KR101372173B1 - 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 사용하는 동적 핵분극화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분극화되는 샘플 내의 분극화 수준을 강화시키는 분극화제로서 트리틸 라디칼과 상자성 금속 이온의 조합을 사용하는 동적 핵 분극화(DNP) 방법, 이러한 방법에서 사용되는 조성물 및 분극화제에 관한 것이다.
동적 핵 분극화, 트리틸 라디칼, 상자성 금속 이온, 조영제, 과분극화

Description

트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 사용하는 동적 핵 분극화 방법{METHOD OF DYNAMIC NUCLEAR POLARISATION(DNP) USING A TRITYL RADICAL AND A PARAMAGNETIC METAL ION}
본 발명은 분극화되는 샘플 내의 분극화 수준을 강화시키는 동적 핵 분극화(DNP) 방법 및 이러한 방법에서 사용되는 조성물 및 분극화제에 관한 것이다.
자기공명(MR)영상화(MRI)는, 환자 및 의료인을 X-선과 같은 잠재적으로 유해한 방사선에 노출시키지 않고서도, 환자의 신체 또는 그 일부의 영상을 비-침투적인 방식으로 수득하는 것을 허용하기 때문에 의사들에게 특히 매력적이 된 영상화 기술이다. MRI는 높은 품질의 영상을 제공하기 때문에, 연질 조직 및 기관의 우수한 영상화 기술이며, 정상 조직과 이병 조직, 예를 들면 종양 및 병변을 구별할 수 있게 해 준다.
MR 조영제를 사용하거나 사용하지 않고서 MRI를 수행할 수 있다. 그러나 조영-강화 MRI는 통상적으로 훨씬 더 작은 조직 변화를 감지할 수 있게 해 주므로, 예를 들면 작은 종양 또는 전이된 암세포와 같은 초기 단계의 조직 변화를 감지하는 강력한 도구가 된다.
여러 유형의 조영제가 MRI에서 사용되어 왔다. 수용성 상자성 금속 킬레이트, 예를 들면 가돌리늄 킬레이트, 예를 들면 옴니스캔(Omniscan, 등록상표)(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))가 널리 사용되는 MR 조영제이다. 이것은 낮은 분자량을 갖기 때문에, 맥관계에 투여되면 세포외 공간(즉 혈액 및 간질)에 신속하게 분배된다. 이것은 신체로부터 비교적 신속하게 제거된다.
한편으로는 혈액 저류 MR 조영제, 예를 들면 초상자성 산화철 입자는 오랜 시간 동안 맥관계 내에 머무른다. 이것은 간의 조영을 강화할 뿐만 아니라, 모세혈관 투과성의 이상, 예를 들면 혈관신생에 의해 초래된 것과 같은, 종양의 "누출성" 모세혈관 벽을 감지하는데에 매우 유용한 것으로 밝혀졌다.
전술된 조영제의 의심의 여지가 없는 탁월한 성질에도 불구하고, 이러한 조영제의 사용이 위험이 전혀 없는 것은 아니다. 상자성 금속 킬레이트 착물은 통상적으로 높은 안정도상수를 가짐에도 불구하고, 투여 후 독성 금속 이온이 신체 내에 방출될 수 있다. 더욱이, 이러한 유형의 조영제는 낮은 특이도를 나타낸다.
WO-A-99/35508에는 MRI 조영제로서 고-T1 제제의 과분극화된(hyperpolarised) 용액을 사용하여 환자를 MR 검사하는 방법이 개시되어 있다. "과분극화"라는 용어는 고-T1 제제 내에 존재하는 NMR 활성 핵, 즉 핵 스핀이 0이 아닌 핵, 바람직하게는 13C- 또는 15N-핵의 핵 분극화를 실온 및 1 T(열적 분극화)에서 발견되는 수준보다 높게 강화시킴을 의미한다. NMR 활성 핵의 핵 분극화를 강화시키면, 이러한 핵의 여기 핵 스핀 상태와 기저 핵 스핀 상태 사이의 밀도차가 현저하게 증가함으로써, MR 신호강도가 100 배 이상 증폭된다. 과분극화된 13C- 및 /또는 15N-풍부한 고-T1 제제를 사용하는 경우, 13C 및/또는 15N의 자연존재비는 무시할만 하므로 본질적으로 배경 신호의 간섭은 없어서, 신호강도 뿐만 아니라 조영효과도 유리하게 높아질 것이다. 통상적인 MRI 조영제와 과분극화된 고-T1 제제의 주요 차이점은, 전자의 경우 신체 내의 수분 양성자의 이완시간이 변화하면 조영효과의 변화가 초래되는 반면에, 후자의 경우 수득된 MR 신호가 오로지 주입된 제제로부터만 유래되기 때문에 이러한 제제는 비-방사성 트레이서로서 간주될 수 있다는 것이다.
비-내생 및 내생(endogenous) 화합물, 예를 들면 아세트산염, 피루브산염, 옥살산염 또는 글루콘산염, 당, 예를 들면 글루코스 또는 프럭토스, 우레아, 아미드, 아미노산, 예를 들면 글루탐산염, 글리신, 시스테인 또는 아스파르트산염, 뉴클레오티드, 비타민, 예를 들면 아스코르브산, 페니실린 유도체 및 술폰아미드를 포함하지만 이것으로만 제한되지는 않는, MR 조영제로서 사용되기에 적합한 다양한 가능한 고-T1 제제가 WO-A-99/35508에 개시되어 있다. 추가로, 시트르산 사이클과 같은 대사 사이클 내의 중간체, 예를 들면 푸마르산이 대사 활성의 MR 영상화를 위한 바람직한 조영제라고 언급되어 있다.
과분극화된 조영제의 신호는, 이완, 및 환자의 신체에 투여시 희석으로 인해, 감쇠한다는 것을 알아야 한다. 따라서 생물학적 유체(예를 들면 혈액) 내에서의 조영제의 T1 값은, 조영제가 고도로 과분극화된 상태에서 환자의 신체 내 목표 부위에 분배될 수 있도록, 충분히 길어야(높아야) 한다. 높은 T1 값을 갖는 조영제 외에도, 높은 분극화 수준을 달성하는 것이 매우 유리하다.
과분극화된 고-T1 제제를 수득하는 여러 방법이 WO-A-99/35508에 개시되어 있는데, 이것들 중 하나가 분극화제 또는 소위 DNP 제제, 즉 짝을 이루지 않은 전자를 포함하는 화합물을 사용하여 샘플을 분극화시키는 동적 핵 분극화(DNP) 기술이다. DNP 과정 동안, 초기에 DNP 제제를 여기시키는, 통상적으로 극초단파 형태인 에너지가 제공된다. 기저 상태로의 감쇠 시, DNP 제제의 짝을 이루지 않은 전자로부터 샘플의 NMR 활성 핵으로의 분극화 전이가 일어난다. 일반적으로, 적당한 또는 높은 자기장 및 매우 낮은 온도를 DNP 과정에서 사용하는데, 예를 들면 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 DNP 과정을 수행한다. 또다르게는, 적당한 자기장 및 충분한 분극화 강화가 달성되는 임의의 온도를 사용할 수 있다. DNP 기술은 예를 들면 본원에서 참고로 인용된 WO-A-98/58272 및 WO-A-01/96895에 기술되어 있다.
DNP 제제를 어떤 것으로 선택하는지에 따라서, 분극화되는 샘플에서 달성될 수 있는 분극화 수준이 크게 달라지기 때문에, DNP 제제는 DNP 과정에서 결정적인 역할을 한다. 다양한 DNP 제제는, WO-A-99/35508에서 "OMRI 조영제"로서 지칭된 바와 같이, 공지되어 있다. WO-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 또는 WO-A-96/39367에 기술된 바와 같은 산소-기재, 황-기재 또는 탄소-기재의 안정한 트리틸 라디칼을 사용하면, 다양한 상이한 샘플에서 높은 분극화 수준이 달성된다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 이르러, DNP 제제로서, DNP 방법에 의해 분극화되는 샘플 및 트리틸 라디칼을 포함하는 조성물에 상자성 금속 이온을 첨가하면 샘플 내에서 현저하게 증가된 분극화 수준을 달성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 분극화된 샘플을 환자의 MR 검사 절차에서 MR 조영제로서 사용하는 임상 상황에서 특히 유리하다. 샘플 내의 분극화 수준이 예를 들면 2 배 만큼 강화될 수 있다면, 샘플의 농도의 절반만이 MR 검사 절차에서 사용될 것이다. 이는 물론 경제적인 관점에서 유리할 뿐만 아니라 이러한 2 배 농도에서 원치 않는 부작용을 가질 수 있는 샘플을 사용할 수 있다는 가능성을 열었다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 샘플, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물을 제조하고, 조성물에 대해 동적 핵 분극화를 수행함을 포함하는, 과분극화된 고체 샘플의 제조 방법을 제공한다.
"과분극화" 및 "분극화"라는 용어는 이후에는 상호교환되어 사용되며, 과도한 핵 분극화 수준을 나타낸다. 바람직하게는 "과분극화" 및 "분극화"라는 용어는 0.1 %를 초과하는, 더욱 바람직하게는 1 %를 초과하는, 가장 바람직하게는 10 %를 초과하는 핵 분극화 수준을 나타낸다.
분극화 수준은 예를 들면 과분극화된 샘플 내의 NMR 활성 핵의 고체 상태 NMR 측정에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 과분극화된 샘플 내의 NMR 활성 핵이 13C인 경우, 상기 샘플의 고체 상태 13C-NMR이 획득된다. 고체 상태 13C-NMR 측정 은 바람직하게는 낮은 숙임각(flip angle)을 사용하는 단순 펄스-획득 NMR 시퀀스로 이루어진다. 과분극화된 샘플의 신호강도를 동적 핵 분극화 과정 전의 샘플의 분극화 수준과 비교한다. 이어서 분극화 수준을 DNP 전과 DNP 후의 샘플의 신호강도의 비로부터 계산한다.
유사한 방식으로, 용해된 과분극화된 샘플에 대한 분극화 수준을, 과분극화된 샘플 내 NMR 활성 핵의 액체 상태 NMR 측정을 통해 결정할 수 있다. 역시 용해된 과분극화된 샘플의 신호강도를 동적 핵 분극화 과정 전의 용해된 샘플의 분극화 수준과 비교한다. 이어서 분극화 수준을 DNP 전과 DNP 후의 샘플의 신호강도의 비로부터 계산한다.
"샘플"이라는 용어는 동적 핵 분극화(DNP)에 의해 과분극화되는 분자 일체를 지칭한다. 일반적으로, 샘플은 하나 이상의 화학적 화합물이다.
본 발명에 따르는 방법은 분극화되는 샘플 내에서 높은 분극화 수준을 달성한다. 원칙적으로 모든 화학적 화합물이 본 발명의 방법에서 샘플로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 약물 후보 물질, 적합하게는 작은(예를 들면 2000 Da 미만의) 유기 분자 또는 여러 약물 후보 물질들의 혼합물이고, 과분극화된 약물 후보 물질은 예를 들면 특정 수용체에 대한 결합력을 결정하는 NMR 분석 또는 효소 분석에서 사용될 수 있다. 이러한 분석은 WO-A-2003/089656 또는 WO-A-2004/051300에 기술되어 있고, 바람직하게는 액체 상태 NMR 분광법을 기반으로 하는데, 이는 과분극화된 고체 샘플이 분극화 후에 바람직하게는 용해 또는 용융을 통해 액화되어야 함을 의미한다. 샘플은 동위원소가 풍부하거나 풍부하지 않을 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조영제 또는 이것의 전구체이고, 과분극화된 샘플은 MR 영상화 및/또는 화학적 변위 영상화에서 조영제로서 사용된다. 바람직하게는 샘플은, 생체 내로 전달된 후에 영상화되기에 충분히 긴 시간 동안 분극화가 유지되도록 느린 종축이완을 나타내는 분극화된 핵을 함유하는 샘플이다. 바람직한 샘플은, 10 초 초과, 바람직하게는 30 초 초과, 더욱 더 바람직하게는 60 초 초과의 종축이완시간상수(T1)를 갖는 핵을 함유한다. 이러한 소위 "고-T1 제제"는 예를 들면 WO-A-99/35508에 기술되어 있다. 또다르게는, 가능한 샘플의 T1 값을, 문헌에서 발견하거나, 가능한 샘플의 NMR 스펙트럼을 획득함으로써, 예를 들면 13C-표지된 가능한 샘플의 T1을 결정하기 위한 13C-NMR 스펙트럼을 획득함으로써, 결정할 수 있다.
특히 바람직한 샘플은 인간 및 비-인간 동물 신체 내의 대사 과정에서 특정 역할을 하는 샘플이다. 이러한 과분극화된 조영제는 생체내 MR 검사에서 조직의 대사 상태에 대한 정보를 얻는데 사용될 수 있는데, 즉 이것은 대사 활성의 생체내 MR 영상화에서 유용하다. 조직의 대사 상태에 대한 정보는 예를 들면 건강한(정상) 조직과 이병 조직을 구별하는데 사용될 수 있다. 따라서 특히 바람직한 샘플은 내생 화합물, 더욱 바람직하게는 인간 또는 비-인간 동물 신체 내의 대사 과정에서 특정 역할을 하는 내생 화합물이다. 특히 바람직한 샘플은 (양성자화되거나 탈양성자화된 형태의) 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐 산, 시스테인, 아스파라긴 및 아스파르트산, 아세트산염, 피루브산, 피루브산염, 옥살산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 락트산, 시트르산염, 중탄산염, 말론산염, 숙신산염, 옥살로아세트산염, α-케토글루타르산염, 3-히드록시부티르산염, 이소시트르산염 및 우레아 중에서 선택된다. 매우 바람직한 실시양태에서, 전술된 바람직한 샘플은 동위원소, 더욱 바람직하게는 13C- 또는 15N-동위원소, 가장 바람직하게는 13C-동위원소가 풍부하다.
일반적으로, MR 조영제로서 사용되도록 의도되는 샘플은 바람직하게는 동위원소가 풍부한 화합물, 즉 핵 스핀이 0이 아닌 핵(MR 활성 핵), 적합하게는 15N 및/또는 13C 핵, 더욱 바람직하게는 13C이 풍부한 화합물이다. 동위원소가 풍부하다는 것은 동위원소가 화합물 분자 내의 하나 이상의 부위에서 선택적으로 풍부하다는 것과 모든 부위에 걸쳐 균일하게 풍부하다는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면 화학적 합성 또는 생물학적 표지를 통해 샘플을 동위원소가 풍부하게 만들 수 있는데, 두 방법 다 해당 분야에 공지되어 있고, 적당한 방법은 동위원소가 풍부하게 되어야 할 화합물에 따라 달리 선택될 수 있다.
MR 조영제로서 사용되도록 의도되는 샘플의 바람직한 실시양태는 분자의 한 위치에서만 동위원소가 풍부한 샘플, 바람직하게는 10 % 이상, 더욱 적합하게는 25 % 이상, 더욱 바람직하게는 75 % 이상, 가장 바람직하게는 90 % 이상으로 동위원소가 풍부한 샘플이다. 이상적으로는, 100 %로 동위원소가 풍부한 샘플이다.
동위원소가 풍부한 최적의 위치는 MR 활성 핵의 이완시간에 따라 달라진다. 바람직하게는 화합물은 긴 T1 이완시간을 갖는 위치에서 동위원소가 풍부하다. 카르복실-C-원자, 카르보닐-C-원자 또는 4차 C-원자에서 동위원소가 풍부한 13C-풍부한 화합물이 바람직하게 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 피루브산 또는 피루브산염이 본 발명의 방법에서 샘플로서 사용된다. 피루브산 및 피루브산염은 C1-위치(13C1-피루브산/-피루브산염), C2-위치(13C2-피루브산/-피루브산염), C3-위치(13C3-피루브산/-피루브산염), C1- 및 C2-위치(13C1,2-피루브산/-피루브산염), C1- 및 C3-위치(13C1,3-피루브산/-피루브산염), C2- 및 C3-위치(13C2,3-피루브산/-피루브산염), 또는 C1-, C2- 및 C3-위치(13C1,2,3-피루브산/-피루브산염)에서 동위원소가 풍부할 수 있다. C1-위치가 13C 동위원소 풍부 상태를 위해 바람직한 위치이다. 추가로 바람직한 샘플은 13C-알라닌, 13C-글리신, 13C-글루타민, 13C-글루탐산, 13C-시스테인, 13C-아스파라긴, 13C-아스파르트산(양성자화되거나 탈양성자화된 형태의 모든 아미노산), 13C-아세트산염, 13C-옥살산염, 13C-말레산염, 13C-푸마르산염, 13C-락트산염, 13C-락트산, 13C-시트르산염, 13C-중 탄산염, 13C-말론산염, 13C-숙신산염, 13C-옥살로아세트산염, 13C-α-케토글루타르산염, 13C-이소시트르산염, 13C-3-히드록시부티르산염 및 13C-우레아이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 샘플은 고체 상태 NMR 분광법에서 사용된다. 여기서, 과분극화된 고체 샘플은 정적 또는 마술각(magic angle) 스피닝 고체 상태 NMR 분광법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 샘플은 특정 성질을 갖는 화학적 화합물로만 제한되지 않고, 임의의 크기 및 유형의 분자가 이러한 방법에서 샘플로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 트리틸 라디칼은 DNP 제제로서 작용하는데, 이는 DNP 제제의 큰 전자 스핀 분극화가 전자 라모(Larmor) 주파수와 유사한 극초단파를 통해 샘플 내 핵의 핵 스핀 분극화로 전환되기 때문에, DNP 방법에서 필수적이다. 극초단파는 e-e 및 e-n 전이를 통해 전자와 핵 스핀 시스템 사이의 교류를 자극한다. 효과적인 DNP를 위해, DNP 제제는, 전술된 전자와 핵 스핀 시스템 사이의 교류에 필요한 DNP 제제와 샘플 사이의 긴밀한 접촉을 달성하도록, 분극화되는 샘플에서 안정하고 용해되어야 한다. 이러한 문맥에서, 안정한 트리틸 라디칼이 매우 유용한 DNP 제제라는 것이 밝혀졌다. 산소-기재, 황-기재 또는 탄소-기재의 안정한 트리틸 라디칼이 예를 들면 WO-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 또는 WO-A-96/39367에 기술되어 있다.
어떤 트리틸 라디칼을 선택하는 것이 가장 좋은지는 몇몇 인자에 따라 달라진다. 전술된 바와 같이, 트리틸 라디칼과 샘플은, 샘플 내에 최적 분극화 수준을 달성하기 위해서, DNP 동안에 긴밀하게 접촉해야 한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 트리틸 라디칼은 샘플 또는 샘플의 용액에 가용성이다. 이러한 샘플의 용액을 제조하기 위해, 용매 또는 용매 혼합물을 사용하여 샘플을 용해시킬 수 있다. 그러나, 분극화된 샘플이 생체내 MR 영상화와 같은 생체내 용도에서 사용되는 경우, 용매의 양을 최소로 유지하거나, 가능하다면 용매를 사용하지 않는 것이 바람직하다. 분극화되는 샘플이 예를 들면 액체인 경우, 또는 예를 들면 샘플을 용융시킴으로써 샘플을 액체 상태로 전환시키는 경우, 후자가 가능할 수 있다. 분극화된 샘플을 생체내 조영제로서 사용하는 경우, 분극화된 샘플을 통상적으로는 비교적 높은 농도로 투여하므로, 즉 고도로 농축된 샘플을 바람직하게는 DNP 과정에서 사용하므로, 용매의 양을 바람직하게는 최소로 유지한다. 이러한 맥락에서, 샘플을 함유하는 조성물(즉 DNP 제제, 샘플 및 필요하다면 용매)의 질량을 가능한 한 작게 유지하는 것도 중요하다. 예를 들면 샘플을 MR 조영제로서 사용하기 위해, DNP 과정 후에 과분극화된 고체 샘플을 액체 상태로 전환시키는데에 용해를 이용할 경우, 높은 질량은 용해 공정의 효율에 나쁜 영향을 미칠 것이다. 용해 효율, 및 따라서 달성된 분극화의 보존 효율은, 조성물의 질량이 증가할수록, 감소한다는 것이 관찰되었다. 이는 아마도, 조성물의 표면적은 두번째로 증가하는 반면에, 조성물의 부피는 세번째로 증가한다는 사실 때문인 것 같다. 또한 특정 용매를 사용하는 경우, 이러한 용매가 생리학적으로 허용되지 않을 수 있기 때문에, MR 조영제로서 사용된 과분극화된 샘플을 환자에게 투여하기 전에, 용매를 제거해야 한다.
분극화되는 샘플이 친유성(또는 친수성) 화합물인 경우, 트리틸 라디칼도 역 시 친유성(또는 친수성)이어야 한다. 트리틸 라디칼의 친유성 또는 친수성은, 트리틸 라디칼 분자로 하여금 친유성 또는 친수성이 되게 하는 적합한 잔사를 어떤 것으로 선택하는지에 따라 달라질 수 있다. 또한, 트리틸 라디칼은 샘플의 존재 하에서 안정해야 한다. 따라서 분극화되는 샘플이 산(또는 염기)인 경우, 트리틸 라디칼은 산성(또는 염기성) 조건에서 안정해야 한다. 분극화되는 샘플이 반응성 기를 함유하는 경우, 이러한 반응성 기에 대해 비교적 불활성인 트리틸 라디칼이 사용되어야 한다. 전술된 바에 따르면, 트리틸 라디칼을 어떤 것으로 선택하는지는 샘플의 화학적 본질에 따라 크게 달라진다는 것은 명백하다.
문헌[J.H.Ardenkjaer-Larsen 등, PNAS 100(18), 2003, 10158 - 10163]에는, (미국특허 제 6,013,810 호에 상세하게 기술된) 트리틸 라디칼인 (트리스{8-카르복실-2,2,6,6-테트라[2-(1-히드록시에틸)]-벤조(1,2-d:4,5-d') 비스(1,3)디티올-4-일}메틸 소디움염 및 용매로서 글리세롤을 사용하여 13C-표지된 우레아 및 표지되지 않은 우레아를 성공적으로 DNP 분극화시켜, 우레아에서 높은 분극화 수준을 달성하는 것이 기술되어 있다.
WO-A-2006/011811에는, 락트산 또는 피루브산과 같은 산성 유기 화합물의 DNP 분극화에 특히 유용한 DNP 제제인 트리틸 라디칼이 개시되어 있다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 실시양태에서, 샘플은 피루브산, 더욱 바람직하게는 13C-피루브산, 가장 바람직하게는 13C1-피루브산 또는 피루브산염, 더욱 바람직하게는 13C-피루브산염, 가장 바람직하게는 13C1-피루브산염이고, 트리틸 라디칼은 하기 화학식 1의 라디칼이다.
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상기 식에서,
M은 수소 또는 1 당량의 양이온이고;
R1은 동일하거나 상이하고, 직쇄형 또는 분지형 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2(여기서 n은 1, 2 또는 3임)이고;
X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기이다.
바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 1 당량의 생리학적으로 허용가능한 양이온이다. "생리학적으로 허용가능한 양이온"이라는 용어는 인간 또는 비-인간 동물 생체에 의해 허용되는 양이온을 나타낸다. 바람직하게는 M은 수소 또는 알칼리 양이온, 암모늄 이온 또는 유기 아민 이온, 예를 들면 메글루민이다. 가장 바람직하게는 M은 수소 또는 나트륨이다.
추가로 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하고, 더욱 바람직하게는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기이고, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 이소프로필이다.
추가로 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하거나 상이하고, 바람직하게는 동일하고, -CH2-OCH3, -CH2-OC2H5, -CH2-CH2-OCH3, -CH2-SCH3-, -CH2-SC2H5 또는 -CH2-CH2-SCH3, 가장 바람직하게는 -CH2-CH2-OCH3이다.
더욱 바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 나트륨이고, R1은 동일하고, -CH2-CH2-OCH3이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 트리틸 라디칼은 WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711, WO-A-96/39367 및 WO-A-2006/011811에 상세하게 기술된 바와 같이 합성될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 상자성 금속 이온은 원자번호가 58 내지 70인 란탄족 금속 또는 원자번호가 21 내지 29, 42 또는 44인 전이금속의 상자성 금속 이온이다. 단일의 또는 상이한 금속의 상자성 금속 이온이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 단일 금속의 상자성 금속 이온이 사용된다. 적합한 상자성 이온은 예를 들면 Cr3+, Mn2+, Fe3+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Nd3+, Sm3+, Gd3+, Tb3+, Dy3+, Ho3+, Er3+ 및 Yb3+를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상자성 금속 이온은 Cr3+, Mn2+, Fe3+, Fe2+, Gd3+ 및 Tb3+로 이루어진 군에서 선택되고, 더욱 바람직한 실 시양태에서, 상자성 금속 이온은 Cr3+, Mn2+, Fe3+ 및 Gd3+로 이루어진 군에서 선택된다.
적합하게는, 상자성 금속 이온은 킬레이트화된 형태 또는 염의 형태로 사용된다.
분극화되는 샘플이 고체 상태 NMR에 사용되도록 의도된 경우, 상자성 금속 이온은 바람직하게는 염의 형태로 사용된다. 적합한 염은 예를 들면 상자성 금속 이온의 무기 또는 유기 염, 예를 들면 CrCl3, MnCl2, FeCl2, FeCl3, GdCl3, Gd(III) 아세트산염 또는 Gd(III) 피루브산염이다. 분극화되는 샘플이 액체이거나 샘플이 용매에 용해된 용액인 경우, 액체 샘플 또는 샘플의 용액에 가용성인 염을 선택하는 것이 유리하다. 또다른 실시양태에서, 상자성 금속 이온은 킬레이트화된 형태로 첨가될 수 있다.
과분극화된 고체 샘플을 액체 상태 NMR에서 사용하거나 인간 또는 동물 생체에서의 조영제로서 사용하는 경우, 이것을 용해시키거나 용융시킴으로써 용액 또는 액체를 수득해야 한다. 그러나, 이러한 용액 또는 액체 내의 자유 상자성 이온은 샘플 내 분극화된 핵의 T1 이완시간을 급격하게 단축시킴으로써, 즉 분극화의 자연 감쇠를 가속시킴으로써, 샘플이 MR 조영제로서 유용하게 되기에 충분히 높은 MR 신호강도를 제공하는데 필요한 시간을 단축시킨다. 다른 한편으로는, 자유 상자성 금속 이온은 최종의 주입가능한 조영제로부터 제거되지 않는다면, 종종 생리학적으로 허용되지 않거나 낮은 수준으로 허용되며, 원치않는 효과, 즉 독성을 가질 것이 다.
자유 상자성 금속 이온의 전술된 효과를 극복하기 위하여, 상자성 금속 이온은 킬레이트화된 형태로 사용될 수 있다. 또다르게는, 이것들은 이것의 염의 형태로 사용되고, 과분극화된 샘플의 용해 또는 용융 후에 신속하게 제거될 수 있다. 자유 상자성 금속 이온을 신속하게 제거하는 방법은 본 발명에서 나중에 논의된다. 또다른 실시양태에서, 염의 형태의 상자성 금속 이온을 사용하고, 킬레이트화제를 용해 매체에 첨가하여 상기 자유 상자성 금속 이온을 착화시킴으로써, 전술된 효과를 극복할 수 있다. 이러한 경우, (a) 용해 매체에 가용성이고 안정하고, (b) 자유 상자성 금속 이온과 신속하게 안정한 착물을 형성하는 킬레이트화제를 선택해야 한다.
전술된 바와 같이, 상자성 금속 이온을 본 발명의 방법에서 킬레이트화된 형태로 사용할 수 있다. "상자성 킬레이트"라는 용어는 이후부터는 킬레이트화된 형태의 상자성 금속 이온, 즉 상자성 금속 이온 및 킬레이트화제를 포함하는 착물을 가리킨다.
이러한 목적을 위한 다양한 킬레이트화제가 공지되어 있다. 일반적으로 종종 N, O, P 또는 S와 같은 헤테로원자를 함유하는 고리형 및 비고리형 킬레이트화제가 사용될 수 있고, 고리형 킬레이트화제가 바람직하다. 적합한 비고리형 킬레이트화제는 예를 들면 DTPA 및 이것의 유도체, 예를 들면 DTPA-BMA, DTPA-BP, DTPA-BMEA, EOB-DTPA, BOPTA 및 MS-325, EDTA 및 이것의 유도체, 예를 들면 EDTA-BMA, DPDP, PLED, HPTA, 아미드 또는 디아미드, 예를 들면 TOGDA, 술폰산염 또는 포스포네이트이다. 적합한 고리형 킬레이트화제는 예를 들면 크립탄드, PCTA-[12], PCTP-[12], PCTP-[13], DOTA, DO3A 및 이것의 유도체, 예를 들면 HP-DO3A 및 DO3A-부트리올이다. DOTA, DO3A 및 이것의 유도체가 바람직한 고리형 킬레이트화제이다. 전술된 킬레이트화제 및 이것의 합성 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 예를 들면 풀러렌 또는 제올라이트와 같은 비교적 불활성인 화학 물질인 킬레이트화제가 사용된다. 분극화되는 샘플이 예를 들면 상기 단락에서 언급된 바와 같은 작용기를 포함하는 킬레이트화제와 반응하는 반응성 기를 포함하는 반응성 화합물인 경우, (Gd3+와 같은 상자성 금속 이온을 캡슐화하는) 이러한 킬레이트화제를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 상자성 킬레이트는 단량체성 상자성 킬레이트, 즉 킬레이트화제 및 단일 상자성 금속 이온으로 이루어진 화학 물질, 예를 들면 GdDTPA-BMA 또는 MnDPDP일 수 있다. 다른 한편으로는, 상자성 킬레이트는 다량체성 상자성 킬레이트, 즉 각각 킬레이트화제 및 단일 상자성 금속 이온으로 이루어진 둘 이상의 아단위(subunit)로 이루어진 화학 물질일 수 있다. 삼량체성 상자성 킬레이트의 예는 1,3,5-트리스-(N-(DO3A-아세트아미도)-N-메틸-4-아미노-2-메틸페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온, 즉 트리아진트리온 코어 및 이러한 코어에 연결된 3개의 아단위로 이루어진 상자성 킬레이트(여기서 각각의 아단위는 상자성 금속 이온으로서 Gd3+ 및 킬레이트화제로서 DO3A를 포함함)이다. 피루브산의 분극화에서 이러한 삼량체성 상자성 킬레이트를 사용하면 높은 분극화 수준을 달성하게 된다. 이러한 삼량체성 상자성 킬레이트의 합성에 대한 상세한 내용은 본 발명의 실시예 부분에 기술되어 있다.
전술된 트리틸 라디칼과 마찬가지로, 분극화되는 샘플은 상자성 금속 이온과 긴밀하게 접촉해야 한다. 하기 내용에서, 달리 언급되거나 명시되지 않은 한, "상자성 금속 이온"이라는 용어는 예를 들면 염의 형태 및 상자성 킬레이트 형태의 상자성 금속 이온을 일컫는데 사용된다. 샘플이 액체 또는 샘플의 용액인 경우, 액체 샘플 및 샘플의 용액에 가용성인 상자성 금속 이온을 사용하는 것이 바람직하다. 분극화되는 샘플이 친유성(또는 친수성) 화합물이고 상자성 킬레이트가 사용되는 경우, 상자성 킬레이트도 역시 친유성(또는 친수성)이어야 한다. 상자성 킬레이트의 친유성 또는 친수성은, 친유성 또는 친수성 잔사를 포함하는 킬레이트화제를 어떤 것으로 선택하는지에 따라 달라질 수 있다. 또한, 과분극화된 고체 샘플이 액화되거나 용해 매체 내의 킬레이트화제에 의해 착화된 후에 자유 상자성 금속 이온이 신속하고 효율적으로 제거되지 않으면, 착물 분해(탈착화)는 분극화 감쇠 및 전술된 바와 같은 액화된 샘플 내의 분극화 수준에 나쁜 영향을 주는 자유 상자성 이온을 초래하기 때문에, 상자성 킬레이트가 샘플의 존재하에서 안정한 것이 바람직하다. 또한, 분극화되는 샘플이 산(또는 염기)인 경우, 상자성 금속 이온은 산성(또는 염기성) 조건에서 안정해야 한다. 분극화되는 샘플이 반응성 기를 함유하는 경우, 이러한 반응성 기에 대해 비교적 불활성인 상자성 금속 이온이 사용되어야 한다. 전술된 바에 따르면, 상자성 금속 이온을 어떤 것으로 선택하는지는 샘플의 화학적 본질 및 이것의 최종 용도(고체 NMR, 액체 NMR 또는 조영제)에 따라 크게 달라진다는 것은 명백하다.
본 발명의 또다른 양태는, 샘플 또는 이것의 전구체, 트리틸 라디칼 또는 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물을 제조하고, 이 조성물에 대해 동적 핵 분극화를 수행하고, 조성물을 액화시키고, 임의적으로는 액화된 조성물로부터 트리틸 라디칼 및/또는 상자성 금속 이온을 제거함을 포함하는, 과분극화된 액체 샘플의 제조 방법이다.
본 발명에 따르는 방법을 수행하는 경우, 첫번째 단계는 샘플, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물을 제조하는 것이다. 본 발명의 방법에서 사용된 샘플이 예를 들면 피루브산과 같이 실온에서 액체인 경우, 샘플을 선택된 트리틸 라디칼 및 선택된 상자성 금속 이온과 배합하여, 화합물들이 긴밀하게 접촉된 조성물을 형성한다. 바람직하게는, 선택된 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온은 액체 샘플에 가용성이다. 교반, 와류 또는 초음파 처리와 같은, 해당 분야에 공지된 여러 수단을 사용하여, 긴밀한 혼합을 추가로 촉진할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 샘플이 실온에서 고체인 경우, 이것을 용융시킬 수 있고, 용융된 샘플을 선택된 트리틸 라디칼 및 선택된 상자성 금속 이온과 배합한다. 또다른 실시양태에서, 예를 들면 고체 샘플을 적당한 용매 또는 용매 혼합물, 바람직하게는 우수한 유리 형성제이며 냉각/동결 시 조성물의 결정화를 억제하는 용매에 용해시킴으로써, 고체 샘플의 용액을 제조할 수 있다. 적합한 유리 형성제는 예를 들면 글리세롤, 프로판디올 또는 글리콜이다. 이어서, 용해된 샘플을 선택된 트리틸 라디칼 및 선택된 상자성 금속 이온과 배합한다. 냉각/동결 시에 샘플이 결정화되 는 경우, 유리 형성제를 액체 샘플 또는 비-유리 형성 용매에 용해된 샘플에 첨가할 수도 있다. 그러나 전술된 바와 같이, 용매 및/또는 유리 형성제를 필요한 최소 수준으로 첨가해야 한다. 따라서, 샘플에 가용성이거나 샘플과 혼화성인 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 선택하는 것이 바람직하다.
적합하게는, 트리틸 라디칼의 농도는 조성물 내 5 내지 25 mM, 바람직하게는 10 내지 20 mM이다. 상자성 금속 이온의 농도와 관련하여, 조성물 내 0.1 내지 6 mM(금속 이온)이 적합하고, 0.5 내지 4 mM이 바람직하다.
조성물을 바람직하게는 결정화를 억제하는 방식으로 냉각 및/또는 동결시킨다. 냉각/동결을, 해당 분야에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들면 조성물을 액체 질소에서 동결시키거나, 단순히 조성물을 DNP 분극화기에 넣어 액체 헬륨에 의해 동결시킴으로써, 달성할 수 있다.
조성물을 냉각/동결 전에 탈기시킬 수 있다. 헬륨 기체를 조성물을 통해 (예를 들면 2 내지 15 분 동안) 발포시킴으로써 탈기를 수행할 수 있지만, 기타 공지된 통상적인 방법을 사용하여 탈기를 수행할 수도 있다.
DNP 기술은 예를 들면 본원에서 참고로 인용된 WO-A-98/58272 및 WO-A-01/96895에 기술되어 있다. 일반적으로 적당한 또는 높은 자기장 및 매우 낮은 온도가 DNP 과정에서 사용될 수 있는데, 예를 들면 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 DNP 과정을 수행할 수 있다. 또다르게는, 충분한 분극화 강화가 달성되는 임의의 온도 및 적당한 자기장이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, DNP 과정을 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 수행한다. 적합한 분극화 장치(분극 화기)는 예를 들면 WO-A-02/37132에 기술되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 분극화 장치는 저온 유지 장치 및 분극화 수단, 예를 들면 도파관에 의해, 초전도 자석과 같은 자기장 형성 수단에 의해 둘러싸여진 중심 보어 내의 극초단파 공급원에 연결된 극초단파 챔버를 포함한다. 보어는 적어도 초전도 자석 근처의 영역 "P"의 수준까지 수직으로 하향 연장되는데, 여기서 자기장 강도는 샘플 핵의 분극화가 일어나기에 충분히 높아서, 예를 들면 1 내지 25 T이다. 시료(분극화되는 조성물)를 위한 보어는 바람직하게는 밀봉가능하고, 저압, 예를 들면 1 mbar 이하의 압력으로 비워질 수 있다. 제거가능한 수송관과 같은 시료 공급 수단이 보어 내에 함유될 수 있으며, 이러한 관은 보어의 상부로부터 영역 P 내의 극초단파 챔버 내부의 한 지점까지 삽입될 수 있다. 영역 P는, 액체 헬륨에 의해, 분극화가 일어나기에 충분히 낮은 온도, 바람직하게는 0.1 내지 100 K, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10 K, 가장 바람직하게는 1 내지 5 K로 냉각된다. 시료 공급 수단은 보어 내에서 부분 진공을 유지하도록 바람직하게는 상부 말단에서 임의의 적합한 방식으로 밀봉될 수 있다. 시료-보유 용기, 예를 들면 시료-보유 컵이, 시료 공급 수단의 저부 말단 내에 제거가능하게 장착될 수 있다. 시료-보유 용기는 바람직하게는 낮은 비열용량 및 우수한 저온 특성을 갖는 가벼운 물질, 예를 들면 KelF(폴리클로로트리플루오로에틸렌) 또는 PEEK(폴리에테르에테르케톤)로 만들어지며, 이것은 하나 초과의 시료를 보유할 수 있도록 디자인될 수 있다.
시료를 시료-보유 용기 내로 삽입시키고, 액체 헬륨에 침지시키고, 바람직하게는 200 mW에서 약 94 GHz의 주파수에서 극초단파를 조사한다. 예를 들면 분극화 되는 샘플에 따라, 극초단파 조사 동안에 시료의 고체 상태 NMR 신호를 획득함으로써, 분극화 수준을 모니터링할 수 있다. 일반적으로, NMR 신호 대 시간을 나타내는 그래프에서 포화 곡선을 수득한다. 따라서, 언제 최적 분극화 수준에 도달하는지를 결정할 수 있다.
분극화되는 샘플이 MR 조영제로서 사용되도록 의도되는 경우, 과분극화된 샘플을 함유하는 조성물을 바람직하게는, DNP 과정 후에 이러한 고체 조성물을 적당한 용매 또는 용매 혼합물에, 예를 들면 완충액과 같은 수성 운반체에 용해시키거나 용융시키고 임의적으로는 후속적으로 적합한 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키거나 희석시킴으로써, 고체 상태로부터 액체 상태로 전환시킨다(즉 액화시킨다). 과분극화된 고체 조성물을 용해시키기에 적합한 방법 및 장치는 예를 들면 WO-A-02/37132에 기술되어 있다. 과분극화된 고체 조성물을 용융시키기에 적합한 방법 및 장치는 예를 들면 WO-A-02/36005에 기술되어 있다. 과분극화된 샘플이 MR 조영제로서 사용되도록 의도된 경우, 과분극화된 샘플을 함유하는 고체 조성물을 바람직하게는 수성 운반체 또는 적합한 용매에 용해시켜, 생리학적으로 허용가능한 용액을 수득한다. 또다르게는, 과분극화된 샘플을 함유하는 고체 조성물을 용융시키고, 용융된 조성물을 바람직하게는 수성 운반체 또는 적합한 용매에 희석/용해시켜, 생리학적으로 허용가능한 용액을 수득한다.
본 발명의 방법과 관련한 맥락에서, 과분극화된 샘플을 함유하는 고체 조성물의 용해에 사용되는 용매는 과분극화된 샘플을 상이한 과분극화된 화학 물질로 전환시킬 수도 있다. 이러한 경우, 과분극화된 고체 샘플은 "샘플 전구체"로서 나 타내어진다. 예를 들면, 염기를 함유하는 용매가 과분극화된 산을 포함하는 고체 조성물(샘플 전구체)을 용해시키는데 사용되는 경우, 과분극화된 산은 중화되고 염으로 전환된다. 따라서, 과분극화된 액체 샘플은 산의 염이며 더 이상 산 자체가 아니다.
본 발명에 따르는 방법의 후속 단계에서는, 트리틸 라디칼 및/또는 상자성 금속 이온 및/또는 이것들의 반응 생성물을 임의적으로 액화된 조성물로부터 제거한다. 과분극화된 샘플이 인간 또는 동물 생체에서 MR 조영제로서 사용되도록 의되되는 경우, 트리틸 라디칼과 상자성 금속 이온 둘 다를 바람직하게는 액화된 조성물로부터 제거한다.
트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 부분적으로, 상당히 또는 완전히 제거하는데에 유용한 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 적용가능한 방법은 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온의 본질에 따라 달라진다. 과분극화된 샘플을 함유하는 고체 조성물을 용해 또는 용융시키면, 트리틸 라디칼 및/또는 상자성 금속 이온은 침전되고, 따라서 여과에 의해 액체로부터 용이하게 분리할 수 있다. 침전이 일어나는지의 여부는 물론 용매의 본질 및 트리틸 라디칼 및/또는 상자성 금속 이온의 본질에 따라 달라진다.
침전이 일어나지 않는 경우에는, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 크로마토그래피적 분리 기술, 예를 들면 액체상 크로마토그래피, 예를 들면 역상 이온교환 크로마토그래피, (고체상) 추출 또는 해당 분야에 공지된 기타 크로마토그래 피적 분리 방법을 사용하여 제거할 수 있다. 일반적으로, T1 이완으로 인해 액체 샘플 감쇠에서 분극화로서 한 단계에서 트리틸 라디칼과 상자성 금속 이온 둘 다를 제거할 수 있는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 임의의 원치않는 화합물이 액체 샘플로부터 빠르게 제거될수록, 샘플 내에 보유된 분극화 수준은 높아진다. 따라서, 샘플과 트리틸 라디칼과 상자성 금속 이온 사이의 긴밀한 접촉이라는 관점 뿐만 아니라, 빠르고 효율적인 제거라는 관점에서, 유사한 화학적 성질을 갖는, 예를 들면 친유성 또는 친수성 여부가 일치하는 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 선택하는 것이 유리하다. 예를 들면 친유성 트리틸 라디칼 및 친유성 상자성 킬레이트를 사용하는 경우, 이러한 화합물 둘 다를, 한 단계에서, 단일 크로마토그래피 칼럼에서 역상 액체 크로마토그래피를 통해 제거할 수 있다.
(예를 들면 상자성 금속 염의 사용으로 인해) 자유 상자성 금속 이온이 액화된 조성물 내에 존재하는 경우, 이러한 이온을 바람직하게는, 문헌[O.Vigneau 등, Anal.Chim.Acta 435(1), 2001, 75-82]에 기술된 바와 같은 이온 인식(imprinted) 수지 또는 양이온 교환 수지를 사용하여 제거한다. 또다른 가능한 방법은, 문헌[A.Sorin 등, J.Membrane Science 267(1-2), 2005, 41-49]에 개시된 바와 같이, 자유 상자성 금속 이온을 하전된 유기 멤브레인 상에 선택적 착화시킴으로써 나노-여과하는 것이다. 또한, 문헌[S.Donald 등, J.Inorg. Biochem. 56(3), 1994, 167-171]에 개시된 바와 유사하게, 친화 크로마토그래피를 통해 자유 상자성 금속 이온을 액화된 조성물로부터 제거할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 자유 상자성 금속 이온을 표면 개질된 중합체 추출법인 스모펙스(Smopex, 등록상표)를 통해 제거할 수 있다. 스모펙스 소거제는 거의 전적으로 섬유 표면 상에만 존재하는 활성 소거 기를 함유한다. 이것은 빠른 반응 역학 및 높은 금속 함량을 나타내며, 기계적으로 및 화학적으로 안정하다. 또다른 실시양태에서, 자유 상자성 금속 이온과 저-용해도 화합물, 예를 들면 저-용해도 염을 형성하는 용해 매체를 선택하거나 조성물을 분극화시키기 전에 침전보조제를 조성물에 첨가함으로써, 자유 상자성 금속 이온을 침전을 통해 제거할 수 있다. 예를 들면 조성물이 Gd3+-염, 예를 들면 GdCl3를 포함하는 경우, Na3PO4를 침전보조제로서 조성물에 첨가하면, 이제는 샘플, 트리틸 라디칼, GdCl3 및 Na3PO4를 포함하게 된 조성물이 동적 핵 분극화된다. 예를 들면 수성 운반체에 용해 시, GdCl3와 Na3PO4는, 침전되므로 여과에 의해 용이하게 제거될 수 있는 저-용해도 Gd-인산염을 형성할 것이다. 다른 한편으로는, 과분극화된 샘플, 트리틸 라디칼 및 GdCl3를 포함하는 고체 조성물은 Na3PO4를 함유하는 수성 운반체에 용해되어, 침전되는 저-용해도 Gd-인산염을 형성할 수 있다.
트리틸 라디칼은 특징적인 자외선/가시광선 흡수 스펙트럼을 갖기 때문에, 트리틸 라디칼의 제거 후 액체 샘플 내에서의 이것의 존재를 검사하기 위한 방법으로서 자외선/가시광선 흡수도 측정법을 사용할 수 있다. 정량적 결과, 즉 액체 샘플 내에 존재하는 트리틸 라디칼의 농도를 수득하기 위해서, 액체 샘플의 액적으로부터 유래된 특정 파장에서의 흡수도가 샘플 내 트리틸 라디칼 농도에 상응하도록, 광학적 분광기를 보정할 수 있다. 과분극화된 액체 샘플을 인간 또는 비-인간 동물 신체의 생체내 MR 영상화를 위한 조영제로서 사용하는 경우에 트리틸 라디칼을 제거하는 것이 특히 바람직하다.
상자성 금속 이온 및/또는 트리틸 라디칼을 제거한 후에, 액체 샘플에 대해 잔여 상자성 금속 이온 및/또는 트리틸 라디칼을 검사할 수 있다.
킬레이트가 (강한) 발색단을 함유하는 경우, 형광 또는 자외선/가시광선 흡수도 측정법을 상자성 킬레이트의 존재를 검사하는 방법으로서 사용할 수 있다. 전기활성 잔기가 킬레이트 내에 존재하는 경우, 상자성 킬레이트의 존재를 검사하는 또다른 방법은 전기화학적 감지법이다.
상자성 금속염이 조성물에서 사용되는 경우, 형광 측정법을 사용하여, 자유 상자성 금속 이온이 액체 조성물로부터 제거된 후에 그것의 존재를 검사할 수 있다. 예를 들면 Gd3+-염이 사용되는 경우, 275 ㎚의 여기 파장을 갖는 형광 및 314 ㎚에서의 방출의 모니터링을, 높은 특이도를 갖고서 자유 Gd3+를 감지하는 방법으로서 사용할 수 있다. 또한, 530 내지 550 ㎚에서의 가시광선 흡수도를 감지한 후 비색분석제(colorimetric agent) PAR(4-(2-피리딜아조)레조르시놀)로써 착화시킴으로써, 자유 Gd3+를 감지할 수 있다. 기타 상자성 금속 이온을 위한 기타 비색분석제는 해당 분야에 공지되어 있고 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 13C-피루브산, 바람직하게는 13C1-피루브산을 샘플 전구체로서, 또는 13C-피루브산염, 바람직하게는 13C1-피루브산염을 샘플로서 포함하고, 화학식 1의 트리틸 라디칼, 및 Gd3+ 또는 Gd3+-염, 예를 들면 GdCl3 또는 Gd(III) 피루브산염을 포함하는 상자성 킬레이트인 상자성 금속 이온을 포함한다. 화학식 1의 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을, 13C-피루브산, 또는 용매, 바람직하게는 물 및 임의적으로 유리 형성제에 용해된13C-피루브산염의 용액에 용해시킴으로써, 조성물을 제조한다. 화합물을 잘 혼합하고, 조성물을 냉각 및/또는 동결시킨다. 동적 핵 분극화시킨 후에, 과분극화된 13C-피루브산 또는 13C-피루브산염을 포함하는 고체 조성물을 수성 운반체, 바람직하게는 수성 완충액에 용해시키거나, 용융시킨 후에 수성 운반체에 용해/희석시킨다.
13C-피루브산(샘플 전구체)의 경우, 조성물을 염기로써 중화시켜 13C-피루브산염(샘플)을 형성한다. 한 실시양태에서, 분극화된 13C-피루브산을 함유하는 고체 조성물을 액체 염기와 반응시켜 그것을 용해시킴과 동시에 13C-피루브산염으로 전환시킨 후, 완충액을 첨가하여 용해를 완결하고, 임의적으로 잔여 13C-피루브산을 13C-피루브산염으로 전환시킨다. 바람직한 실시양태에서, 염기는 NaOH의 수용액이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 완충액은 TRIS 완충액, 시트르산염 완충액 또는 인 산염 완충액이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 완충액과 염기를 하나의 알칼리성 용액에서 배합하고, 이러한 용액을 과분극화된 13C-피루브산을 함유하는 고체 조성물에 첨가하여, 13C-피루브산을 용해시킴과 동시에 13C-피루브산염으로 전환시킨다.
Gd3+-염을 상자성 금속 이온으로서 사용하는 경우, Gd3+-염을, 가능한 한 신속하고 효율적으로, 용해된 13C-피루브산염으로부터 제거하는 것이 중요하다. 적합한 방법은 문헌[O.Vigneau 등, Anal.Chim.Acta 435(1), 2001, 75-82]에 개시된 바와 같은 이온 인식 수지 또는 양이온 교환 수지를 사용하여 제거하는 것이다. 또다른 가능한 방법은, 문헌[A.Sorin 등, J.Membrane Science 267(1-2), 2005, 41-49]에 개시된 바와 같이, 자유 Gd3+를 하전된 유기 멤브레인 상에 선택적 착화시킴으로써 나노-여과하는 것이다. 또한, 문헌[S.Donald 등, J.Inorg. Biochem. 56(3), 1994, 167-171]에 개시된 바와 같이, 친화 크로마토그래피를 통해 자유 Gd3+를 제거할 수 있다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 자유 Gd3+를 신속하고 효율적으로 착화시킬 수 있는 용해 매체에 킬레이트화제, 예를 들면 DTPA, DTPA-BMA, EDTA 또는 EDTA 및 DTPA의 유도체를 첨가함으로써, 자유 Gd3+를 제거한다. 이렇게 수득된 Gd-킬레이트를 하기 단락에 기술된 바와 같이 용해된 샘플로부터 제거할 수 있다.
Gd-킬레이트를 상자성 금속 이온으로서 사용하는 경우, 화학식 1의 트리틸 라디칼과 Gd-킬레이트를 동시에 제거하는 것을 허용하는 역상 액체 크로마토그래피를 사용함으로써, 킬레이트를 제거할 수 있다.
정제된 액체 샘플 내의 잔여 자유 Gd3+, Gd-킬레이트 및 화학식 1의 트리틸 라디칼을 검사하는 적합한 방법은 18/19 페이지에 기술되어 있다.
조성물이 13C-피루브산, 화학식 1의 트리틸 라디칼 및 Gd3+-염을 포함하고, 고체 조성물을 용융시키는 경우, 자유 Gd3+ 금속 이온을 바람직하게는 제거한 후에, 용융된 조성물 내에 포함된 과분극화된 13C-피루브산을 염기로써 중화시켜 13C-피루브산염을 형성한다. 13C-피루브산염으로의 전환 및 용해/희석을 전술된 바와 같이 수행할 수 있다. 자유 Gd3+ 금속 이온을 용융된 조성물로부터 제거하는 공정을 바람직하게는 양이온 교환 고체상 추출법을 통해, 예를 들면 적합한 양이온 교환 고체상 추출 카트리지 또는 칼럼을 사용하여 수행한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 과분극화된 액체 13C-피루브산염을 "통상적인" MR 조영제, 즉 해부학적 영상화를 위한 조영 강화제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 과분극화된 액체 13C-피루브산염의 추가의 이점은 피루브산염이 심지어는 높은 농도에서도 인간 신체에 의해 매우 잘 허용되는 내생 화합물이라는 점이다. 피루브산염은 시트르산 사이클 내의 전구체로서, 인간 신체 내 에서 중요한 대사적 역할을 한다. 피루브산염은 상이한 화합물들로 전환되는데, 이것은 아미노기전달반응을 통해 알라닌이 되고, 산화적 탈카르복실화를 통해, 피루브산염은 아세틸-CoA 및 중탄산염으로 전환되고, 피루브산염은 환원됨으로써 락트산염이 되고 카르복실화됨으로써 옥살로아세테이트가 된다.
또한, 과분극화된 13C-피루브산염의 과분극화된 13C-락트산염, 과분극화된 13C-중탄산염(13C1-피루브산염의 경우, 오로지 13C1,2-피루브산염 또는 13C1,2,3-피루브산염) 및 과분극화된 13C-알라닌으로의 대사적 전환을 인간 신체에서 대사 과정의 생체내 MR 연구에 사용할 수 있다. 13C-피루브산염은 37 ℃에서 인간 전혈에서 약 42 s의 T1 이완시간을 갖지만, 과분극화된 13C-피루브산염의 과분극화된 13C-락트산염, 과분극화된 13C-중탄산염 및 과분극화된 13C-알라닌으로의 전환은 13C-피루브산염 모 화합물 및 이것의 대사산물로부터의 신호의 감지를 허용하기에 충분히 빠른 것으로 밝혀졌다. 알라닌, 중탄산염 및 락트산염의 양은 검사되는 조직의 대사 상태에 따라 달라진다. 과분극화된 13C-락트산염, 과분극화된 13C-중탄산염 및 과분극화된 13C-알라닌의 MR 신호강도는 이러한 화합물의 양 및 감지 시점에서의 과분극화 정도와 관련이 있으므로, 과분극화된 13C-피루브산염의 과분극화된 13C-락트산염, 과 분극화된 13C-중탄산염 및 과분극화된 13C-알라닌으로의 전환을 모니터링함으로써, 비-침투적 MR 영상화를 사용하여 인간 또는 비-인간 동물 신체 내의 생체내 대사 과정을 연구할 수 있다.
상이한 피루브산염 대사산물로부터 유래된 MR 신호 진폭은 조직의 유형에 따라 다르다는 것이 밝혀졌다. 알라닌, 락트산염, 중탄산염 및 피루브산염에 의해 형성된 독특한 대사 피크 패턴은 검사되는 조직의 대사 상태에 대한 지문으로서 사용될 수 있어서, 건강한 조직과 종양 조직을 구별할 수 있게 한다. 이로 인해 본 발명에 따르는 조성물은 생체내 MR 종양 영상화를 위한 탁월한 제제가 된다. 과분극화된 13C-피루브산염을 종양 영상화에 사용하는 것은 WO-A-2006/011810에 상세하게 기술되어 있다.
또한, 과분극화된 13C-피루브산염을 심장 영상화에 사용하는 것은 WO-A-2006/054903에 기술되어 있다.
본 발명의 또다른 양태는 샘플, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 또다른 양태는 동적 핵 분극화에 사용하기 위한, 샘플, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 또다른 양태는 동적 핵 분극화에 의해 수득된, 과분극화된 샘플, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 또다른 양태는 동적 핵 분극화에 사용하기 위한, 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온을 포함하는 분극화제이다. 바람직한 실시양태에서, 분극화제는 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온, 더욱 바람직하게는 트리틸 라디칼 및 상자성 킬레이트, 또는 염 형태의 트리틸 라디칼 및 상자성 금속 이온으로 이루어진다.
실시예 1: 상자성 킬레이트로서 GdDTPA-BMA를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -피루브산의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 1a: 트리틸 라디칼인 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(메톡시에틸)벤조-[1,2-4,5']비스-(1,3)디티올-4-일)메틸 소디움염의 합성
WO-A1-98/39277의 실시예 7에 따라 합성된 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(히드록시에틸)벤조-[1,2-4,5']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 소디움염 10 g(70 mmol)을 아르곤 대기 중에서 디메틸아세트아미드 280 ㎖에 현탁시켰다. 수소화나트륨(2.75 g)에 이어 요오드화메틸(5.2 ㎖)을 첨가하고, 약간 발열성인 반응이 60 분 동안 34 ℃ 수조에서 1시간 동안 진행되도록 두었다. 동일한 양의 수소화나트륨 및 요오드화메틸을 첨가하는 것을 2번 반복하고, 최종 첨가를 완결하고 나면, 혼합물을 실온에서 68 시간 동안 교반한 후 물 500 ㎖에 부었다. 1 M NaOH(aq) 40 ㎖를 사용하여 pH가 13을 초과하도록 pH를 조절하고, 혼합물을 상온에서 15 시간 동안 교반하여, 형성된 메틸 에스테르를 가수분해시켰다. 이어서 2 M HCl(aq) 50 ㎖를 사용하여 상기 혼합물을 약 2의 pH로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(500 ㎖ 및 2 × 200 ㎖)를 사용하여 3번 추출하였다. 유기상을 합한 것을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 증발 건조시켰다. 용출액으로서 아세토니트릴/물을 사용하는 제조용 HPLC를 통해 조질 생성물(24 g)을 정제하였다. 수집된 분획을 증발시켜 아세토니트릴을 제거하였다. 남은 수상을 에틸 아세테이트로써 추출하고, 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 증발 건조시켰다. 물(200 ㎖)을 잔사에 첨가하고, 0.1 M NaOH(aq)를 사용하여 pH를 조심스럽게 7로 조절하고, 이러한 과정 동안 잔사를 서서히 용해시켰다. 중화 후, 수용액을 동결 건조시켰다.
실시예 1b: 실시예 1a의 라디칼을 사용하는, 과분극화된 13 C-피루브산의 제조
실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산(553 ㎎)과 표지되지 않은 피루브산(10.505 g)의 혼합물에 용해시킴으로써, 실시예 1a의 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 이 용액의 액적(2.015 g)을 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 4 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 고체 조성물 ㎎ 당 5.72(적분)이었다. 고체 상태 13C-NMR 측정법은 낮은 숙임각을 사용한 단순 펄스-획득 NMR 시퀀스로 이루어졌다. 동적 핵 분극화된 샘플의 신호강도를, 열적 분극화된 샘플, 즉 동적 핵 분극화 과정을 개시하기 전에 실온에서 자연 분극화된 샘플의 것과 비교하였다. 샘플이 언제 최대 분극화에 도달했는지를 결정하기 위해 서, 동적 핵 분극화 과정을 개시한 후에 상이한 시점에서 저-숙임각 고체 13C-NMR 스펙트럼을 획득하였다. 분극화를 열적으로 분극화된 샘플의 신호강도 및 동적 핵 분극화된 샘플의 신호강도의 비로부터 계산하였다.
실시예 1c: 실시예 1a의 라디칼 및 GdDTPA-BMA를 사용하는, 과분극화된 13 C 1 -피루브산의 제조
조성물이, 13C1-피루브산과 표지되지 않은 피루브산의 혼합물에 트리틸 라디칼과 함께 용해된 GdDTPA-BMA를 함유한다는 것을 제외하고는, 실시예 1b에 기술된 바와 동일한 방법에 따라 실시예를 수행하였다. 조성물은 라디칼 농도가 15 mM이고 Gd3+ 농도가 1.5 mM이었다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 4 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 고체 조성물 ㎎ 당 9.69(적분)였다.
분극화되는 조성물 내의 상자성 금속 이온의 존재로 인해, 13C-피루브산의 고체 상태 분극화는 거의 2배가 될 수 있었다.
실시예 2: Gd(III) 아세트산염을 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -피루브산의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산 43.7 ㎎에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다.
실시예 1b에 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 고체 조성물 ㎎ 당 5.72(적분)였다.
또다른 실시양태에서, 실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산 43.7 ㎎에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, Gd(III) 아세트산염을 혼합물에 첨가하여 Gd3+ 농도가 2 mM인 조성물을 수득하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다.
실시예 1b에 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 고체 조성물 ㎎ 당 9.37(적분)이었다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니, 고체 상태 분극화가 약 2 배 만큼 강화되었다.
실시예 3: 상자성 금속 이온의 부재 하에서의, 과분극화된 13 C 1 -피루브산염의 용액의 제조(비교실시예)
실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 18.9 mM인 조성물 43 ㎎을 제조하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 수산화나트륨과 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(TRIS)의 수용액에 용해시켜, 40 mM TRIS 완충액 중 총 피루브산염 농도가 약 78 mM인 과분극화된 소디움 13C1-피루브산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 20.8 %였다.
실시예 4: 1,3,5-트리스-(N-(DO3A-아세트아미도)-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(10)의 Gd-킬레이트의 합성
(4a) 2-메틸-4-니트로페닐이소시아네이트(1)의 제조
Figure 112008038806861-pct00002
2-메틸-4-니트로아닐린(35.0 g, 230 mmol)을 에틸 아세테이트(400 ㎖)에 용해시키고 0 ℃로 냉각시켰다. 포스겐(180 ㎖, 톨루엔 중 20 %)을 30 분에 걸쳐 적가하자마자, 백색 염이 침전되었다. 최종 첨가를 완결한 후, 온도를 실온으로 서서히 상승시키고, 이어서 반응 혼합물을 환류시켰다(약 100 ℃). 이것을 2시간 30분 동안 환류시키고, 이어서 용매 200 ㎖를 증류 제거한 후, 온도를 80 ℃로 저하시키고 포스겐(140 ㎖, 톨루엔 중 20 %)을 적가하였다. 최종 첨가를 완결한 후, 반응 용액을 3 시간 동안 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 농축 건조시켰다. 갈색/황색 물질을 디에틸 에테르(250 ㎖)에 용해시키고, 여과하고, 농축시켜, 연한 갈색 분말(36 g, 88 %)을 수득하였다.
(4b) 1,3,5-트리스-(4-니트로-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(2)의 제조
250 ㎖ 플라스크 내의 2-메틸-4-니트로페닐이소시아네이트(36.0 g)에 DMSO(50 ㎖)를 첨가하고, 플라스크에 유리 스토퍼를 덮고 그것을 플라스틱 클립으로써 제자리에 고정시킴으로써, 플라스크를 밀봉하였다. 플라스크를 그 즉시 85 ℃로 가열된 유조에 넣고 진한 갈색 반응 용액을 16 시간 30 분 동안 가열하였다. 유조를 제거하고, 반응 용액을 실온으로 냉각시킨 후에 물(800 ㎖)에 붓고, 초음파 처리하고, 침전을 여과 회수하였다. 여과 케이크를 에탄올(500 ㎖)에 첨가하고, 이것을 4 시간 동안 환류시킨 후, 실온으로 냉각시키고, 생성물을 여과 회수하여, 회백색 분말(28.1 g, 78 %)을 수득하였다.
(4c) 1,3,5-트리스-(4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(3)의 제조 방법
1,3,5-트리스-(4-니트로-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(2.86 g, 5.4 mmol)을 THF(70 ㎖)에 용해시켰다. HCl(4.5 ㎖, 6 M), 물(18 ㎖) 및 Pd/C(0.6 g, 10 %)를 첨가하였다. 반응 용기를 비우고, 3 번의 사이클을 통해 아르곤을 채운 후, 파르(Parr) 수소화 장치(60 psi)에서 수소화시켰다. 2 시간 후, 멤브레인 펌프를 사용하여 과량의 수소를 제거하고, Pd/C(10 %)를 여과 제거하였다. 더 이상의 THF가 남아있지 않을 때까지 등명한 반응 용액을 농축시키고, NaHCO3(약 3.7 g)를 사용하여 pH를 7로 조절하였다. 수상을 에틸 아세테이트(3 × 100 ㎖)로써 추출하고, 유기상을 합한 것을 MgSO4를 사용하여 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 갈색 분말을 수득하였다. 조질 생성물을 메탄올로부터 재결정화시켜, 생성물로서 회백색 분말(1.9 g, 80 %)을 수득하였다.
Figure 112008038806861-pct00003
(4d) 1,3,5-트리스-(4-포름아미도-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(4)의 제조
포름산(175 ㎖)을 얼음-냉각된 500 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 넣었다. 아세트산 무수물(15 ㎖, 0.16 mol)을 첨가하고, 황색 용액을 아르곤 중에서 1 시간 동안 0 ℃에서 교반하였다. 이 용액에 트리아민(3)(8.7 g, 0.020 mol)을 첨가하고, 얼음조를 제거하였다. 아르곤 중에서 실온에서 30 분 동안 교반한 후, HPLC를 통해 완전한 반응이 이루어졌음을 확인하였다. 용매를 진공 중에서 제거하고, 갈색 점착성 잔사를 H2O에 현탁시키고, 여과 회수하였다. 이어서 이것을 H2O로써 잘 세척하여 모든 산이 제거되었음을 확인하였다. 생성물은 연한 갈색 고체(10.2 g, 99 %)였다.
Figure 112008038806861-pct00004
(4e) 1,3,5-트리스-(N-포르밀-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난- 2,4,6-트리온(5)의 제조
모든 유리 제품들을 오븐에서 조심스럽게 건조시키고, DMF를 4 Å 분자체 상에서 건조시켰다. Li(Me3Si)2N(116 ㎖, 0.116 mol, 헥산 중 1 M)을 500 ㎖ 둥근바닥 플라스크 내 화합물(4)(10.2 g, 0.0193 mol)의 DMF-용액(115 ㎖)에 첨가하였다. 밝은 갈색 용액에서 붉은 벽돌색 슬러리로 변한 반응 혼합물을 아르곤 중에서 1 시간 동안 교반하였다. 요오드화메틸(12.2 ㎖, 0.196 mol)을 첨가하고, 반응 혼합물을, 2 시간 동안, 또는 HPLC를 통해 완전한 메틸화가 이루어졌음이 확인될 때까지 교반하였다. 이어서 헥산을 회전증발기에서 제거하고 잔사를 NaH2PO4(1300 ㎖, 100 mM)의 용액에 부으면서 격렬하게 교반하였다. 형성된 화합물(5)의 침전을 여과 회수하여 연한 색의 고체(6.7 g, 60 %)를 수득하였다.
Figure 112008038806861-pct00005
(4f) 1,3,5-트리스-(N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(6)의 제조
디옥산(52 ㎖), HCl(52 ㎖, 6 M) 및 화합물(5)(6.5 g, 11 mmol)을 250 ㎖ 둥근바닥 플라스크에서 혼합하여 연한 색의 슬러리를 형성하였다. 반응 혼합물을 아르곤 중에서 30 분 동안 가열 환류하였다. 황색이 된 용액을 실온으로 냉각시키 고, 이어서 용매를 회전증발기에서 제거하였다. 이어서 오렌지색 잔사를 H2O 500 ㎖에 용해시키고, 잔사를 NaHCO3(포화) 용액으로써 중화시키면서 격렬하게 교반하였다. 형성된 침전을 여과 회수하고 H2O로써 여러번 세척하여 연한 색의 고체(4.7 g, 84 %)를 수득하였다.
Figure 112008038806861-pct00006
(4g) 1,3,5-트리스-(N-클로로아세틸-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(7)의 제조
100 ㎖ 둥근바닥 플라스크에서 화합물(6)(4.6 g, 9.5 mmol)을 DMA(15 ㎖)에 용해시키고, 클로로아세틸 클로라이드(2.6 ㎖, 33 mmol)를 0 ℃에서 교반하면서 첨가하였다. 반응물을 아르곤 중에서 실온에서 30 분 동안, 또는 HPLC를 통해 완전한 클로로아세틸화가 이루어졌음이 확인될 때까지 교반하였다. 이어서 슬러리를 물(500 ㎖)이 담긴 큰 비이커에 부으면서 격렬하게 기계적으로 교반하였다. 형성된 침전을 여과 회수하고, 0.3 mbar에서 진공 중에서 건조시켰다(6.3 g). 연한 색의 고체를 아세토니트릴 70 ㎖에 용해시키고 H2O 500 ㎖에 부으면서 격렬하게 기계적으로 교반하였다. 형성된 침전을 여과 회수하고, 건조기에 두어 건조시켰다(6.1 g, 89 %).
Figure 112008038806861-pct00007
(4h) 1,3,5-트리스-(N-(DO3A t-부틸에스테르-아세트아미도)-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온(8)의 제조
50 ㎖ 둥근바닥 플라스크에서 화합물(7)(0.50 g, 0.70 mmol)을 DO3A t-부틸 에스테르(2.5 g, 4.2 mmol), 디이소프로필에틸아민(910 ㎕, 5.2 mmol) 및 아세토니트릴(15 ㎖)과 함께 현탁시켰다. 초음파 처리 후, 반응 혼합물을 아르곤 중에서 75 ℃에서, LC/MS를 통해 완전한 커플링이 이루어졌음이 확인될 때까지, 교반하였다. 이어서 용매를 회전증발기에서 제거하고, 조질 생성물(2.9 g)을 후속 반응에서 사용하였다.
Figure 112008038806861-pct00008
(4i) 1,3,5-트리스-(N-(DO3A-아세트아미도)-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5] 트리아지난-2,4,6-트리온(9)의 제조
조질 생성물(8)(1.9 g)을 TFA(130 ㎖) 및 CH2Cl2(130 ㎖)에 용해시키고 아르곤 중에서 50 ℃에서 교반하였다. 용액을 1 시간 동안 또는 LC/MS를 통해 완전한 보호해제(deprotection)가 이루어졌음이 확인될 때까지, 교반하였다. 이어서 용매를 회전증발기에서 제거하고, 잔사를 진공 중에서 밤새 건조시켰다. 이어서 조질 생성물(2.4 g)을 최종 단계에서 사용하였다.
Figure 112008038806861-pct00009
(4j) 1,3,5-트리스-(N-(DO3A-아세트아미도)-N-메틸-4-아미노-2-메틸-페닐)-[1,3,5]트리아지난-2,4,6-트리온의 가돌리늄 킬레이트(10)의 제조
조질 생성물(9)(2.4 g)을 물에 용해시키고, Gd(OAc)3(1.4 g, 4.2 mmol)를 첨가하면서 교반하였다. 이어서 진공(0.3 mbar)을 가하고, 반응을 LC/MS로써 계속 모니터링하였다. 이어서 완전한 착화가 이루어졌음이 감지되자, 용매를 진공 중에서 제거하였다. 이어서 조질 생성물 3.1 g을 제조용 HPLC(410 ㎎, 실시예 7에서 42 %)를 통해 정제하였다.
실시예 5: 실시예 4의 Gd-킬레이트의 존재 하에서, 과분극화된 13 C 1 -피루브산염의 용액의 제조
실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 18.9 mM인 조성물 43 ㎎을 제조하였다. 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가하여, 실시예 4의 Gd-킬레이트 농도가 0.63 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.89 mM인 조성물을 수득하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 수산화나트륨과 TRIS의 수용액에 용해시켜, 40 mM TRIS 완충액 중 총 피루브산염 농도가 약 78 mM인 과분극화된 소디움 13C1-피루브산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 44.7 %였다.
실시예 3과 실시예 5를 비교하면, 조성물 내의 상자성 금속 이온의 존재로 인해, 샘플 내 분극화 수준은 2 배 초과 만큼 강화될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 상자성 금속 이온의 존재하에서 및 분극화 전 조성물의 탈기를 수행하 는, 과분극화된 13 C 1 -피루브산염의 용액의 제조
실시예 1a의 트리틸 라디칼을 13C1-피루브산에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물 43 ㎎을 제조하였다. 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가하여, 실시예 4의 Gd-킬레이트 농도가 0.5 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.5 mM인 조성물을 수득하였다. 공기를 제거하기 위해, 조성물에 헬륨 기체를 10 분 동안 발포시킴으로써 탈기시켰다. 이로써 조성물을 트리틸 라디칼 및 Gd-킬레이트에 대해 농축시켜, 실시예 1a의 트리틸 라디칼 농도가 18.9 mM이고 실시예 4의 Gd-킬레이트 농도가 0.63 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.89 mM인 조성물을 수득하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 수산화나트륨과 TRIS의 수용액에 용해시켜, 40 mM TRIS 완충액 중 총 피루브산염 농도가 약 78 mM인 과분극화된 소디움 13C1-피루브산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 55.3 %였다.
실시예 5와 실시예 6을 비교하면, 조성물의 탈기에 의해, 13C1-피루브산염 내의 분극화 수준은 약 10 % 만큼 더욱 강화될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 8: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 1,1-비스(히드록시메틸)시클로프로판-1- 13 C의 고체 상태 분극화의 비교
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 1,1-비스(히드록시메틸)시클로프로판-1-13C 9 ㎕와 에틸렌 글리콜 36 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 조성물 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 25.8(적분)이었다.
또다른 실험에서, WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 1,1-비스(히드록시메틸)시클로프로판-1-13C 9 ㎕ 및 에틸렌 글리콜 36 ㎕에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가하여, 실시예 4의 Gd-킬레 이트 농도가 0.62 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.86 mM인 조성물을 수득하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 44.9(적분)였다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니, 고체 상태 분극화가 약 2 배 만큼 강화되었다.
실시예 9: GdCl 3 를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -피루브산의 고체 상태 분극화의 비교
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염 3.1 ㎎을 13C1-피루브산 90 ㎕에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 25 %였다.
또다른 실험에서, WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라-(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염 3.1 ㎎을 13C1-피루브산 90 ㎕에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 15 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, GdCl3(10 mM 수용액 10 ㎕)를 혼합물에 첨가하여, Gd3+ 농도가 1 mM인 조성물을 수득하였다. 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.950 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 50 %였다.
분극화되는 조성물에 상자성 금속 이온을 첨가하였더니, 고체 상태 분극화가 약 2 배 만큼 강화되었다.
실시예 10: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -D 2 -푸마르산염의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 10a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 13 C 1 -D 2 -푸마르산염의 고체 상태 분극화(비교실시예)
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을, 물 17 ㎕에 용해된 0.21 mmol 13C1-D2-푸마르산과 0.24 mmol TRIS의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 220이었다(적분/mmol-13C).
실시예 10b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용한 13 C 1 -D 2 -푸마르산염의 고체 상태 분극화
또다른 실험에서, WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비 스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을, 물 17 ㎕에 용해된 0.21 mmol 13C1-D2-푸마르산과 0.24 mmol TRIS의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.7 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 2.1 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 630이었다(적분/mmol-13C).
상자성 금속 이온을 첨가하였더니, 고체 상태 분극화가 약 3 배 만큼 강화되었다.
실시예 11: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하거나 사용하지 않는, 과분극화된 13 C 1 -푸마르산염의 용액의 제조
실시예 11a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 과분극화된 13 C 1 -푸마르산염의 용액의 제조(비교실시예)
WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 실시예 10a의 분극화된 고체 조성물을 수산화나트륨의 수용액에 용해시켜, 40 mM TRIS 완충액 중 총 푸마르산염 농도가 약 40 mM인 과분극화된 TRIS-13C1-푸마르산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 9 %였다.
실시예 11b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, 과분극화된 13 C 1 -푸마르산염의 용액의 제조
WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 실시예 10b의 분극화된 고체 조성물을 수산화나트륨의 수용액에 용해시켜, 40 mM TRIS 완충액 중 총 푸마르산염 농도가 약 40 mM인 과분극화된 TRIS-13C1-푸마르산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 23 %였다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니 액체 상태 분극화가 2.5 배 만큼 강화되었다.
실시예 12: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -아세트산염의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 12a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 13 C 1 -아세트산염의 고체 상 태 분극화(비교실시예)
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.199 mmol TRIS-13C1-아세트산염과 물 13 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 195(적분/mmol-13C)였다.
실시예 12b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, 13 C 1 -아세트산염의 고체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.199 mmol TRIS-13C1-아세트산염과 물 13 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.2 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 0.6 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 450(적분/mmol-13C)이었다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니 고체 상태 분극화가 2.3 배 만큼 강화되었다.
실시예 13: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -중탄산염의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 13a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 13 C 1 -중탄산염의 고체 상태 분극화(비교실시예)
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 Cs-13C1-중탄산염 21 ㎎과 글리세롤 5 ㎕과 물 8 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 70(적분/mmol-13C)이었다.
실시예 13b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, 13 C 1 -중탄산염의 고체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 Cs-13C1-중탄산염 21 ㎎과 글리세롤 5 ㎕과 물 8 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 10 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.7 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 2.1 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 390(적분/mmol-13C)이었다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니 고체 상태 분극화가 5.6 배 만큼 강화되었다.
실시예 14: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 13 C 1 -락트산염의 고체 상태 분극화의 비교
실시예 14a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 13 C 1 -락트산염의 고체 상태 분극화(비교실시예)
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.23 mmol 13C1-락트산염(57 % 수용액)에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 13 mM인 조성물을 제조하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같이 수행된 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상 태 분극화를 결정하였더니 28(적분/mmol-13C)이었다.
실시예 14b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, 13 C 1 -락트산염의 고체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.23 mmol 13C1-락트산염(57 % 수용액)에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 13 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.4 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.2 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 2 시간 후에 분극화를 중단시켰다.
실시예 1b에서 기술된 바와 같은 고체 상태 13C-NMR을 통해 고체 상태 분극화를 결정하였더니 178(적분/mmol-13C)이었다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니 고체 상태 분극화가 6.4 배 만큼 강화되었다.
실시예 15: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용할 때와 사용하지 않을 때의 3-히드록시 부티르산염의 액체 상태 분극화의 비교
실시예 15a: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하지 않는, 3-히드록시부티르산염의 액체 상태 분극화(비교실시예)
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.224 mmol 3-히드록시부티르산염(자연존재비 13C)과 물 15 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 13 mM인 조성물을 제조하였다. 와류 및 약한 가열을 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 pH 7.4의 20 mM 인산염 완충액의 수용액에 용해시켜, 약 40 mM의 총 농도를 갖는 과분극화된 3-히드록시부티르산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 8 %였다.
실시예 15b: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, 3-히드록시부티르산염의 액체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올- 4-일)메틸 소디움염을 0.224 mmol 3-히드록시부티르산염(자연존재비 13C)과 물 15 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 13 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.5 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 1.5 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 pH 7.4의 20 mM 인산염 완충액의 수용액에 용해시켜, 약 40 mM의 총 농도를 갖는 과분극화된 3-히드록시부티르산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 26 %였다.
상자성 금속 이온을 첨가하였더니 액체 상태 분극화가 3 배 초과 만큼 강화되었다.
실시예 16: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, TRIS- 13 C 1 -글루탐산염의 액체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올- 4-일)메틸 소디움염을 0.06 mmol 13C1-글루탐산과 74 μmol TRIS와 물 7 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 16 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.3 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 0.9 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 수용액에 용해시켜, 약 10 mM의 총 농도를 갖는 과분극화된 트리스-13C1-글루탐산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 25 %였다.
실시예 17: 실시예 4의 Gd-킬레이트를 사용하는, TRIS- 13 C 1 -아스파르트산염의 액체 상태 분극화
WO-A-97/09633의 실시예 29에 따라 합성된 트리틸 라디칼인 트리스-(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)-메틸벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3-디티올-4-일)메틸 소디움염을 0.058 mmol 13C1-아스파르트산과 74 μmol TRIS와 물 7 ㎕의 혼합물에 용해시킴으로써, 트리틸 라디칼 농도가 16 mM인 조성물을 제조하였다. 또한, 실시예 4의 Gd-킬레이트를 첨가함으로써, Gd-킬레이트 농도가 0.3 mM인, 즉 Gd3+ 농도가 0.9 mM인 조성물을 수득하였다. 와류, 약한 가열 및 초음파 처리를 병행하여 조성물을 균질해질 때까지 혼합하고, 시료 컵에 넣고 DNP 분극화기에 삽입하였다. 극초단파(93.890 GHz)를 조사하면서 3.35 T 자기장에서 1.2 K에서 DNP 조건에서 조성물을 분극화시켰다. 3 시간 후에 분극화를 중단시키고, WO-A-02/37132에 따르는 용해 장치를 사용하여 조성물을 수용액에 용해시켜, 약 10 mM의 총 농도를 갖는 과분극화된 트리스-13C1-아스파르트산염의 중성 용액을 수득하였다.
400 MHz에서 액체 상태 13C-NMR을 통해 액체 상태 분극화를 결정하였더니 16 %였다.

Claims (19)

  1. 인간 또는 비-인간 동물 신체 내의 대사 과정에서 특정 역할을 하는, 13C 또는 15N이 풍부한 내생(endogenous) 화합물인 샘플;
    탄소-기재의 트리틸 라디칼; 및
    가돌리늄 이온
    을 포함하고
    상기 트리틸 라디칼이 화학식 1의 라디칼이고;
    <화학식 1>
    Figure 712013003878426-pct00012
    (상기 식에서,
    M은 수소 또는 1 당량의 양이온이고;
    R1은 동일하거나 상이하고, 직쇄형 또는 분지형 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2(여기서 n은 1, 2 또는 3이고, X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기임))
    상기 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물이 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴 및 아스파르트산, 아세트산염, 피루브산, 피루브산염, 옥살산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 락트산, 시트르산염, 중탄산염, 말론산염, 숙신산염, 옥살로아세트산염, α-케토글루타르산염, 3-히드록시부티르산염, 이소시트르산염 및 우레아로 이루어지는 군에서 선택된 것인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 동적 핵 분극화에 사용하기 위한 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 가돌리늄 이온이 킬레이트화된 형태 또는 염의 형태인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 가돌리늄 이온이 킬레이트화된 형태이고, 킬레이트화제가 고리형 또는 비고리형 킬레이트화제, 또는 N, O, S 및 P로 이루어진 군의 헤테로원자를 함유하는 고리형 또는 비고리형 킬레이트화제인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 가돌리늄 이온이 킬레이트화된 형태이고, 킬레이트화제가 DOTA 또는 DO3A로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 가돌리늄 이온이 샘플 또는 샘플의 용액에 가용성인 조성물.
  9. 인간 또는 비-인간 동물 신체 내의 대사 과정에서 특정 역할을 하는, 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물인 과분극화된 샘플;
    탄소-기재의 트리틸 라디칼; 및
    가돌리늄 이온
    을 포함하고,
    상기 트리틸 라디칼이 화학식 1의 라디칼이고;
    <화학식 1>
    Figure 712013003878426-pct00013
    (상기 식에서,
    M은 수소 또는 1 당량의 양이온이고;
    R1은 동일하거나 상이하고, 직쇄형 또는 분지형 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2(여기서 n은 1, 2 또는 3이고, X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기임))
    상기 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물이 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴 및 아스파르트산, 아세트산염, 피루브산, 피루브산염, 옥살산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 락트산, 시트르산염, 중탄산염, 말론산염, 숙신산염, 옥살로아세트산염, α-케토글루타르산염, 3-히드록시부티르산염, 이소시트르산염 및 우레아로 이루어지는 군에서 선택된 것인
    동적 핵 분극화에 의해 수득된 조성물.
  10. 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물인 샘플;
    탄소-기재의 트리틸 라디칼; 및
    가돌리늄 이온
    을 포함하는 조성물을 제조하고;
    조성물에 대해 동적 핵 분극화를 수행하는 것
    을 포함하며,
    상기 트리틸 라디칼이 화학식 1의 라디칼이고;
    <화학식 1>
    (상기 식에서,
    M은 수소 또는 1 당량의 양이온이고;
    R1은 동일하거나 상이하고, 직쇄형 또는 분지형 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2(여기서 n은 1, 2 또는 3이고, X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기임))
    상기 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물이 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴 및 아스파르트산, 아세트산염, 피루브산, 피루브산염, 옥살산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 락트산, 시트르산염, 중탄산염, 말론산염, 숙신산염, 옥살로아세트산염, α-케토글루타르산염, 3-히드록시부티르산염, 이소시트르산염 및 우레아로 이루어지는 군에서 선택된 것인,
    13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물인 과분극화된 고체 샘플의 제조 방법.
  11. 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물인 샘플;
    탄소-기재의 트리틸 라디칼; 및
    가돌리늄 이온
    을 포함하는 조성물을 제조하고;
    조성물에 대해 동적 핵 분극화를 수행하고;
    조성물을 액화시키는 것
    을 포함하고,
    상기 트리틸 라디칼이 화학식 1의 라디칼이고;
    <화학식 1>
    Figure 712013003878426-pct00015
    (상기 식에서,
    M은 수소 또는 1 당량의 양이온이고;
    R1은 동일하거나 상이하고, 직쇄형 또는 분지형 C1-C6-알킬기 또는 -(CH2)n-X-R2(여기서 n은 1, 2 또는 3이고, X는 O 또는 S이고, R2는 직쇄형 또는 분지형 C1-C4-알킬기임))
    상기 13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물이 알라닌, 글리신, 글루타민, 글루탐산, 시스테인, 아스파라긴 및 아스파르트산, 아세트산염, 피루브산, 피루브산염, 옥살산염, 말레산염, 푸마르산염, 락트산염, 락트산, 시트르산염, 중탄산염, 말론산염, 숙신산염, 옥살로아세트산염, α-케토글루타르산염, 3-히드록시부티르산염, 이소시트르산염 및 우레아로 이루어지는 군에서 선택된 것인,
    13C 또는 15N이 풍부한 내생 화합물인 과분극화된 액체 샘플의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 조성물을 용해시킴으로써 액화시키는, 과분극화된 액체 샘플의 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 트리틸 라디칼 또는 가돌리늄 이온 또는 둘 다를 액화된 조성물로부터 제거하는 단계를 더 포함하는, 과분극화된 액체 샘플의 제조 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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