 104M-1s-1; 104M-1s-1 내지 105M-1s-1 또는 105M-1s-1 내지 106M-1s-1의 결합율 상수(Kon)을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하 또는 약 10-6s-1 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 해리율 상수(Koff)를 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 결합 단백질은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 하나 이상의 표적에 대해 10-3s-1 내지 10-4s-1; 10-4s-1 내지 10-5s-1 또는 10-5s-1 내지 10-6s-1의 해리율 상수(Koff)를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 표적 에 대해 약 10-7 M 이하; 약 10-8 M 이하; 약 10-9 M 이하; 약 10-10 M 이하; 약 10-11 M 이하; 약 10-12 M 이하 또는 10-13 M 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 해리 상수(KD)를 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 결합 단백질은 IL-12 또는 IL-23에 대해 10-7 M 내 지 10-8 M; 10-8 M 내지 10-9 M; 10-9 M 내지 10-10 M; 10-10 내지 10-11 M; 10-11 M 내지 10-12 M 또는 10-12 내지 M 10-13 M의 해리 상수(KD)를 갖는다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 면역접착 분자, 이미지화 제제, 치료제 및 세포독성 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 포함하는 접합체이다. 바람직하게, 이미지화 제제는 방사선표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생발광 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 이미지화 제제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방사선표지이다. 바람직하게, 치료제 또는 세포독성 제제는 항 대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스 유발 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 결정화된 결합 단백질이고 결정으로서 존재한다. 바람직하게, 결정은 담체 부재의 조절 방출 약제학적 결정이다. 보다 바람직하게, 결정화된 결합 단백질은 당해 결합 단백질의 가용성 대응물 보다 생체내에서 보다 큰 반감기를 갖는다. 가장 바람직하게, 결정화된 결합 단백질은 생물학적 활성을 보유한다.
또 다른 양태에서, 상기된 결합 단백질은 당화된다. 바람직하게 당화는 사람 당화 패턴이다.
본 발명의 한 측면은 상기된 결합 단백질중 임의의 하나를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 추가의 양태는 상기된 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고 이때, 벡터는 pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (추가의 다중 클로닝 부위를 갖는 pTT); pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO®, pEF6TOPO® 및 pBJ으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 숙주 세포는 상기된 벡터로 형질전환된다. 바람직하게, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 대장균 (E. coli)이다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 바람직하게, 진핵 세포는 원생 생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균류 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 CHO 및 COS을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물 세포; 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진균류 세포 또는 Sf9과 같은 곤충 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기된 숙주 세포중 임의의 하나를 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에 배양 배지에서 배양함을 포함하는, 상기된 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 당해 방법에 의해 제조되는 결합 단백질중 50% 내지 75%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다. 보다 바람직하게, 당해 방법에 의해 제조되는 결합 단백질중 75% 내지 90%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다. 가장 바람직하게, 제조되는 결합 단백질중 90% 내지 95%는 이원 특이적 4가 결합 단백질이다.
또 다른 양태는 상기된 방법에 따라 제조되는 결합 단백질을 제공한다.
하나의 양태는 결합 단백질 방출용 조성물을 제공하고 이때 당해 조성물은 상기된 바와 같은 결정화된 결합 단백질 및 성분 및 하나 이상의 중합 담체를 포함하는 제형을 포함한다. 바람직하게, 중합 담체는 폴리(아크릴산), 폴리 (시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(데프시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프롤락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리 (하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리캔, 황화 폴리에아카라이드, 이의 블렌드 및 공중합체로 이루어진 하나 이상의 그룹으로부터 선택된 중합체이다. 바람직하게, 당해 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태는 상기된 유효량의 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기된 바와 같은 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다. 바람직하게, 추가의 제제는 치료제, 이미지화제, 세포독성 제제, 혈관형성 억제제 (항-VEGF 항체 또 는 VEGF-트랩을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 키나제 억제제 (KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 공동 자극 분자 차단제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이에 제한되지 않음); 접착 분자 차단제(항-LFA-1 Abs, 항-E/L 셀렉틴 Abs, 소분자 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 항-IL-6/사이토킨 수용체 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제, 마약류 비스테로이드 소염 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항 미생물성 제제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사선 약제, 항우울증제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 및 사이토킨 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기된 결합 단백질을 사람 피검체에 투여하여 사람 피검체내 표적 또는 표적들의 활성이 억제되어 치료가 성취됨을 포함하는, 상기된 결합 단백질이 결합할 수 있는 표적 또는 표적들이 해로운 장애를 앓는 사람 피검체를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 장애는 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 대장염, 장 염증 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부경화증, 이식편 대 숙주 질 환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 질환, 다분비선 제I형 결핍증 및 다분비선 제II형 결핍증, 슈미트 증후군, 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽종 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 크움즈 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 질환 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조죽 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 조합성 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 범발성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 구드패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 경변, 알콜 유도 간 손상, 콜레오사타티스(choleosatatis), 특이체질성 간 질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, B 그룹 스트렙토코씨(streptococci) (GBS) 감염, 정신 장애(예를 들어, 우울증 및 정신분열증), Th2 형 및 Th1 형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(상 이한 형태의 통증), 및 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암종 및 조혈 악성종양(백혈병 및 림프종), 아베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 심방박동, AIDS 치매 합병증, 알콜 유도 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-l-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 앙기나 협심증, 전각 세포 퇴화, 항 cd3 치료, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 아오딕 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방세동 (지연 또는 발작성), 심방조동, 동정맥 막힘, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 퇴화, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학치료 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크루츠펠트-자콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭섬유증, 사이토킨 치료 관련 장애, 권투선수치매(Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 광범위 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장 애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물 유도 운동 장애, 약물 과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스탄-바르 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할레로르덴-스파츠 질환(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성 요독증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 과운동성 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동 부족 장애, 시상하부 - 뇌하수체-부신피질계 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/자궁염/광학적 신경근염, 허혈 관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프피부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막염 균혈증, 대사/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 연결 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 퇴화(만셀 데제린- 토마스 쉬-드라거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수이형성증후군 , 심근 경색, 심근 허혈 장 애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구감소성 발열 , 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, okt3 치료, 고환염/부고환염, 고환염/절관절제술 반전 과정, 기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 상핵 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 피부경화증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈증, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌 퇴화, 스트렙토코커스 근염, 소뇌 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나팔락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 말초혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염 , 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판 심장 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥동 질환, 정맥종 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이탈 뇌염/무균성 수막염, 바이탈-연관 적혈구식작용 증후군, 웨른니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직 의 이종이식 거부를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기된 결합 단백질중 임의의 하나를 상기 논의된 바와 같은 제2 제제의 투여 전후 또는 동시에 투여하는 단계를 포함하는, 장애를 앓는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 제2 제제는 부데노사이드, 상피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF의 항체 또는 효능제, CD2, CD3, CD4, CD8, CD-19, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β전환 효소 억제제, TNFα전환 효소 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토킨 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염 사이토킨, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직한 양태에서, 상기된 약제학적 조성물은 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 협막내, 연골내, 강내, 세포내, 소뇌내, 소뇌심실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 일시주사, 질내, 직장, 협측, 설하, 비내 및 경피투여로부터 선택되는 하나 이상의 방식으로 피검체에게 투여된다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 하나 이상의 결합 단백질에 대한 하나 이상의 항-이디오타입 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합부의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 골격 영역 또는 본 발명의 결합 단백질에 도입될 수 있는 이의 일부에 제한되지 않지만 이와 같은 하나 이상의 면역글로불린 분자 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BlyS; BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (I-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MIP-2); SLC; 엑소더스 -2; CCL22 (MDC / STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 /에오탁신 -2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신 -3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (p16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘 -7); CLN3; CLU (클루스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카테프신 B); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FIL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KRTHB6 (모발 특이적 II형 케라틴); LAMA5; LEP (렙틴); Lingo -p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-β); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; 미드킨; MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴 -III); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈 2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토킨); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (마스핀); SERPINE1 (PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (트롬보스폰딘 -1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; 조직 인자; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; Toll형 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Iia); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 표적과 결합할 수 있다.
도 1A는 이원 가변 도메인(DVD)-Ig 작제물을 도시한 것이고 2개의 모 항체로부터 DVD-Ig를 제조하기 위한 전략을 보여준다. 도 1B는 작제물 DVD1-Ig, DVD2-Ig, 및 하이브리도마 클론 2D13.E3 (항-IL-1α) 및 13F5.G5 (항-IL-1β) 기원의 2 개의 키메라 1특이적 항체를 도시한 것이다.
본 발명은 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 다가 및/또는 다특이적 결합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 DVD-Ig를 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포 뿐만 아니라 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)에 관한 것이다. 시험관내 또는 생체내에서 특이적 항원을 검출하기 위한 본 발명의 DVD-Ig를 사용하는 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 다른 표시가 없는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술적 용어들은 당업자가 유니트 알고 있는 의미를 갖는다. 또한, 정황상 다른 필요가 없는 한, 용어의 단수적 표현은 복수도 포함하며, 복수적 표현은 단수도 포함하는 것이다. 본 명세서에서, "또는"는 다른 표시가 없는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는" 및 이러한 유형어, 예컨대 "포함한다" 및 "포함한" 등은 제한적 의미가 아니다. 또한, "원소" 또는 "성분" 등의 용어도 다른 구체적 표현이 없는 한, 1 유니트를 포함하는 원소 및 성분은 물론 하나 이상의 서브유니트를 포함하는 원소 및 성분들도 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화 등과 관련하여 사용된 용어들은 당업계에 공지되어 있고 공통적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있고, 다른 표시가 없는 한 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 각종 일반 서적 및 구체적인 문헌들에 기술된 바와 같은 통상의 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 공통적으로 수행되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조자의 지침에 따라 수행한다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의학 및 약제 화학과 관련하여 사용된 용어 및 그 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되어 일반적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약제, 제형, 전달 및 환자 치료에 대해서도 표준 기술을 사용한다.
본 발명을 더 용이하게 이해할 수 있도록 이하에 사용된 용어들의 정의를 정리했다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 쇄을 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 혼용할 수 있는 것으로서, 이 역시 아미노산의 중합체 쇄을 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"란 용어는 그 기원이나 파생 급원에 따라서 자연 상태일 때 동반되던 자연 관련 성분과 관련되어 있지 않은 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 즉, 동일한 종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없고; 다른 종 유래의 세포에 의해서 발현되거나; 자연에서 발생되지 않는 것이다. 즉, 자연적으로 생성하는 세포와 다른 세포 시스템에서 합성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩타이드는 이의 자연 관련 성분에서 "분리된" 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 사용하여 분리를 통해 자연 관련 성분으로부터 실질적으로 유리될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "회수하는"이란 용어는 당업계에 공지된 단백질 정제 기술 등을 사용하여 분리에 의해 자연 관련 성분이 실질적으로 제거된 폴리펩타이드와 같은 화학종을 제공하는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "생물학적 활성"은 항원의 모든 고유 생물학적 성질을 언급한다. 생물학적 성질은 수용체로의 결합; 세포 증식의 유도, 세포 성장의 억제, 기타 사이토킨의 유도, 아폽토시스의 유도 및 효소 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
항체, 단백질 또는 펩타이드의 제2 화학종과의 상호작용과 관련하여 본 명세서에 사용된 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 그 상호작용이 화학종 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 이루어진다는 것을 의미한다. 예컨대, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하여 여기에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리된 미표지 A)를 포함하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자 또는 이러한 Ig 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 갖는 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변형체 또는 유도체를 의미한다. 이러한 돌연변이체, 변형체 또는 유도체 항체형은 당업계에 공지되어 있다. 이의 구체예에 대해서는 이하에 논의되나, 이에 국한되지는 않는다.
완전한 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 약어로 HCVR 또는 VH로 표시됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 약어로 LCVR 또는 VL로 표시됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라 불리는 초가변성 영역들로 나뉠 수 있고, 여기에는 골격 영역(FR)이라는 더 보존적인 영역들이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단으로 다음과 같은 순서에 따라 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 온전한 항체의 파파인 분해에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 항체 이펙터 기능을 변경시키기 위한 Fc부 내의 아미노산 잔기의 치환은 당업계에 공지되어 있다(Winter et al., 미국 특허 5,648,260; 5624821). 항체의 Fc 부는 여러 중요한 이펙터 기능, 예컨대 사이토킨 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체와 항원-항체 복합체의 반감기/제거율 등을 매개한다. 몇몇 경우에는 이러한 이펙터 가능이 치료 항체에 바람직하지만, 어떤 다른 경우에는 치료 목적에 따라서 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정 사람 IgG 아이소타입, 구체적으로 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 혈행 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 양태에서는, 항체의 불변 영역, 예컨대 항체의 Fc 영역에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 치환되어 이펙터 기능이 변경된 항체가 제공된다. 면역글로불린의 2개의 동일한 중쇄의 이량체화는 CH3 도메인의 이량체화에 의해 매개되고 힌지 영역내에서 디설파이드 결합에 의해 안정화된다(문헌참조: Huber et al. Nature; 264: 415-20; Thies et al 1999 J Mol Biol; 293: 67-79.). 중쇄-중쇄 디설파이드 결합을 방지하기 위한 힌지 영역내 시스테인 잔기의 돌연변이는 CH3 도메인의 이량체화를 불안정화시킬 것이다. CH3 이량체화에 관여하는 잔기들은 동정되었다(문헌참조:Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73.). 따라서, 1가의 반쪽 Ig를 생성시킬 수 있다. 흥미롭게도, 이들 1가의 반쪽 Ig 분자는 IgG 및 IgA 서브클래스 둘다에 대해 천연에서 발견되었다 (Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70.;Biewenga et al 1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400). FcRn: Ig Fc 영역의 화학양론은 2:1인 것으로 측정되었고(문헌참조: West et al .2000 Biochemistry 39: 9698-708), 반쪽 Fc는 FcRn 결합을 매개하기에 충분하다(문헌참조: Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548.). CH3 이량체화에 중요한 잔기가 CH3 베타 쉬트 구조의 내부 접지면상에 존재하는 반면에, FcRn 결합에 관여하는 영역이 CH2-CH3 도메인의 외부 접지면상에 존재하기 때문에, CH3 도메인의 이량체화를 붕괴시키기 위한 돌연변이는 FcRn 결합에 대해 큰 역효과를 나타내지 않을 수 있다. 그러나, 반쪽 Ig 분자는 통상의 항체 크기 보다 작기 때문에 조직 침투에 있어서 특정 잇점을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본 발명의 결합 단백질의 불변 영역, 예를 들어, Fc 영역에서 치환되어 중쇄의 이량체화가 붕괴되어 반쪽 DVD Ig 분자가 생성된다.
본 명세서에 사용된 항체의 "항원 결합부"(또는 간단히 "항체부")란 용어는 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 하나 이상의 항체 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 완전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 항체 양태들은 또한 이특이적, 이중특이 또는 다중특이 형일 수 있으며, 즉 2개 이상의 다른 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 일가 단편인 Fab 단편; (ii) 2개의 Fab 단편이 힌지(hinge) 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합되어 있는 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 한쪽 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 하나의 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편(본원에 참조로서 인용되는, Ward et al.,(1989) Nature 341: 544-546; Winter et al., PCT publication WO90/05144A1); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 다른 유전자에 의해 암호화되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(일본쇄 Fv(scFv)로 알려진 것; 예컨대 Bird et al.(1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:5879-5883)를 형성하고 있는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커를 이용하여 VL 및 VH 영역은 재조합법으로 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원 결합부"라는 용어에도 포함되는 것으로도 간주된다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 이중항체(diabody)도 포함된다. 이중항체는 일본쇄 폴리펩타이드에서 VH 및 VL 도메인이 발현되지만, 동일 쇄 상의 두 도메인 사이에 쌍 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이특이적 항체이다(예컨대, Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 이러한 항체 결합부는 당업계에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)). 추가로, 단일쇄 항체는 또한 상보적 경쇄 폴리펩타이드와 함께 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"를 포함한다(문헌참조: Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); 및 미국 특허 제 5,641,870호).
용어 "다가 결합 단백질"은 본원 명세서 전반에 걸쳐 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 지칭하는데 사용된다. 다가 결합 단백질은 바람직하게 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 가공되고 일반적으로 천연 항체이다. 용어 "다특이적 결합 단백질"은 2개 이상의 관련 또는 비관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 언급한다. 본 발명의 이원 가변 도메인 (DVD) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고 4가 또는 다가의 결합 단백질이다. DVD는 즉, 하나의 항원에 결합할 수 있는 1특이적이거나 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 다특이적일 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig로 언급된다. DVD Ig의 각 반쪽은 하나의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 하나의 경쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여하는 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이특이적 항체"는 쿠아드로마 기술 (문헌참조: Milstein, C. and A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934): p. 537-40), 2개의 상이한 mAb의 화학적 접합 (문헌참조: Staerz, U.D., et al., Nature, 1985. 314(6012): p. 628-31), 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 크놉 인투 홀 또는 유사한 방법(문헌참조: Holliger, P., T. Prospero, and G. Winter, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(14): p. 6444-8.18)에 의해, 다중의 상이한 면역글로불린 종(이중에 하나만이 작용성 이특이적 항체이다)을 생성시킴으로써 제조되는 완전한 길이의 항체를 언급한다. 분자 기능에 의해, 이특이적 항체는 이의 2개의 결합 암(한쌍의 HC/LC)중 하나상의 하나의 항원(또는 에피토프)에 결합하고 이의 2번째 암(다른 쌍의 HC/LC)상의 다른 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 당해 정의에 따라, 이특이적 항체는 2개의 구분된 항원 결합 암(2개 특이성 및 CDR 서열로)을 갖고 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이원-특이적 항체"는 이의 결합 암(한 쌍의 HC/LC)의 각각에서 2개의 상이한 항원(또는 에피토프)와 결합할 수 있는 완전한 길이의 항체를 언급한다(문헌참조: PCT publication WO 02/02773). 따라서, 이원-특이적 결합 단백질은 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 암을 갖고 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 2가이다.
결합 단백질의 "작용성 항원 결합 부위"는 표적 항원에 결합할 수 있는 부위이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화성은 근본적으로 항원 결합 부위가 유래된 모 항체 만큼 강하지 않지만 항원에 결합하는 능력은 항원에 결합하는 항체를 평가하기 위해 공지된 다수의 방법중 임의의 하나를 사용하여 측정가능해야만 한다. 더욱이, 본원에서 다가의 항체의 항원 결합 부위의 항원 결합 친화성은 정량적으로 동일할 필요는 없다.
용어 "사이토킨"은 세포간 매개체로서 다른 세포 집단에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어이다. 당해 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 통상적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 사이토킨중에는 사람 성장 호르몬, N-메티오닐 사람 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH)와 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 - 베타 뮬러리안 억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬 관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-알파와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린형 성장 인자 -1 및 -11; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론-알파, -베타 및 감마 콜로니 자극 인자(CSF)(예를 들어, 대식세포-CSF(M-CSF))와 같은 인터페론; 과립구 대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23과 같은 인터류킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)을 포함하는 기타 폴리펩타이드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물 기원의 단백질을 포함한다.
용어 "링커"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하는데 사용되고 하나 이상의 항원 결합부를 연결하는데 사용된다. 당해 링커 폴리펩타이드는 문헌(참조: Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123)]에 널리 공지되어 있다. 바람직한, 링커는AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 118); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 119); AKTTPKLGG(서열번호 120); SAKTTPKLGG(서열번호 121); SAKTTP(서열번호 122); RADAAP(서열번호 123); RADAAPTVS(서열번호 124); RADAAAAGGPGS(서열번호 125); RADAAAA(G4S)4(서열번호 126); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 127); ADAAP(서열번호 40); ADAAPTVSIFPP(서열번호 103); TVAAP(서열번호 44); TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); QPKAAP(서열번호 88); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92); AKTTPP(서열번호 38); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 128); AKTTAP(서열번호 129); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 99); ASTKGP(서열번호 42); 또는 ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 언급한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질의 항체 집단으로부터 수득된 항체를 언급하고. 즉, 개개의 항체를 포함하는 집단은 최소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고 단일 항원에 대해 지시된 것이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프들)에 대해 지시된 상이한 항체들을 포함하는 항체 집단과는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체 생성을 요구하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변 및 불변 영역을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들어, CDR 및 특히 CDR3에서 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래하는 CDR 서열이 사람 골격 서열상으로 접목된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 사람 항체"는 재조합 수단에 의해 생성되거나, 발현되거나, 제작되거나 분리된 모든 사람 항체, 예를 들어, 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기 섹션 II C에서 추가로 기재됨), 재조합, 조합된 사람 항체 라이브러리로부터 유래된 항체 (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378 ), 사람 면역글로불린 유전자로 유전자 전이된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체 (Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱함을 포함하는 임의의 기타 수단에 의해 생성되거나 발현되거나 제작되거나 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 당해 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 양태에서, 당해 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열로 유전자 전이된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용되고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련된 것이지만 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"친화성 성숙된" 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상이 변형되어 당해 변형된 것을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화성이 개선된 것이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 항체는 당업계에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌[참조:Marks et al. BidlTechnology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙화를 기재하고 있다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌[참조:Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147- 155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. BioL 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"키메라 항체"란 용어는 한 종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사람 불변 영역에 결합된 항체를 의미한다.
"CDR 접목 항체"란 용어는 한 종에서 유래되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열들이 다른 종의 CDR 서열로 교체된 항체를 의미하는 것으로서, 예컨대 쥐의 CDR의 하나 이상(예컨대, CDR3)이 사람 CDR 서열로 교체된 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유한 항체가 있다.
"사람화된 항체"란 용어는 사람을 제외한 종(예컨대, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "사람다운", 즉 사람 배선 가변 서열과 더 유사한 서열로 변경된 항체를 의미한다. 사람화된 항체의 일 형태는 사람 CDR 서열이 대응하는 비사람 CDR 서열을 대신하기 위하여 비사람 VH 및 VL 서열로 도입된 CDR 접목 항체이다.
용어 "캐뱃 번호", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 당해 분야에서 인지되며 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기 보다 더 가변적인(즉, 초가변성) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 and, kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 31 내지 35 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 95 내지 102 부위의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 24 내지 34 부위, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56 부위, 및 CDR3에 있어서 아미노산 89 내지 97 부위의 범위이다.
용어 "CDR"은 항체 가변 서열내 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역에는 3개의 CDR이 있고 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 명명된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역내 존재하는 3개의 CDR 그룹을 언급한다. 이들 CDR의 정확한 경계선은 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 문헌[Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))]에 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 캐뱃 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia and coworkers (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989))]에서는, 아미노산 서열 수준에서 다양성이 크다 할지라도 캐뱃 CDR내에 특정 아부위는 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 취하고 있음을 밝혔다. 이들 아부위는 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3로서 명명되었고 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 초티아 CDR로서 언급될 수 있고 이는 캐뱃 CDR과 중복되는 경계선을 갖는다. 캐뱃 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) and MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계선 한정은 상기 시스템중 하나를 엄격하게 따르지는 않지만, 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 영향주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 측면에서 이들이 단축되거나 연장될 수 있다 하더라도 캐뱃 CDR과 중복된다. 본원에 사용된 방법은 당해 시스템중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 캐뱃 또는 초티아 한정된 CDR을 사용하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 언급한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 골격 서열의 의미는 이에 따라 상이하게 해석된다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 또는 중쇄상의 골격 영역을 각 쇄상에 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치되고 CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치된다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 서브-영역으로 특정화하는 것 없이 다르게 언급된 골격 영역은 단일의 천연 면역글로불린 쇄의 가변 영역내에 조합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 FR은 4개의 서브-영역중 하나를 나타내고 FR들은 골격 영역을 구성하는 4개의 서브-영역중 2개 이상을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전학적 재배열 및 돌연변이를 유발하는 성숙 과정을 거치지 않는 비-림프성 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 언급한다[Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)]. 본 발명의 다양한 양태에 의해 제공되는 잇점중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자 보다 종에서 개체에 특징적인 필수 아미노산 서열을 보존할 가능성이 높음에 따라 당해 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외래 공급원으로서 인지될 가능성이 낮다는 사실에 기인한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람화된 항체"는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변이 유도체, 유사체 또는 이의 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 언급한다. 사람화된 항체는 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv)를 포함하고 여기서, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR에 상응하고 골격 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 CDR이다. 바람직하게, 사람화된 항체는 또한 사람 면역글로불린의 전형적인 영역인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 하나 이상의 부분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘다를 함유한다. 당해 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중화"는 결합 단백질이 사이토킨에 특이적으로 결합하는 경우 사이토킨의 생물학적 활성을 중화시킴을 언급한다. 바람직하게, 중화 결합 단백질은 사이토킨에 결합하여 약 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 또는 85% 이상으로 사이토킨의 생물학적 활성을 감소시킨다.
용어 "활성"은 2개 이상의 항원에 대한 DVD-Ig의 결합 특이성/친화성과 같은 활성을 포함한다.
"에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적 결합이 가능한 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정인자에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 기가 포함되고, 다른 특정 양태에서는 특이적인 입체 구조 특징, 및/또는 특이적 하전 특징을 갖는 것일 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 일 영역이다. 특정 양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 배합 혼합물에서 자신의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라스몬 공명"이란 용어는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 등을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학 현상을 의미한다. 이에 대한 상세한 설명은 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 "Kon"이란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 항체의 결합을 나타내는 결합률 상수(on rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "Koff"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리를 나타내는 해리율 상수(off rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "Kd"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같은 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "표지된 결합 단백질"이란 용어는 결합 단백질을 식별할 수 있게 하는 표지(label)가 혼입되어 있는 단백질을 의미한다. 표지는 검출성 마커, 예컨대 방사성동위원소 아미노산의 혼입 또는 표식된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오틴 잔기(예컨대, 광학 또는 비색법으로 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)의 폴리펩타이드에 대한 부착인 것이 바람직하다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예에는 다음과 같은 것이 있으나, 이에 국한되지 않는다: 방사선동위원소 또는 방사선핵종(예, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르스), 효소 표지(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오틴 기; 2차 리포터(예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프; 및 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트.
"접합체"란 용어는 제2 화학 잔기, 예컨대 치료제 또는 세포독성제에 화학적으로 결합된 결합 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "제제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 바람직하게는, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스튼, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결정" 또는 "결정화된"은 결정 형태로 존재하는 항체 또는 항원 결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태의 물질의 일 형태로서, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예, 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 입체 배열로 구성된다. 이러한 입체 배열은 당업계에 공지된 특이적인 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정 중에서 반복되는 기본 유니트 또는 빌딩 블록은 비대칭 유니트라 한다. 배열내 비대칭 유니트의 반복은 분명한 소정의 결정학적 대칭과 일치하게 하여 결정의 "유니트 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적 해독에 의한 유니트 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York (1999)].
본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미하는 것으로서, 리보뉴클레오타이드이거나 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 한 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어에는 일본쇄 및 이본쇄 형태의 DNA가 포함되지만, 이본쇄 DNA인 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "분리된 폴리뉴클레오타이드"란 용어는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 게놈, cDNA 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합)를 의미하는데, 그 기원에 따라서, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연에서 발견되는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"의 폴리뉴클레오타이드 전부 또는 일부와 관련되어 있지 않거나, 자연에서는 결합되지 않았던 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 결합되거나; 또는 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 간주한다. 벡터의 한가지 형태는 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형의 이본쇄 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 형태의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 기원을 보유한 세균 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈에 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동적으로 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로 재조합 DNA법에 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 대체될 수 있다. 하지만, 본 발명은 등가 기능을 하는 바이러스 벡터와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
"작동적으로 결합된"이란 용어는 기술된 성분이 의도한 방식대로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치 상태를 의미한다. 암호 서열에 "작동적으로 결합된" 조절 서열은 암호 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 수행되도록 결찰된다. "작동적으로 결합된" 서열에는 당해 유전자에 근접한 발현 조절 서열 번호 및 당해 유전자를 조절하기 위하여 트랜스로 작용하거나 일정 거리에 있는 발현 조절 서열이 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 결찰된 암호 서열의 발현과 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 접목 및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효과적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 필요한 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열 번호 등이 포함된다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르며, 원핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열이 있고; 진핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 프로모터 및 전사 종결 서열이 있다. "조절 서열"이란 용어는 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 간주하고, 리더 서열 번호 및 융합 파트너 서열과 같이 그 존재가 유리한 추가 성분을 포함할 수도 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 유입되는 임의의 공정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 자연 또는 인공 조건 하에서 실시될 수 있다. 형질전환은 이종 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 따라 달라질 수 있다. 이러한 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택되는데, 그 예로는 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션 및 입자 충격이 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 이러한 "형질감염된" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제성 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정적으로 형질감염된 세포를 포함한다. 또한, 이들 세포는 삽입된 DNA 또는 RNA를 한정된 시간 동안 일시적으로 발현하는 세포도 포함한다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 외인성 DNA가 도입된 세포를 의미하는 것으로 간주한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이 세포의 자손도 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 후속 세대에는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않지만 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함되는 것으로 간주한다. 숙주 세포는 임의의 생물계에서 선택되는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 진핵생물 세포에는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포가 포함된다. 가장 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 세포주 대장균; 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애를 포함하며, 이에 국한되지는 않는다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양과 형질전환(예, 전기천공, 리포펙션)에는 표준 기술을 사용할 수 있다. 효소 반응과 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 수행하거나 당업계에서 일반적으로 수행하는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 상기 기술 및 절차들은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 또는 본 명세서에서 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 특정 문헌들에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행할 수 있다[본원에 참고인용된 문헌 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)].
당업계에 공지되고 본 명세서에 사용된 바와 같은 "유전자전이 유기체"란 용어는 전이유전자를 포함하는 세포를 가진 유기체를 의미하는 것으로서, 유기체(또는 이 유기체의 선조)에 도입된 전이유전자는 유기체에서 자연 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "전이유전자"는 유전자전이 유기체가 발생하는 세포의 게놈으로 안정적이고 작동적으로 통합되어, 유전자전이 유기체의 하나 이상의 세포 형태 또는 조직에서 암호화된 유전자 산물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
본 명세서에 사용된 "조절하다" 및 "조정하다"란 용어는 당해 분자의 활성(즉, 사이토킨의 생물학적 활성)에 있어서 변화 또는 변경을 의미한다. 조절은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도(magnitude)에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있다. 분자 활성 및 기능의 예에는 결합 특징, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 시그날 전달 등이 있으나, 이에 국한되지는 않는다.
이와 마찬가지로, 본 명세서에 사용된 "조절인자"란 용어는 당해 분자의 활성 또는 기능(즉, 사이토킨의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조절인자는 이 조절인자의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도에 비교했을 때 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 특정 양태에서, 조절인자는 분자의 하나 이상의 활성 또는 기능의 정도를 감소시키는 억제제이다. 억제제의 예에는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 유기 소분자가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 펩티바디는 WO 01/83525 등에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "효능제(agonist)"란 용어는 목적하는 분자와 접촉했을 때 효능제의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도와 비교했을 때 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가를 유발하는 조절인자를 의미한다. 목적하는 효능제의 구체예에는 항원에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "길항제" 또는 "억제제"란 용어는 목적하는 분자와 접촉했을 때, 길항제의 부재 시 관찰되는 활성이나 기능의 정도와 비교했을 때 당해 분자의 특정 활성이나 기능의 정도에 있어서의 감소를 유발하는 조절인자를 의미한다. 목적하는 길항제의 구체예에는 항원의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단 또는 조절하는 물질이 포함된다. 항원의 길항제 및 억제제에는 항원에 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 완화시키거나 장애의 진행을 차단하거나, 장애를 퇴화시키거나, 재발, 발병, 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 개시 또는 진행을 차단하거나, 장애를 검출하거나 또 다른 치료의 예방학적 또는 치료학적 효과(예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제)를 증진시키거나 개선시키는데 충분한 치료양을 언급한다.
본 명세서에 사용된 "시료"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고 있다. 본 명세서에 사용된 "생물학적 시료"는 생물체 또는 이전 생물체에서 유래하는 임의의 양의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물체에는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 물질에는 혈액, 혈청, 뇨, 윤활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
I. DVD 결합 단백질의 제조
본 발명은 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 결합 단백질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 결합 단백질은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 폴리펩타이드이고, X2는 Fc 영역이고 n은 0 또는 1이다]를 포함하는 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 본 발명의 결합 단백질은 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명은 발현 벡터, 숙주 세포 및 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
A. 모 모노클로날 항체의 제조
DVD 결합 단백질의 가변 도메인은 목적하는 항원에 결합할 수 있는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하는, 모 항체로부터 수득될 수 있다. 이들 항체는 천연에 존재할 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술 또는 이의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 광범위한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 기술을 포함하여 예를 들어, 문헌[Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (본 문헌은 이의 전반전인 내용이 본원에 참조로서 인용된다)]에 교시된 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함하여 단일 클론으로부터 유래되지만 이를 생성시키는 방법에 의해 유래되지 않는 항체를 언급한다. 하이브리도마는 하기 실시예 1에서 논의되는 바와 같이 선별하고 클로닝하고 추가로 강한 하이브리도마 성장, 고 항체 생산 및 목적하는 항체 특성을 포함하여 목적하는 특성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마는 동일유전자계 동물, 면역계가 결핍된 동물, 예를 들어, 누드 마우스와 같은 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양에서 배양하고 증식시킬 수 있다. 하이브리도마를 선별하고 클로닝하고 증식시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 상기 논의된 바와 같이 마우스 하이브리도마이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 랫트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비사람, 비마우스 종에서 제조된다. 또 다른 양태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이고 이때 사람 비-분비 골수종이 특이 항원과 결합할 수 있는 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
재조합 모노클로날 항체는 문헌[U.S. Patent No. 5,627,052, PCT Publication WO 92/02551 and Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기재된 바와 같이 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)과 같이 당업계에 언급된 과정을 사용하여 단일의 분리된 림프구로부터 생성된다. 본 방법에서, 목적하는 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들어, 면역화된 동물로부터 유래된 림프구는 동정되고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역전사효소 PCR에 의해 세포로부터 수득하고 이어서 이들 가변 영역을 적절한 면역글로불린 불변 영역(예를 들어, 사람 불변 영역)과 관련하여 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 생체내 선별된 림프구로부터 유래된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포를 이어서 추가 분석하고 예를 들어, 형질감염된 세포를 선별하여 목적하는 항원에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리함에 의해 선별할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 예를 들어, 문헌[PCT Publication WO 97/29131 and PCT Publication WO 00/56772]에 기재된 바와 같은 시험관내 친화성 성숙화 방법에 의해 추가로 조작할 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 사람 면역글로불린 좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람 동물을 목적하는 항원으로 면역화시켜 제조된다. 바람직한 양태에서, 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 좌의 대형 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결핍된 유전자 조작된 마우스 균주인 XENOMOUSE® 유전자 전이 마우스이다. 문헌[Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) 및 미국 특허 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 및 6,130,364]을 참조한다. 1991년 7월 25일에 공개된 WO 91/10741, 1994년 2월 3일에 공개된 WO94/02602, 1996년 10월 31일에 공개된 WO 96/34096 및 WO 96/33735, 1998년 4월 23일에 공개된 WO98/16654, 1998년 6월 11일에 공개된 WO 98/24893, 1998년 11월 12일에 공개된 WO 98/50433, 1999년 9월 10일에 공기된 WO 99/45031, 1999년 10월 21일에 공개된 WO 99/53049, 2000년 2월 24일에 공개된 WO 00 09560 및 2000년 6월 29일에 공개된 WO 00/037504도 참조한다. XENOMOUSE® 유전자 전이 마우스는 완전하게 사람 항체의 성인계 사람 목록을 생산하고, 항원 특이적인 사람 Mab를 생성한다. XENOMOUSE® 유전자 전이 마우스는 사람 중쇄 좌 및 x 경쇄 좌의 메가염기 크기의 배선 형태 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 목록의 약 80%를 포함한다[본원에 참고인용된 Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495(1998) 참조].
또한, 본 발명의 항체 제조에는 시험관내 방법도 사용할 수 있는데, 여기서 항체 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체를 동정한다. 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Ladner et al. 미국 특허 5,223,409; Kang et al. PCT 공개 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공개 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공개 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공개 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공개 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공개 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공개 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85 ; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol.Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, 미국 출원 공개 20030186374, 및 PCT 공개 WO 97/29131(각각 본원에 참고인용됨)] 등에 설명된 방법을 포함한다.
본 발명의 모 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 파아지 입자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파아지 입자 표면상에 나타난다. 특히, 당해 파아지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 나타내는데 사용될 수 있다. 목적하는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인 발현 파아지는 예를 들어, 표지된 항원 또는 고형 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선별되거나 동정될 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파아지는 전형적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트형 파아지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT application No. PCT/GB91/01134; PCT publications WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and U.S. Pat. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 and 5,969,108; 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 것들을 포함한다.
상기 문헌에 기재된 바와 같이, 파아지 선별 후, 파아지로부터 항체 암호화 영역을, 하기에 상세히 기재되는 바와 같이 분리할 수 있고 이를 사용하여 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현되는 사람 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[PCT publication WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); and Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); and Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (당해 문헌은 이의 전반적인 냉용이 본원에 참조로서 인용된다)]에 기재된 것들과 같은 방법을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 사용될 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[U.S. Pat. 4,946,778 and 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); and Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)]에 기재된 것들을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 대형 조합 라이브러리에 대해 당업계에 공지된 기타 방법을 적용하여 본 발명의 이원 특이성 항체를 동정할 수 있다. 한가지 유형의 또 다른 발현 시스템은 문헌[PCT Publication No. WO 98/31700 by Szostak and Roberts, and in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302]에 기재된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA 단백질 융합으로서 발현되는 것이다. 당해 시스템에서, 공유 융합은 mRNA 및 3' 말단에 푸로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 함유하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해, 암호화된 펩타이드 또는 반백질 사이에서 형성된다. 따라서, 특이적 mRNA는 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 일부(예를 들어, 항체 결합부 또는 이의 일부)의 이원 특이성 항원에 대한 성질을 기준으로 mRNA의 배합 혼합물(예를 들어, 조합 라이브러리)로부터 집적될 수 있다. 당해 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수된 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상기된 바와 같이(예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서) 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고 특히, 본래에 선별된 서열에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합을 추가로 스크리닝함에 의해 또는 상기된 바와 같은 재조합 항체의 친화성 성숙화를 위한 기타 방법에 의해 친화성이 추가로 성숙화될 수 있다.
또 다른 방법에서, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전학적 방법을 사용하여 항체 도메인을 효소 세포벽에 부착시키고 이들을 효모의 표면상에 나타나게 할 수 있다. 특히, 당해 효모를 사용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 사람 또는 쥐)로부터 발현되는 항원 결합 도메인이 나타나게 할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 문헌[본원에 참조로서 인용된 Wittrup, et al. U.S. Patent No. 6,699,658]에 기재된 것들을 포함한다.
상기된 항체는 추가로 변형시켜 CDR 접목 및 사람화된 모 항체를 생성시킬 수 있다. CDR-접목된 모 항체는 사람 항체 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고 이때, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역은 목적하는 항원과 결합할 수 있는 쥐 항체의 CDR 서열로 대체된다. 임의의 사람 항체 기원의 골격 서열은 CDR 접목을 위한 주형으로서 작용할 수 있다. 그러나, 당해 골격상으로의 직쇄 대체는 흔히 항원에 대한 결합 친화성을 약간 손상시킨다. 사람 항체가 본래의 쥐 항체와 보다 동일할수록 쥐 CDR과 사람 골격의 조합이 CDR내에서 뒤틀림을 유발하여 친화성을 감소시킬 가능성이 보다 적어진다. 따라서, CDR을 제외한 쥐 가변 골격을 대체하도록 선택된 사람 가변 골격은 쥐 항체 가변 영역 골격과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 바람직할 수 있다. CDR을 제외한 사람 및 쥐 가변 영역은 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 보다 바람직할 수 있다. CDR을 제외한 사람 및 쥐 가변 영역은 쥐 항체 가변 영역 골격과 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 보다 더 바람직할 수 있다. CDR을 제외한 사람 및 쥐 가변 영역은 쥐 항체 가변 영역 골격과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 가장 바람직할 수 있다. 당해 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있고(문헌참조: EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Pat. Nos. 5,225,539; 5,530,101; and 5,585,089), 베니어링 또는 재표면화(문헌참조: EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,352호)이 있다.
사람화된 항체는 비-사람 종 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 기원의 골격 영역을 갖는, 목적하는 항원에 결합하는 비-사람 종 항체 기원의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 예를 들어, 본원에 전반적인 내용이 참조로서 인용되는 하기 인터넷 주소 및 문헌에 기재되어 있다:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). 당해 입수된 서열을 사용하여 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화성, 결합율, 해리율, 결합도(avidity), 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특징을 감소시키거나 증진시키거나 변형시킬 수 있다.
사람 골격 영역내 골격 잔기는 상응하는 CDR 공여자 항체로 대체하여 항원 결합을 변화, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이들 골격 대체는 예를 들어, CDR 및 골격 잔기의 상호작용에 대해 모델링하여 항원 결합과 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 동정하여 특정 위치에서의 특정 골격 잔기를 동정함에 의해 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정된다(Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다). 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 유용하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 나타내는 컴퓨터 프로그램은 유용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 가능한 잔기의 역할에 대한 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 선별될 수 있고 컨센서스 및 입수 서열로부터 조합될 수 있어 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 목적하는 항체 특성이 성취된다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여한다. 항체는 문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT publication WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 것들을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 사람화될 수 있다.
모 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지되어 있는 특정 표적에 결합할 수 있는 다양한 모노클로날 항체로부터 선택될 수 있다. 이들은 항-TNF 항체(미국 특허 제6,258,562호), 항-IL-12 및/또는 항 -IL-12p40 항체(미국 특허 제6,914,128호); 항-IL-18 항체 (US 2005/0147610 A1), 항 -C5, 항 -CBL, 항-CD147, 항-gp120, 항-VLA-4, 항-CD11a, 항-CD18, 항-VEGF, 항-CD40L, 항-Id, 항-ICAM-1, 항-CXCL13, 항-CD2, 항-EGFR, 항-TGF-베타 2, 항-E-셀렉틴, 항-Fact VII, 항-Her2/neu, 항-F gp, 항-CD11/18, 항-CD14, 항-ICAM-3, 항-CD80, 항-CD4, 항-CD3, 항-CD23, 항-베타2-인테그린, 항-알파4베타7, 항-CD52, 항-HLA DR, 항-CD22, 항-CD20, 항-MIF, 항-CD64 (FcR), 항-TCR 알파 베타, 항-CD2, 항-Hep B, 항-CA 125, 항-EpCAM, 항-gp120, 항-CMV, 항-gpIIbIIIa, 항-IgE, 항-CD25, 항-CD33, 항-HLA, 항-VNR인테그린, 항-IL-1알파, 항-IL-1베타, 항-IL-1 수용체, 항-IL-2 수용체, 항-IL-4, 항-IL-4 수용체, 항-IL5, 항-IL-5 수용체, 항-IL-6, 항-IL-8, 항-IL-9, 항-IL-13, 항-IL-13 수용체, 항-IL-17 및 항-IL-23 을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6 and http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html ).
모 모노클로날 항체는 또한 임상적 시험용 또는 임상 사용 개발용으로 승인된 다양한 치료학적 항체로부터 선택될 수 있다. 당해 치료학적 항체는 리툭시마브 (RITUXAN®, IDEC/Genentech/Roche) (문헌참조: 예를 들어 미국 특허 제5,736,137호), 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 승인된 키메라 항-CD20 항체; HUMAX-CD20®, Genmab에 의해 현재 개발된 항-CD20, 미국 특허 제5,500,362호에 기재된 항 -CD20 항체, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), 및 PRO70769 (PCT/US2003/040426, entitled "Immunoglobulin Variants and Uses Thereof"), 트라스투즈마브 (HERCEPTIN®, Genentech) (문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,677,171호), 유방암을 치료하기 위해 승인된 사람화된 항- Her2/neu 항체; Genentech에 현재 개발된 퍼투주마브 (rhuMab-2C4, OMNITARG®); 미국 특허 제5,753,894호에 기재된 항 -Her2 항체; 세툭시마브 (ERBITUX®, Imclone) (미국 특허 제4,943,533호; PCT WO 96/40210), 다양한 암에 대해 임상 시험중의 키메라 항-EGFR; Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 현재 개발된 ABX-EGF(미국 특허 제6,235,883호) ; Genmab에 의해 현재 개발된 HUMAX-EGFRTM (미국 출원 번호 제10/172,317호),; 425, EMD55900, EMD62000, 및 EMD72000 (Merck KGaA) (미국 특허 제5,558,864호; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (U.S. Pat. No. 5,891,996; U.S. Pat. No. 6,506, 883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81); mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2); 및 SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); B-세포 만성 림프구 백혈병의 치료를 위해 현재 승인된 사람화된 모노클로날 항체인 알렘투주마브 (CAMPATH®, Millenium); 무로모나브 -CD3 (Orthoclone OKT3), Ortho Biotech/Johnson &Johnson, ibritumomab tiuxetan에 의해 개발된 항-CD3 항체(ZEVALIN®), IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin에 의해 개발된 항-CD20 항체(MYLOTARG®), Celltech/Wyeth, alefacept에 의해 개발된 항-CD33(p67 단백질) (AMEVIVE®), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합체, Centocor/Lilly에 의해 개발된 아브식시마브(REOPRO®), Novartis에 의해 개발된 바실릭시마브(SIMULECT®), Medimmune에 의해 개발된 팔리비주마브(SYNAGIS®), 인플릭시마브 (REMICADE®), Centocor에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 아달리무마브 (HUMIRA®), Abbott에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, HUMICADE® , Celltech에 의해 개발된 항-TNF알파 항체, 에타네르셉트 (ENBREL®), an Immunex/Amgen에 의해 개발된 항-TNF알파 Fc 융합체, ABX-CBL, Abgenix에 의해 개발된 항-CD147 항체, ABX-IL8, Abgenix에 의해 개발된 항-IL-8 항체, ABX-MA1, Abgenix에 의해 개발된 항-MUC18 항체, 펨투모마브 (R1549, 90Y-muHMFG1), Antisoma에 의해 개발중인 항-MUC1, 테렉스 (R1550), Antisoma에 의해 개발된 항-MUC1 항체, Antisoma에 의해 개발된 AngioMab(AS1405), Antisoma에 의해 개발된 HuBC-1, Antisoma에 의해 개발된 티오플라틴 (AS1407), ANTGREN®(나탈리주마브), Biogen에 의해 개발된 항-알파 -4-베타 -1 (VLA-4) 및 알파 -4-베타 -7 항체, VLA-1 mAb, Biogen에 의해 개발된 항 -VLA-1 인테그린 항체, LTBR mAb, Biogen에 의해 개발된 항 림포톡신 베타 수용체(LTBR) 항체, CAT-152, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발된 항-TGF-2 항체, J695, Cambridge Antibody Technology 및 Abbott에 의해 개발된 항-IL-12 항체, CAT-192, Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의해 개발된 항-TGF1 항체, CAT-213, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발된 항-에오탁신1 항체, LYMPHOSTAT-B®, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발된 항- Blys 항체, TRAIL-R1mAb, Cambridge Antibody Technology 및 Human Genome Sciences, Inc.에 의해 개발된 항-TRAIL-R1 항체, AVASTIN® 베바시주마브, rhuMAb-VEGF, Genentech에 의해 개발된 항-VEGF 항체, Genentech에 의해 개발된 항-HER 수용체 계열 항체, 항-조직 인자 (ATF), Genentech, XOLAIR® 에 의해 개발된 항-조직 인자 항체(오말리주마브), Genentech에 의해 개발된 항 -IgE 항체, RAPTIVA®(에팔리주마브), Genentech 및 Xoma에 의해 개발된 항-CD11a 항체, Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에 의해 개발된 MLN-02 항체 (이전에는 LDP-02), HUMAX CD4®, Genmab에 의해 개발된 항-CD4 항체, HUMAXTM-IL15, Genmab 및 Amgen에 의해 개발된 항-IL15 항체, Genmab 및 Medarex에 의해 개발된 HUMAXTM-Inflam, HUMAXTM-암, Genmab 및 Medarex 및 Oxford GcoSciences에 의해 개발된 항-헤파라나제 I 항체, Genmab 및 Amgen에 의해 개발된 HUMAXTM-림프종, Genmab에 의해 개발된 HUMAXTM-TAC, IDEC-131, 및 IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD40L 항체, IDEC-151 (클레놀릭시마브), IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD4 항체, IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD80 항체, IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-CD23, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발된 항-대식세포 이동 인자(MIF) 항체, BEC2, Imclone에 의해 개발된 항-이디오타입 항체, IMC-1C11, Imclone에 의해 개발된 항-KDR 항체, DC101, Imclone에 의해 개발된 항-flk-1, Imclone에 의해 개발된 항-VE 캐드헤린 항체, CEA-CIDE® (라베투주마브), Immunomedics에 의해 개발된 항-암배아 항원(CEA) 항체, LYMPHOCIDE® (에프라투주마브), Immunomedics에 의해 개발된 항-CD22 항체, Immunomedics에 의해 개발된 AFP-Cide, Immunomedics에 의해 개발된 골수종 Cide, Immunomedics에 의해 개발된 LkoCide, Immunomedics에 의해 개발된 ProstaCide, MDX-010, Medarex에 의해 개발된 항-CTLA4 항체, MDX-060, Medarex에 의해 개발된 항-CD30 항체, Medarex에 의해 개발된 MDX-070, Medarex에 의해 개발된 MDX-018, OSIDEM® (IDM-1), 및 Medarex 및 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발된 항-Her2 항체, HUMAX-CD4®, Medarex 및 Genmab에 의해 개발된 항-CD4 항체, HUMAX-IL15, Medarex 및 Genmab에 의해 개발된 항-IL15 항체, CNTO 148, Medarex 및 Centocor/J&J에 의해 개발된 항-TNF 항체, CNTO 1275, Centocor/J&J에 의해 개발된 항-사이토킨 항체, MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의해 개발된 항-세포간 접착 분자-1(ICAM-1)(CD54) 항체, MOR201, MorphoSys에 의해 개발된 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3), NUVION®(비실리주마브), Protein Design Labs에 의해 개발된 항-CD3 항체, HUZAF®, Protein Design Labs에 의해 개발된 항-감마 인터페론 항체, Protein Design Labs에 의해 개발된 항 - 51 인테그린, Protein Design Labs에 의해 개발된 항-IL-12, ING-1, Xoma에 의해 개발된 항-Ep-CAM 항체, XOLAIR® (Omalizumab), Genentech 및 Novartis에 의해 개발된 사람화된 항-IgE 항체, 및 MLN01, Xoma에 의해 개발된 항-베타2 인테그린 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않고 당해 인용된 문헌 모두는 특별히 본원에 참조로서 인용된다.
B. DVD분자의 작제:
이원 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자는 2개 상이한 모 mAb 기원의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 직접적으로 탠덤으로 연결되거나 재조합 DNA 기술에 의해 짧은 링커를 통해 연결되고 이어서 경쇄 불변 도메인이 연결되도록 디자인한다. 유사하게, 중쇄는 탠덤으로 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)에 이어서 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다 (도 1A).
가변 도메인은 상기된 방법중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 바람직한 양태에서, 가변 도메인은 쥐 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 보다 바람직하게, 가변 도메인은 CDR 접목되거나 사람화된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인이다. 가장 바람직하게, 가변 도메인은 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
하나의 양태에서, 제1 및 제2 가변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 직접적으로 연결된다. 또 다른 양태에서, 가변 도메인은 링커 서열을 통해 연결된다. 바람직하게, 2개의 가변 도메인이 연결된다. 3개 이상의 가변 도메인은 또한 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 가변 도메인은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 본 발명의 DVD 분자는 수용체의 리간드 결합 도메인, 효소의 활성 도메인과 같은 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 하나의 비-면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있다. DVD 분자는 또한 2개 이상의 비-Ig 도메인을 포함할 수 있다.
링커 서열은 단일 아미노산 또는 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 바람직하게, 링커 서열은 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 118); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 119); AKTTPKLGG(서열번호 120); SAKTTPKLGG(서열번호 121); SAKTTP(서열번호 122); RADAAP(서열번호 123); RADAAPTVS(서열번호 124); RADAAAAGGPGS(서열번호 125); RADAAAA(G4S)4(서열번호 126); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 127); ADAAP(서열번호 40); ADAAPTVSIFPP(서열번호 103); TVAAP(서열번호 44); TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); QPKAAP(서열번호 88); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92); AKTTPP(서열번호 38); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 128); AKTTAP(서열번호 129); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 99); ASTKGP(서열번호 42); ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48); GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 130); GENKVEYAPALMALS(서열번호 131); GPAKELTPLKEAKVS(서엶번호 132); 및 GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 133)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 링커 서열의 선택은 여러 Fab 분자의 결정 구조 분석을 기초로 한다. Fab 또는 항체 분자 구조에서 가변 도메인과 CH1/CL 불변 도메인간에는 천연 유연성 연결이 있다. 당해 천연 연결체는 약 10 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함하고, 이중 4 내지 6개의 잔기는 V 도메인의 C-말단으로부터 유래된 것이고 4 내지 6개의 잔기는 CL/CH1 도메인의 N-말단으로부터 유래된 것이다. 본 발명의 DVD Ig는 각각 DVD-Ig의 경쇄 및 중쇄에서 링커로서 CL 또는 CH1의 N-말단의 5 내지 6개의 아미노산 잔기 또는 11개 내지 12개의 아미노산 잔기를 사용하여 제조된다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 처음 5개 내지 6개의 아미노산 잔기는 강한 2차 구조 없이 루프 형태를 취함에 따라서 2개의 가변 도메인간의 유연성 링커로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 처음 5 내지 6개의 아미노산 잔기는 강한 2차 구조 없이 루프 형태를 취함에 따라서 2개의 가변 도메인간에 유연성 링커로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기는 천연 연장의 가변 도메인이고 이들은 Ig 서열의 일부임으로 링커 및 연결부로부터 잠재적으로 유발되는 면역원성을 크게 감소시킨다.
또 다른 링커 서열은 임의의 길이의 CL/CH1 도메인의 임의의 서열, 예를 들어, CL/CH1 도메인의 처음 5 내지 12개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만 CL/CH1 도메인의 모든 잔기를 포함하지는 않는다. 경쇄 링커는 Cκ 또는 Cλ로부터 비롯될 수 있고; 중쇄 링커는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는 임의의 이소형의 CH1으로부터 비롯될 수 있다. 링커 서열은 또한 Ig-형 단백질 (예를 들어, TCR, FcR, KIR)과 같은 기타 단백질; G/S 기본 서열 (예를 들어, G4S 반복체); 힌지 영역 유래 서열 및 기타 단백질 기원의 기타 천연 단백질로부터 유래할 수 있다.
바람직한 양태에서, 불변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개의 연결된 가변 도메인에 연결한다. 바람직하게, 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 연결하고 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 연결한다. 바람직하게, 불변 도메인은 각각 사람 중쇄 불변 도메인 및 사람 경쇄 불변 도메인이다. 가장 바람직하게, DVD 중쇄는 추가로 Fc 영역에 연결한다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 가장 바람직하게, Fc 영역은 사람 Fc 영역이다. 바람직한 양태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD기원의 Fc 영역을 포함한다.
가장 바람직한 양태에서, 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드는 조합되어 DVD-Ig 분자를 형성한다. 특이적 표적에 결합할 수 있는 특이적 DVD-Ig 분자 및 이의 제조 방법에 관한 상세한 기재는 하기의 실시예 부분에서 제공된다.
C. DVD 단백질의 제조
본 발명의 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로부터 발현되고 여기서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염된다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입시키는데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 간주한다. 본 발명의 DVD 단백질은 원핵생물 숙주 세포 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 세포에서의 DVD 단백질의 발현이 바람직하며, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵생물 세포(특히 포유동물 세포)가 적당한 폴딩을 이루어 면역학적 활성인 DVD 단백질을 회합(assembly)하여 분비하는데 원핵생물 세포보다 더 적당하기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기에 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예컨대, R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982) Mol.Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용된, Urlaub and Chasin(1980) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr-CHO 세포), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 있다. DVD 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, DVD 단백질은 숙주 세포에서 DVD 단백질이 발현되기에 또는 바람직하게는 숙주 세포가 증식되는 배양 배지로 DVD 단백질이 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. DVD 단백질은 표준 단백질 정제법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 DVD 단백질의 재조합 발현을 위해 바람직한 시스템에서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, DVD 중쇄 및 경쇄는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 인자에 각각 작동적으로 결합되어 상기 유전자의 높은 전사율을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 보유하며, 이 유전자는 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 해준다. 선별된 형질전환 숙주 세포는 DVD 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있도록 배양하고, 이러한 배양 배지로부터 완전한 DVD를 회수한다. 재조합 발현 벡터 제조, 숙주 세포 형질감염, 형질전환체 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 DVD의 회수에는 표준 분자 생물학 기술을 사용한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 DVD 단백질이 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 배양하여 본 발명의 DVD 단백질을 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 추가로 배양 배지로부터 DVD 단백질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
DVD-Ig의 중요한 특징은 이것이 통상적인 항체와 유사한 방법으로 제조되고 정제될 수 있다는 것이다. DVD-Ig의 제조는 목적하는 이원-특이적 활성을 갖는 균질의 단일 주요 생성물을 유도하고 불변 영역의 임의의 서열의 변형 또는 임의의 종류의 화학적 변형이 필요 없다. "이특이적", "다특이적" 및 :"다특이적 다가"의 완전한 길이의 결합 단백질을 제조하기 위해 이전에 기재된 방법은 단일의 주요 생성물을 유도하지 못하고 대신 어셈블리된 불활성, 단일 특이적, 다특이적, 다가, 완전한 길이의 결합 단백질 및 다가의 완전한 길이의 결합 단백질 및 상이한 결합 부위가 조합된 다가의 완전한 길이의 결합 단백질을 유도한다. 하나의 예로서, 문헌[참조:Miller 및 Presta (PCT publication WO2001/077342(A1))에 기재된 디자인을 기초로, 16개의 가능한 중쇄 및 경쇄의 조합이 있다. 결과적으로 단백질의 단지 6.25%만이 목적하는 활성 형태에 있을 가능성이 있다. 전형적으로 대규모 제조에 사용되는 표준 크로마토그래피 기술을 사용한 불활성 및 부분 활성 형태의 단백질로부터 완전한 활성 형태의 단백질의 분리는 아직 입증되어야만 한다.
놀랍게도, 본 발명의 "이원 특이적 다가 완전한 길이의 결합 단백질"의 디자인은 주로 목적하는 "이원-특이적 다가의 완전한 길이의 단백질"로 어셈블리하는 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 유도한다.
어셈블리되고 발현된 이원 가변 도메인 면역글로불린 분자중 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상 및 보다 바람직하게는 90% 이상은 목적하는 이원-특이적 4가 단백질이다. 본 발명의 당해 측면은 특히, 본 발명의 상업적 용도를 증진시킨다. 따라서, 본 발명은 "이원-특이적 4가 완전한 길이의 결합 단백질"의 단일 주요 생성물을 유도하는 단일 세포에서 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 50% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
본 발명은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 75% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
본 발명은 단일 세포에서 "이원 특이적 4가의 완전한 길이의 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 유도하는, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키기 위한 바람직한 방법을 제공하고 여기서, "주요 생성물"은 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 90% 초과의 모든 어셈블리된 단백질이다.
II. 유도체화된 DVD 결합 단백질:
일 양태는 본 발명의 결합 단백질이 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자(예컨대, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합된 표지된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지된 결합 단백질은 본 발명의 결합 단백질(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연합 등에 의해)을 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체(예, 이특이적 항체 또는 이중항체), 검출성 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자와 결합 단백질의 연합을 매개할 수 있는 단백질이나 펩타이드(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그) 등에 기능적으로 연결시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질이 유도체화될 수 있는 유용한 검출성 제제에는 형광 화합물이 포함된다. 검출성 형광 제제의 예에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 있다. 또한, 결합 단백질은 검출성 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 결합 단백질이 검출성 효소로 유도체화된 경우에는, 효소가 검출성 반응 산물을 생산하기 위해 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출성 제제 서양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한 발색 반응 생성물을 유도한다. 결합 단백질은 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 이 경우 아비딘이나 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출한다.
본 발명의 다른 양태는 결정화된 결합 단백질, 및 이러한 결정을 포함하는 제형 및 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 이에 대응하는 가용성 결합 단백질보다 생체내 반감기가 더 길다. 다른 양태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 보유한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 당업계에 공지되어 있고 본원에 참고인용된 WO 02072636에 개시된 바와 같이 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 항체 또는 이의 항원 결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 당화된 결합 단백질을 제공한다. 생체내 생산된 초기 단백질은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱으로 처리될 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 당화로 알려진 방법에 의해 효소적으로 첨가될 수 있다. 그 결과 수득되는 공유 결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유한 단백질은 당화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 항체는 가변성 도메인 뿐만 아니라 Fc 도메인에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 당단백질이다. Fc 도메인내 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 이펙터 기능에 중요한 효과를 나타내고 항체의 항원 결합 또는 반감기에 최소의 효과를 나타낸다(R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11 - 6). 대조적으로, 가변성 도메인의 당화는 항체의 항원 결합 활성에 효과를 가질 수 있다. 가변성 도메인내 당화는 항체 결합 친화성에 대해 음성 효과를 나타낼 수 있고 이는 입체 장애때문이거나(Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), 항원에 대한 친화성을 증가시키기 때문이다(Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
본 발명의 한 측면은 결합 단백질의 O- 또는 N- 결합된 당화 부위가 돌연변이된 당화 부위 돌연변이체를 제조하는 것에 관한 것이다. 당업자는 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 당해 돌연변이체를 제조할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 당화 부위 돌연변이체는 본 발명의 또 다른 목적이다.
여전히 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합부의 당화는 변형된다. 예를 들어, 당화되지 않은 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 당화되어 있지 않다). 항원에 대한 항체의 특이성을 증가시키기 위해 당화가 변형될 수 있다. 당해 당화 변형은 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 당화 부위를 변형시킴에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 치환되어 하나 이상의 가변 영역 당화 부위가 제거됨으로써 그 부위에서의 당화가 제거된다. 당해 당화 제거는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 당해 방법은 문헌[PCT Publication WO2003016466A2, and U.S. Pat. Nos. 5,714,350 and 6,350,861, 이의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 상세하게 추가로 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 변형된 결합 단백질은 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체 또는 GlcNAc 구조의 2등분이 증가된 항체와 같은 변형된 유형의 당화를 가질 수 있다. 당해 변형된 당화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 당해 탄수화물 변형은 예를 들어, 변형된 당화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시켜 성취될 수 있다. 변형된 당화 기구를 갖는 세포는 당업계에 보고되어 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변형된 당화를 갖는 항체를 제조하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, as well as, European Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 03/035835; WO 99/54342 80, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다].
단백질 당화는 당해 단백질의 아미노산 서열, 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 다른 유기체는 다른 당화 효소(예컨대, 글리코실트란스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산하고, 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다를 수 있다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 당화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 다를 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 퓨코스, n-아세틸글루코사민 및 시알산 등을 이에 국한됨이 없이 포함할 수 있다. 이러한 당화된 결합 단백질은 당화 패턴이 사람이도록 글리코실 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 상이한 단백질 당화는 상이한 단백질 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 당화된 치료 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일 단백질 효능에 비해 저하될 수 있다. 이러한 당단백질은 또한 사람 중에서 면역원성일 수 있고 투여 후 생체내 반감기가 감소될 수 있다. 사람 및 다른 동물에 존재하는 특정 수용체는 특정 당화 잔기를 인식하고 혈류로부터 그 단백질의 신속 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로, 단백질 폴딩, 용해성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래픽킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질이나 인자에 의해 인식, 항원성 또는 알레르기원성 등의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 당업자는 특정 조성과 당화 패턴을 가진 치료 단백질, 예컨대 사람 세포 또는 의도된 피검체 동물의 종 특이적 세포에서 생산되는 것과 동일하거나 적어도 유사한 당화 조성 및 패턴을 가진 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포와 상이한 당화된 단백질의 발현은 숙주 세포의 유전자 변형을 통해 이종 당화 효소를 발현하도록 함으로서 수득될 수 있다. 사람 단백질 당화를 나타내는 항체 또는 항원 결합부는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 당업자라면 제조할 수 있다. 예를 들어, 효모 균주는 비자연발생의 당화 효소를 발현하도록 유전자 변형되어, 이 효모 균주에서 생산된 당화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포에서 생산된 것과 동일한 단백질 당화가 수득된 바 있다(미국 특허 출원 20040018590 및 20020137134 및 PCT 공개공보 WO2005100584 A2).
결합 단백질 외에도, 본 발명은 또한 본 발명의 당해 결합 단백질에 특이적인 항-이디오타입(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 또 다른 항체의 항원 결합 영역과 연합된 유일한 결정인자를 인지하는 항체이다. 항-Id는 결합 단백질 또는 CDR 함유 영역으로 동물을 면역화시켜 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정인자를 인지하고 이에 응답하여 항-Id 항체를 생산한다. 또한, 항-Id 항체는 소위 항-항-Id 항체를 생산하는 또 다른 동물에서 면역반응을 유도하기 위한 "면역원"으로서 사용될 수 있다..
또한, 목적하는 단백질은 다양한 당화 효소를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 발현시킬 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이며, 이에 따라 상기 라이브러리의 구성 숙주 세포는 변형된 당화 패턴을 가진 당해의 단백질을 생산한다. 그 다음, 당업자는 새로운 특정 당화 패턴을 가진 당해의 단백질을 선별하여 분리할 수 있다. 특별하게 선별된 신규 당화 패턴을 가진 단백질은 생물학적 성질이 개선되거나 변경된 단백질인 것이 바람직하다..
III. DVD-Ig의 용도
2개 이상의 항원에 결합하는 성질이 있다면, 본 발명의 결합 단백질은 통상의 면역분석법, 예컨대 효소 결합된 면역흡착분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학법을 통해 항원(예컨대 혈청이나 혈장과 같은 생물학적 시료에서)을 검출하는데 사용할 수 있다. DVD-Ig는 결합 또는 미결합된 항체의 검출을 촉진시키기 위해 직간접적으로 검출성 물질로 표지화된다. 적당한 검출성 물질에는 각종 효소, 보결분자족, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적당한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제가 있고; 적당한 보결분자족 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적당한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 있으며; 적당한 방사능 물질의 예에는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm이 있다.
본 발명의 결합 단백질은 시험관내 및 생체내 모두에서 항원의 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서, 당해 DVD-Ig를 사용하여, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 사람 피검체 또는 본 발명의 결합 단백질이 교차 반응하는 항원을 갖는 기타 포유동물 피검체에서 항원 활성을 억제할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항원 활성이 해로운 질환 또는 장애를 앓는 피검체에서 항원 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 결합 단백질은 치료 목적을 위해 사람 피검체에 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 활성이 해로운 장애"는 장애를 앓는 피검체에서 항원의 존재가 장애의 병리에 관여하거나 장애의 악화에 기여하는 인자이거나 의심되는 것으로 나타나는 질환 및 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 항원 활성이 해로운 장애는 항원 활성의 감소가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. 당해 장애는 예를 들어, 장애를 앓는 피검체의 생물학적 유체중에 항원 농도를 증가시켜(예를 들어, 피검체의 혈청, 혈장, 윤활액중의 항원 농도의 증가) 입증될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질로 치료될 수 있는 장애의 비제한적인 예는 하기에서 및 본 발명의 항체의 약제학적 조성물에 관한 부분에서 논의되는 장애를 포함한다.
본 발명의 DVD-Ig는 하나의 항원 또는 다중 항원에 결합할 수 있다. 당해 항원은 본원에 참조로서 인용되는 하기의 데이터베이스에 열거된 표적물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 표적 데이터베이스는 하기와 같은 목록을 포함한다:
치료학적 표적 (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp);
사이토킨 및 사이토킨 수용체 (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewiERBITUytokines.de/cope.cgi, and
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html);
케목킨 (http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html);
케목킨 수용체 및 GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/);
올팩터리 수용체 (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp);
수용체 (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm);
암 표적 (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi);
잠재적 항체 표적으로서 분비된 단백질 (http://spd.cbi.pku.edu.cn/);
단백질 키나제 (http://spd.cbi.pku.edu.cn/), 및
사람 CD 마커 (http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf) 및 (Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106:3123-6).
DVD-Ig는 효능/안정성을 증진시키고/시키거나 환자의 적용 범위를 증가시키기 위해 2개의 상이한 표적을 동시에 차단시키는 치료제로서 유용하다. 당해 표적은 가용성 표적 (IL-13 및 TNF) 및 세포 표면 수용체 표적 (VEGFR 및 EGFR)을 포함할 수 있다. 이것은 또한 암 치료를 위해 종양 세포와 T세포(Her2 및 CD3)간에, 또는 자가면역/이식을 위해 자가반응성 세포와 이펙터 세포간에 또는 임의의 특정 질환에서 발병 세포를 제거하기 위한 임의의 표적 세포와 이펙터 세포간에 재지시된 세포독성을 유도하는데 사용될 수 있다.
추가로, 동일한 수용체상에 2개의 상이한 에피토프를 표적화하도록 디자인되는 경우, DVD-Ig는 수용체 클러스터링 및 활성화를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 효능성 및 길항성 항-GPCR 치료제를 제조하는데 이득일 수 있다. 이 경우에, DVD-Ig를 사용하여 클러스터링/시그날 전달(2개의 세포 표면 분자) 또는 시그날 전달(하나의 분자상에)을 위해 하나의 세포에 대해 2개의 상이한 에피토프를 표적화할 수 있다. 유사하게, DVD-Ig 분자는 CTLA-4 연결, 및 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프(또는 2개 카피의 동일한 에피토프)를 표적화함에 의한 음성 시그날을 유발하여 면역 반응을 하향 조절하도록 디자인될 수 있다 CTLA-4는 다수의 면역학적 장애의 치료를 위해 임상적으로 유효하다. CTLA-4/B7 는 세포 주기 진행, IL-2 생성 및 활성화 후 T 세포의 증식을 약화시킴에 의해 T 세포 활성화를 음성으로 조절하고 CTLA-4 (CD152) 관여는 T 세포 활성화를 하향 조절할 수 있고 면역 내성의 유도를 촉진시킬 수 있다. 그러나, CTLA-4의 효능성 항체 관여에 의해 T 세포 활성화를 약화시키는 전략은 CTLA-4 활성화가 연결을 요구하기 때문에 성공적이지 못하였다. CTLA-4/B7의 분자 상호작용은 결정 구조 분석 (Stamper 2001 Nature410:608)에 의해 입증된 바와 같이 "경사진 지퍼" 정렬로 있다. 그러나, 항-CTLA-4 모노클로날 항체를 포함하는, 현재 시판되는 CTLA-4 결합 시약의 어떠한 것도 연결 성질을 갖지 않는다. 이러한 문제를 해결하기 위한 여러 시도가 있었다. 한 경우에, 세포 구성원 결합 단일쇄 항체가 제조되었고 마우스에서 동형접합성 거부를 억제하였다 (Hwang 2002 JI 169:633). 별도의 경우에, CTLA-4에 대한 인공 APC 표면 연결된 단일쇄 항체를 제조하고 T세포 반응을 약화시키는 것으로 입증되었다(Griffin 2000 JI 164:4433). 2개의 경우에, CTLA-4 연결은 인공 시스템에서 막 결합 항체를 밀접하게 국소화시킴으로써 달성되었다. 당해 실험은 CTLA-4 음성 시그날 전달에 의해 면역을 하향조절한다는 개념의 증거를 제공하지만 이들 보고에 사용되는 시약은 치료학적 용도로서 적합하지 않다. 이에 대해, CTLA-4 연결은 CTLA-4 세포외 도메인의 2개의 상이한 에피토프(또는 2개 카피의 동일한 에피토프)에 표적화되는 DVD-Ig 분자를 사용함에 의해 달성될 수 있다. 추론적으로 IgG의 2개의 결합 부위간의 거리는 약 150-170으로서 CTLA-4의 활성 연결(2개의 CTLA-4 동종이량체간에 30 내지 50Å)에 대해서 너무 크다. 그러나, DVD-Ig(하나의 암)상의 2개의 결합 부위간의 거리는 30 내지 50Å의 범위로서 훨씬 짧고 CTLA-4의 적당한 연결을 허용한다.
유사하게, DVD-Ig는 2개의 상이한 세포 표면 수용체 복합체의 구성원(예를 들어, IL12-R 알파 및 베타)을 표적화할 수 있다. 추가로, DVD-Ig는 CR1 및 가용성 단백질/병원체를 표적화하여 표적 가용성 단백질/병원체의 신속한 제거를 구동시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 DVD-Ig는 세포내 전달(내재화 수용체 및 세포내 분자를 표적화하는) 또는 뇌 내부로의 전달(혈뇌 장벽을 통과하기 위해 트랜스페린 수용체 및 CNS 질환 매개체를 표적화)을 포함하는, 조직-특이적 전달(국소 PK가 증진됨에 따라 효능을 보다 증진시키고/시키거나 독성을 저하시키기 위한 조직 마커 및 질환 매개체를 표적화함)을 위해 사용될 수 있다. DVD-Ig는 또한 항원의 비중화 에피토프에 결합함으로써 특정 위치로 항원을 전달하고 또한 항원의 반감기를 증가시키는 캐리어 단백질로서 작용할 수 있다. 또한, DVD-Ig는 환자에게 이식된 의료 장치에 물리적으로 연결되거나 이들 의료 장치를 표적화하도록 디자인될 수 있다(문헌참조: Burke, Sandra E.; Kuntz, Richard E.; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus (ABT-578) eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006), 58(3), 437-446; Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L., Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005), 377-397). 간략하게, 적당한 유형의 세포를 의학적 이식체 부위에 지시함으로써 정상적인 조직 기능을 치유하고 회복시킬 수 있다. 또한, 매개체(사이토킨을 포함하지만 이에 제한되지 않음)의 억제는 커플링된 DVD에 의한 장치 이식 즉시 또는 장치에 표적화되는 즉시 제공된다. 예를 들어, 스텐트는 차단된 동맥을 청소하고 심근으로의 혈류를 개선시키기 위해 개재 심장학에서 수년동안 사용되어 왔다. 그러나, 통상적인 노출된 금속 스텐트는 몇몇 환자에서 재발협착증(처리된 영역에서 동맥의 재협소화)을 일으켜 혈액 응고를 유발할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 최근에, 항-CD34 항체 피복된 스텐트가 보고되었고 이는 혈액 전반에 걸쳐 순환하는 내피 선조 세포(EPC)를 포획함으로 인해 발생되는 혈액 응고를 방지하고 재발협착증을 감소시킨다. 내피 세포는 혈관을 따라 존재하여 혈류를 원할하게 하는 세포이다. EPC는 스텐트의 경표면에 부착하여 연한 층을 형성하고 치유를 촉진시킬 뿐만 아니라 이전에 스텐트의 사용과 연관된 합병증인 재발협착증 및 혈액 응고를 방지한다 (Aoji et al . 2005 J Am Coll Cardiol. 45(10):1574-9). 스텐트를 필요로 하는 환자에 대한 성과를 개선시킬 뿐만 아니라 심혈관 우회 수술을 필요로 하는 환자와도 관련이 있다. 예를 들어, 항-EPC 항체로 피복된 보족 혈관(인공 동맥)은 우회 수술 이식을 위해 환자 다리 또는 팔로부터 동맥을 사용할 필요가 없다. 이것은 수술 및 마취 시간을 감소시키고 이어서 관상 수술 사망을 감소시킬 것이다. DVD-Ig는 세포 보강을 촉진시키는 이식된 장치상에 피복된 단백질(또는 지질 및 폴리사카라이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 에피토프) 뿐만 아니라 세포 표면 마커(CD34와 같은)에 결합되도록 하는 방식으로 디자인된다. 당해 방법은 또한 일반적으로 기타 의학적 이식체에 적용될 수 있다. 또한, DVD-Ig는 의료 장치에 피복될 수 있고 이식 및 장치로부터 모든 DVD가 방출되는 즉시(또는 이미 로딩된 DVD-Ig의 노화 및 변성을 포함하는 추가의 신선한 DVD-Ig를 필요로 할 수 있는 임의의 기타 요구시), 당해 장치는 신선한 DVD-Ig를 환자에게 전신 투여하여 재로딩될 수 있고 이때, DVD-Ig는 목적하는 표적(사이토킨, 세포 표면 마커(예를 들어, CD34)등)에 결합하도록 디자인되고 이는 장치상에 피복된 표적(지질, 폴리사카라이드 및 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종류의 단백질, 에피토프를 포함함)에 대한 한 세트의 결합 부위와 다른 결합 부위를 갖는다. 당해 기술은 피복된 이식체의 유용성을 연장시키는 잇점을 갖는다.
A. 다양한 질환에서 DVD-Ig의 용도
본 발명의 DVD-Ig 분자는 또한 다양한 질환을 치료하기 위한 치료학적 분자로서 유용하다. 당해 DVD 분자는 특정 질환에 관련된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 다양한 질환에서 당해 표적의 예는 하기된 바와 같다.
1. 사람 자가면역 및 염증 반응
많은 단백질은 일반적인 자가면역 및 염증 반응에 연루되어 있고 다음을 포함한다: C5, CCL1 (I-309), CCL11 (에오탁신), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신 -2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1, CXCL10 (IP-10), CXCL11 (I-TAC / IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78 / LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (내피 단핵구 활성화 사이토킨), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1, AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, and RNF110 (ZNF144). 한 측면에서, 상기 열거된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 DVD-Ig가 제공된다.
2. 천식
알레르기성 천식은 상승된 혈청 IgE 수준 뿐만 아니라 호산구증가증, 배상세포 이형성증, 상피 세포 변화, 기도 과민반응 (AHR), 및 Th2 및 Th1 사이토킨 발현의 존재를 특징으로 한다. 현재 기도 염증이, T세포, B 세포, 호산구, 비만세포 및 대식세포의 복합 상호작용 및 사이토킨 및 케목킨을 포함하는 이들의 분비 매개체의 상호작용을 포함하는, 천식 병리학의 주요 인자인 것으로 광범위하게 수긍되고 있다. 코르티코스테로이드는 오늘날 천식에 대해 가장 중요한 소염 치료제이지만 이의 작용 기작은 비특이적이고 특히 어린 환자 집단에서 안전성 문제가 존재한다. 따라서 보다 특이적이고 표적화된 치료제의 개발이 요구된다. 마우스에서 IL-13이, 호산구 염증과는 무관하게, AHR, 점액 과분비 및 기도 섬유증을 포함하는 천식의 많은 특징을 모방하고 있다는 증거가 증가하고 있다 (Finotto et al., International Immunology (2005), 17(8), 993-1007; Padilla et al., Journal of Immunology (2005), 174(12), 8097-8105).
IL-13은 천식과 연관된 병리학적 반응을 유발하는데 주요 역할을 가짐으로서 관련되어 있다. 폐에서 IL-13의 효과를 감소시키는 항-IL-13 모노클로날 항체 치료제 개발은 신규 천식 치료제의 개발을 위해 상당히 전망있는 흥미로운 신규 방법이다. 그러나, 상이한 면역학적 경로의 기타 매개체가 또한 천식 병리에 연루되어 있고 IL-13 뿐만 아니라 이들 매개체를 차단하는 것이 추가의 치료학적 이득들 제공할 수 있다. 당해 표적 쌍은 IL-13, 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)와 같은 프로-염증 사이토킨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. TNF-는 천식에서 염증 반응을 증폭시킬 수 있고 질환 중증도와 관련될 수 있다 (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). 이것은 IL-13 및 TNF- 둘다의 차단이 특히, 심각한 기도 질환에서 이로운 효과를 가질 수 있음을 시사한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 DVD-Ig는 표적 IL-13 및 TNFα에 결합하고 천식을 치료하기 위해 사용된다.
염증 및 AHR 둘다가 평가될 수 있는 OVA 유도된 천식 마우스 모델과 같은 동물 모델은 당업계에 공지되어 있고 천식을 치료하는 다양한 DVD-Ig의 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 천식을 연구하기 위한 동물 모델은 문헌[참조: Coffman, et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1875-1879; Lloyd, et al., Advances in Immunology (2001), 77, 263-295; Boyce et al., Journal of Experimental Medicine (2005), 201(12), 1869-1873; and Snibson, et al., Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005), 35(2), 146-52]에 기재되어 있다. 당해 표적 쌍의 통상적인 안전성 평가 뿐만 아니라, 면역억제 정도에 대한 특이적 시험이 요구될 수 있고 최상의 표적 쌍을 선별하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257).
상기된 추론 및 효능 및 안정성에 대한 동일한 평가 모델을 사용함을 기초로, DVD-Ig 분자가 결합할 수 있고 천식을 치료하는데 유용한 기타 표적 쌍을 측정할 수 있다. 바람직하게, 당해 표적은 IL-13과 IL-1베타( IL-1베타는 또한 천식에서 염증 반응에 연루되어 있다); IL 13, 염증에 관여하는 사이토킨과 케목킨, 예를 들어 IL-13과 IL-9; IL-13과 IL-4; IL-13과 IL-5; IL-13과 IL-25; IL-13과 TARC; IL-13과 MDC; IL-13과 MIF; IL-13과 TGF-b; IL-13과 LHR 효능제; IL-13과 CL25; IL-13과 SPRR2a; IL-13과 SPRR2b; 및 IL-13과 ADAM8을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 하기의 그룹으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 천식에 연루된 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 DVD-Ig를 제공한다: CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, 히스타민 및 히스타민 수용체, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR, 및 키티나제.
3. 류마티스 관절염
전신성 질환인 류마티스 관절염(RA)는 관절 활막에서의 만성 염증 반응을 특징으로 하고 연골의 퇴화 및 관절 인접 골의 부식과 연관되어 있다. TNF, 케목킨 및 성장 인자를 포함하는 많은 염증 촉진 사이토킨은 환부 관절에서 발현된다. RA의 마우스 모델에 항- TNF 항체 또는 sTNFR 융합 단백질 융합 단백질의 전신성 투여는 소염 및 관절 보호성 인것으로 나타났다. RA 환자에서 TNF의 활성이 정맥내 투여되는 인플릭시마브에 차단된 임상적 연구 (Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFαlpha treatment. Ann Rheum Dis 58 Suppl 1:I61-4. )에서, 키메라 항-TNF 모노클로날 항체(mAB)는 TNF가 IL-6, IL-8, MCP-1 및 VEGF의 생산, 면역 및 염증 세포의 관절로의 보강, 혈관형성 및 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 및 3의 혈액 수준의 감소를 조절한다는 증거를 제공했다. 류마티스 관절염에서 염증 경로의 보다 나은 이해를 통해 류마티스 관절염에 연루된 기타 치료학적 표적을 동정하게 되었다. 인터류킨-6 길항제(MRA), CTLA4Ig (abatacept, Genovese Mc et al 2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.), 및 항-B 세포 치료 (rituximab, Okamoto H, Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909)와 같은 전망있는 치료제가 지난해에 걸쳐 무작위 조절된 시험에서 이미 시험되었다. 인터류킨-15, 인터류킨-17 및 인터류킨-18을 포함하는 기타 사이토킨이 동정되었고 동물 모델에서 이로운 것으로 나타났고 이들 제제의 임상적 시험이 진행중에 있다. 항-TNF와 또 다른 매개체를 병용하는 이원 특이적 항체 치료는 임상적 효능 및/또는 환자 보호에 큰 잠재력을 갖는다. 예를 들어, TNF 및 VEGF 둘다를 차단함으로써 RA의 병생리학에 연루된 염증 및 혈관형성을 잠재적으로 박멸시킬 수 있다. TNF와 IL-18; TNF와 IL-12; TNF와 IL-23; TNF와 IL-1베타; TNF와 MIF; TNF와 IL-17; 및 TNF와 IL-15을 포함하지만 이에 제한되지 않는 RA에 연루된 기타 표적쌍을 특이적 DVD Ig로 차단시키는 것이 또한 고려된다. 이들 표적 쌍에 대한 통상적인 안정성 평가 뿐만 아니라 면역 억제 정도에 대한 특정 시험이 요구될 수 있고 표적 쌍을 선별하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Hart et al., Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), 108(2), 250-257). DVD Ig 분자가 류마티스 관절염 치료를 위해 유용할 것인지의 여부는 콜라겐 유도된 관절염 마우스 모델과 같은 임상전 동물 RA 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 기타 유용한 모델은 또한 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2):114-22).
4. SLE
SLE의 면역병리학적 특징은 폴리클로날 B 세포가 활성화되어 글로불린 과다 혈증, 자가항체 생산 및 면역 복합체의 형성이 유도된다는 것이다. 기본적인 비정상적 현상은 T 세포가, 일반화된 T 세포 조절불능으로 인해 막아야 될 B 세포 클론을 억제하지 못한다는 것이다. 또한, B 및 T-세포 상호작용은, 제2 시그날을 개시하는 CD40과 CD40L, B7과 CD28 및 CTLA-4와 같은 동시 자극 분자 뿐만 아니라 여러 사이토킨(예를 들어, IL-10)에 의해 촉진된다. 이들 상호작용은, 면역 복합체 및 아폽토시스 물질에 대한 식세포 제거의 손상과 함께 면역 반응을 존속시키고 조직 손상이 유발된다. 하기의 표적이 SLE에 연루될 수 있고 잠재적으로 치료학적 중재를 위한 DVD-Ig 방법(B 세포 표적 치료)을 위해 잠재적으로 사용될 수 있다: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA, 및 NT5E.; 동시 자극 시그날: CTLA4 또는 B7.1/B7.2; B 세포 생존 억제: BlyS, BAFF; 보체 불활성화: C5; 사이토킨 조절. 주요 원리는 임의의 조직에서 총 생물학적 반응이 염증 촉진 또는 소염 사이토킨의 국소적 수준간에 이의 균형에 따른 결과인 것이다(문헌참조: Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7). SLE는 혈청중에서 IL-4, IL-6, IL-10이 상승하는 것으로 입증된 Th-2 유발 질환인 것으로 간주된다. IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, 및 TNF-a로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig가 또한 고려된다. 상기 논의된 표적의 조합은 SLE에 대한 치료학적 효능을 증진시킬 것이고 이것은 다수의 낭창 임상전 모델에서 시험될 수 있다(문헌참조: Peng SL (2004) Methods Mol Med.;102:227-72).
5. 다발성 경화증
다발성 경화증 (MS)은 병인이 명백하게 미지인 복합 사람 자가면역형 질환이다. 신경계 전반에 걸친 미엘린 염기성 단백질(MBP)의 면역학적 파괴는 다발성 경화증의 주요 병리이다. MS는 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의한 침투를 포함하는 복합 병리 질환이고 중추 신경계내 반응 질환이다. 사이토킨, 반응성 질소 종 및 동시자극인자 분자의 CNS내 발현은 모두 MS에서 기재되었다. 주로 고려되는 것은 자가면역 발병에 기여하는 면역학적 기작이다. 특히, 항원 발현, 사이토킨 및 백혈구 상호작용 및 조절 T-세포는 Th1 및 Th2 세포와 같은 기타 T-세포의 균형/조절을 도와주고 치료학적 표적 동정을 위해 중요한 영역이다.
IL-12는 염증 촉진 사이토킨이고 APC에 의해 생성되어 Th1 이펙터 세포의 분화를 촉진한다. IL-12는 MS를 앓는 환자 및 EAE-에 걸린 동물의 발생 병변에서 생성된다. 이전에, IL-12 경로에서의 간섭은 설치류에서 EAE를 예방하고 항-IL-12 mAb를 사용한 IL-12p40의 생체내 중화는 통상의 마모셋에서 미엘린 유도된 EAE 모델에서 이로운 효과를 갖는 다는 것을 보여주었다.
TWEAK는 TNF 계열의 구성원이고, 염증 촉진, 증식 또는 아폽토시스 효과가 세포 유형에 의존하는 중추 신경계(CNS)내에서 항상성으로 발현된다. 이의 수용체인 Fn14는 내피 세포, 반응성 성상세포 및 뉴런에 의해 CNS에서 발현된다. TWEAK 및 Fn14 mRNA 발현은 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안에 척주에서 증가된다. 6마리 마우스당 C57BL에서 미엘린 올리고수지상세포 당단백질(MOG) 유도된 EAA에서 항 -TWEAK 항체 처리는 마우스가 적응(priming) 기간 후 처리되는 경우 질환 중증도 및 백혈구 침투를 감소시킨다.
본 발명의 한 측면은 IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFN감마, GM-CSF, FGF, C5, CD52, 및 CCR2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 2개의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig 분자에 관한 것이다. 바람직한 양태는 MS의 치료에 이로운 치료제로서 이원-특이적 항-IL-12/TWEAK DVD Ig를 포함한다. MS를 치료하기 위한 DVD 분자의 유용성을 평가하기 위한 여러 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다 (문헌참조: Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 26(11):565-71; Lublin FD., et al., (1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208; Genain CP, et al., (1997) J Mol Med. 75(3):187-97; Tuohy VK, et al., (1999) J Exp Med. 189(7):1033-42; Owens T, et al., (1995) Neurol Clin.13(1):51-73; and 't Hart BA, et al., (2005) J Immunol 175(7):4761-8). 이들 표적 쌍의 통상적인 안전성 평가 뿐만 아니라 면역 억제 정도에 대한 특정 시험이 요구될 수 있고 최상의 표적 쌍을 선택하는데 도움이 된다(문헌참조: Luster et al., Toxicology (1994), 92(1-3), 229-43; Descotes, et al., Developments in biological standardization (1992), 77 99-102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3(4):442-6).
6. 패혈증
패혈증의 병생리학은 그람 음성 유기체의 외막 성분(리포폴리사카라이드[LPS], 지질 A, 내독소) 및 그람 양성 유기체의 외막 성분(리포테이코산, 펩티도글리캔)에 의해 개시된다. 이들 외막 성분은 단핵구의 표면상의 CD14 수용체와 결합할 수 있다. 이어서 최근에 보고된 톨(toll)형 수용체에 의해, 시그날은 세포로 전달되어 결국 염증 촉진 사이토킨 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파) 및 인터류킨-1(IL-1)의 생성을 유발한다. 압도적인 염증 및 면역 반응은 패혈성 쇼크의 필수적 특징이고 조직 손상, 다발성 기관 부전증 및 패혈증 유도된 사멸의 병리에 중추 역할을 한다. 사이토킨, 특히, 종양 괴사 인자 (TNF) 및 인터류킨 (IL)-1은 패혈성 쇼크의 중요한 매개체인 것으로 밝혀졌다. 이들 사이토킨은 조직에 대한 직접적인 독성 효과를 갖고 이들은 또한 포스포리파제 A2를 활성화시킨다. 이들 및 기타 효과는 혈소판 활성화 인자의 농도를 증가시키고 산화질소 신타제 활성을 촉진시키고 호중구에 의한 조직 침투를 촉진시키고 호중구 활성을 촉진시킨다.
패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료는 임상적 난제로서 남아있고 염증 반응에 겨냥된 생물학적 반응 개질제(즉, 항-TNF, 항-MIF)를 사용한 최근 기대되는 시험이 단지 약간의 임상적 이득을 나타내었다. 최근에, 관심이 면역 억제의 수반된 기간을 역전시키것을 목표로 하는 치료쪽으로 전환되었다. 실험 동물 및 중증 환자에 대한 연구는 림프성 기관 및 몇몇 유조직의 증가된 아폽토시스가 당해 면역 억제, 아네르기 및 기관계 기능부전에 기여하는 것임을 입증하였다. 패혈증 증후군동안에, 림프구 아폽토시스는 IL-12의 부재 또는 글루코코르티코이드, 그랜자임 또는 소위 '사멸' 사이토킨, 종양 괴사 인자 알파 또는 Fas 리간드의 방출에 의해 유발될 수 있다. 아폽토시스는 시토졸 및/또는 미토콘드리아 카스파제의 자가 활성화를 통해 진행하고, 당해 카스파제는 Bcl-2 계열의 아폽토시스 촉진 및 항-아폽토시스 구성원에 의해 영향받을 수 있다. 실험적 동물에서, , 아폽토시스의 억제제를 사용한 치료로 림프구 세포 아폽토시스를 방지할 수 있을 뿐만 아니라 이것은 또한 당해 결과를 개선시킬 수 있다. 항-아폽토시스 제제를 사용한 임상적 시도는 대부분 이들의 투여 및 조직 표적화와 연관된 기술적 어려움으로 인해 아득하지만 림프구 아폽토시스의 억제는 패혈성 환자에 대한 매력적인 치료학적 표적을 나타낸다. 또한, 염증 매개체 및 아폽토시스 매개체를 표적화하는 이원 특이적 제제는 부가 이득을 가질 수 있다. 본 발명의 한 측면은 하기의 표적으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 패혈증에 연루된 하나 이상의 표적, 바람직하게는 2개의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig에 관한 것이다: TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, 톨형 수용체, TLR-4, 조직 인자, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL10, IL1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1A, CSF3, IL10, IL1B, IL6, ADORA2A, CCR3, IL10, IL1B, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, 미드킨, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1, 및 TREM1. 패혈증에 대한 당해 DVD Ig의 효능은 당업계에 공지된 임상전 동물 모델에서 평가될 수 있다(문헌참조: Buras JA, et al.,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65 and Calandra T, et al., (2000) Nat Med. 6(2):164-70).
7. 신경학적 장애
7.1. 신경퇴행성 질환
만성 신경퇴행성 질환은 일반적으로 연령 의존적 질환이고 신경 기능의 점진적인 상실(뉴런 세포사, 탈수초성), 운동성 상실 및 기억 상실을 특징으로 한다. 만성 신경퇴행성 질환(예를 들어, 알츠하이머 질환)을 뒷받침하는 기작에 대한 새로운 지식은 복합적 병인을 보여주고 다양한 인자, 예를 들어, 혈당 상태, 아밀로이드 생산 및 다량체화, 수용체 RAGE(AGE에 대한 수용체)에 결합하는 진전된 당화 최종 생성물의 축적, 증가된 뇌 산화 스트레스, 감소된 뇌 혈류, 염증성 사이토킨 및 케목킨을 포함하는 신경염증, 뉴런 기능부전 및 소교 세포 활성화가 이들의 발병 및 진행에 기여하는 것으로 인지되었다. 따라서, 이들 만성 신경퇴행성 질환은 다발성 세포 유형 및 매개체간에 복잡한 상호작용을 나타낸다. 당해 질환에 대한 치료 전략은 제한되고 대부분 비특이적 소염제(예를 들어, 코르티코스테로이드, COX 억제제)로 염증 과정을 차단하거나 당해 제제로 뉴런 상실 및/또는 시냅스 기능을 차단하는 것으로 구성된다. 이들 치료는 질환 진행을 중지시키는데 실패한다. 최근 연구는 가용성 A-b 펩타이드(A-b 올리고머 형태를 포함함)에 대한 항체와 같은 보다 표적화된 치료가 질환 진행의 중지를 도와줄수 있을 뿐만 아니라 기억의 유지를 도와줄 수 있음을 시사한다. 이들 예비 관찰은 하나 이상의 질환 매개체(예를 들어, A-b, 및 TNF와 같은 염증 촉진 사이토킨)를 표적화하는 특정 치료가 단일 질환 기작(예를 들어, 가용성 A- 단독)을 표적화하여 관찰되는 것 보다 만성 신경퇴행성 질환에 대해 보다 우수한 치료학적 효능을 제공할 수 있음을 시사한다(문헌참조: C.E. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 2005 Oct 24; Nelson RB., Curr Pharm Des. 2005;11:3335; William L. Klein.; Neurochem Int. 2002 ;41:345; Michelle C Janelsins, et al., J Neuroinflammation. 2005 ;2:23; Soloman B., Curr Alzheimer Res. 2004;1:149; Igor Klyubin, et al., Nat Med. 2005;11:556-61; Arancio O, et al., EMBO Journal (2004) 1-10; Bornemann KD, et al., Am J Pathol. 2001;158:63; Deane R, et al., Nat Med. 2003;9:907-13; and Eliezer Masliah, et al., Neuron. 2005;46:857).
본 발명의 DVD-Ig 분자는 알츠하이머와 같은 만성 신경퇴행성 질환에 연루된 하나 이상의 표적에 결합할 수 있다. 당해 표적은 AD 병리학에 연루된 임의의 매개체, 가용성 또는 세포 표면, 예를 들어, AGE(S100A, 암포테린), 염증 촉진 사이토킨(예를 들어, IL-1), 케목킨(예를 들어, MCP 1), 신경 재생을 억제하는 분자(예를 들어, Nogo, RGM A), 신경 성장을 증진시키는 분자(뉴로트로핀)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. DVD-Ig 분자의 효능은 아밀로이드 전구체 단백질 또는 RAGE를 과발현하고 알츠하이머 질환 유사 증상을 나타내는 유전자 전이 마우스와 같은 임상전 동물 모델에서 유효할 수 있다. 또한, DVD-Ig 분자는 작제되고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고 사람 환자에서 시험하기 위한 최상의 치료학적 DVD-Ig 가 선택될 수 있다. DVD-Ig 분자는 또한 파킨슨 질환과 같은 기타 신경퇴행성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 알파-시누클레인은 파킨슨 병리학에 관여한다. 알파-시누클레인 및 염증 매개체(예를 들어, TNF, IL-1, MCP-1)를 표적화할 수 있는 DVD-Ig는 파킨슨 질환에 대해 효과적인 치료임을 입증할 수 있고 본 발명에 고려된다.
7.2 신경 소생 및 척주 손상
병리학적 기작의 지식이 증가했음에도 불구하고 척주 손상(SCI)은 여전히 황무지인 상태이고 고도의 의학적 요구를 특징으로 하는 의학적 징후를 나타낸다. 대부분의 척주는 타박상이거나 압착 손상이고 1차 손상은 일반적으로 2차 손상 기작(염증 매개체, 예를 들어, 사이토킨 및 케목킨)에 따른 것이고 이것은 초기 손상을 악화시키고 환부를, 때때로 10배 이상으로 증대시킨다. SCI에서 이들 1차 및 2차 기작은 기타 수단에 의해 유발되는 뇌 손상, 예를 들어, 뇌졸중의 기작가ㅗ 매우 유사하다. 어떠한 만족할만한 치료가 존재하지 않고 메틸프레드니솔론(MP)의 고 투여량의 일시 주사가 손상 후 8시간의 좁은 시간 범위에서만 사용되는 치료이다. 그러나, 당해 치료는 단지 임의의 상당한 기능적 회복 없이 2차 손상을 예방하기 위해 의도된다. 명백한 효능의 부재 및 후속 감염 및 중증 조직학적 근육 변형을 갖는 면역억제와 같이 중증 역효과 때문에 가혹하게 비판받고 있다. 내인성 소행 잠재력을 자극하는 어떠한 다른 약물, 생물학적 또는 소분자도 승인되지 않았지만 최근해에 SCI의 동물모델에서 전망있는 치료 원리 및 약물 후보가 효능을 나타내었다. 사람 SCI에서 기능적 회복의 부재는 대부분, 환부, 상처 조직, 미엘린에서 및 손상 관련 세포상에서 신경돌기 성장을 억제하는 인자에 의해 유발된다. 당해 인자는 미엘린 연관 단백질 NogoA, Omgp 및 MAG, RGM A, 상처 연관 CSPG(콘드로이틴 설페이트 프로테오글리캔) 및 반응성 성상세포에 대한 억제 인자(몇몇 세마포린 및 에프린)이다. 그러나, 환부에는 성장 억제 인자 뿐만 아니라 뉴로트로핀, 라미닌, L1 및 기타와 같은 신경돌기 성장 자극 인자가 존재한다. 신경돌기 성장 억제 및 성장 촉진 분자의 전체적 효과는 NogoA 또는 RGM A와 같은 단일 인자의 차단이, 억제 영향의 감소가 성장 억제로부터 성장 촉진으로의 균형을 전환시킬 수 있기 때문에, 설치류 SCI 모델에서 기능적으로 상당히 회복시킴을 설명할 수 있다. 그러나, 단일 신경돌기 과증식 억제 분자를 차단함으로써 관찰되는 회복은 완전하지 않다. 보다 신속하고 보다 명백한 회복을 성취하기 위해, Nogo 및 RGM A와 같은 2개의 신경돌기 과증식 억제 분자를 차단하거나 신경돌기 과증식 억제 분작를 차단하고 신경돌기 과증식 증진 분자(예를 들어, Nogo 및 뉴로트로핀)의 기능을 증진시키거나 신경돌기 과증식 억제 분자(Nogo 및 염증 촉진 분자, 예를 들어, TNF )를 차단하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌참조: McGee AW, et al., Trends Neurosci. 2003;26:193; Marco Domeniconi, et al., J Neurol Sci. 2005;233:43; Milan Makwana1, et al., FEBS J. 2005;272:2628; Barry J. Dickson, Science. 2002;298:1959; Felicia Yu Hsuan Teng, et al., J Neurosci Res. 2005;79:273; Tara Karnezis, et al., Nature Neuroscience 2004; 7, 736; Gang Xu, et al., J. Neurochem.2004; 91; 1018).
한 측면에서, NgR과 RGM A; NogoA와 RGM A; MAG과 RGM A; OMGp와 RGM A; RGM A와 RGM B; CSPG와 RGM A; 아그레칸, 미드킨, 뉴로칸, 베르시칸, 포스파칸, Te38 및 TNF-a; Aβ 원형체 특이적 항체와 같은 표적 쌍과 결합할 수 있는 DVD-Ig가 수지상세포 & 액손 발아를 촉진하는 항체와 배합되어 제공된다. 수지상세포 병리는 AD에 대한 매우 조기 징후이고 NOGO A가 수지상세포 성장을 제한시키는 것으로 공지되어 있다. 당업자는 당해 유형의 ab를 SCI-후보물(미엘린-단백질) Ab와 배합할 수 있다. 기타 DVD-Ig 표적은 NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG 또는 Omgp의 조합체를 포함할 수 있다. 추가로, 표적은 또한 신경돌기의 억제에 연루된 임의의 매개체, 가용성 또는 세포 표면, 예를 들어, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, 세마포린, 에프린, 가용성 A-b, 염증 촉진 사이토킨(예를 들어, IL-1), 케목킨(예를 들어, MIP 1a), 신경 소행을 억제하는 분자를 포함할 수 있다. 항-Nogo/항-RGM A 또는 유사한 DVD-Ig 분자의 효능은 척주 손상의 임상전 동물 모델에서 유효할 수 있다. 또한, 이들 DVD-Ig 분자가 작제될 수 있고 동물 모델에서 효능에 대해 시험될 수 있고 최상의 치료학적 DVD-Ig가 사람 환자에서 시험하기 위해 선택될 수 있다. 또한, 단일 수용체, 예를 들어, 3개의 리간드 Nogo, Ompg 및 MAG와 결합하는 Nogo 수용체 및 A-b 및 S100 A와 결합하는 RAGE상에 2개의 별도의 결합 부위를 표적화하는 DVD-Ig 분자가 작제될 수 있다. 추가로, 신경돌기 과증식 억제제, 예를 들어, nogo 및 nogo 수용체는 또한 다발성 경화증과 같은 면역학적 질환에서 신경 소생을 방지하는 역할을 한다. nogo-nogo 수용체 상호작용의 억제는 다발성 경화증의 동물 모델에서 회복을 증진시키는 것으로 나타났다. 따라서, 하나의 면역 매개체, 예를 들어, IL-12와 같은 사이토킨의 기능 및 신경돌기 과증식 억제제 분자, 예를 들어, nogo 또는 RGM의 기능을 을 차단할 수 있는 DVD-Ig 분자는 면역 또는 신경돌기 억제제 분자만을 차단하는 것 보다 신속하고 보다 큰 효능을 제공할 수 있다.
8. 종양학적 장애
모노클로날 항체 치료는 암에 대한 중요한 치료학적 방식으로서 나타났다 (von Mehren M, et al 2003 Monoclonal antibody therapy for cancer. Annu Rev Med.;54:343-69). 항체는 아폽토시스, 재지시된 세포독성, 리간드-수용체 상호작용의 간섭을 유도하거나 신생물 표현형에 중요한 단백질의 발현을 차단함에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 항체는 종양 미세환경의 성분을 표적화하여 종양 연관 혈관형성과 같은 중요한 구조물을 교란시킬 수 잇다. 항체는 또한 리간드가 성장 인자인 수용체, 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체를 표적화할 수 있다. 따라서, 당해 항체는 표적화된 종양 세포에 결합하여 세포 성장을 자극하는 중성 리간드를 억제한다. 또한, 항체는 항-이디오타입 네트워크. 보체 매개 세포독성 또는 항체 의존성 세포성 세포 독성(ADCC)를 유도할 수 있다. 2개의 별도의 종양 매개체를 표적화하는 이원-특이적 항체의 사용은 단일 특이적 치료에 비하여 추가의 이득을 제공한다. 종양학적 질환을 치료하기 위해 하기 쌍의 표적과 결합할 수 있는 DVD Ig가 또한 고려된다: IGF1과 IGF2; IGF1/2와 Erb2B; VEGFR과 EGFR; CD20과 CD3, CD138과 CD20, CD38과 CD20, CD38과 CD138, CD40과 CD20, CD138과 CD40, CD38과 CD40. 기타 표적 조합은 EGF/erb-2/erb-3 계열의 하나 이상의 구성원을 포함한다. 종양학적 질환에 관련되고 DVD Ig가 결합할 수 있는 기타 표적(하나 이상)은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, EGF, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4, FGF7, IGF1, IGF1R, IL2, VEGF, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B, ODZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, ENO1, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3, IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, NOX5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1, PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53, CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG, NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2, NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2, NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1, CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1, FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP, PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1, CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROBO2, CD44, ILK, ITGA1, APC, CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2, CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES, DNCL1, ELAC2, ENO2, ENO3, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1, GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1, KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1, STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECAM1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFαIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-카드헤린), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-카테닌), CTSB (카텝신 B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (겔솔린), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (당단백질 130), ITGA6 (a6 인테그린), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), MKI67 (Ki-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (마스핀), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (트롬보스폰딘 -1), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (토포이소머라제 Iia), TP53, AZGP1 (아연 -a-당단백질), BPAG1 (플렉틴), CDKN1A (p21Wap1/Cip1), CLDN7 (클라우딘 -7), CLU (클루스테린), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (피브로넥틴), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (a6 인테그린), ITGB4 (b 4 인테그린), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (케라틴 19), KRTHB6 (모발 특이적 II형 케라틴), MACMARCKS, MT3 (메탈로티오넥틴 -III), MUC1 (무신), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (림포필린 B), SCGB2A1 (맘마글로빈 2), SCGB2A2 (맘마글로빈 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, 및 TNFAIP2 (B94).
IV. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명의 결합 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 장애를 진단, 검출 또는 모니터링하거나 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처리 또는 완화시키고/시키거나 연구에 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 결합 단백질, 및 본 발명의 결합 단백질 이외에 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 바람직하게, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처리 또는 완화시키는데 유용한 것으로 공지되거나 이에 사용되었거나 현재 사용중인 것들이다. 이들 양태에 따라, 당해 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 피검체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어에는 생리학적으로 화합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상 또는 이의 배합물이 포함된다. 대부분의 경우에는 조성물에 당과 같은 등장제, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜 또는 염화나트륨이 포함되는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 항체 일부의 유효 수명이나 효과를 증강시키는 습윤화제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량 포함할 수도 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나 처리하거나 치료하거나 완화시키는데 유용한 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 조합된 하나 이상의 항체 및 예방제 또는 치료제를 투여하는데 사용될 수 있고, 리포좀내 캅셀화제, 미세입자, 미세캅셀제, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포내이입[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], 레트로바이러스 또는 기타 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제를 예로 들 수 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하내) , 뇌척수 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여 (예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 흡입기 또는 분무기 및 분무제를 갖는 제형을 사용하는 폐 투여가 사용될 수 있다[U.S. Pat. Nos. 6, 019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290, 540, and 4,880,078; and PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, and WO 99/66903, 각각의 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다]. 하나의 양태에서, 본 발명의 결합 단백질, 병용 치료제 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR®폐 약물 전달 기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여된다. 특정 양태에서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐 또는 피하내로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 임의의 간편한 경로, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막 내층(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장내 점막등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다.
특정 양태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 본 발명의 예방제 또는 치료제를 국소적으로 투여하는 것이 요구될 수 있다. 이것은 예를 들어, 비제한적으로, 국소 주입, 주사 또는 임플란트에 의해 성취될 수 있고 당해 임플란트는 막 및 매트릭스, 예를 들어, 시알라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들어, Tissuel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 물질로 이루어진다. 한 양태에서, 본 발명의 길항제인 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 증상을 예방, 치료, 처리 및/또는 완화시킥 위해 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처리 및/또는 완화시키기 위해 본 발명의 피검체 외에도 유효량의 하나 이상의 치료제(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)와 병용하여 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다.
또 다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 조절 방출 또는 지연 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 양태에서, 펌프를 사용하여 조절된 또는 지연된 방출을 성취할 수 있다(see Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 또 다른 양태에서, 중합재를 사용하여 본 발명의 치료제의 조절되거나 지연된 방출을 성취할 수 있다[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. No. 5,679,377; U.S. Pat. No. 5, 916,597; U. S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT Publication No. WO 99/15154; and PCT Publication No. WO 99/20253]. 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리언하이드라이드, 폴리(N- 비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서, 지연된 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 누출되는 불순물이 없고, 저장시 안정하고 생분해성이다. 또 다른 양태에서, 조절되거나 지연된 방출 시스템은 예방제 또는 치료제와 근접하게 위치됨에 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다(Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
조절된 방출 시스템은 문헌[Langer (1990, Science 249:1527-1533)]에서 논의되었다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지연된 방출 제형을 제조할 수 있다[U. S. Pat. No. 4,526, 938, PCT publication WO 91/05548, PCT publication WO 96/20698, Ning et al. , 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다].
본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 특정 양태에서, 핵산은 생체내 투여되어 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진시킬 수 있고 당해 핵산은 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성되고 이것이 세포내로 투여되도록 하며, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(U. S. Pat. No. 4,980,286) 또는 직접 주사 또는 미세입자 충격(예를 들어, 유전자 총; 바이올리스틱, 듀폰트) 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로의 피복을 투여에 사용하거나 핵으로 진입하는 것으로 공지된 호메오박스형 펩타이드에 연결시켜 투여한다(Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). 또한, 핵산은 세포내로 도입되고 발현을 위해 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 DNA 내로 통합된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비내(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 당해 조성물은 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내 또는 경구 투여용으로 채택된 약제학적 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액중의 용액이다. 필요한 경우, 당해 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노캠과 같은 국소 마취제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소적으로 투여되어야만 하는 경우, 당해 조성물은 연고, 크림, 경피 패취, 로션, 젤, 샴프, 분무제, 에어로졸 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 형태로 제형화될 수 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]. 분무 불가능한 국소 투여 형태를 위해, 통상적으로 국소 적용과 양립할 수 있는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 바람직하게 물 보다 큰 역학 점도를 갖는 조성물이 사용될 수 있다. 적합한 제형은 제한없이 용제, 현탁제, 유제, 크림, 연고, 산제, 도찰제, 고약등을 포함하고 경우에 따라 이들은 예를 들어, 삼투압과 같은 다양한 성질에 영향을 미치기 위해 보조제(에를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤화제, 완충제 또는 염)과 함께 멸균되거나 혼합된다. 기타 적합한 국소 투여 형태는 바람직하게 고체 또는 액체 불활성 담체와 배합된 활성 성분이 가압된 휘발성 물질(예를 들어, 가스 추진제, 예를 들어, 프레온)과의 혼합물 또는 압착병에 팩키징된 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 수분화제 또는 보습제가 또한 경우에 따라 약제학적 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 당해 추가의 성분의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 에어로졸 형태, 분무, 연무 또는 적가 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 다라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 간편하게 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 적합한 추진제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)의 사용과 함께 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양이 전달되도록 밸브를 설치하여 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캅셀제 및 카트릿지(예를 들어, 젤라틴으로 구성된)는 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캡, 용제, 현탁제의 형태로 경구적으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 결합제(예를 들어, 예비젤화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들어, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) 또는 습윤화제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 정제는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 제한 없이 용제, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나 이들은 사용전에 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구성을 위해 무수 생성물로서 제공될 수 있다. 당해 액상 제제는 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성 오일) 및 방부제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 당해 제제는 또한 적절하게 완충염, 향제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 적합하게 예방제 또는 치료제의 느린 방출, 조절된 방출 또는 지연된 방출용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용함에 의해 분무화제로 제형화된 조성물을 폐 투여함을 포함할 수 있다[U.S. Pat. Nos. 6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, and 4,880,078; and PCT Publication Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, and WO 99/66903, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]. 특정 양태에서, 본 발명 항체, 병용 치료제 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여된다.
본 발명의 방법은 주사(예를 들어, 일시 주사 또는 연속 주입)에 의해 비경구 투여용으로 제형화된 조성물을 투여함을 포함할 수 있다. 주사용 제형은 방부제 첨가와 함께 단위 용량 형태(예를 들어, 앰푸울 또는 다용량 컨테이너)로 제공될 수 있다. 당해 조성물은 현탁제, 용제 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있고 현탁화제, 가용화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 성분은 사용전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균 발연원 부재 물)과의 구성을 위해 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 방법은 추가로 데포우 제제로서 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 당해 오래 지속적인 제제는 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 조성물은 적합한 중합재 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중 유제로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 불량한 가용성 유도체 (예를 들어, 불량한 가용성 염으로서)로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 수산화철, 이소프로필아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 함께 혼합하여, 예를 들어, 앰푸울 또는 사쉐트(활성제의 양을 나타냄)와 같은 밀폐된 컨테이너에서 무수 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 단위 용량 형태로 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰푸울을 제공하여 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 예방제 또는 치료제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물이 제제의 양을 나타내는 앰푸울 또는 사쉐트와 같은 밀폐된 컨테이너에 팩키징된 것을 제공한다. 한 양태에서, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에서 무수 멸균된 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 공급되고 피검체 투여용으로 적당한 농도로 재구성(예를 들어, 물 또는 식염수와 함께)될 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에 무수 멸균 동결건조된 분말로서 제공되고 단위 용량은 5 mg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 75 mg 이상 또는 100 mg 이상이다. 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 이의 본래의 컨테이너에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 하고 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주 이내, 바람직하게는 5일 이내, 72시간 이내, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 1시간 이내에 투여되어야만 한다. 또 다른 실험에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양 및 농도를 나타내는 밀폐된 컨테이너에서 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 투여된 조성물의 액체 형태는 밀폐된 컨테이너에 0.25 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 8 mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/kg 이상, 25 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상, 75 mg/ml 이상 또는 100 mg/ml 이상으로 공급된다. 액체 형태는 이의 본래의 컨테이너에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 한다.
본 발명의 결합 단백질은 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 여기서, 항체 또는 항체 일부는 항체 0.1 내지 250mg/ml를 포함하는 주사 용액으로 제조하는 것이 바람직하다. 주사 용액은 플린트 또는 호박색 바이엘, 앰플 또는 사전충진 주사기 중의 액체 또는 동결건조 투여 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)의 L-히스티딘(1-50mM), 최적으로는 5-10mM일 수 있다. 다른 적당한 완충액으로는 석신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투여 형태인 경우 최적으로는 150mM)의 농도로 용액의 독성을 개질하는데 사용될 수 있다. 동결건조 투여 형태에는 동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스(최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 첨가될 수 있다. 다른 적당한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 있다. 동결건조 투여 형태에는 벌크 제제(Bulking agent), 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이 첨가될 수 있다. 액체 및 동결건조 투여 형태에는 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10mM)이 첨가될 수 있다. 다른 적당한 벌크 제제(Bulking agent)에는 글리신, 아르기닌이 있으며, 이는 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로서 포함될 수 있다. 또 다른 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 비경구 투여용의 주사가능한 용액으로 제조된 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 보조제로서 유용한 제제, 예를 들어, 치료학적 단백질(예를 들어, 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 것들을 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 Hylenex®과 같은 하이알루로니다제(재조합 사람 하이알루로니다제)이다. 주사가능한 용액중에 하이알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후 사람 생물유용성을 개선시킨다. 이는 또한 보다 큰 주사 부위 용적(즉 1ml 초과)을 가능하게 하고 통증 및 불괘감이 덜하고 주사 부위 반응이 최소로 발생한다(본원에 참조로서 인용되는 WO2004078140, US2006104968).
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 예컨대 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌약 등이 포함된다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도마다 다르다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사 용액 또는 주입 용액 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 조성물과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 일반적으로 멸균될 수 있고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 주문 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요에 따라 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적당한 용매에서 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 필요에 따라 전술한 다른 성분을 포함하는 멸균 매개제에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조에 유용한 멸균 동결건조 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유체성은 예컨대 레시틴과 같은 피복의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 주사 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 첨가하여 제공할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 다양한 치료학적 용도에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 이 화합물이 신속 방출되지 않게 하는 담체와 함께 조제될 수 있으며, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 조절 방출 제형이 있다. 여기에는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체화합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다[예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물( 및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 충진되거나, 정제로 압착되거나 또는 피검체 식이에 직접 첨가될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취성 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐; 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 피복하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 공동 투여할 필요가 있을 수 있다.
또한, 보충적 활성 화합물이 상기 조성물에 첨가될 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-12 활성이 해로운 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동조제되고(되거나) 공동투여된다. 예를 들어, 본 발명의 결합 단백질은 다른 표적(예컨대, 다른 사이토킨에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가 항체와 공동조제 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 2종 이상과 함께 사용될 수 있다. 이러한 병용 치료는 투여되는 치료제를 보다 낮은 투여량으로 사용할 수 있게 하여 각종 단독치료법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있으므로 바람직하다.
특정 양태에서, 결합 단백질은 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 연결되기도 한다. 이러한 비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 본원에 참고인용된 미국 출원 일련번호 09/428,082 및 공개된 PCT 출원 WO 99/25044에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 또 다른 예방제 또는 치료제는 유전자 치료에 의해 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 처리하거나 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료법은 피검체에게 발현되거나 발현 가능한 핵산을 투여함에 의해 수행되는 치료법을 언급한다. 본 발명의 당해 양태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 이의 암호화된 본 발명의 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당업계에서 유용한 임의의 유전자 치료법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 치료법의 일반적인 검토를 위해 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 관해 당업계에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기재되어 있다. 다양한 유전자 치료법에 대한 상세한 설명은 본원에 참조로서 인용된 문헌[US20050042664 A1]에 기재되어 있다.
본 발명의 결합 단백질은 결합 단백질에 의해 인식되는 표적이 해로운 각종 질환을 치료하는데 유용하다. 이러한 질병에는 류마티스성 관절염, 골관절염, 소아만성관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응 관절염, 척추관절염, 전신홍반루푸스, 크론병, 궤양성 결장염, 염증장병, 인슐린 의존 당뇨병, 갑상샘염, 천식, 알레르기병, 건선, 피부경화증, 이식대숙주병, 기관 이식거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역병, 사르코이드증, 죽상경화증, 파종 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브스병, 신장증후군, 만성피로증후군, 베게너 육아종증, 헨녹-쇈라인 자반증(Henoch-Schonlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질병, 기생충병, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단 척수염, 헌팅톤씨 무도병, 파킨슨씨병, 알쯔하이머병, 졸중, 원발성 담관성간경화증, 용혈빈혈, 악성암, 심장부전, 심근경색, 애디슨씨병, 산발성, 다선성 결핍 I형 및 다선성 결핍 II형, 슈미트씨 증후군, 성인(급성) 호흡곤란증후군, 탈모증, 원형탈모증, 흠성혈청 관절증, 관절증, 라이터씨병, 건선관절증, 궤양성결장염관절증, 창자병 윤활막염, 클라미디아증, 예르시니아 및 살모넬라 관련 관절증, 척추관절증, 죽상병/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역수포병, 보통천포창, 낙엽천포창, 유사천포창, 선형 IgA 병, 자가면역 용혈빈혈, 쿰스 양성 용혈빈혈, 후천성 악성빈혈, 소아악성빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리병(Royal Free Disease), 만성 점막피부칸디다증, 거대세포 동맥염, 원발성 경화증 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍증후군, 후천성 면역결핍 관련병, B형 간염, C형 간염, 공통가변성면역결핍(공통가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소부전증, 조숙 난소부전, 섬유소성 폐질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증후 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합조직병 관련 간질성 폐병, 복합 결합조직병 관련 폐병, 전신 경화증 관련 간질성 폐병, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐병, 전신홍반루푸스 관련 폐병, 피부근육염/다발근육염 관련 폐병, 쇼그렌병 관련 폐병, 강직척추염 관련 폐병, 혈관염성 광범위 폐병, 혈철소증 관련 폐병, 약물 유도 간질성 폐병, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐쇄세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤 폐병, 감염후 간질성 폐병, 통풍 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(고전적 자가면역 또는 루푸스 간염), 2형 자가면역 간염(항LKM 항체 간염), 자가면역 매개 저혈당증, 흑색가시세포증 관련 B형 인슐린 내성, 부갑상샘항진증, 기관 이식 관련 급성 면역 질환, 기관 이식 관련 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화담관염, 1형 건선, 2형 건선, 특발 백혈구감소증, 자가면역 호중구 감소증, 신장병 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원반형 홍반루푸스, 특발성 또는 NOS 남성 불임, 정자 자가면역성, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합조직 질환에 부차적인 폐 고혈압, 굿파스쳐 증후군, 결절다발동맥염의 폐동맥 징후, 급성 류마티스열, 류마티스성 척추염, 스틸스병, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스씨병/동맥염, 자가면역 저혈소판증, 특발 저혈소판증, 자가면역 갑상샘 질환, 갑상샘항진증, 갑상샘종 자가면역 갑상샘항진증(하시모토씨병), 위축 자가면역 갑상샘항진증, 원발성 점액부종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간질환, 만성 간질환, 알콜간경화증, 알콜 유도 간 손상, 담즙정체, 특이 간질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기 및 천식, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 질환(예, 우울증 및 정신분열병), Th2 타입 및 Th1 타입 매개 병, 급성 및 만성 통증 및 암, 예컨대 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선 및 직장의 암 및 조혈계 암(백혈병 및 림프종), 아베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 공기 이소성 심방박동, AIDS 치매 합병증, 알콜 유도 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-l-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 앙기나 협심증, 전각 세포 퇴화, 항 cd3 치료, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 아오딕 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방세동 (지연 또는 발작성), 심방조동, 동정맥 막힘, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 퇴화, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학치료 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크루츠펠트-자콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭섬유증, 사이토킨 치료 관련 장애, 권투선수치매(Dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 광범위 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물 유도 운동 장애, 약물 과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스탄-바르 바이러스 감염, 피부홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할레로르덴-스파츠 질환(Hallerrorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성 요독증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 출혈, 간염(A), 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 과운동성 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동 부족 장애, 시상하부 - 뇌하수체-부신피질계 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/자궁염/광학적 신경근염, 허혈 관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프피부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막염 균혈증, 대사/특발성, 편두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 연결 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 퇴화(만셀 데제린- 토마스 쉬-드라거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수이형성증후군 , 심근 경색, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 I 근육 위축증, 호중구감소성 발열 , 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, okt3 치료, 고환염/부고환염, 고환염/절관절제술 반전 과정, 기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 상핵 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노드 현상 및 질환, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 피부경화증, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈증, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌 퇴화, 스트렙토코커스 근염, 소뇌 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나팔락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 말초혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염 , 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판 심장 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥동 질환, 정맥종 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이탈 뇌염/무균성 수막염, 바이탈-연관 적혈구식작용 증후군, 웨른니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Peritt et al. PCT publication No. WO2002097048A2, Leonard et al., PCT publication No. WO9524918 A1, and Salfeld et al., PCT publication No. WO00/56772A1).
본 발명의 결합 단백질은 자가면역 질병, 구체적으로 염증 관련 질병, 예컨대 류마티스성 척추염, 알레르기, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염 등을 앓고 있는 사람의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 류마티스성 관절염, 크론병, 다발성 경화증, 인슐린 의존 당뇨병 및 건선의 치료에 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 결합 단백질은 각종 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 전술한 질환의 치료에 단독으로 또는 배합물로서 사용될 수 있다. 당해 결합 단백질은 단독으로 사용되거나 또는 의도한 목적에 따라 당업자에 의해 선택된 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질병이나 증상의 치료에 유용한 것으로 인식된 치료제 분야일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 특성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 유효한 제제일 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되어야 하는 배합물은 의도한 목적에 유용한 배합물로 이해되어야 한다. 이하에 설명되는 제제는 목적에 유용한 예시적 제제로서, 한정하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체와 이하에 기술되는 목록 중에서 선택되는 하나 이상의 추가 제제일 수 있다. 이러한 배합물은 또한 하나 이상의 추가 제제를 포함할 수 있으며, 예를 들어 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있을 정도의 배합이라면 2개 또는 3개의 추가 제제가 첨가될 수도 있다.
자가면역 및 염증 질환을 치료하기 위한 바람직한 배합물은 이부프로펜과 같은 약물을 포함하는 NSAID로 언급되기도 하는 비스테로이드 소염 약물이다. 다른 바람직한 배합물은 프레드니솔론을 비롯한 코르티코스테로이드류이며; 본 발명의 DVD Ig와 함께 환자를 치료하는 경우, 필요한 스테로이드 용량이 점감되어 스테로이드 사용 시의 공지된 부작용이 저하되거나 심지어 제거될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항체 결합부와 함께 류마티스성 관절염용 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 사이토킨 억제성 소염제(CSAID); 다른 사람 사이토킨 또는 성장인자(예컨대, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, IL-21, IL-23, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF)에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, CTLA와 같은 세포 표면 분자 또는 이들의 리간드, 예컨대 CD154(gp39 또는 CD40L)에 대한 항체와 조합될 수 있다.
치료제의 바람직한 배합물은 자가면역 및 후속 염증 캐스캐이드의 여러 지점에서 방해할 수 있다; 바람직한 예에는 TNF 길항제, 예를 들어, 키메라, 사람화된 또는 사람 TNF 항체, D2E7(PCT 공개 WO 97/29131), CA2(REMICADE® 인플릭시마브) CDP571, 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체, (p75TNFR1gG (ENBREL®에타너셉트) 또는 p55TNFR1gG (lenercept), 및 또한 TNFα전환 효소(TACE) 억제제가 있고, 유사하게 IL-1 억제제(인터류킨-1-전환 효소 억제제, IL-1RA등)는 동일 이유때문에 유효하다. 다른 바람직한 배합물에는 인터류킨 11이 있다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-12 기능과 병행하거나, IL-12 기능에 의존적이거나 IL-12 기능과 협동적인 작용을 할 수 있는 자가면역 반응의 다른 주요 작용인자이다. 특히 바람직한 예는 IL-18 항체 또는 가용성 IL-18 수용체를 포함하는 IL-18 길항제 또는 IL-18 결합 단백질이다. 확인된 바에 따르면, IL-12와 IL-18이 중복되지만 독특한 기능을 보유하여, 이 둘에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적이었다. 또 다른 바람직한 배합물은 비고갈성 항-CD4 억제제이다. 또 다른 바람직한 배합물에는 공동자극 경로의 길항제 CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2), 예컨대 항체, 용해성 수용체 또는 길항제성 리간드 등이 포함된다.
본 발명의 결합 단백질은 또한 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 오로 티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린수용체 효능제(살부타몰, 터부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸 및 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, 전염증성 사이토킨, 예컨대 TNFα 또는 IL-1에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체 및 유도체 p75TNFRIgG(ENBREL® 에타너셉트 및 p55TNFRIgG(lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 아스파린, 트리암시놀론 아세토나이드, 프로폭시펜 나프실레이트/apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙 나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 사람 재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 설린닥, 시아노코발라민/fa/피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트 나트륨, 프레드니솔론, 몰핀 설페이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민 설프/콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센 나트륨, 오메프라졸, 시클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18BP, 항-IL-12, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801 및 메소프람 등의 제제와도 배합될 수 있다. 바람직한 배합물에는 메토트렉세이트 또는 레플루노미드가 있으며, 보통 또는 중증 류마티스성 관절염 증례에는 사이클로스포린이 있다.
류마티스 관절염을 치료하기 위해 결합 단백질과 배합하여 사용될 수 있는 비제한적인 추가의 제제는 하기의 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 비-스테로이드 소염 약물(NSAID); 사이토킨 억제 소염 약물(CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (사람화된 항-TNFα 항체; Celltech/Bayer); CA2/인플릭시마브 (키메라 항-TNFα 항체; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/에타너셉트 (75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Immunex; Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-IgG (55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (비-고갈 영장류화된 항-CD4 항체; IDEC/SmithKline; Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2 (IL-2 융합 단백질; Seragen; Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); 항-Tac (사람화된 항-IL-2Ra; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (소염 사이토킨; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; 재조합 IL-10, 소염 사이토킨; DNAX/Schering); IL-4; IL-10 및/또는 IL-4 효능제 (예를 들어, 효능제 항체); IL-1RA (IL-1 수용체 길항제; Synergen/Amgen); 아나킨라(Kineret®Amgen); TNF-βp/s-TNF (가용성 TNF 결합 단백질; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (포스포디에스테라제 IV형 억제제; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (COX-2 Inhibitor; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81); 일로프로스트(Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82); 메토트렉세이트; 탈리도미드 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282) 및 탈리도미드-관련 약물(예를 들어, 셀겐); 레플루노미드 (소염 및 사이토킨 억제제; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); 트라넥삼산(플라스미노겐 활성화 억제제; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284); T-614 (사이토킨 억제제; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); 프로스타글란딘 E1 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); 테니댑 (비스테로이드 소염 약물; Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280); 나프록센(비스테로이드 소염 약물; Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); 멜록시캠(비스테로이드 소염 약물); 이부프로펜(비스테로이드 소염 약물); 피록시캠(비스테로이드 소염 약물); 디클로페낙 (비스테로이드 소염 약물); 인도메타신(비스테로이드 소염 약물); 설파살라진(Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); 아자티오프린(Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); ICE 억제제(효소 인터류킨-1b 전환 효소의 억제제); zap-70 및/또는 lck 억제제 (타이로신 키나제 zap-70 또는 lck의 억제제); VEGF 억제제 및/또는 VEGF-R 억제제 (혈관 내피 세포 성장 인자 또는 혈관 내피 세포 성장 인자 수용체의 억제제; 혈관형성의 억제제); 코르티코스테로이드 소염 약물(예를 들어, SB203580); TNF-컨버타제 억제제; 항-IL-12 항체; 항-IL-18 항체; 인터류킨-11 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296); 인터류킨-13 (Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308); 인터류킨-17 억제제(Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S120); 금; 페니실라민; 클로로퀸; 클로람부실; 하이드록시클로로퀸; 사이클로스포린; 사이클로포스파미드; 총 림프계 조사; 항-흉선 글로불린; 항-CD4 항체; CD5-독소; 경구 투여된 펩타이드 및 콜라겐; 로벤자리트 이나트륨; 사이토킨 조절제(CRA) HP228 및 HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고-데옥시뉴클레오타이드(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); 가용성 보체 수용체 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); 프레드니손; 오르고테인; 글리코사미노글리캔 폴리설페이트; 미노사이클린; 항-IL2R 항체; 해양 및 식물 지질(어류 및 식물 종자 씨드 지방산; DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); 아우라노핀; 페닐부타존; 메클로페남산; 플루페남산; 정맥내 면역글로불린; 질레우톤; 아자리빈; 마이코페놀산(RS-61443); 타크롤리무스(FK-506); 시롤리무스 (라파마이신); 아미프릴로스(테라펙틴); 클라드리빈(2-클로로데옥시아데노신); 메토트렉세이트; 항바이러스제 및 면역 조절제.
한 양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 류마티스 관절염 치료를 위해 하기의 제제중 하나와 배합하여 투여된다: KDR (ABT-123)의 소분자 억제제, Tie-2의 소분자 억제제; 메토트렉세이트; 프레드니손; 셀레콕시브; 폴산; 하이드록시클로로퀸 설페이트; 로페콕시브; 에타너셉트; 인플릭시마브; 레플루노미드; 나프록센; 발데콕시브; 설파살라진; 메틸프레드니솔론; 이부프로펜; 멜록시캠; 메틸프레드니솔론 아세테이트; 금 나트륨 티오말레이트; 아스피린; 아자티오프린; 트리암시놀론 아세토니드; 프로프시펜 나프실레이트/apap; 폴레이트; 나부메톤; 디클로페낙; 피록시캠; 에토돌락; 디클로페낙 나트륨; 옥사프로진; 옥시코돈 hcl; 하이드로코돈 비타르트레이트/apap; 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨; 펜타닐; 아나킨라, 사람 재조합 트라마돌 hcl; 살살레이트; 설린닥; 시아노코발라민/fa/피리독신; 아세트아미노펜; 알렌드로네이트 나트륨; 프레드니솔론; 모르핀 설페이트; 리도카인 하이드로클로라이드; 인도메타신; 글루코사민 설페이트/콘드로이틴; 사이클로스포린; 아미트립틸린 hcl; 설파디아진; 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜; 올로파타딘 hcl; 미소프로스톨; 나프록센 나트륨; 오메프라졸; 미코페놀레이트 모페틸; 사이클로포스파미드; 리툭시마브; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; ABT-874; ABT-325 (항-IL 18); 항-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; 로플루밀라스트; IC-485; CDC-801; 및 메소프람.
본 발명의 결합 단백질이 배합될 수 있는 염증장병에 유용한 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 부데노사이드; 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린, 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라지드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장 인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 다른 사람 사이토킨 또는 성장 인자, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-15, IL-16, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF 등에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포 표면 분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드에 대한 항체와 조합될 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TNFα전환효소 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ)과 배합될 수 있다.
결합 단백질이 배합될 수 있는 크론병 치료제의 바람직한 예에는 다음과 같은 것이 있다: TNF 길항제, 예컨대 항-TNF 항체, D2E7(PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA® 아달리무마브), CA2(REMICADE® 인플릭시마브), CDP 571, TNFR-Ig 작제물, (p75TNFR1gG(ENBREL®etanercept) 또는 p55TNFR1gG(lenercept)) 억제제 및 PDE4 억제제. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 코르티코스테로이드, 예컨대 부데노사이드 및 덱사메타손과 배합될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산 및 올살라진과 같은 제제, 및 전염증성 사이토킨, 예컨대 IL-1, 예를 들어 IL-1β 전환효소 억제제 및 IL-1ra의 합성 또는 작용을 방해하는 제제와 배합될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 또한 T 세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 타이로신 키나제 억제제 6-머캅토퓨린과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 IL-11과 배합될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원 결합부는 메살라민, 프레드니손, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 인플릭시마브, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 디페녹실레이트/아트로프 설페이트, 로퍼아미드 하이드로클로라이드, 메토트렉세이트, 오메프라졸, 폴레이트, 시프로플록사신/덱스트로스-물, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 테트라사이클린 하이드로클로라이드, 플루오시노나이드, 메트로니다졸, 티메로살/붕산, 콜레스티라민/슈크로스, 시프로플록사신 하이드로클로라이드, 하이오시아민 설페이트, 메페리딘 하이드로클로라이드, 미다졸람 하이드로클로라이드, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 프로메타진 하이드로클로라이드, 인산나트륨, 설파메톡사졸/트리메토프림, 셀레콕시브, 폴리카르보필, 프로폭시펜 나프실레이트, 하이드로코르티손, 멀티비타민, 발살라지드 이나트륨, 코데인 포스페이트/메메, 콜레세벨람 hcl, 시아노코발라민, 엽산, 레보플록사신, 메틸프레드니솔론, 나탈리주마브 및 인터페론-감마와 배합될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 코르티코스테로이드; 메토트렉세이트; 4-아미노피리딘; 티자니딘; 인터페론-β1a(AVONEX®; Biogen); 인터페론-β1b(BETASERON®; Chiron/Berlex); 인터페론 α-n3(Interferon Sciences/Fujimoto), 인터페론-α(Alfa Wassermann/J&J), 인터페론 β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics), 페그인터페론 α2b(Enzon/Schering-Plough), 코폴리머 1(Cop-1; COPAXONE®글라티라머 아아세테이트(glatiramer acetate); Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); 고압 산소; 정맥내 면역글로불린; 클라브리빈; 다른 사람 사이토킨 또는 성장인자 및 이의 수용체, 예컨대 TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-23, IL-15, IL-16, EMAP-II, GM-CSF, FGF 및 PDGF에 대한 항체 또는 길항제. 본 발명의 결합 단백질은 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90과 같은 세포 표면 분자 또는 이의 리간드에 대한 항체와 조합될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 또한 제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노마이드, NSAID, 예컨대 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론, 포스포디에스터라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린작용제, TNFα 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨에 의한 시그날 전달을 방해하는 제제(예, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환효소 억제제, TACE 억제제, T-세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 용해성 사이토킨 수용체 및 이의 유도체(예, 용해성 p55 또는 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R) 및 소염성 사이토킨(예, IL-4, IL-10, IL-13 및 TGFβ)과 배합될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 바람직한 예에는 인터페론 β, 예컨대 IFNβ1a 및 IFNβ1b; 코팍손, 코르티코스테로이드, 카스파제 억제제, 예컨대 카스파제-1 억제제, IL-1 억제제, TNF 억제제 및 CD40 리간드 및 CD80에 대한 항체가 포함된다.
본 발명의 결합 단백질은 또한 제제, 예컨대 알렘투주마브, 드로나비놀, 유니메드, 다클리주마브, 미토크산트론, 크살리 프로덴 하이드로클로라이드, 팜프리딘, 글라티라머 아세테이트, 나탈리주마브, 신나비돌, a-임뮤노킨 NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, 케목킨 수용체 길항제, BBR-2778, 칼라구알린, CPI-1189, LEM(리포좀 캡슐화된 미토크산트론), THC.CBD(칸나비노이드 효능제) MBP-8798, 메소프람(PDE4 억제제), MNA-715, 항-IL-6 수용체 항체, 뉴로박스, 피르페니돈, 알로트랩 1258(RDP-1258), sTNF-R1, 탈람파넬, 테리플루노마이드, TGF-베타2, 티플리모타이드, VLA-4 길항제(예컨대, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, ANTEGREN® 나탈리주마브-ELAN/Biogen), 인터페론 감마 길항제, IL-4 효능제와 배합될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 협심증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 아스피린, 니트로글리세린, 이소소르비드 모노니트레이트, 메토프롤롤 석시네이트, 아테놀로, 메토프롤롤 타르트레이트, 암로디핀 베실레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 클로피도그렐 비설페이트, 니페디핀, 이토바스타틴 칼슘, 염화칼륨, 후로세미드, 심바스타틴, 베라파밀 hcl, 디곡신, 프로프라놀롤, 하이드로클로라이드, 카베딜롤, 리시노프릴, 스피로노락톤, 하이드로클로로티아지드, 에나라프릴 말레이트, 나돌로, 라미프릴, 에녹사파린 나트륨, 헤라핀 나트륨, 발사르탄, 소탈롤 하이드로클로라이드, 페노피브레이트, 에제티미브, 부메타니드, 로사탄 포타슘, 리시노프릴/하이드로클로로티아지드, 펠로디핀, 캅토프릴, 비소프롤롤 푸마레이트.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 강직 척추염 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 이브푸로펜, 디클로페낙 및 미소프로스톨, 나프록센, 멜록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 셀레콕시브, 로페콕시브, 설파살라진, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 미노시클린, 프레드니손, 에타너셉트, 인플릭시마브.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 천식 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 알부테롤, 살메테롤/플루티카손, 몬텔루카스트 나트륨, 플루티카손 프로피오네이트, 부데소니드, 프레드니손, 살메테롤 크시나포에이트, 레발부테롤 hcl, 알부테롤 설페이트/이프라트로퓸, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 이프라트로퓸 브로마이드, 아지트로마이신, 피르부테롤 아세테이트, 프레드니솔론, 무수 테오필린, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 클라리트로마이신, 자피르루카스트, 포르모테롤 푸마레이트, 인플루엔자 바이러스 백신, 메틸프레드니솔론, 아목시실린 트리하이드레이드, 플루니솔라이드, 알레르기 주사, 크로몰린 나트륨, 펙소페나딘 하이드로클로라이드, 플루니솔라이드/멘톨, 아목시실린/클라불라네이트, 레보플록사신, 흡입기 보조 장치, 구아이페네신, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 목시플록사신 hcl, 독시사이클린 하이클레이트, 구아이페네신/d-메토판, p-에페드린/cod/클로페니르, 가티플록사신, 세테리진 하이드로클로라이드, 모메타손 퓨로에이트, 살메테롤 신나포에이트, 벤조나테이트, 세팔렉신, pe/하이드로코돈/클로르페니르, 세티리진 hcl/슈도에페드, 페닐에프린/cod/프로메타진, 코데인/프로메타진, 세프프로질, 덱사메타손, 구아이페네신/슈도에페드린, 클로페니라민/하이드로코돈, 네도크로밀 나트륨, 테르부탈린 설페이트, 에피네프린, 메틸프레드니솔론, 메타프로테레놀 설페이트.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 COPD 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 알부테롤 설페이트/이프라트로퓸, 이프라트로퓸 브로마이드, 살메테롤/플루티카손, 알부테롤, 살메테롤 크시나포에이트, 플루티카손 프로피오네이트, 프레드니손, 무수 테오필린, 메틸프레드니솔론 나트륨 석시네이트, 몬텔루카스트 나트륨, 부데소니드, 포르모테롤 푸마레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 레보플록사신, 구아이페네신, 아지트로마이신, 베클로메타손 디프로피오네이트, 레발부테롤 hcl, 플루니솔라이드, 세프트리악손 나트륨, 아목시실린 트리하이드레이트, 가티플록사신, 자피르루카스트, 아목시실린/클라불라네이트, 플루니솔라이드/멘톨, 클로르페니라민/하이드로코돈, 메타프로테레놀 설페이트, p-데페드린/로라타딘, 테르부탈린 설페이트, 티오트로퓸 브로마이드, (R,R)-포르모테롤, TgAAT, 실로밀라스트, 로플루밀라스트.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 HCV 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 인터페론-알파-2a, 인터페론-알파-2b, 인터페론-알파 con1, 인터페론-알파-n1, 페길화된 인터페론-알파-2a, 페길화된 인터페론-알파-2b, 리바비린, 페그인터페론 알파-2b + 리바비린, 우르소데옥시콜린산, 글리시리진산, 티말파신, 막사민, VX-497 및 표적, 즉 HCV 폴리머라제, HCV 프로테아제, HCV 헬리카제, HCV IRES(내부 리보솜 진입 부위)의 간섭을 통해 HCV를 치료하는데 사용되는 임의의 화합물.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 특발폐섬유증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 프레드니손, 아자티오프린, 알부테롤, 콜히친, 알부테롤 설페이트, 디곡신, 감마 인터페론, 메틸프레드니솔론 sod succ. 로라제팜, 후로세미드, 리시노프릴, 니트로글리세린, 스피로놀락톤, 시클로포스파미드, 이프라트로퓸 브로마이드, 악티노마이신 d, 알테플라스, 플루티카손 프로피오네이트, 레보플록사신, 메타프로테레놀 설페이트, 몰핀 설페이트, 옥시코돈 hcl, 염화칼륨, 트리암시놀론 아세토나이드, 무수 태크로리무스, 칼슘, 인터페론-α, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 모페틸, 인터페론-감마-1β.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 심근경색 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 아스피린, 니트로글리세린, 메토프롤롤 타르트레이트, 에녹사파린 나트륨, 헤파린 나트륨, 클로피도그렐 비설페이트, 카베딜롤, 아테놀롤, 몰핀 설페이트, 메토프롤롤 석시네이트, 워파린 나트륨, 리시노프릴, 이소소르비드 모노니트레이트, 디곡신, 후로세미드, 심바스타틴, 라미프릴, 테넥테플라스, 에나라프릴 말레이트, 토르세미드, 레타바스, 로사탄 포타슘, 퀴나프릴 hcl/mag carb, 부메타니드, 알테플라스, 아날라프릴라트, 아미오다론 하이드로클로라이드, 티로피반 hcl m-하이드레이트, 딜티아젬 하이드로클로라이드, 캡토프릴, 이르베사탄, 발사탄, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드, 호시노프릴 나트륨, 리도카인 하이드로클로라이드, 엡티피바타이드, 세파졸린 나트륨, 아트로핀 설페이트, 아미노카프린산, 스피로노락톤, 인터페론, 소탈롤 하이드로클로라이드, 염화칼륨, 도큐세이트 나트륨, 도부타민 hcl, 알프라졸람, 프라바스타틴 나트륨, 아토바스타틴 칼슘, 미다졸람 염삼염, 메페리딘 하이드로클로라이드, 이소소르비드 디니트레이트, 에피네프린, 도파민 하이드로클로라이드, 비파리루딘, 로수바스타틴, 엑제티미브/심바스타틴, 아바시미브, 카리포라이드.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 건선 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: KDR(ABT-123)의 소분자 억제제, Tie-2의 소분자 억제제, 칼시포트리엔, 클로베타솔 프로피오네이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 할로베타솔 프로피오네이트, 타자로텐, 메토트렉세이트, 플루오시노나이드, 베타메타손 diprop 보강형, 플루오시놀론 아세토나이드, 아시트레틴, 타르 샴푸, 베타메타손 발레레이트, 모메타손 후로에이트, 케토코나졸, 프라목신/플루오시놀론, 하이드로코르티손 발레레이트, 플루안드레놀라이드, 우레아, 베타메타손, 클로베타솔 프로피오네이트/에몰, 플루티카손 프로피오네이트, 아지트로마이신, 하이드로코르티손, 보습 포뮬라, 엽산, 데소니드, 피메크로리무스, 콜타르, 디플로라손 디아세테이트, 에타너셉트 폴레이트, 젖산, 메톡살렌, hc/비스무스 subgal/znox/resor, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 선스크린, 할시노나이트, 살리실산, 안트랄린, 클로코르톨론 피발레이트, 석탄 추출물, 콜타르/살리실산, 콜타르/살리실산/황, 데속시메타손, 디아제팜, 피부연화제, 플루오시노나이드/피부연화제, 광유/피마자유/na lact, 광유/땅콩유, 석유/이소프로필 미리스테이트, 프소랄렌, 살리실산, 비누/트리브롬살란, 티메로살/붕산, 셀레콕시브, 인플릭시마브, 사이클로스포린, 알레파셉트, 에팔리주마브, 태크로리무스, 피메크로리무스, PUVA, UVB, 설파살라진.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 건선 관절염 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 메토트렉세이트, 에타너셉트, 로페콕시브, 셀레콕시브, 엽산, 설파살라진, 나프록센, 레플루노미드, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 인도메타신, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 프레드니손, 설린닥, 베타메타손 diprop 보강형, 인플릭시마브, 메토트렉세이트, 폴레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 디클로페낙, 디메틸설폭사이드, 피록시캄, 디클로페낙 나트륨, 케토프로펜, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론, 나부메톤, 톨메틴 나트륨, 칼시포트리엔, 사이클로스포린, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 플루오시노나이드, 글루코사민 설페이트, 골드 나트륨 티오말레이트, 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 이부프로펜, 리세드로네이트 나트륨, 설파디아진, 티오구아닌, 발데콕시브, 알레파셉트, 에팔리주마브.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 재협착증 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 시로리무스, 파클리탁셀, 에버로리무스, 태크로리무스, ABT-578, 아세타미노펜.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 좌골신경통 치료제의 비제한적 예에는 다음과 같은 것이 있다: 하이드로코돈 비타르트레이트/apap, 로페콕시브, 시클로벤자프린 hcl, 메틸프레드니솔론, 나프록센, 이부프로펜, 옥시코돈 hcl/아세타미노펜, 셀렉코시브, 발데콕시브, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 프레드니손, 코데인 포스페이트/apap, 트라마돌 hcl/아세타미노펜, 메탁사론, 멜록시캄, 메토카르바몰, 리도카인 하이드로클로라, 디플로페낙 나트륨, 가바펜틴, 덱사메타손, 카리소프로돌, 케토롤락 트로메타민, 인도메타신, 아세타미노펜, 디아제팜, 나부메톤, 옥시코돈 hcl, 티자니딘 hcl, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 프로폭시펜 냅실레이트/apap, asa/oxycod/옥시코돈 ter, 이부프로펜/하이드로코돈 bit, 트라마돌 hcl, 에토돌락, 프로폭시펜 hcl, 아미트립틸린 hcl, 카리소프로돌/코데인 phos/asa, 몰핀 설페이트, 멀티비타민, 나프록센 나트륨, 오르페나드린 시트레이트, 테마제팜.
본 발명의 결합 단백질과 배합될 수 있는 SLE(루푸스) 치료제의 바람직한 예에는 다음과 같은 것이 있다: NSAID, 예컨대 디클로페낙, 나프록센, 이부프로펜, 피록시캄, 인도메타신; COX2 억제제, 예컨대 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브; 항말라리아제, 예컨대 하이드록시클로로퀸; 스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 부데노사이드, 덱사메타손; 세포독성제, 예컨대 아자티오프린, 시클로포스파미드, 미코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트; PDE4 억제제 또는 퓨린 합성 억제제, 예컨대 셀레셉트. 본 발명의 결합 단백질은 또한 설파살라진, 5-아미노살리실산, 올살라진, 이뮤란 및 IL-1과 같은 전염증성 사이토킨의 합성, 생산 또는 작용을 방해하는 제제, 예컨대 IL-1β 전환효소 억제제 및 IL-1ra와 같은 카스파제 억제제와 배합될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 또한 T 세포 시그날 전달 억제제, 예컨대 티로신 키나제 억제제; 또는 T 세포 활성화 분자를 표적으로 하는 분자, 예컨대 CTLA-4-IgG 또는 항-B7계 항체, 항-PD-1계 항체 등과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 IL-11 또는 항사이토킨 항체, 예컨대 포노토리주마브(항-IFNg 항체) 또는 항수용체 항체, 예컨대 항-IL-6 수용체 항체 및 B-세포 표면 분자에 대한 항체와 조합될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부는 LJP 394(아베티무스), B-세포를 불활성화시키거나 고갈시키는 제제, 예컨대 리툭시마브(항-CD20 항체), LYMPHOSTAT-B®(항-BlyS 항체), TNF 길항제, 예컨대 항-TNF 항체, D2E7(PCT 공개 WO 97/29131; HUMIRA® 아달리무마브), CA2(REMICADE® 인플릭시마브), CDP571, TNFR-Ig 작제물(P75TNFRIgG(ENBREL® etarnercept) 및 p55TNFRIgG(lenercept))와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란 용어는 원하는 치료 결과를 수득하기 위한 투여량과 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 상기 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 당업자라면 결정할 수 있는 것으로서, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 원하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 수득하기 위한 투여량 및 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질병의 초기 단계전이나 초기 단계에 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.
투여 계획은 원하는 최적 반응(예컨대, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 1회의 일시주사를 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료하는 포유동물 피검체에 대하여 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 따라서, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.
본 발명의 결합 단백질의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한의 예시적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg 이다. 또한, 투여량 값은 개체의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 예시적일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 명심해야 한다.
본원에 기재된 발명의 방법이 기타 적합하게 변형되고 적용될 수 있고 본 발명의 범위 또는 본원에 기재된 양태로부터 벗어나지 않고서도 적합한 등가물을 사용하여 변형되고 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 현재 본 발명을 상세하게 설명했고 이와 동일하게 하기의 실시예를 참조로 보다 명백하게 이해될 수 있을 것이고 당해 실시예는 설명을 목적으로 포함된 것이지 본 발명을 제한하고자 한 것은 아니다.
실시예 1: 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)의 생성
이원 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자를 2종의 상이한 모(母) mAb로부터의 2종의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 직접 또는 짧은 링커를 통해서 재조 합 DNA 기술에 의해 직렬로 연결되고 이어서 경쇄 불변 도메인이 연결되도록 고안한다. 마찬가지로, 중쇄는 직렬로 연결된 2종의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)에 이어서 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다(도 1A).
실시예 1.1: IL-1α 및 IL-1β에 대한 쥐 모노클로날 항체의 생성
IL-1α 및 IL-1β에 대한 모노클로날 항체를 당업계에 익히 공지된 하이브리도마 기술을 사용하여 다음과 같이 생성시켰다.
실시예 1.1.A: 마우스의 면역화
정제된 재조합 사람 IL-1α 및 쥐 IL-1β(R&D Systems)를 역가 검정 및 스크리닝 ELISA에서 면역원 및 피복 항원으로서 사용하였다. 면역화 용량은 1차 면역화 및 부스트 면역화 둘다에 대해 5.0 내지 20.0㎍/마우스/주사의 범위였다. IMMUNEASYTM 보조제를 퀴아겐(Qiagen)(Waltham, MA)으로부터 구입하고 10.0㎍ 항원당 20ml IMMUNEASYTM 보조제의 보조제/항원 비로 사용하였다. 요이치로 이와쿠라 박사(University of Tokyo, Minato-ku, Tokyo, Japan)로부터 입수한 5마리의 IL-1αβ KO 마우스를 포함하는 각 동물 그룹을 면역화시켰다. 마우스는 하기 기술하는 투여 스케줄에 따라서 면역화시켰다. MRC-5 세포는 ATCC(Manassas, VA)로부터 입수하여 IL-1 생물검정을 위해 사용하였다. 사람 IL-8 ELISA 키트 및 대조군 마우스 항-hIL-1α 및 β 항체(MAB200 및 MAB201)는 R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입하였다.
간략하게 언급하면, 먼저 바이알 내의 보조제를 보텍스(vortex)를 사용하여 가볍게 혼합하여 보조제-항원 혼합물을 제조하였다. 목적하는 양의 보조제를 바이알로부터 제거하여 오토클레이브된 1.5mL 마이크로원심관에 넣었다. 항원을 PBS 또는 염수 중에서 0.5 내지 1.0 mg/ml 범위의 농도로 제조하였다. 이어서, 계산된 양의 항원을 보조제를 함유한 마이크로원심관에 부가하고, 용액을 상하로 5회 가볍게 피펫팅하여 혼합하였다. 보조제-항원 혼합물을 실온에서 15분 동안 항온처리한 다음, 상하로 5회 가볍게 피펫팅하여 다시 혼합하였다. 보조제-항원 용액을 동물 주사용으로 적절한 주사기내로 흡인해 넣었다. 총 5 내지 20㎍의 항원을 50 내지 100㎕의 용적 중에서 주사한다. 각 동물을 면역화시킨 다음, 역가에 따라서 2 내지 4회 부스트시켰다. 역가가 우수한 동물을 융합 및 하이브리도마의 생성 전에 최종 정맥내 부스트시켰다.
실시예 1.1.B: 하이브리도마의 스크리닝:
상기한 바와 같이 생성시킨 하이브리도마를 스크리닝하고 ELISA를 사용하여 항체 역가를 측정하였다: 단백질 항원을 표준 ELISA 과정을 사용하여 특이적 항체를 검출하기 위해 ELISA 플레이트에 직접 피복시켯다. 간략하게 언급하면, ELISA 플레이트를 4℃에서 100㎕의 rhIL-1α 또는 rhIL-1β(1.0㎍/ml in PBS)으로 밤새 피복시켰다. 플레이트를 250㎕ PBS/0.5% TWEEN®20 폴리에틸렌-소르비탄 모노라우레이트로 3회 세척하고 200㎕ 차단 완충액(0.5% TWEEN®20 폴리에틸렌-소르비탄 모노라우레이트)를 함유한 PBS 중의 2% BSA)으로 차단하였다. 희석된 혈청 또는 하이브리도마 상청액(100㎕)을 각 웰에 부가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 PBS/0.5% TWEEN®20 폴리에틸렌-소르비탄 모노라우레이트로 3회 세척하였다. HRP-염소 항-쥐 IgG를 검출용으로 사용하고, 결합 OD를 450nm에서 관찰하였다. ELISA에서 높은 특이적 활성을 나타낸 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 서브클로닝하고 정제하고, 당해 항체의 친화성(비아코어(Biacore)) 및 효능(MRC-5 생물검정)을 다음과 같이 특성 규명하였다.
실시예 1.1.C: IL-1α 및 IL-1β에 대한 쥐 모노클로날 항체의 특성 규명:
다음의 검정을 사용하여 실시예 1.1.B에 기술한 하이브리도마에 의해 생산된 항체를 특성 규명하였다.
실시예 1.1.C.1: 표면 플라스몬 공명:
포획된 항체(염소 항-마우스 IgG를 통해서 바이오센서 매트릭스상에 포획된 마우스 항-rmIL1 항체)와 rmIL1 항체 사이의 실시간 결합 상호작용을 제조업자의 지침 및 표준 과정에 따라서 비아코어(BIAcore) 시스템(제조원: Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 표준 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 간략하게, rmIL-1를 HBS 전개 완충액(running buffer)(Biacore AB)에 희석시키고, 50㎕ 분취액을 고정화된 단백질 매트릭스를 통해서 5 ml/분의 유속으로 주입하였다. 사용된 rhIL1의 농도는 62.5, 125, 187.5, 250, 375, 500, 750, 1000, 1500 및 2000 nM이였다. 해리 상수(해리 속도)를 측정하기 위해, 비아코어 동역학적 평가 소프 트웨어(version 3.1)를 사용하였다.
실시예 1.1.C.2: 항-IL-1 생물검정:
MRC-5 세포주는 용량 의존적 방식으로 사람 IL-1α 및 IL-1β에 반응하여 IL-8을 생산하는 사람 폐 섬유모세포 세포주이다[참조: Dinarello, C. A., K. Muegge, and S. K. Durum. 2000. Current Protocols in Immunology 6:1]. MRC-5 세포를 10% FBS 완전 MEM에서 배양하고 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 성장시켰다. 재조합 사람 IL-1α 또는 IL-1β에 대한 mAb의 중화 효능을 측정하기 위해, 상이한 농도(0 내지 10㎍/ml)의 mAb(50㎕)를 96웰 플레이트에 부가하고 50㎕의 rhIL-1α 또는 rhIL-1β (10 내지 50 pg/ml)와 함께 37℃에서 1시간 동안 사전항온처리하였다. 상청액을 수거하고 희석시키고 IL-8 농도를 표준 IL-8 ELISA 키트 (R&D Systems)를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 항체 효능을 MRC-5 세포에 의한 IL-8 생산을 억제하는 이의 능력으로 측정하였다.
비아코어 및 MRC-5 생물검정을 토대로 하여, 높은 친화성 및 효능을 갖는 수많은 쥐 항-hIL-1α 및 항-hIL-1β 항체가 동정되었고, 이를 하기 표 1에 제시한 다:
Figure 112008012399231-pct00001
실시예 1.1.D: IL-1α 및 IL-1β에 대한 쥐 모노클로날 항체의 클로닝 및 서열분석:
표 1에 기재된 모든 항-IL-1α/β mAb 및 부가적 항체의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 유전자의 클로닝 및 서열분석을, 제조업자의 지침에 따라서 TRIZOL® 시약(Invitrogen)을 사용하여 각 하이브리도마 세포주로부터의 전체 RNA의 분리 및 정제한 후에 수행하였다. VH 및 VL 유전자 둘다의 증폭을 제조업자가 제시한 바와 같이 1-튜브 RT-PCR 키트(Qiagen)를 사용하여 마우스 Ig-프라이머 세트(Novagen, Madison, WI)로부터의 IgGVH 및 IgκVL 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다. 생산적 증폭으로부터 수득된 DNA 단편을 제조업자의 지침에 따라서 pCR-TOPO® 벡터(Invitrogen)내로 클로닝하였다. 이어서, 다수의 VH 및 VL 클론을 ABI 3000 서열분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디데옥시 쇄 종결 방법으로 서열분석하였다. 모든 mAb VL 및 VH 유전자의 서열은 하기 표 2에 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00002
Figure 112008012399231-pct00003
실시예 1.2: 쥐-사람 키메릭 항체의 생성 및 특성 규명
상기한 모든 mAb를 키메릭 항체(사람 불변 영역을 가짐)로 전환시키고, 발현시키고, 정제하고, 능력을 확인하기 위해 특성 규명하고, 후속적 DVD-Ig 분석을 위한 대조군으로서 사용한다. 3D12.E3를 키메릭 형태로 전환시키기 위해, 3D12.E3-VL을 프라이머 P1 및 P2을 사용하여 증폭시켰다; 한편, 사람 Ck 유전자(ABC에서 당사에서 제조된 pBOS 벡터)를 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P1 및 P4를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 키메릭 경쇄 3D12.E3-VL-hCk를 제조업자의 지침에 따라서 TOPO® 벡터 클로닝에 의해 pEF6 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)내로 서브클로닝하였다. 하기 표 3에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00004
3D12.E3 중쇄를 키메릭 형태로 전환시키기 위해, 3D12.E3-VH를 프라이머 P5 및 P6을 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, 사람 Cγ1 유전자(ABC에서 당사에서 제조된 pBOS 벡터)를 프라이머 P7 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P5 및 P8을 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 키메릭 경쇄 3D12.E3-VH-hCγ1을 제조업자의 지침에 따라서 pcDNA3.1 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)내로 서브클로닝하였다. 하기 표 4에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00005
마찬가지로, 키메릭 13F5.G5-VH-Cγ1을 프라이머 P21/P22(VH의 경우) 및 P7/P8 (hCγ1의 경우)를 사용하여 생성시키고 pcDNA3.1 TOPO® 벡터내로 클로닝하고 키메릭 13F5.G5-VL-Cκ를 프라이머 P23/P24 (VL의 경우) 및 P3/P4(hCk의 경우)를 사용하여 생성시키고 pEF6 TOPO® 벡터내로 클로닝하였다. 하기 표 5에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00006
키메릭 Ab를 발현시키기 위해, 13F5.G5-VL-Cκ 및 13F5.G5-VH-Cγ1을 72시간 동안 LIPOFECTAMINE® 형질감염 시약(Invitrogen)을 사용하여 COS 중에서 공동 발현시키고, 배지를 수거하고 IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 유사하게, 13F5.G5-VL-Cκ 및 13F5.G5-VH-Cγ1를 72시간 동안 LIPOFECTAMINE® 형질감염 시약(Invitrogen)을 사용하여 COS 중에서 공동 발현시키고, IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 2종의 정제된 키메릭 Ab 모두를 비아코어 및 MRC-5 생물검정에 의해 특정 규명하여 활성을 확인하였다. 당해 결과는 이들 키메릭 Ab가 본래의 쥐 mAb의 것과 유사한 친화성 및 효능을 나타냈음을 보여주었다.
실시예 1.3: IL-1α/β 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig)의 작제, 발현 및 정제
hIL-1α 및 hIL-1β에 결합할 수 있는 DVD-Ig를 생성시키는데 사용되는 작제물은 도 1B에 도시한다. 간략하게 언급하면, 2종의 고 친화성 쥐 Ab, 항-hIL-1α(클론 3D12.E3) 및 항-hIL-1β(클론 13F5.G5)를 포함하는 모 mAb를 Balb/c 마우스 를 각각 재조합 IL-1α 단백질 (rhIL-1α) 및 재조합 IL-1β 단백질(rhIL-1β)로 면역화시킴에 의해 수득하였다. 이들 2종의 하이브리도마 클론의 VL/VH 유전자를 마우스 Ig 프라이머 키트(Novagen, Madison, WI)를 사용하여 RT-PCR로 분리시켰다. 먼저, VL/VH 유전자를 키메릭 항체(사람 불변 영역을 가짐)로 전환시켜 활성 및 효능을 확인하였다. DVD1-Ig를 생성시키기 위해, 13F5.G5의 VH 및 VL을 각각 3D12.E3의 VH 및 VL의 N-말단에 직접 융합시켰다(도 1B에 도시된 바와 같음). DVD2-Ig를 유사하게 작제하되, 단 경쇄(링커 서열은 ADAAP(서열번호 40)이다) 및 중쇄(링커 서열은 AKTTPP(서열번호 38)이다) 둘다 내의 2개의 가변 도메인 사이에 링커를 갖도록 하였다. 이들 서열을 쥐 Ck 및 CH1 서열의 N-말단으로부터 선별하였다. 쥐 Ck 및 CH1의 N-말단으로부터 선별된 이들 링커 서열은 가변 도메인의 천연 신장부(extension)이고 몇가지 Fab 결정 구조의 분석에 근거하여 유의적 2차 구조를 갖지 않는 유동적 입체형태를 나타낸다. PCR 클로닝의 상세한 과정은 하기에 기술한다.
실시예 1.3.A: hIL-1α/bDVD1-Ig의 분자적 클로닝:
13F5.G5-VH를 프라이머 P21 및 P25를 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, 3D12.E3-VH-hCγ1을 프라이머 P14 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P21 및 P8을 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 DVD1-Ig 중쇄 hIL-1α/bDVD1-VH-hCγ1을 제조업자의 지침에 따라서 pcDNA3.1 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)내로 서브클로닝하였다. 하기 표 6에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00007
hIL-1α/βDVD1-Ig 경쇄를 생성시키기 위해, 13F5.G5-VL을 프라이머 P23 및 P26을 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, 3D12.E3-VL-hCκ를 프라이머 P16 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P23 및 P4를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 hIL-1α/bDVD1-Ig 경쇄 hIL-1α/bDVD1-VL-hCκ을 제조업자의 지침에 따라서 pEF6 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)내로 서브클로닝하였다. 하기 표 7에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00008
실시예 1.3.B: hIL-1α/bDVD2-Ig의 분자적 클로닝:
13F5.G5-VH를 프라이머 P21 및 P17을 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, 3D12.E3-VH-hCγ1을 프라이머 P18 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P21 및 P8을 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 DVD2-Ig 중쇄 hIL-1α/bDVD2-VH-hCγ1을 제조업자의 지침에 따라서 pcDNA3.1 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen)내로 서브클로닝하였다. 하기 표 8에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00009
hIL-1α/βDVD2-Ig 경쇄를 생성시키기 위해, 13F5.G5-VL을 프라이머 P23 및 P19를 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, 3D12.E3-VL-hCκ를 프라이머 P20 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머 P23 및 P4를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 산물인 hIL-1α/bDVD2-Ig 경쇄 hIL-1α/bDVD2-VL-hCκ를 제조업자의 지침에 따라서 pEF6 TOPO® 포유동물 발현 벡터(Invitrogen) 내로 서브클로닝하였다. 하기 표 9에 PCR 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00010
hIL-1α/bDVD1-Ig 및 hIL-1α/bDVD2-Ig의 최종 서열을 표 10에 기술한다.
Figure 112008012399231-pct00011
Figure 112008012399231-pct00012
Figure 112008012399231-pct00013
Figure 112008012399231-pct00014
실시예 1.3.C: hIL-1α/βDVD1-Ig의 발현 및 정제
각 작제물의 중쇄 및 경쇄를 각각 pcDNA3.1 TOPO® 및 pEF6 TOPO® 벡터 (Invitrogen Inc.)내로 서브클로닝하고, 정확성을 보장하기 위해 서열분석하였다. 각 작제물의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 COS 세포 및 사람 배아 신장 293 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, Manassas, VA)) 내에서 각각 리포펙타민(LIPOFECTAMINE) 2000 및 293펙틴 시약을 사용하여 일시적으로 발현시켰다. 세포 배양 배지를 일시적 형질감염시킨지 72시간 후에 수거하고, 항체를 제조업자의 지침에 따라서 단백질 A 크로마토그래피(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 정제하였다. Ab를 SDS-PAGE로 분석하고 A280 및 BCA(Pierce, Rockford, IL)로 정량하였다. 표 11은 hIL-1α/bDVD1-Ig 및 hIL-1α/bDVD2-Ig의 발현 수준이 키메릭 Ab의 발현 수준에 필적함을 보여주며, 이는 DVD-Ig가 포유동물 세포에서 효율적으로 발현될 수 있음을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00015
실시예 1.4: hIL-1α/b DVD-Ig의 질량 분광분석 및 SEC 분석
DVD-Ig의 중쇄 및 경쇄의 분자량(MW)를 측정하기 위해, DVD-Ig 10㎕(0.8 ㎍/㎕)를 1.0M DTT 용액(5㎕)으로 환원시켰다. PLRP-S, 8u, 4000A, 및 1x150 mm 단백질 컬럼(Michrom BioResource, Auburn, MA)을 사용하여 DVD-Ig의 중쇄 및 경쇄를 분리시켰다. Agilent HP1100 Capillary HPLC (Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)를 질량 분광계 QSTAR®(Applied Biosystems, Foster City, CA)와 함께 사용하였다. 샘플을 탈염시키기 위해 발코(valco) 밸브를 10분으로 설정하여 유동을 폐기물로부터 MS로 전환시켰다. 완충액 A는 0.02% TFA, 0.08% FA, 0.1% ACN 및 99.8% HPLC-H2O였다. 완충액 B는 0.02% TFA, 0.08% FA, 0.1% HPLC-H2O, 및 99.8% ACN을 함유하였다. HPLC 유속은 50㎕/분이였으며, 샘플 주입 용량은 8.0 mL였다. 컬럼 오븐의 온도는 60℃로 설정하였고, 분리 구배는 5분 동안 5% B; 35분 동안 5% B에서 65% B; 다시 5분 동안 65% B에서 95% B, 및 5분 동안 95% B에서 5% B였다. TOFMS 스캔은 800 내지 2500 amu이고, 사이클은 3600회였다. 전체길이 DVD-Ig의 MW를 측정하기 위해, 단백질 MICROTRAPTM 카트리지(Michrom BioResource, Auburn, MA)를 샘플을 탈염시키는데 사용하였다. HPLC 구배는 5분 동안 5% B; 1분 동안 5% B에서 95% B; 및 4분 동안 95% B에서 5% B였다. QSTAR TOFMS 스캔은 2000 내지 3500 amu이고, 사이클은 899회였다. 모든 MS 미처리 데이타를 Analyst QS 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. DVD-Ig의 SEC 분석을 위해, PBS 중의 정제된 DVD-Ig 및 키메릭 Ab를 Superose 6 10/300 G2, 300 x 10 mm 컬럼(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)에 적용시켰다. HPLC 기기, 모델 10A (Shimadzu, Columbia, MD)를 SEC용으로 사용하였다. 모든 단백질을 280 nm 및 214 nm에서 UV 검출을 사용하여 측정하였다. 용출은 0.5 mL/분의 유속에서의 등용매 용출이였다. 안정성 연구를 위해, PBS 중의 0.2 내지 0.4 mg/ml 농도 범위의 샘플을 -80℃ 내지 25℃에서 3회의 동결-해동 사이클에 도입시키거나 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 4주 및 8주동안 항온처리한 다음, SEC 분석하였다.
DVD-Ig 및 키메릭 Ab를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 수율(3 내지 5mg/L)은 각 단백질에 대한 발현 배지의 hIgG 정량치와 일치하였다. 정제된 DVD-Ig 및 키메릭 Ab의 조성 및 순도를 환원 조건 및 비환원 조건 둘다에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 비환원 조건하에, 4종의 단백질 각각은 단일 밴드로서 이동하였다. DVD-Ig 단백질은 예상한대로 키메릭 Ab보타 큰 M.W.를 나타냈다. 비환원 조건하에 4종의 단백질 각각은 2개의 밴드, 즉 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 산출하였다. 다시, DVD-Ig의 중쇄 및 경쇄는 크기가 키메릭 Ab의 크기보다 컸다. SDS-PAGE는 각각의 DVD-Ig가 단일 종으로서 발현되고, 중쇄 및 경쇄가 효율적으로 쌍을 이루어 IgG-유사 분자를 형성하였음을 나타냈다. 두 DVD-Ig 분자의 중쇄 및 경쇄 뿐만 아니라 전체길이 단백질의 크기는 아미노산 서열을 기초로 한 이들의 분자량 계산치와 일치한다(표 11 참조).
DVD-Ig의 정확한 분자량을 측정하기 위해, 질량 분광분석법을 사용하였다. 표 I에 제시한 바와 같이, 경쇄, 중쇄 및 전체길이 단백질을 포함하는 각 DVD-Ig의 실험에 의해 측정된 분자량은 예측된 값과 잘 일치한다. 용액 중에서 DVD-Ig의 물리적 특성을 추가로 연구하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 각 단백질을 분석하였다. 키메릭 Ab 및 DVD2-Ig는 둘다 단량체 단백질로서 물리적 상동성을 입증하는 단일 피크를 나타냈다. 3D12.E3 키메릭 Ab는 13F5.G5 키메릭 Ab보다 작은 물리적 크기를 나타냈는데, 이는 3D12.E3 키메릭 Ab가 보다 조밀한 구상 형태를 채택하였음을 가리킨다. DVD1-Ig는 우측에서 주요 피크 뿐만 아니라 숄더 피크(shoulder peak)를 나타냈는데, 이는 DVD1-Ig의 일부분이 당해 완충액 조건하에 응집된 형태로 존재할 수 있음을 시사한다.
실시예 1.5: hIL-1α/β DVD-Ig의 시험관내 안정성의 분석
DVD-Ig의 물리적 안정성을 다음과 같이 시험하였다. PBS 중의 0.2 내지 0.4 mg/ml 농도 범위의 정제된 항체를 -80℃ 내지 25℃에서 3회의 동결-해동 사이클에 도입시키거나 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 4주 및 8주 동안 항온처리한 다음, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다(표 12 참조).
Figure 112008012399231-pct00016
두 키메릭 Ab는 모두, 통상의 IgG 분자에 있어 정상적인 것인 소량의 응집 및 단편화를 나타냈다. DVD1-Ig는 정제 후에 SEC상에서 약간의 응집을 나타냈다. 안정성 분석에서는, DVD1-Ig는 상이한 조건하에 PBS 중에서도 응집을 나타냈다; 그러나, DVD1-Ig의 응집된 형태의 비율은 연장된 저장 동안에 또는 보다 고온에서 증가하지 않았다. DVD1-Ig의 단편화된 형태의 비율은 정상 범위 내에 있었으며, 키메릭 3D12.E3 Ab의 것과 유사하였다. 대조적으로, DVD2-Ig는 매우 우수한 안정성을 나타냈다. 모든 시험된 조건하에 DVD2-Ig의 경우에 응집 또는 단편화중 어떠한 것도 검출되지 않았으며, 100%의 DVD2-Ig가 온전한 단량체성 분자로서 유지되었다.
실시예 1.6: hIL-1α/bDVD-Ig의 항원 결합 친화성의 측정
rhIL1-α 및 rhIL1-β에 대한 DVD-Ig 결합의 동역학을 25℃에서 HBS-EP (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 비아코어 3000 기기(제조원: Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 표면 플라스몬 공명-기반 측정으로 측정하였다. 모든 화학물질은 비아코어 AB (Uppsala, Sweden)로부터 또는 본원에 기술한 그밖의 다른 공급원으로부터 입수하였다. 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)에 희석된 약 5000 RU의 염소 항-사람 IgG Fcg 단편 특이적 폴리클로날 항체(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)를 제조업자의 지침에 따라서 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 조사 등급 바이오센서 칩을 가로질러 25 mg/ml으로 직접 고정화시켰다. 바이오센서 표면상의 미반응된 잔기를 에탄올아민으로 차단하였다. 유동셀(flowcell) 2 및 4 내의 변형된 카복시메틸 덱스트란 표면을 반응 표면으로서 사용하였다. 유동셀 1 및 3 내의 염소 항-사람 IgG를 함유하지 않는 미변형된 카복시메틸 덱스트란을 참조 표면으로서 사용하였다. 동역학적 분석을 위해, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델로부터 추론된 속도식을 Bioevaluation 4.0.1 소프트웨어를 사용하여 모든 10개의 주입물의 결합 및 해리 상(전체적 핏트(fit) 분석을 사용)에 동시에 핏트시켰다. 정제된 DVD-Ig 샘플을 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 반응 표면을 가로지르는 포획을 위해 HEPES-완충된 염수에 희석시키고 5 ml/분의 유속으로 반응 매트릭스 위에 주입하였다. 결합 및 해리 속도 상수, kon (M-1s-1) 및 koff (s-1)를 25 ml/분의 연속적 유속적 하에 측정하였다. 속도 상수를 1.25 내지 1000 nM 범위의 10가지의 상이한 항원 농도에서 동역학적 결합을 측정하여 추론하였다. 이어서, DVD-Ig와 rhIL1a/b 사이의 평형 해리 상수(M)를 하기 식에 의해 동역학 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. 또한, rhIL1a/b 샘플의 분취량을 블랭크 참조 및 반응 CM 표면 위에 동시에 주입하여 임의의 비특이적 결합 배경값을 기록하고 이를 공제함으로써, 대다수의 굴절율 변화 및 주입 노이즈(injection noise)를 제거하였다. 후속적으로 10mM 글리신(pH 1.5) 25ml을 5 ml/분의 유속으로 2회 주입하여 표면을 재생시켰다. 표면에 고정화된 항-Fc 항체는 완전히 재생되었고 12회의 사이클에 걸쳐서 이의 전체적 포획 능력을 유지하였다. 포획된 DVD-Ig-rhIL1α/β 복합체의 겉보기(apparent) 화학량론을 포화 결합 조건(항정상태 평형)하에 다음 식을 사용하여 계산하였다:
Figure 112008012399231-pct00017
비아코어 분석은 키메릭 Ab가 본래의 하이브리도마 mAb로서 IL-1과 유사한 결합 동역학 및 친화성을 지녔음을 나타냈고, 이는 정확한 VL/VH 서열이 분리되었음을 나타낸다(표 III). hIL-1α에 대한 2종의 DVD-Ig의 전반적 결합 파라메터는 유사했으며, DVD-Ig의 친화성은 키메릭 3D12.E3 Ab의 친화성보다 단지 2 내지 3배 작았다. hIL-1β에 대한 DVD2-Ig의 결합 친화성은 키메릭 Ab 13F5.G5의 결합 친화성보다 다소 작았지만, DVD1-Ig의 결합 친화성보다는 3배 높았다. IL-1에 대한 화학량론의 평가로 나타난 바에 따르면, hIL-1에 대한 2종의 DVD-Ig의 친화성은 hIL-1에 대한 키메릭 Ab의 친화성과 비교해 유사하였다. 2가 일특이적인 두 키메릭 Ab 모두는 각각 1.6 및 1.7의 화학량론으로 Biocore 상의 IL-1α 및 IL-1β에 결합하였다. 이는, 항체가 비아코어 센서 칩상에 조밀하게 고정화되어 화학량론이 1.5 내지 2.0의 범위가 되는 경우에 분자간 계면으로 인해서 IgG에 있어 통상적인 것이다. hIL-1α 및 hIL-1β에 대한 2종의 DVD-Ig의 화학량론은 2종의 키메릭 Ab의 것과 유사하였으며, 이는 2종의 DVD-Ig 모두가 각 항원에 대한 2가 결합 능력을 지녔음을 나타낸다.
Figure 112008012399231-pct00018
또한, DVD-Ig의 4가 이중-특이적 항원 결합을 비아코어에 의해 분석하였다(표 14). DVD-Ig를 먼저 비아코어 센서 칩상에서 염소 항-사람 Fc 항체를 사용하여 포획하고, 제1 항원을 주입하고 결합 시그날을 관찰하였다. DVD-Ig가 제1 항원에 의해 포화됨에 따라, 제2 항원을 주입하고 제2 시그날을 관찰하였다. 이것은 DVD2-Ig의 경우에 IL-1β를 먼저 주입한 다음 IL-1α를 주입하거나, IL-1α를 먼저 주입한 다음 IL-1β를 주입하여 수행하였다. 어떠한 순서에서도 이중-결합 활성이 검출되었다. 유사한 결과는 DVD1-Ig 경우에도 수득되었다. 따라서, 각 DVD-Ig는 이중-특이적 4가 분자로서 2종의 항원 모두에 동시에 결합할 수 있다. 표 IV에 제시된 바와 같이, 제1 항원, hIL-1α 또는 hIL-1β에 대한 2종의 DVD-Ig 모두의 화학량론은 일특이적 2가 결합의 것과 유사하게 1.5를 초과하였다. 제2 항원의 주입시, DVD-Ig는 제1 항원에 의해 이미 점유된 한편, 제2 항원(즉, hIL-1α 또는 hIL-1β)에 대한 2종의 DVD-Ig 모두의 화학량론은 1.0 내지 1.3이였다. 따라서, DVD-Ig는 2종의 IL-1α 및 2종의 IL-1β 분자에 결합할 수 있다. DVD-Ig를 비아코어 센서 칩상에서 염소 항-사람 Fc 항체를 통해서 포획하고, 제1 항원을 주입하고 결합 시그날을 관찰한 다음, 제2 항원을 주입하였다.
Figure 112008012399231-pct00019
실시예 1.7: DVD-Ig의 기능적 상동성의 측정
DVD2-Ig를 표적-특이적 친화성 크로마토그래피 대신에 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였기 때문에, 어떠한 잠재적인 잘못 폴딩(folding)된 및/또는 잘못 일치(match)된 VL/VH 도메인이라도(존재한다면) 2종의 상이한 항원에 대한 결합 연구에 의해 평가할 수 있다. 이러한 결합 분석은 크기 배지 액체 크로마토그래피(SEC)로 수행하였다. DVD2-Ig를 단독으로 또는 37℃에서 등몰비의 IL-1α, IL-1β 또는 IL-1α와 IL-1β둘다와 함께 120분 동안 항원처리한 후에 컬럼에 적용하였다. 각각의 항원을 또한 대조군으로서 단독으로 적용하였다. SEC 결과는 DVD2-Ig가 용액 중에서 IL-1α 및 IL-1β에 결합할 수 있었으며 이러한 결합이 SEC 시그날로의 이동을 초래하였을 나타냈으며, 이러한 이동은 DVD2-Ig가 어떠한 한 항원과의 복합체 형태로 존재한 경우에 이의 동적 크기가 증가함을 나타낸다. DVD2-Ig 시그날의 이동은 부분적이 아니라 100%였으며, 모든 DVD2-Ig 분자가 항원에 결합할 수 있었음을 시사한다. IL-1α 및 IL-1β 둘다의 존재하에서는 DVD2-Ig 시그날의 추가적이고 완전한 이동이 있었으며, 이는 모든 DVD2-Ig 분자가 균일한 방식으로 항원 둘다에 결합할 수 있었음을 나타낸다. 당해 실험은 DVD-Ig가 기능적으로 상동성인 단백질로서 발현되었음을 입증한다. 이것은 DVD-Ig가 모든 이미 기술된 이특이적, 다특이적 및 다가 면역글로불린-유사 및 면역글로불린-유래의 분자와 상이한, 상동성인 기능적 단일 종으로서 생산될 수 있음을 입증하는 것으로서 중요한 의미를 내포한다.
실시예 1.8: DVD-Ig의 생물학적 활성의 측정
DVD-Ig의 생물학적 활성은 MRC-5 생물검정을 사용하여 측정하였다. MRC-5 세포주는 용량 의존적 방식으로 사람 IL-1α 및 IL-1β에 반응하여 IL-8을 생산하는 사람 폐 섬유모세포 세포주이다, MRC-5 세포를 ATCC로부터 입수하고, 5% CO2 항온처리기에서 37℃에서 10% FBS 완전 MEM 중에서 배양하였다. 사람 IL-1α 또는 IL-1β에 대한 DVD-Ig의 중화 활성을 측정하기 위해, MEM/10% FBS 중의 50㎕의 Ab (1E-7 내지 1E-12 M)를 96웰 플레이트에 부가하고 50㎕의 hIL-1α 또는 hIL-1β (200pg/ml)와 함께 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 사전항온처리하였다. 이어서, 1E5/ml 농도의 MRC-5 세포를 모든 웰에 부가하고(100㎕), 플레이트를 5% CO2 항온처리기 내에서 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 상청액을 수거하고, 사람 IL-8 생산을 표준 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN)에 의해 측정하였다. DVD-Ig의 중화 활성을 IL-8 생산을 억제하는 이의 능력으로 측정하였다.
표 13에 제시된 바와 같이, 2종의 DVD-Ig는 모두 hIL-1α 및 hIL-1β를 중화시킬 수 있었다. hIL-1α에 대한 결합 친화성과 일치하여, hIL-1α에 대한 DVD1-Ig 및 DVD2-Ig의 중화 활성도 또한 유사하였는데, 즉 키메릭 Ab의 중화 활성보다 3배 작았다(표 III 참조). hIL-1β에 대한 결합 친화성과 일치하여, hIL-1β에 대한 DVD2-Ig의 중화 활성은 키메릭 Ab 13F5.G5의 중화 활성보다 다소 작았지만, DVD1-Ig의 중화 활성보다 3배 높았다. 종합하면, 본래의 mAb과 비교해 DVD-Ig 분자의 생물학적 활성의 유의적 감소는 없었다.
DVD-Ig가 IL-1α 및 IL-1β 둘다의 존재하에 IL-8 생산을 억제할 수 있었는지를 측정하기 위해, 동량의 hIL-1α 및 hIL-1β를 MRC-5 검정의 동일한 배양 시스템에 부가하였다. DVD1-Ig 및 DVD2-Ig 는 둘다, IL-1α 및 IL-1β 둘다의 존재하에 MRC-5 세포에 의한 IL-8 합성을 억제할 수 있었으며, 활성은 오직 1종의 사이토킨만이 존재한 단일-검정의 값과 유사하였다(표 13). IL-1α 및 IL-1β 둘다가 존재한 당해 검정에서, DVD2-Ig의 이중-억제 활성(1.2 nM)은 DVD1-Ig의 이중-억제 활성(2.2 nM)보다 높았다.
실시예 2: DVD-Ig 분자에서의 링커 크기 및 가변 도메인 배향의 분석
표 15에 제시한 바와 같은, 상이한 모 mAb 쌍을 갖는 부가적 DVD-Ig 분자를 작제하였다. mAb의 각 쌍에 대해, 4종의 상이한 DVD-Ig 작제물을 생성시켰다: 짧은 링커를 갖는 2종 및 긴 링커를 갖는 2종, 각각 2가지의 상이한 도메인 배향, 즉 a-b-C (알파-베타-불변 도메인) 및 b-a-C (베타-알파-불변 도메인)을 가짐. 링커 서열은 다음과 같이 사람 Ck 또는 CH1 도메인의 N-말단 서열로부터 유도하였다:
짧은 링커: 경쇄: TVAAP(서열번호 44); 중쇄: ASTKGP(서열번호 42)
긴 링커: 경쇄: TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); 중쇄: ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48)
모든 중쇄 및 경쇄 작제물을 pBOS 발현 벡터내로 서브클로닝하고 COS 또는 자유형 293 세포에서 발현시켰다.
새로운 DVD 클론을 작제하기 위해, 2종의 mAb의 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 둘다를 먼저 hIL-1αbDVD1-Ig 및 hIL-1αbDVD2-Ig에 대해 기술한 바와 같은 중복 PCR을 사용하여 직렬로 연결시켰다. 이어서, 연결된 조각들을 상동성 재조합을 사용하여 pBOS 벡터에 서브클로닝하였다. 간략하게 언급하면, 벡터를 제한 분해(2㎍의pBOS-hCk 벡터를 O+ 완충액 중에서 FspAI 및 BsiWI로 분해시키고, 2㎍의 pBOS-hCγz,non 벡터를O+ 완충액 중에서 FspAI 및 SaII로 분해시켰다)에 의해 선형화시켰다. 분해된 샘플을 1% 아가로스 겔상에 전개시키고, 골격 단편을 50㎕ 물 중에서 정제하였다. 상동성 재조합 및 형질전환을 위해, DH5a 적격성(competent) 세포를 빙상에서 해동시키고 20 내지 50ng의 연결된 PCR 산물 및 20 내지 50ng의 선형화된 벡터(모두 50㎕ DH5a 세포 내)와 혼합하였다. 당해 혼합물을 가볍게 혼합하고 빙상에서 45분 동안 항온처리한 다음, 42℃에서 1분 동안 열 충격을 가하였다. 이어서, 100㎕ SOC 배지를 부가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 형질전환 배지를 암피실린을 함유하는 LB/아가 플레이트에 접종하고 37℃에서 18 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 세균 클론을 분리시키고, 이로부터 DNA를 정제하여 서열분석하였다. 서열이 확인된 최종 클론을 앞서 기술한 바와 같이 Ab 발현 및 정제를 위해 COS 또는 293 세포에서 공동 형질감염시켰다(동일한 Ab 쌍의 일치되는 HV 및 LC)
정제된 DVD-Ig 단백질의 특성은 표 16에 약술되어 있다. 표 16의 좌측 부분은 새로운 hIL-1α/βDVD-Ig 분자의 작제를 위해 사용된 2쌍의 mAb의 특이성, 결합 친화성 및 중화 효능을 나타낸다. 항체 18F4.2C8 및 1B12.4H4 (실시예 1.1.D 참조)를 사용하여 hIL-1α/bDVD3a-Ig, hIL-1α/bDVD4a-Ig, hIL-1α/bDVD3b-Ig 및 hIL-1α/bDVD4b-Ig를 작제하였다. hIL-1α/bDVD3a-Ig 및 hIL-1α/bDVD4a-Ig는 각각 짧은 링커 및 긴 링커를 갖는 a-b-C 배향으로 존재하였다. hIL-1α/bDVD3b-Ig 및 hIL-1α/bDVD4b-Ig는 각각 짧은 링커 및 긴 링커를 갖는 b-a-C 배향으로 존재하였다. 항체 6H3.1A4 및 6B12.4F6를 사용하여 hIL-1α/bDVD5a-Ig, hIL-1α/bDVD6a-Ig, hIL-1α/bDVD5b-Ig 및 hIL-1α/bDVD6b-Ig를 작제하였다. hIL-1α/bDVD5a-Ig 및 hIL-1α/bDVD6a-Ig는 각각 짧은 링커 및 긴 링커를 갖는 a-b-C 배향으로 존재하였다. hIL-1α/bDVD5b-Ig 및 hIL-1α/bDVD6b-Ig는 각각 짧은 링커 및 긴 링커를 갖는 b-a-C 배향으로 존재하였다. 이들 부가적 hIL-1α/bDVD-Ig의 분자적 클로닝을 hIL-1α/bDVD1-Ig(실시예 1.3 참조)에 대해 이미 기술한 과정을 사용하여, 중복 PCR 과정을 사용하여 수행하였다. 이들 부가적 hIL-1α/βDVD-Ig의 아미노산 서열은 표 15에 기재한다.
Figure 112008012399231-pct00020
Figure 112008012399231-pct00021
Figure 112008012399231-pct00022
Figure 112008012399231-pct00023
Figure 112008012399231-pct00024
Figure 112008012399231-pct00025
Figure 112008012399231-pct00026
Figure 112008012399231-pct00027
Figure 112008012399231-pct00028
Figure 112008012399231-pct00029
Figure 112008012399231-pct00030
Figure 112008012399231-pct00031
새로운 DVD 작제물의 특성은 표 16에 약술되어 있다. 친화성(Kd) 및 생물학적 활성(IC50)은 각각 비아코어 및 MRC-5 생물검정으로 측정하였다. 모든 새로운 DVD 단백질의 SDS-PAGE 분석은 환원 조건 및 비환원 조건 둘다에서 통상의 항체 및 DVD1/2-Ig와 유사한 정상적 이동 패턴을 나타냈다.
Figure 112008012399231-pct00032
새로운 DVD 분자의 기능적 특성을 규명한 결과, 어떠한 배향에서도, 긴 링커를 갖는 DVD가 두 항원 모두에 대한 결합 및 중화 측면에서 짧은 링커를 갖는 DVD보다 우수하게 작용하는 것으로 밝혀졌다. 긴 링커를 갖는 DVD와 관련하여, b-a-C 배향을 갖는 DVD는 두 항원 모두에 대한 우수한 결합 및 중화를 나타낸 반면, a-b-C 배향을 갖는 DVD는 IL-1α에 대한 우수한 결합 및 중화를 나타냈고 IL-1β에 대한 감소된 결합 및 중화를 나타냈다(예를 들면, DVD4b 대 DVD4a). DVD-Ig 분자, DVD4b는 nM 이하의 농도에서 IL-1α 및 IL-1β 둘다에 결합하여 중화시켰으며 모 mAb의 결합 및 중화 특성을 완전히 보유하였다.
실시예 3: IL-12 및 IL-18에 결합할 수 있는 DVD-Ig
IL-12 및 IL-18에 결합할 수 있는 DVD-Ig 분자는 2종의 모 mAb, 사람 IL-12p40에 대한 1종(ABT874) 및 사람 IL-18에 대한 다른 1종(ABT325)을 사용하여 상기한 바와 같이 작제하였다. 4종의 상이한 항-IL12/18 DVD-Ig 작제물을 생성시켰다: 짧은 링커를 갖는 2종 및 긴 링커를 갖는 2종, 각각 2가지의 상이한 도메인 배향, 즉 a-b-C (알파-베타-불변 도메인) 및 b-a-C (베타-알파-불변 도메인)을 가짐(표 VI). 사람 Cλ/κ 또는 CH1 도메인의 N-말단 서열로부터 유도한 링커 서열은 다음과 같았다:
DVD1218 작제물(ABT874는 Vλ를 갖는다)의 경우:
경쇄 (λ): 짧은 링커: QPKAAP(서열번호 88); 긴 링커: QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92)
중쇄 (γ1): 짧은 링커: ASTKGP(서열번호 42); 긴 링커: ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48)
DVD1812 작제물(ABT325는 Vk를 갖는다)의 경우:
경쇄 (κ):짧은 링커: TVAAP(서열번호 44) ; 긴 링커: TVAAPSVFIFPP(서열번호 50)
중쇄 (γ1): 짧은 링커: ASTKGP(서열번호 42); 긴 링커: ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48)
모든 중쇄 및 경쇄 작제물을 pBOS 발현 벡터내로 서브클로닝하고 COS 세포 및 자유형 293 세포에서 발현시킨 다음, 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 물질을 SDS-PAGE 및 SEC에 적용한 결과, 이의 프로파일은 DVD2-Ig의 것과 유사하였다.
하기 표 17에 각각의 항-IL12/IL18 DVD-Ig 단백질을 발현시키는데 사용된 중쇄 및 경쇄 작제물을 기재한다.
Figure 112008012399231-pct00033
실시예 3.1.1: DVD1218SL 및 DVD1218LL에 대한 DNA 작제물의 분자적 클로닝
중쇄 작제물 DVD1218HC-LL 및 DVD1218HC-SL을 생성시키기 위해, ABT-874의 VH 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 1 및 프라이머 2L 또는 프라이머 2S를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 한편, ABT-325의 VH 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 3L 또는 프라이머 3S 및 프라이머 4를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머, 프라이머 1 및 4를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 중복 PCR 산물을 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCγ1,z 비-포유동물 발현 벡터(Abbott) 내로 표준 상동성 재조합 방법에 의해 서브클로닝하였다.
경쇄 작제물 DVD1218LC-LL 및 DVD1218LC-SL를 생성시키기 위해, ABT-874의 VL 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 5 및 프라이머 6L 또는 프라이머 6S를 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, ABT-325의 VL 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 7L 또는 프라이머 7S 및 프라이머 8을 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머, 프라이머 5 및 8을 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 중복 PCR 산물을 Srf I 및 Not I 이중 분해된 pBOS-hCk 포유동물 발현 벡터(Abbott) 내로 표준 상동성 재조합 접근법에 의해 서브클로닝하였다.
Figure 112008012399231-pct00034
하기 기술하는 바와 같이 유사한 접근법을 사용하여 DVD1812SL 및 DVD1812LL를 생성시켰다.
실시예 3.1.2: DVD1812SL 및 DVD1812LL에 대한 DNA 작제물의 분자적 클로닝
중쇄 작제물 DVD1812HC-LL 및 DVD1812HC-SL을 생성시키기 우해, ABT-325의 VH 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 1 및 프라이머 9L 또는 프라이머 9S를 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, ABT-874의 VH 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 10L 또는 프라이머 10S 및 프라이머 4를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머, 프라이머 1 및 4를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 중복 PCR 산물을 Srf I 및 Sal I 이중 분해된 pBOS-hCγ1,z 비-포유동물 발현 벡터(Abbott) 내로 표준 상동성 재조합 접근법에 의해 서브클로닝하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다;
경쇄 작제물 DVD1812LC-LL 및 DVD1812LC-SL을 생성시키기 위햐, ABT-325의 VL 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 11 및 프라이머 12L 또는 프라이머 12S를 사용하여 PCR 증폭시켰다; 한편, ABT-874의 VL 도메인을 프라이머, 각각 프라이머 13L 또는 프라이머 13S 및 프라이머 14를 사용하여 증폭시켰다. 두 PCR 반응은 모두, 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 실시하였다. 2종의 PCR 산물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하고 프라이머, 프라이머 11 및 14를 사용한 후속적 중복 PCR 반응을 위한 중복 주형으로서 함께 사용하였다. 중복 PCR 산물을 Srf I 및 Not I 이중 분해된 pBOS-hCk 포유동물 발현 벡터(Abbott) 내로 표준 상동성 재조합 접근법에 의해 서브클로닝하였다. 이들 작제물을 위해 사용된 프라이머 서열은 하기 표 19에 기재한다.
Figure 112008012399231-pct00035
항-IL12/IL-18 DVD-Ig의 8종의 중쇄 및 경쇄 작제물의 최종 DNA 서열은 하기 표 20에 제시한 바와 같다.
Figure 112008012399231-pct00036
Figure 112008012399231-pct00037
Figure 112008012399231-pct00038
Figure 112008012399231-pct00039
Figure 112008012399231-pct00040
Figure 112008012399231-pct00041
Figure 112008012399231-pct00042
실시예 3.2.: IL-12/IL-18 DVD Ig의 항원 결합 친화성의 측정
hIL-12 및 hIL-18에 대한 항-IL-12/18 DVD-Ig의 결합 친화성은 비아코어로 측정하였다(표 21). IL-18에 대한 중화 활성은 KG-1 검정[참조: Konishi, K., et al.]으로 측정하였다. 간략하게 언급하면. IL-18 샘플(2 ng/ml의 최종 농도)을 DVD-Ig(0 내지 10 mg/ml의 최종 농도)와 함께 37℃에서 1시간 동안 사전항온처리하고, 이어서 10 ng/ml hTNF를 함유하는 RPMI 배지 중의 KG-1 세포(3x106/ml)에 부가한 다음, 37℃에서 16 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 배양 상청액을 수거하고 각 샘플 중에서의 사람 IFN-γ 생산을 ELISA(R&D Systems)로 측정하였다. IL-18에 대한 DVD 분자의 억제 활성은 IC50 값으로서 표시하여 표 VI에 제시한다. IL-12에 대한 항-IL-12/18 DVD 분자의 억제 활성을 측정하기 위해, 활성화된 PHA 아세포(blast cell)로부터의 IL-12-유도된 IFN-ν 생산 검정을 사용하였다[참조: D'Andrea, A et al.]. 사람 IFN-γ의 생산을 위해, PHA 아세포를 사람 IL-12와 함께 18시간 동안 항온처리하였다. 최대 이하(sub-maximal) 자극(최대치의 55 내지 75%)은 200 pg/mL의 사람 IL-12 농도로 수득되었다. 상청액을 특이적 사람 IFN-γ ELISA (Endogen, Cambridge, MA)을 사용하여 IFN-γ에 대해 검정하였다. 중화성 IL-12 DVD는 IL-12 유도된 IFN-γ 생산을 방해하였다. DVD의 중화 활성은 표 21에 나타낸 바와 같이 사람 PHA 아세포에 의한 IFN-γ 생산을 50% 억제하는데 요구되는 DVD 농도를 측정함으로써 측정한다.
Figure 112008012399231-pct00043
표 21은 항-IL-12/IL-18 DVD 분자의 작제를 위해 사용된 완전한 사람 mAb의 특이성, 결합 친화성 및 중화 활성을 나타낸 것이다. 표 VI에 제시한 바와 같이, 이들 mAb는 높은 친화성 및 중화 활성을 나타냈다. 항-IL-18/IL-12 DVD 작제물의 특성의 요약은 표 VI에 제시한다. 모든 새로운 DVD 단백질의 SDS-PAGE 분석은 환원 조건 및 비환원 조건 둘다에서 통상의 항체 및 DVD1/2-Ig와 유사한 정상적 이동 패턴을 나타냈다. SEC 분석은 모든 분자들이 정상적이며 200 kD 영역에서 피크를 나타냄을 보여주었다. 비아코어 결합 데이타는 생물학적 검정에서의 중화 활성과 일치한다.
실시예 3.3: 생체내 항-IL-12/IL-18 DVD-Ig의 생물학적 활성
IL-12 및 IL-18 둘다는 각종 자극에 반응하여 최적의 IFNγ를 생산하는데 요구된다. 생체내 항-IL-12/IL-18 DVD-Ig의 생물학적 활성은 huPBMC-SCID 마우스 모델을 사용하여 측정하였다. 당해 모델에서, 항-IL-12 항체(ABT-874) 항-IL-18 항체 (ABT-325) 또는 항-IL-12/항-IL-18 DVD-Ig를 복강내 또는 정맥내 주사하고(250 mg/각 마우스) 이어서 새로이 정제된 사람 PBMC(huPBMC)를 SCID 마우스에 복강내 주사하였다. 15분 후, 마우스에게 건조된 스타필로코커스 아우레우스(staphylococcus aureus) 세포(SAC)를 시험접종(challenge)시켜 사람 IFNγ 생산을 유도하였다. 동물(n= 7 내지 8/그룹)을 18 내지 20시간 후에 희생시키고, 혈청 huIFNγ 수준을 ELISA로 측정하였다. ABT 874 및 ABT-325는 SAC-유도된 IFNγ를 약 70% 억제하였으며, 이는 당해 모델에서 각 화합물에 의한 최대 IFNγ 억제를 나타낸다. 그러나, 마우스를 ABT-874 + ABT-325 및 항-IL-12/항-IL-18 DVD-Ig로 처리한 결과, IFNγ 생산은 거의 100% 억제되었다. 이러한 결과들은 항-IL-12/항-IL-18 DVD-Ig 분자가 생체내에서 기능적으로 활성임을 시사한다.
실시예 3.4 항-IL-12/IL-18 DVD-Ig의 약동학 및 약력학
항-IL-12/IL-18 DVD-Ig의 전반적 약동학 및 약력학 프로파일은 마우스에서 모 mAb와 유사하였는데, 즉 통상의 IgG에 필적하는 73% 생체이용율이였다. 유사한 약동학, 즉 6 내지 8일 후의 신속한 제거(clearance)도 또한 항-사람 IgG 반응으로 인해서 다른 mAb(예를 들면, 사람, 랫트 등)에서 관찰되었다.
수컷 SD 랫트에게 항-IL-12/IL-18 DVD-Ig를 4mg/kg으로 정맥내 또는 피하 투여하였다. PK 곡선의 초기 부분은 정상적이고 다른 사람 항체의 것과 매우 유사한 것으로 보였다. 6일째에 시작한 DVD-1g의 신속한 제거로 인해서 두 그룹 모두에서의 정확한 반감기는 추론할 수 없었다. 6일 후의 DVD-Ig 농도에서의 급작스러운 저하는 RAHA 반응 때문일 수 있다. 그러나, 유사한 프로파일은 이러한 특정 실험에서 당해 DVD-Ig의 작제를 위해 사용된 모 항체 중 하나(ABT-874) 뿐만 아니라 이미 연구된 일특이적 사람 항체에서도 또한 관찰되었다. 피하 및 정맥내 그룹 둘다에서 6일째까지의 DVD-Ig 농도를 토대로 하여 DVD-Ig의 생체이용율을 추산하였다. 3마리의 랫트중 2마리는 80 내지 95%의 생체이용율을 나타냈으며, 3마리 마웃의 평균 생체이용율은 73%였다.
실시예 3.5: 항-IL-12/항-IL-18 DVD-Ig의 물리적/화학적 특성 규명
단백질 A 정제된, 293 세포 유래의 항-IL-12/항-IL-18 DVD-Ig의 물리적 및 화학적 특성규명 결과는 하기 표 22에 약술되어 있다.
Figure 112008012399231-pct00044
실시예 3.6: 부가적 항-12/항-18 DVD-Ig(1D4.1-ABT325)의 생성
표 23에 제시한 바와 같은 상이한 모 항-IL-12(클론번호 1D4.1)을 갖는 mAb 부가적 항-IL-12/IL-18 DVD-Ig 분자를 작제하였다. 1D4.1-ABT325 DVD-Ig 작제물은 다음과 같이 사람 Ck 및 CH1 도메인의 N-말단 서열로부터 유도된 짧은 링커를 사용하여 생성시켰다:
짧은 링커: 경쇄: TVAAP(서열번호 44); 중쇄: ASTKGP(서열번호 42)
모든 중쇄 및 경쇄 작제물을 앞서 기술한 바와 같이 pBOS 발현 벡터내로 서브클로닝하고 COS 세포 또는 자유형 293 세포에서 발현시키고 특성규명하였다. 1D4.1-ABT325 DVD-Ig는 2종의 본래의 mAb의 활성을 완전히 보유하였다(표 24).
Figure 112011023304851-pct00063
Figure 112008012399231-pct00046
Figure 112008012399231-pct00047
실시예 4: 항-CD20/항-CD3 DVD-Ig의 생성
항-CD20/항-CD3 DVD-Ig를 쥐 항-사람-CD20(클론 5F1) 및 항-사람-CD3(클론 OKT3) 모 항체를 사용하여 생성시켰다. 초기 작제물은 상이한 도메인을 배향을 갖는 2종의 DVD-Ig를 포함하였다. 항-CD3/항-CD20 DVD-Ig는 VCD3-링커-VCD20-불변 영역의 순서로 작제하고, 항-CD20/항-CD3 DVD-Ig는 VCD20-링커-VCD3-불변 영역의 순서로 작제하였다. 그러나, 예비 세포 표면 결합 연구에서, 항-CD3 활성이 당해 고안에서 보존되었음에도 불구하고 항-CD20 결합 활성은 항-CD3/항-CD20 DVD-Ig 분자에서 감소되었다, 대조적으로, 항-CD3 및 항-CD20 결합 활성 둘다는 항-CD20/항-CD3 DVD-Ig 분자에서 완전히 보존되었으며, 이는 이것이 DVD-Ig 포맷에 있어 이들 두 mAb/표적 조합에 대해 최적인 도메인 배향임을 나타낸다. 따라서, 후속적 연구를 위해 항-CD20/항-CD3 DVD-Ig 작제물을 선택하였다.
항-CD20/항-CD3 DVD-Ig는 키메릭 Ig로서 생성시켰는데, 즉 불변 영역이 사람 불변 영역이 되도록 하였다. 결합 분석을 위해, 사람 T 세포주 Jurkat 및 B 세포주 Raji를 사람 IgG로 차단한 다음, 쥐 항-hCD3 mAb OKT3, 쥐 항-hCD20 mAb 1F5 및 항-CD20/항-CD3 DVD-Ig로 염색하였다. 이어서, 세포를 세척하고 FITC-표지된 염소 항-쥐 IgG(항-hIgG 교차-반응성이 없음)로 염색하였다. 항-CD20/CD3 DVD-Ig는 T 세포와 B 세포 둘다에 결합한 반면, CD3 및 CD20 mAb는 오직 T 또는 B 세포중 하나에만 결합하였다. CD20/CD3 DVD-Ig의 아미노산 서열은 표 25에 기재한다.
Figure 112008012399231-pct00048
Figure 112008012399231-pct00049
실시예 5: mIL-1α/βDVD-Ig의 생성
DVD-Ig 분자의 약동학, 생체내 효능, 조직 투과 및 면역원성과 관련된 주요 문제들을 연구하기 위해, 마우스-항-마우스 IL-1α/β DVD-Ig 분자를 하기와 같이 작제하였다.
실시예 5.1: mIL-1α/βDVD-Ig의 작제
IL-1αβ이중 KO 마우스로부터 생성된 2종의 마우스-항-마우스 IL-1α/β mAb(9H10 및 10G11)을 사용하여 마우스-항-마우스 IL-1α/β DVD-Ig 분자를 작제하였다. 마우스 항-마우스 IL-1α및 마우스 항-마우스 IL-1β 모노클로날 항체를, IL-1α/β 이중 KO 마우스를 각각 마우스 IL-1α 또는 마우스 IL-1β으로 면역화시킴으로써 생성시켰다. 1종의 마우스 항-마우스 IL-1α(클론 9H10) 및 1종의 마우스 항-마우스 IL-1β mAb(클론 10G11)를 선별하여 mIL-1α/β DVD-Ig 분자를 생성시키는데 사용하였다. 다양한 링커 크기 및 상이한 도메인 배향을 시험하였다. 최종 기능적 mIL-1α/β DVD-Ig 분자를 V(항-mIL-1β)-링커-V(항-mIL-1β)-쥐 불변 영역 (Cγ2a 및 Cκ)의 배향으로 작제하였다. 클로닝, 발현 및 정제 과정은 hIL-1α/β DVD-Ig의 것과 유사하였다. mIL-1α/β DVD-Ig의 클로닝을 hIL-1α/β DVD3-Ig에 대해 기술한 바와 유사한 중복 PCR 및 상동성 재조합을 사용하여 수행하였다. mIL-1α/β DVD-Ig의 서열은 하기 표 26에 제시한다.
Figure 112008012399231-pct00050
Figure 112008012399231-pct00051
쥐 mIL-1α/β DVD-Ig는 IL-1α 및 IL-1β 둘다에 대한 친화성/시험관내 효능을 보유하였다. 표 27에 mAb 9H10 (항-mIL-1α), 10G11 (항-mIL-1β) 및 mIL-1α/β DVD-Ig의 특성을 제시한다.
Figure 112008012399231-pct00052
실시예 5.2: 관절염 모델에서 mIL-1α/βDVD-Ig의 생체내 활성
항-IL-1α, 항-IL-1β, 조합된 항-IL-1α/항-IL-1β 및 쥐 항-IL-1α/β DVD4-Ig의 치료학적 효과를 당업계에 널리 공지된 콜라겐-유도된 관절염 마우스 모델에서 평가하였다. 간략하게, 수컷 DBA-1 마우스를 꼬리의 기저부에서 CFA 중의 소 II형 콜라겐으로 면역화시켰다. 마우스를 21일째에 복강내(i.p) Zymosan으로 부스트시켰다. 24 내지 27일째에 질환 발생 후, 마우스를 선별하고 각각 10마리 마우스의 개별적 그룹으로 나누었다. 대조 그룹 및 항-사이토킨 그룹의 평균 관절염 스코어는 처리 시작시에 유사하였다. IL-1을 중화시키기 위해, 마우스에게 1 내지 3 mg/kg의 항-IL-1α mAb, 항-IL-1β mAb, 항-IL-1α/항-IL-1β mAb의 조합물 또는 쥐 항-IL-1α/β DVD4-Ig를 격일로 복강내 주사하였다, 마우스를 말초 관절내 관절염의 가시적 외관 및 측정된 질환 활성의 스코어에 대해 주 3회로 주의깊게 검사하였다.
치료학적 방식에 있어 IL-1의 차단은 관절염의 중증도를 효과적으로 감소시켰으며 항-IL-1β는 항-IL-1α(대조 그룹과 비교하여 평균 관절염 스코어의 10% 감소)보다 큰 효능(24% 감소)를 나타타냈다. 항-IL-1-α와 항-IL-1β 사이에 부가적 효과가 관찰되었으며, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb 둘다로 처리된 마우스에서 평균 관절염 스코어가 40% 감소하였다. 놀랍게도, 동일한 용량 수준에서 mDVD-Ig의 처리는 평균 관절염 스코어의 47% 감소를 나타냈는데, 이는 mDVD-Ig의 생체내 치료학적 효능을 입증하는 것이다. 유사한 효능은 또한 당해 동물 모델에서 관절 부종의 측정시에도 관찰되었다.
본 발명은 분자생물학 및 약물 전달 분야에 널리 공지된 기술들을 그대로 참조로 인용한다. 이들 기술은 하기 문헌에 기재된 기술들을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
Figure 112008012399231-pct00053
Figure 112008012399231-pct00054
Figure 112008012399231-pct00055
Figure 112008012399231-pct00056
Figure 112008012399231-pct00057
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Figure 112008012399231-pct00059
Figure 112008012399231-pct00060
Figure 112008012399231-pct00061
수많은 양태 및 특징이 앞서 기술되었지만, 당업자라면 기술된 양태 및 특징이 본원의 기술내용 또는 하기 청구의범위에 정의된 본 발명으로부터 벗어남이 없이 변형 및 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 언급된 각각의 문헌들은 참조로 인용된다.
<110> Abbott Laboratories <120> Dual Variable Domain Immunoglobulin and Uses Thereof <130> 10-2008-7003993 <150> US 60/709,998 <151> 2005-08-19 <160> 133 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(122) <223> Murine monoclonal antibody 3D12 binding human Il-1a (VH) <400> 1 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Lys Arg Met 35 40 45 Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> Murine monoclonal antibody 3D12 capable of binding human IL-1a (VL) <400> 2 Asn Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Cys 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(118) <223> Murine monoclonal antibody 18F4 capable of binding human IL-1a (VH) <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Arg Phe 50 55 60 Leu Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Gly Asn Phe His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> Murine monoclonal antibody 18F4 capable of binding human IL-1a (VL) <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Val Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Thr Arg Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(114) <223> Murine monoclonal antibody 6H3 capable of binding human IL-1a (VH) <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Leu Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Thr Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(107) <223> Murine monoclonal antibody 6H3 capable of binding human IL-1a (VL) <400> 6 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp 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Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(112) <223> Murine monoclonal antibody 13F5 capable of binding human IL-1b (VL) <400> 8 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(122) <223> Murine monoclonal antibody 1B12 capable of binding human IL-1b (VH) <400> 9 Gln Val His Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 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Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <220> <221> primer <222> (1)..(22) <400> 13 atggtgtcca cagctcagtt cc 22 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <220> <221> primer <222> (1)..(29) <400> 14 gcagccaccg tacgccggtt tatttccag 29 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(24) <400> 15 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtc 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> 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<220> <221> primer <222> (1)..(24) <400> 23 atggtcctca tgtccttgct gttc 24 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(34) <400> 24 gcagccaccg tacgccgttt tatttccagc tttg 34 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer1 <222> (1)..(23) <400> 25 cagatccagt tggtgcagtc tgg 23 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(35) <400> 26 caccaactgg atctgtgagg agacggtgac tgagg 35 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(27) <400> 27 aatatccaga tgacacagac tacatcc 27 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(36) <400> 28 gtgtcatctg gatattccgt tttatttcca gctttg 36 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(23) <400> 29 tgggggtgtc gttttggctg agg 23 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(36) <400> 30 gccaaaacga cacccccaca gatccagttg gtgcag 36 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(27) <400> 31 tggtgcagca tcagcccgtt ttatttc 27 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <220> <221> primer <222> (1)..(33) <400> 32 gctgatgctg caccaaatat ccagatgaca cag 33 <210> 33 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric mouse/human VH region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(243) <223> DVD heavy variable hIL-1a/bDVD1-Ig region <400> 33 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr 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Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 107 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(115) <223> Sequence of 9H10 VH region <400> 107 Gln Val Ile Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ala Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Gln Ile Gly Ser Asp Asp Arg Lys Leu Tyr Asn Pro Phe 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ile Thr Leu Ser Glu Asp Thr Ser Asn Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Asn Gly Val Met Glu Tyr Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 108 <211> 330 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(320) <223> Sequence of CH region <400> 108 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 109 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody VL region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(228) <223> Sequence of mIL-1a/b DVD-Ig light variable region <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Ile Leu His Asn Tyr 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ser Ala Lys Ile Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro 115 120 125 Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gln Ser Val Asn His Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys 195 200 205 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 110 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> Sequence of 10G11 VL region <400> 110 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Ile Leu His Asn Tyr 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ser Ala Lys Ile Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Linker peptide <400> 111 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 112 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> Sequence of 9H10 VL region <400> 112 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn His Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 113 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(106) <223> Sequence of CL region <400> 113 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 114 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody VH region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(246) <223> Sequence of 1D4.1-ABT325 DVD-Ig heavy variable region <400> 114 Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser 20 25 30 Val Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Gly Ile Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr Trp Ile Gly 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Phe Ile 165 170 175 Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe Gln Gly Gln 180 185 190 Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe Leu Gln Trp 195 200 205 Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val 210 215 220 Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Met Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 115 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(119) <223> Sequence of 1D4.1 VH region <400> 115 Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Lys Ser 20 25 30 Val Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Gly Ile Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 116 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody VL region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(222) <223> Sequence of 1D4.1-ABT325 DVD-Ig light variable region <400> 116 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser 130 135 140 Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Phe 145 150 155 160 Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 180 185 190 Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro 195 200 205 Ser Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 210 215 220 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(108) <223> Seqeunce of 1D4.1 VL region <400> 117 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 118 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 118 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 119 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 1 5 10 15 Val <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 120 Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 121 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 1 5 10 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 122 Ser Ala Lys Thr Thr Pro 1 5 <210> 123 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 123 Arg Ala Asp Ala Ala Pro 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 124 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 1 5 <210> 125 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 125 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 126 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 126 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 127 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 127 Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala 1 5 10 15 Arg Val <210> 128 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 128 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 129 Ala Lys Thr Thr Ala Pro 1 5 <210> 130 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 130 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 131 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 131 Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser 1 5 10 15 <210> 132 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 132 Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser 1 5 10 15 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker peptide <400> 133 Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gln Val Gln Tyr Pro Ala Ser 1 5 10 15

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  21. 제1 폴리펩타이드 쇄가 서열식 1: VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 항체의 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 중쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단, 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]를 포함하고; 제2 폴리펩타이드 쇄가 서열식 2: VD1-(X1)n-VD2-C [여기서, VD1은 제1 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 경쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, n은 0 또는 1이다]를 포함하며, 이때 서열식 2의 C가 CL 도메인인 경우 서열식 1의 C는 CH1 도메인이고, 서열식 2의 C가 CH1 도메인인 경우 서열식 1의 C는 CL 도메인이며, 상기 2개의 폴리펩타이드 쇄가 2개의 기능성 항원 결합 도메인을 형성하는 것인, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  22. 2개의 폴리펩타이드 쇄가 서열식 1: VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 항체의 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 중쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단, 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]을 포함하며; 2개의 폴리펩타이드 쇄가 서열식 2: VD1-(X1)n-VD2-C [여기서, VD1은 제1 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 경쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, n은 0 또는 1이다]를 포함하며, 이때 서열식 2의 C가 CL 도메인인 경우 서열식 1의 C는 CH1 도메인이고, 서열식 2의 C가 CH1 도메인인 경우 서열식 1의 C는 CL 도메인이며, 4개의 폴리펩타이드 쇄가 4개의 기능성 항원 결합 도메인을 형성하는 것인, 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 하나 이상의 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 표적이, ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그레칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPT1; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLR1 (MDR15); BlyS; BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B; BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6 / JAB61); CCL1 (I-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-1d); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21 (MIP-2); SLC; 엑소더스 -2; CCL22 (MDC / STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2 /에오탁신 -2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신 -3); CCL27 (CTACK / ILC); CCL28; CCL3 (MIP-1a); CCL4 (MIP-1b); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKR1 / HM145); CCR2 (mcp-1RB / RA);CCR3 (CKR3 / CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5 / ChemR13); CCR6 (CMKBR6 / CKR-L3 / STRL22 / DRY6); CCR7 (CKR7 / EBI1); CCR8 (CMKBR8 / TER1 / CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD-22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21Wap1/Cip1); CDKN1B (p27Kip1); CDKN1C; CDKN2A (p16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3; CLDN7 (클라우딘 -7); CLN3; CLU (클루스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSF1 (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카테프신 B); CX3CL1 (SCYD1); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC / IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78 / LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33 / Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCL1; DPP4; E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FGF; FGF1 (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FIL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRT1 (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNAS1; GNRH1; GPR2 (CCR10); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCC10 (C10); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HIP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DRA; HM74; HMOX1; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; IFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; IL1A; IL1B; IL1F10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2;IL1RL1;IL1RL2 IL1RN; IL2; IL20; IL20RA; IL21R; IL22; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); IL7; IL7R; IL8; IL8RA; IL8RB; IL8RB; IL9; IL9R; ILK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAK1; IRAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b 4 인테그린); JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLK10; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KRTHB6 (모발 특이적 II형 케라틴); LAMA5; LEP (렙틴); Lingo -p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-β); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG 또는 Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIB1; 미드킨; MIF; MIP-2; MKI67 (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴 -III); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MYD88; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR1I2; NR1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZ1; OPRD1; P2RX7; PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PPBP (CXCL7); PPID; PR1; PRKCQ; PRKD1; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGS1; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈 2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYE1 (내피 단핵구-활성화 사이토킨); SDF2; SERPINA1; SERPINA3; SERPINB5 (마스핀); SERPINE1 (PAI-1); SERPINF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPP1; SPRR1B (Spr1); ST6GAL1; STAB1; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21; TCP10; TDGF1; TEK; TGFA; TGFB1; TGFB1I1; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBR1; TGFBR2; TGFBR3; TH1L; THBS1 (트롬보스폰딘 -1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TIMP3; 조직 인자; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAIP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSF11A; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSF8 (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1BB 리간드); TOLLIP; Toll형 수용체; TOP2A (토포이소머라제 Iia); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCR1 (GPR5 / CCXCR1); YY1; 및 ZFPM2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  25. 제21항 또는 제22항에 있어서, CD138과 CD20; CD138과 CD40; CD20과 CD3; CD38과 CD138; CD38과 CD20; CD38과 CD40; CD40과 CD20; CD19와 CD20; CD8과 IL-6; PDL-1과 CTLA-4; CTLA-4와 BTNO2; CSPG와 RGM A; IGF1과 IGF2; IGF1/2과 Erb2B; IL-12와 IL-18; IL-12와 TWEAK; IL-13과 ADAM8; IL-13과 CL25; IL-13과 IL-1베타; IL-13과 IL-25; IL-13과 IL-4; IL-13과 IL-5; IL-13과 IL-9; IL-13과 LHR 효능제; IL-13과 MDC; IL-13과 MIF; IL-13과 PED2; IL-13과 SPRR2a; IL-13과 SPRR2b; IL-13과 TARC; IL-13과 TGF-β; IL-1α와 IL-1β; MAG와 RGM A; NgR과 RGM A; NogoA와 RGM A; OMGp와 RGM A; RGM A와 RGM B; Te38과 TNFα; TNFα와 IL-12; TNFα와 IL-12p40; TNFα와 IL-13; TNFα와 IL-15; TNFα와 IL-17; TNFα와 IL-18; TNFα와 IL-1베타; TNFα와 IL-23; TNFα와 MIF; TNFα와 PEG2; TNFα와 PEG4; TNFα와 VEGF; VEGFR과 EGFR; TNFα와 RANK 리간드; TNFα와 Blys; TNFα와 GP130; TNFα와 CD-22 및 TNFα와 CTLA-4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개의 표적과 결합할 수 있는 결합 단백질.
  26. 제23항에 있어서, 하나 이상의 표적의 생물학적 기능을 조절할 수 있는 결합 단백질.
  27. 제23항에 있어서, 하나 이상의 표적을 중화시킬 수 있는 결합 단백질.
  28. 제23항에 있어서, 표적이, 사이토킨, 케목킨, 세포 표면 단백질, 효소 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 사이토킨이 림포킨, 모노킨 및 폴리펩타이드 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  30. 제29항에 있어서, 사이토킨이 IL-1α와 IL-1β인 결합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 결합 단백질이 서열번호 33, 서열번호 37, 서열번호 41, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57 및 서열번호 59로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이원 가변 도메인 (DVD) 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 43, 서열번호 46, 서열번호 49, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 58 및 서열번호 60으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이원 가변 도메인 (DVD) 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  32. 제29항에 있어서, 사이토킨이 TNF-α및 IL-13인 결합 단백질.
  33. 제29항에 있어서, 사이토킨이 IL-12 및 IL-18인 결합 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 결합 단백질이 서열번호 83, 서열번호 90, 서열번호 93, 서열번호 95 및 서열번호 114로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이원 가변 도메인 (DVD) 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호 86, 서열번호 91, 서열번호 94, 서열번호 46, 서열번호 96 및 서열번호 116으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이원 가변 도메인 (DVD) 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  35. 제28항에 있어서, 케목킨이 CCR2, CCR5 및 CXCL-13으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  36. 제28항에 있어서, 세포 표면 단백질이 인테그린인 결합 단백질.
  37. 제28항에 있어서, 세포 표면 단백질이 CD-20 및 CD3인 결합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 결합 단백질이 서열번호 97의 이원 가변 도메인 (DVD) 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 101의 이원 가변 도메인 (DVD) 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  39. 제28항에 있어서, 효소가 키나제 및 프로테아제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  40. 제28항에 있어서, 수용체가 림포킨 수용체, 모노킨 수용체 및 폴리펩타이드 호르몬 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 결합 단백질.
  41. 제28항에 있어서, 표면 플라스몬 공명으로 측정시, 하나 이상의 표적에 대해 102M-1s-1 이상의 결합율 상수(Kon)를 갖는 결합 단백질.
  42. 제28항에 있어서, 표면 플라스몬 공명으로 측정시, 하나 이상의 표적에 대해 10-3s-1 이하의 해리율 상수(Koff)를 갖는 결합 단백질.
  43. 제28항에 있어서, 하나 이상의 표적에 대해 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 결합 단백질.
  44. 제21항 또는 제22항에 따른 결합 단백질을 포함하고, 이미지화제, 치료학적 제제 및 세포독성 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제제를 추가로 포함하는 결합 단백질 접합체.
  45. 제44항에 있어서, 제제가 방사선표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생발광 표지, 자기 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이미지화 제제인 결합 단백질 접합체.
  46. 제45항에 있어서, 이미지화 제제가 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방사선표지인 결합 단백질 접합체.
  47. 제44항에 있어서, 제제가 항 대사물, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토킨, 항-혈관형성제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 어팝토시스 유발 제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료제 또는 세포독성 제제인 결합 단백질 접합체.
  48. 제21항 또는 제22항에 있어서, 결정화된 결합 단백질.
  49. 제48항에 있어서, 결정이 담체 부재의 방출 조절된 약제학적 결정인 결정화된 결합 단백질.
  50. 제48항에 있어서, 결합 단백질의 가용성 대응물 보다 큰 생체내 반감기를 갖는 결정화된 결합 단백질.
  51. 제48항에 있어서, 생물학적 활성을 보유하는 결정화된 결합 단백질.
  52. 결합 단백질을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 쇄 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산으로서, 이때 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄가,
    (a) VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 항체의 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 중쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단, 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]를 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄, 또는
    (b) VD1-(X1)n-VD2-C [여기서, VD1은 제1 항체의 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 항체의 경쇄 가변 도메인이고, C는 항체의 CH1 도메인 또는 항체의 CL 도메인이고, X1은 단일 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산의 폴리펩타이드인 링커이고, 단 이것은 CH1 또는 CL 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않고, n은 0 또는 1이다]를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄이며, 이때 제2 폴리펩타이드 쇄의 C가 항체의 CL 도메인인 경우 제1 폴리펩타이드 쇄의 C는 항체의 CH1 도메인이고, 제2 폴리펩타이드 쇄의 C가 CH1 도메인인 경우 제1 폴리펩타이드 쇄의 C는 CL 도메인이며, 이때 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄가 2개의 기능성 항원 결합 도메인을 형성하는 것인, 분리된 핵산.
  53. 제52항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  54. 제53항에 있어서, pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO 및 pBJ으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
  55. 제53항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 원핵생물 세포인 숙주 세포.
  57. 제56항에 있어서, 대장균 (E. coli)인 숙주 세포.
  58. 제55항에 있어서, 진핵생물 세포인 숙주 세포.
  59. 제58항에 있어서, 진핵생물 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  60. 제58항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동물 세포인 숙주 세포.
  61. 제58항에 있어서, CHO 세포인 숙주 세포.
  62. 제58항에 있어서, COS 세포인 숙주 세포.
  63. 제58항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  64. 제63항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
  65. 제58항에 있어서, 곤충 Sf9 세포인 숙주 세포.
  66. 제55항에 따른 숙주 세포를, 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에서 배양배지에서 배양함을 포함하는, 결합 단백질을 제조하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 생산되는 결합 단백질의 50% 내지 75%가 이원 특이적 4가 결합 단백질인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 생산되는 결합 단백질의 75% 내지 90%가 이원 특이적 4가 결합 단백질인 방법.
  69. 제66항에 있어서, 생산되는 결합 단백질의 90% 내지 95%가 이원 특이적 4가 결합 단백질인 방법.
  70. 제66항에 따른 방법에 따라 제조되는 단백질.
  71. 제21항 또는 제22항에 따른 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 연소성 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선 관절염, 반응성 관절염, 척추관절증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양성 결장염, 장 염증 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부염, 피부경화증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쇼엔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독소 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 급성 횡단성 척수염, 헌팅톤 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전증, 심근경색, 애디슨병, 산발성 다분비선 제I형 결핍증, 다분비선 제II형 결핍증(슈미트 증후군), 성인성(급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응 음성 관절증, 관절증, 라이터병, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 관절병증, 클라미디아-, 예르시니아- 및 살모넬라-관련 관절증, 척추관절증, 죽종 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 크움즈 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 연소성 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로얄 프리(Royal Free) 질환, 만성 점막 피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 증후군, 후천성 면역결핍 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 감마글로불린저혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 부전증, 조숙 난소부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유조직 폐포염, 후-염증성 간질성 폐질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 조합성 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 범발성 폐 질환, 혈철소증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 세기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구성 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드 간염), 2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 극세포증에 따른 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능저하증, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 호중구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임병, 원판양 홍반성 낭창, 남성 불임증 특발증 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압증, 구드패스튜어 증후군, 결절성 다발성 동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸씨 병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 병/동맥염, 자가면역 혈소판감소증, 1형 건선, 2형 건선, 특발성 혈소판감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능항진증, 갑상선종증 자가면역 갑상선 기능저하증(하시모토 병), 위축성 자가면역 갑상선 기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 혈관염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 경변, 알콜 유도 간 손상, 콜레오스타시스(choleostasis), 특이체질성 간 질환, 약물 유도 간염, 비알콜성 지방간염, 알레르기, B 그룹 스트렙토코씨(streptococci) (GBS) 감염, 정신 장애, Th2 형 및 Th1 형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(상이한 형태의 통증), 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암종, 백혈병 및 림프종 같은 조혈 악성종양, 아베타지방단백질혈증, 말초청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전증, 선암종, 이소성 심방박동, AIDS 치매 합병증, 알콜 유도 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식 거부, 알파-l-안티트립신 결핍, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 앙기나 협심증, 전각 세포 퇴화, 항 CD3 치료, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민성 반응, 대동맥 및 말초 결찰증, 대동맥 해부, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥 누공, 운동실조증, 심방세동 (지연 또는 발작성), 심방조동, 동정맥 막힘, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식 (BMT) 거부, 좌각차단, 버키트 림프종, 화상, 심장성 부정맥, 심장성 기절 증후군, 심장 종양, 심근증, 심폐 우회 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 퇴화, 소뇌 장애, 혼란 또는 다초점 심방 빈맥, 화학치료 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜증, 만성 염증 병리, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐 심장, 관상 동맥 질환, 크루츠펠트-자콥(Creutzfeldt-Jakob) 질환, 배양 음성 패혈증, 낭섬유증, 사이토킨 치료 관련 장애, 권투선수치매(dementia pugilistica), 탈수초성질환, 댕기 출혈열, 피부염, 피부학적 증상, 당뇨병, 진성 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환(diabetic ateriosclerotic disease), 광범위 루이체 질환, 확장성 울혈성 심근증, 기저핵 장애, 중년 다운 증후군, CNS 도파민 수용체 차단 약물에 의해 유도된 약물 유도 운동 장애, 약물 과민증, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비질환, 후두개염, 엡스탄-바르 바이러스 감염, 홍색사지통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조증, 기능성 말초 동맥 장애, 진균류 패혈증, 가스괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 기관 또는 조직 이식 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 기관으로 인한 육아종, 모발 세포 백혈병, 할레보르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 고초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액투석, 용혈성 요독증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 출혈, A형 간염, 히스 다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환, 과운동성 장애, 과민성 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동 부족 장애, 시상하부 - 뇌하수체-부신피질계 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/자궁염/광학적 신경근염, 허혈 재관류 손상, 허혈 뇌졸중, 연소성 류마티스 관절염, 연소성 척추 근육 위축증, 카포시 육종, 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌막염, 수막염 균혈증, 대사성/편두통성 두통, 특발성 편두통성 두통, 미토콘드리아 다중 시스템 장애, 복합 연결 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 다발성 골수종, 다발성 시스템 퇴화(만젤, 데제린- 토마스, 쉬-드라거 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 감염증, 마이코박테리움 결핵, 골수이형성증후군, 심근 허혈 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신염, 신증, 신경퇴행성 질환, 신경성 근육 위축증, 호중구감소성 발열 , 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 지류 폐색, 폐색성 동맥 질환, OKT3 치료, 고환염/부고환염, 고환염/절관절제술 반전 과정, 기관비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부수종양성 증후군/악성 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증 질환, 다년성 비염, 심막 질환, 말초 동맥경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군 (다발신경병증, 장기비대, 내분비질환, 모노클로날 감마글로불린혈증, 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 후 심장절개 증후군, 자간전증, 전진적 상핵 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선 치료, 레이노드 현상, 레이노드 질환, 레프섬 질환, 일반 협소 QRS 심근증, 신혈관성고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근병증, 육종, 노인 무도병, 루이체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구 빈혈증, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수운동실조, 척수소뇌 퇴화, 스트렙토코커스 근염, 소뇌 구조적 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계 매독, 전신 아나팔락시스, 전신 염증 반응 증후군, 전신 개시 연소성 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 말초혈관 확장증, 폐색성 혈전 혈관염 , 혈소판감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민성 반응, IV형 과민성, 불안정 앙기나, 요독증, 요로패혈증, 두드러기, 승모판 심장 질환, 하지 정맥, 혈관염, 정맥동 질환, 정맥종 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균류 감염, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-연관 적혈구식작용 증후군, 웨른니케-코르사코프 증후군, 윌슨 질환 및 임의의 기관 또는 조직의 이종이식 거부를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  72. 제71항에 있어서, 하나 이상의 치료학적 제제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 추가의 제제가 치료제, 이미지화제, 세포독성 제제, 혈관형성 억제제; 키나제 억제제; 공동 자극 분자 차단제; 접착 분자 차단제; 항-사이토킨 항체 또는 이의 기능성 단편; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제, 마약류, 비스테로이드 소염 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항 미생물성 제제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사선 약제, 항우울증제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토킨 및 사이토킨 길항제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 제71항에 있어서, 비경구, 피하내, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 협막내, 연골내, 강내, 세포내, 소뇌내, 소뇌심실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 일시주사(bolus), 질내, 직장, 협측, 설하, 비내 및 경피투여로부터 선택되는 하나 이상의 방식으로 피검체에 투여되는 약제학적 조성물.
  77. 제23항에 있어서, X1이 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 118); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 119); AKTTPKLGG(서열번호 120); SAKTTPKLGG(서열번호 121); SAKTTP(서열번호 122); RADAAP(서열번호 123); RADAAPTVS(서열번호 124); RADAAAAGGPGS(서열번호 125); RADAAAA(G4S)4(서열번호 126); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 127); ADAAP(서열번호 40); ADAAPTVSIFPP(서열번호 103); TVAAP(서열번호 44); TVAAPSVFIFPP(서열번호 50); QPKAAP(서열번호 88); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 92); AKTTPP(서열번호 38); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 128); AKTTAP(서열번호 129); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 99); ASTKGP(서열번호 42); ASTKGPSVFPLAP(서열번호 48), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 130); GENKVEYAPALMALS(서열번호 131); GPAKELTPLKEAKVS(서열번호 132); 및 GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 133)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 링커인 결합 단백질.
  78. 제71항에 있어서, 정신 장애가 우울증 또는 정신분열증인, 약제학적 조성물.
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