JP5150822B2 - 生体内因性分子の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応をリアルタイムで検出する方法に関し、より詳細には、オーバーハウザーMRI法又は電子スピン共鳴(EPR)法を用いた生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応の検出方法に関する。
ユビキノン(CoQ)、ビタミンK、アスコルビン酸又はフラビンアデニンジヌクレオチド(flavin adenine dinucleotide、FAD)等のラジカル中間体を形成する、すなわちフリーラジカルを有する生体内因性分子(物質)は、生体内で恒常性の維持(ホメオスタシス)のため重要な役割を担っている。特にユビキノンはすべての細胞が持つミトコンドリアの内膜や原核生物の細胞膜に存在する電子伝達体の1つであり、ミトコンドリア機能の保持に深く関与する。このため、ユビキノンは細胞内のミトコンドリア機能の改善、抗酸化効果、抗アルドステロン効果が期待され心機能補助役等としても用いられている。
ユビキノンはミトコンドリア呼吸鎖I〜IIIにおいてQサイクルと呼ばれる電子の授受に関わる分子であり、電子伝達系において呼吸鎖複合体IとIIIの電子を仲介し、その代謝過程でセミキノンフリーラジカルを生成する。このようなフリーラジカルは生体レドックス反応に関係する。生体レドックス反応とは、酸化還元反応を介した生理機能発現及びそれに伴う活性種産生、産生された活性種と生体分子との代謝・反応の全体を表す概念であり、多くの生理現象やがん・糖尿病をはじめとする生体レドックス疾患に密接に関与することが示唆されている。
従って、ユビキノン等の生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応の挙動、状態を直接視覚化する方法があれば、様々な疾病において、生体内因性分子の情報から病気のメカニズム解明や診断・治療が可能となると考えられる。
このような生体内の画像化をおこなう方法としては、従来よりX線CTやPET CT、磁気共鳴(MRI)等があり、空間情報の画像化を行う形態画像化が主として行われてきたが、近年は形態画像化に加え、生体内の機能・現象を可視化する、機能画像化が行われるようになってきた。
例えば、摘出臓器から調製した溶液中に生成するフリーラジカルを電子スピン共鳴法等で計測し、そのスペクトル波形・強度変化から機能解析をした例がある。この方法は、試験管レベルでの解析はできるものの、疾病に生体内物質がいつ、どこで、どのように関与するかを知ることはできなかった。
また、生体内の酸化還元反応を検出・解析する方法としては、合成ニトロキシルラジカル化合物をプローブとして体内に投与し、当該化合物の酸化還元反応を指標に検出・解析する方法が知られている。しかし、この方法では、生体内の酸化還元反応を合成ニトロキシルラジカル化合物の反応を指標に検出・解析することができるが、生体内分子の酸化・還元反応を直接的に検出・解析しているわけではなかった。
本発明は、前述の問題を解決し、様々な疾病においてそのメカニズムの解明や診断・治療を可能とするために、生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応をリアルタイムで視覚化する方法を提供することをその課題とする。
具体的には、本発明は磁気共鳴法(オーバーハウザーMRI(OMRI)や電子スピン共鳴法を含む)を用いて生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応を視覚化する新規検出方法を提供する。すなわち、本発明の検出方法は、生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と;前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と;前記得られた画像化情報を表示する工程と、を含むものである。
また、本発明の検出方法において用いる前記磁気共鳴法としては、OMRI法または電子スピン共鳴法等を挙げることができる。これらの磁気共鳴法を用いることで、より正確な計測画像を得ることができる。
また、本発明の検出方法の画像化対象となる前記生体内因性分子としては、例えばユビキノン、ビタミンK、アスコルビン酸又はFADを挙げることができる。さらに、本発明において、フリーラジカルを有する生体内因性物質であれば画像化の対象となりうる。これらの生体内因性分子を画像化できるということは、様々な疾病においてそれらの分子が関与する生体機能を直接描写しそのメカニズムの解明や診断・治療を可能とするという観点から重要である。
さらに、本発明の検出方法の対象となる生体内因性分子は、生体外から生体内に取り込まれるものであってもよい。
本発明の検出方法によって生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応をリアルタイムで画像化することができるようになり、生体内因性分子であるユビキノン由来のセミキノンラジカルのオーバーハウザーMRIを用いた画像化を世界で初めて実現した。特にユビキノンに関しては、ユビセミキノンラジカルを内因性のプローブ(造影剤)としてマウス直腸内より投与した場合、時間と共にユビセミキノンラジカルが減少することを示した。一方、溶液の状態ではユビセミキノンラジカルは安定であったことから、投与したユビセミキノンラジカルは生体内反応を経て消失したことが明らかとなった。
また、塞性動脈硬化症の動物モデルであるマウス下肢虚血モデルにユビセミキノンをプローブとして応用した場合、対称肢(正常側)に比べユビセミキノンの消失が有意に抑制されたことから本プローブが病態をモニターできることを示した。
これらの結果より、本法は生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応を直接視覚化するだけでなく、生体内因性分子そのものも視覚化できる可能性が示唆された。また内因性物質であるユビキノンを造影剤として活用するので、造影剤の毒性という観点からも劇的な改善が期待される。
さらに、本発明の検出方法を用いてFADセミキノンラジカルのOMRI画像を得ることにも成功した。FADは生体内の様々な臓器において電子伝達体として活用されていることから、FADを生体プローブとして活用することで生体内因性分子を用いたレドックス可視化への応用が期待できる。
以下に、本発明を詳細に説明する。まず、本発明における生体内因性分子とは、生体内で恒常性の維持(ホメオスタシス)のため重要な役割を担い、ラジカル中間体を形成する分子(物質)であって、元々生体内に存在するものをいう。具体的には、ユビキノン、ビタミンK、アスコルビン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、ビタミンB2等を挙げることができる。
これら生成されるラジカルは不対電子を有し常磁性であり、生体レドックス反応に関係する。この生体レドックス反応とは、酸化還元反応を介した生理機能発現及びそれに伴う活性種産生、産生された活性種と生体分子との代謝・反応の全体を表す概念であり、多くの生理現象やがん・糖尿病をはじめとする生体レドックス疾患に密接に関与することが示唆されている。したがって、生体レドックス状態の可視化は低侵襲的な疾患機序解析あるいは新規治療薬の開発に新しい方法論を提供しうる。
本発明の検出方法により、前記生体内因性分子の機能画像としてのレドックス動態画像、代謝画像などの生体機能画像や、形態画像としての組織画像(13C、1H、31P核等)などのずれのない正確な計測画像を得ることができる。
本発明にいて用いる磁気共鳴法は一般的な磁気共鳴法であり、測定対象物に外部から電磁波又は振動磁場を加えると、特定の周波数に対して一種の共鳴を起こして電磁波が強く吸収される現象(磁気共鳴)を利用して、共鳴吸収の起こる周波数や吸収の波形から物質内部の電子や原子核の状態を測定する方法である。このような磁気共鳴法の具体例としては、磁気共鳴映像(MRI)法、オーバーハウザーMRI(OMRI)法、核磁気共鳴(NMR)法、電子スピン共鳴(EPR)法、等を挙げることができる。前記各種磁気共鳴法の測定条件は、それぞれの測定法に一般的に用いられる条件の範囲で適宜選択することができる。
係る磁気共鳴法による画像化のための装置としては、例えば国際公開公報WO 2010/110384号に開示されている装置、すなわち、「計測対象物の磁気共鳴を励起させるための磁場を発生させる磁場発生手段と、計測対象物または磁場発生手段を移動させることにより計測対象物を磁場発生手段の磁場中を移動させる移動手段と、移動手段による移動中に停止することなく、計測対象物の磁場発生手段に対する移動方向yおよびこの移動方向yに対して直交する方向xのいずれか一方または両方に傾斜磁場を掛けて位相エンコードおよび周波数エンコードのいずれか一方または両方により、計測対象物中の計測画像信号を得る計測手段と、計測画像信号に対し、y方向の移動の影響を補正した補正画像信号を得る補正手段と、を有する装置」を用いることができる。
ここで、前記磁場発生手段は、所定の大きさを発生させる第1の磁場発生手段と、この第1の磁場発生手段の磁場とは異なる大きさの磁場を発生させる第2の磁場発生手段とを有するものであり、前記移動手段は、計測対象物または前記第1および第2の磁場発生手段を移動させることにより、計測対象物を第1および第2の磁場発生手段の磁場中を順に移動させるものであってもよい。
また、前記移動手段は、計測対象物または第1および第2の磁場発生手段を回転移動させることにより、計測対象物を第1および第2の磁場発生手段の磁場中を順に通過させる回転移動手段であってもよい。
このように磁場発生手段を移動する計測対象物に適用することで生体内因性分子の情報を得ることができる。ここで、例えば、レドックス動態画像を得るためには、第1または第2の磁場発生手段の一方は核磁気共鳴を励起して計測するためのものであり、他方は電子スピン共鳴を励起して計測するためのものであってもよい。これにより、ずれのない正確な生体レドックス動態画像を得ることができる。
なお、第1および第2の磁場発生手段は、どちらが大きい磁場を発生させるものであっても良いが、第2の磁場発生手段が第1の磁場発生手段の磁場よりも大きい磁場を発生させるものである場合、例えば低磁場である第1の磁場発生手段をOMRIの電子スピン励起装置として用い、高磁場である第2の磁場発生手段をMRIおよびOMRIの外部磁場発生装置として用いることもできる。これにより、第2の磁場発生手段ではMRI画像およびOMRI画像が得られる。
一方、第1の磁場発生手段が第2の磁場発生手段の磁場よりも大きい磁場を発生させるものである場合は、例えば高磁場である第1の磁場発生手段をMRIの外部磁場発生装置として用い、低磁場である第2の磁場発生手段をOMRIの外部磁場発生装置として用いることもできる。これにより、第1の磁場発生手段ではMRI画像が得られ、第2の磁場発生手段ではOMRI画像が得られる。
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程では、前記得られた生体内因性分子の情報(計測結果)に対し、計測対象物の移動の影響が補正されて補正画像信号が得られる。係る補正信号(画像化情報)は、計測画像信号をS(kx,ky)、補正画像信号(画像化情報)をS’(kx,ky)としたとき、式
(但し、kx、kyはx方向およびy方向の空間周波数、γは磁気回転比、Gy (n)はn回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、vyはy方向の移動速度、Δtyyは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ty0は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。)によって得られるものであってもよい。
(但し、kx、kyはx方向およびy方向の空間周波数、γは磁気回転比、Gy (n)はn回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、vyはy方向の移動速度、Δtyyは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ty0は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。)によって得られるものであってもよい。
また、計測画像信号をS(kx,ky,kz)、補正画像信号(画像化情報)をS’(kx,ky,kz)としたとき、式
(但し、kx、ky、kzはx方向、y方向およびz方向の空間周波数、γは磁気回転比、Gy(n)はn回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、vyはy方向の移動速度、Δtyは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ty0は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。)によって得られるものであってもよい。
(但し、kx、ky、kzはx方向、y方向およびz方向の空間周波数、γは磁気回転比、Gy(n)はn回目の計測における位相エンコードまたは周波数エンコードの傾斜磁場強度、vyはy方向の移動速度、Δtyは位相エンコードまたは周波数エンコードの印加時間、ty0は位相エンコードまたは周波数エンコードの印加までの時間である。)によって得られるものであってもよい。
前記得られた画像化情報はモニター等の表示部に表示され、これにより生体内因性分子そのものや生体内因性分子が関与する反応をリアルタイムで観測することが可能となる。
次に、本発明の効果に関して実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を変更しない範囲で様々な変更及び修飾等されたものも本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
[実施例1]
ファントム実験
各チューブ(内径4.7mm)に、0、0.5、1、2、4、6、8mMユビキノン水溶液(pH11.8)(図3a参照)を含む、7本のチューブからなるファントムを使用した。ユビキノン/NADHファントム実験では、両試薬はリン酸緩衝液(PBS)(pH7.4)中に溶解している。ユビキノン溶液(終濃度10mM)中にNADH溶液(終濃度50mM)を加え、OMRIイメージングを行った。結果を図4に示す。
ファントム実験
各チューブ(内径4.7mm)に、0、0.5、1、2、4、6、8mMユビキノン水溶液(pH11.8)(図3a参照)を含む、7本のチューブからなるファントムを使用した。ユビキノン/NADHファントム実験では、両試薬はリン酸緩衝液(PBS)(pH7.4)中に溶解している。ユビキノン溶液(終濃度10mM)中にNADH溶液(終濃度50mM)を加え、OMRIイメージングを行った。結果を図4に示す。
EPRサイクル中における過度な出力の集中を避けるため、フィールドサイクルモードで運転する特注のヒト全身用マグネット(直径79cm、長さ125cm)(フィリップス研究所、ハンブルク)を用いてOMRIの実験を行った。EPR B0は8.1mT、NMR B0は15mTとした。マウス実験用の共鳴装置は625kHzに調整されており、帯域幅は80kHzでNMR送信サドルコイル(直径25cm、長さ23cm)、受信ソレノイドコイル(直径2.5cm、長さ60mm)からなる。また、最大送信出力は250W(ピーク)である。EPRでは、220.6MHzに調整されたサドルコイル(直径13.5cm、長さ23.5cm)とNMRコイルが使用されている。最大送信出力は100Wである。
MRI用の標準的なグラディエントエコー型シーケンスを用いて、OMRIの実験を行った。フェーズエンコーディングステップには、オーバーハウザー効果(過分極化)を引き起こすFPR飽和パルスが先行した。ある出力における600msのEPRパルスが、この実験に使用された。パルスシーケンスはB0フィールドから開始し8.1mTとし、それはEPR照射に相当した。約200msの間、EPR照射(220.6MHz)が続き、ラジオ周波数(RF)パルスと関連するフィールドグラディエントがオンになる前に、B0フィールドは15mTとなった。イメージは、そのシステムにより実行された標準ソフトウエアを使用してエコーから再構成され、DICOM形式(Digital Imaging and Communications in Medicine)で保存された。OMRIの一般的なスキャン条件は、TEPR×TR×TE=600ms×1200ms×25ms、No. of averages=1、64phase−encoding stepsである。イメージングフィールド(ファントム28mm、生体内48mm)は、64×64サイズである。
[実施例2]
生体内OMRIイメージング
C57BL6マウス(雌、5週齢)は、日本エスエルシー株式会社(浜松、日本)から購入し、実験前に1週間順応させた。マウスはケージ当たりに5匹で、温度および概日リズムを調整した室内で、不断給水・給餌で飼育し、実験時に6〜8週齢、体重は20〜30gだった。全ての手順および動物の取扱いは、九州大学薬学部動物実験倫理委員会により承認されており、九州大学薬学部動物実験ガイドラインに沿って実験を行った。
生体内OMRIイメージング
C57BL6マウス(雌、5週齢)は、日本エスエルシー株式会社(浜松、日本)から購入し、実験前に1週間順応させた。マウスはケージ当たりに5匹で、温度および概日リズムを調整した室内で、不断給水・給餌で飼育し、実験時に6〜8週齢、体重は20〜30gだった。全ての手順および動物の取扱いは、九州大学薬学部動物実験倫理委員会により承認されており、九州大学薬学部動物実験ガイドラインに沿って実験を行った。
マウスは、ウレタン(2g/kg)で麻酔し、胃側を下にして粘着性の皮膚用テープでホルダーに固定した。実験中のマウスの体温は37±1℃だった。マウスを共鳴装置に移し、OMEI測定を開始した。下腹部領域のOMRIイメージングは、pH11.8に調整した8mMユビキノン水溶液(800μL)を直腸投与し、その直後に行った。OMRIの条件は以下の通りである。TR、1200ms;TE、25ms;TEPR、600ms;number of phase−encoding gradient steps、64;NEX、4;FOV、48mm´48mm;Matrix size、64´64(implane resolution 0.75mm);slice thickness、30mm;number of average、1、scanning time、79s。OMRIデータは、Image J software package(http://rsb.info.nih.gov/ij/)を使用し、解析を行った。
[実施例3]
フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)のOMRIによる分子イメージング
体内電子伝達体であるフラビンアデニンジヌクレオチド(flavin adenine dinucleotide、FAD)は、いくつかの代謝反応に必要な酸化還元反応の補因子である。FADH2はエネルギーキャリアであり、還元された補酵素はミトコンドリアでの酸化的リン酸化の基質として使われる。係るFADをPBS(pH7.4)に溶解し各濃度のFAD水溶液を調整した。そして、FADの濃度に対して等濃度のNADH水溶液を添加した後、OMRIにより画像化を行った。結果を図6に示す。
フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)のOMRIによる分子イメージング
体内電子伝達体であるフラビンアデニンジヌクレオチド(flavin adenine dinucleotide、FAD)は、いくつかの代謝反応に必要な酸化還元反応の補因子である。FADH2はエネルギーキャリアであり、還元された補酵素はミトコンドリアでの酸化的リン酸化の基質として使われる。係るFADをPBS(pH7.4)に溶解し各濃度のFAD水溶液を調整した。そして、FADの濃度に対して等濃度のNADH水溶液を添加した後、OMRIにより画像化を行った。結果を図6に示す。
[実施例4]
マウスをイソフルラン麻酔下(2%)、大動脈結紮による右下肢虚血モデルを作成した。OMRI測定は虚血24時間後に行った。対称肢には虚血肢と同様に手術を行ったが、結紮のみ行わなかった。50mMのユビキノン水溶液に100mMのNADHを添加し、10分後の混合液をマウス両肢に200μL筋肉内投与しすぐにOMRI測定を開始した。結果を図7に示す。
[結果]
図1aに、ミトコンドリア呼吸鎖(複合体I)におけるユビキノンの酸化・還元スキームを示す。ユビキノンは、NADHから2つの電子を受け取り、そして電子スピン共鳴スペクトルが検出できるユビセミキノンラジカル形態を介し、ユビキノールに変換される。ユビキノンの酸化還元に関わるベンゾキノン誘導体部位はパラ型に酸素原子が付属しており、C2にはメチル基、C4、C5には酸素原子よりメチル基が付属している。C3にはイソプレン側鎖が付属しており、生体膜中に保持されるべく長い炭素鎖を形成している。構造は以下図の通りである。
マウスをイソフルラン麻酔下(2%)、大動脈結紮による右下肢虚血モデルを作成した。OMRI測定は虚血24時間後に行った。対称肢には虚血肢と同様に手術を行ったが、結紮のみ行わなかった。50mMのユビキノン水溶液に100mMのNADHを添加し、10分後の混合液をマウス両肢に200μL筋肉内投与しすぐにOMRI測定を開始した。結果を図7に示す。
[結果]
図1aに、ミトコンドリア呼吸鎖(複合体I)におけるユビキノンの酸化・還元スキームを示す。ユビキノンは、NADHから2つの電子を受け取り、そして電子スピン共鳴スペクトルが検出できるユビセミキノンラジカル形態を介し、ユビキノールに変換される。ユビキノンの酸化還元に関わるベンゾキノン誘導体部位はパラ型に酸素原子が付属しており、C2にはメチル基、C4、C5には酸素原子よりメチル基が付属している。C3にはイソプレン側鎖が付属しており、生体膜中に保持されるべく長い炭素鎖を形成している。構造は以下図の通りである。
イソプレン側鎖の数(n=)は高等動物では10、下等動物では6〜9であり、イソプレン側鎖が長くなればなるほど黄橙色を呈するようになる。なおn=10のユビキノンは「UQ10」と、イソプレン側鎖の数字を示し、化粧品材料として使用されているコエンザイムQ10とはイソプレン側鎖の数が10ということになる。
図1bに示すユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルは、1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpH11.8に調整した8mMユビセミキノンにより産生された。前後に検出される電子スピン共鳴スペクトルは、内部標準である1mM 15N−CAT1より産生された。15N−CAT1は、14N−CAT1をベースに合成した。
図1cは、ユビセミキノンラジカルの動的核分極(DNP)スペクトルを示す。これは、オーバーハウザー効果MRI(OMRI)装置を用いて得られた。掃引幅(Sweep width)は、1.6mTで100ステップのスキャニングを行った(0.016mT/スキャン)。使用したOMRI装置の電子スピン共鳴照射磁場は7.887mTとした。電子スピン共鳴並びにオーバーハウザー効果MRIの条件は以下の通りである。EPR:マイクロ波強度1mW、変調磁場周波数100kHz、変調磁場振幅0.002mT、照射時間0.03秒、掃引幅5mT、OMRI:TR(繰り返し時間)1200ms、TE(エコー時間)25ms、TEPR 600ms。
ユビセミキノンラジカル産生における濃度及びpH依存性を、図2に示す。図2aは、濃度依存性(左)と電子スピン共鳴スペクトル(右)を示しており、これは1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpH11.8に調整した8mMユビキノンを用いて測定した。ユビキノン濃度は、1、2、4、8、12及び20mMMに設定した。全ての測定は、要事調整した水溶液を用いて3回繰り返しにて行った。ユビキノン濃度の増加と比例しユビセミキノンが産生され、濃度依存的な反応であることが示されている。
図2bは、pH依存性の分散プロット図である。1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpHを9.84、10.8、11.0、11.2、11.5、12.2に調整した8mMユビキノンから産生されるユビセミキノンの濃度が示されている(左図)。また、各pHに調整した後、Xバンド電子スピン共鳴測定を10分間実施した結果(右図)、最大シグナル強度は、pH11.8に調整されたユビキノン水溶液で得られた。しかしながら、pH10.8以下の条件下では、電子スピン共鳴シグナルは得られなかった。EPR測定の条件は、マイクロ波強度1mW、変調磁場周波数100kHz、変調磁場振幅0.002mT、照射時間0.03秒、掃引幅5mTである。
図3に、OMRIを用いたユビセミキノンラジカルのインビトロ分子イメージングの結果を示す。図3aは、疑似試料の構成図を示す。数値は、1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpH11.8に調整したユビキノンラジカルの濃度を示している(0.5、1、2、4、6、8mM)。各ユビキノンラジカル水溶液はガラスチューブ(直径4mm、高さ30mm)に注入され測定を行った。
図3bは、EPR照射を行った場合(Hyperpolization ON)、図3cはEPR照射を行っていない場合(Hyperpolization OFF)における疑似試料のOMRI画像を示している。EPR照射がOFFの条件では、OMRI画像の取得感度が低くかったが、EPR照射を行い、核スピンを増強したOMRIイメージング法(EPR照射ON)において、8mMのユビキノンから産生されたユビセミキノンラジカル画像データを取得した。
図3dは、EPR照射ONの画像データとOFFの画像データの差分画像データを示し、図3EはEPR照射の有無によるSNR信号強度の差を示している。以上の結果から、水溶液をアルカリ性に調整することで、ユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトル及びOMRIを用いた画像データを取得可能であることを証明した。さらに生体内のレドックス状態を解析するため、電子供与体を用いた測定系を構築した。
図4に、EPR及びOMRIを用いたCoQ/NADHシステムにおけるユビセミキノンラジカルのスペクトル分析及び分子イメージングの結果を示す。生体内のpH条件の下、電子供与体であるNADHを添加し産生させたユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルとOMRIを用いてイメージングを行った。
図4aは、pH7.4に調整したPBS中に溶解した10mMのコエンザイムQ−0(Co−Q0;イソプレン側鎖の数がゼロ))、50mMのNADH、及び10mMのCoQ−0と50mMのNADHを混合物の電子スピン共鳴スペクトルを示している。また、図4bはユビセミキノンラジカルを擬似的に配置した図を示し、係るユビセミキノンラジカルに対して、電子スピン共鳴をさせたとき(Hyperpolization ON)と共鳴させないとき(Hyperpolization OFF)のOMRI画像がそれぞれ図4c及び図4dである。さらに、図4eはHyperpolization ONとOFFの差分データにより得られたユビセミキノンフリーラジカルの画像データであり、これらの結果から、電子供与体であるNADHを添加した条件において産生されたユビセミキノンラジカルの電子スピン共鳴スペクトルとOMRIを用いたイメージングが可能であることを証明した。
ユビセミキノンラジカルを野生型マウスの直腸に投与し、OMRIを用いたインビボイメージングの性能を評価した結果を図5に示す。図5aは、マウスの大腸と盲腸におけるユビセミキノンラジカルの代謝動態を示している。また、図5bはマウスのプロトンMRイメージ(生体画像データ)(Hyperpolization−OFF)を、図5cはプロトンMRイメージとユビセミキノンフリーラジカルイメージの融合画像データを、図5dはレドックスマップとMRIイメージを、それぞれ示す。レドックスマップは、ユビセミキノンフリーラジカル画像データの1ピクセル当たりにおけるユビセミキノンフリーラジカル消失速度定数を計算した結果の片対数プロット図である。さらに、図5eは、盲腸におけるOMRIシグナルの経時変化とユビキノン水溶液の安定性に関する片対数プロット図である。
大腸と盲腸のOMRIイメージの強度は、ユビセミキノンフリーラジカルの消失によって徐々に減少することが示されている(a)。大腸と盲腸におけるOMRIイメージの強度は、ユビセミキノンフリーラジカルの消失に応じて徐々に減少したが、ユビキノン水溶液の強度は、20分以上も安定であった。これらのデータは、生体内に投与されたユビキノン水溶液から体内でのレドックス反応によりユビセミキノンフリーラジカルが産生されその体内動態をイメージングしていることを示している。
図6にフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)のOMRIによる分子イメージングの結果を示す。FADのESRスペクトルの中心磁場をOMRIの電子スピン励起磁場として照射し、FADセミキノンラジカルのOMRI画像を得た。10mM〜100mMのFAD水溶液を調整し、同様に等モルのNADHを添加しESRで定量を行った結果、図6Bに示すようにFADの濃度依存的にセミキノンラジカルが生成することが明らかとなった。FADは生体内における様々な臓器において電子伝達体として機能していることから、FADを生体プローブとして使用することで生体内因性分子を用いたレドックスの可視化が可能となる。
図7に閉塞性動脈硬化症の動物モデルであるマウス下肢虚血モデルのユビセミキノンプローブを用いた解析結果を示す。図7に示されるように、ユビキノンプローブ投与後にマウス両肢においてユビセミキノンラジカル分布画像を得た。虚血肢における画像強度は対称肢に比べ高かった。それぞれの画像強度の領域を関心領域として選定し、強度の変化をプロットすると虚血肢におけるプローブの消失は対称肢に比べ有意に遅かった。これは虚血による筋組織の障害によりユビキノンプローブのラジカル消失能が有意に低下したことを表している。これらの結果から、本プローブは生体組織のレドックス機能障害をモニターできることを示している。
Claims (4)
- 生体内因性分子の酸化及び/又は還元反応をリアルタイムで検出するための方法であって、
測定対象となる生体に磁気共鳴法を適用して生体内因性分子の情報を得る工程と、
前記得られた生体内因性分子の情報を処理して画像化情報を得る工程と、
前記得られた画像化情報を表示する工程と、
を含み、前記生体内因性分子の情報を得る工程は、前記測定対象又は前記測定対象となる生体から得られたサンプル中におけるユビキノン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビタミンK、又はアスコルビン酸の情報を得るものであり、前記測定対象又は前記サンプルは、電子供与体と前記生体内因性分子とが予め投与されているものである、検出方法。 - 前記電子供与体はNADHである、請求項1に記載の検出方法。
- 前記磁気共鳴法がオーバーハウザーMRI法または電子スピン共鳴法のいずれかである、請求項1に記載の検出方法。
- 生体内因性分子は生体外から生体内に取り込まれるものである、請求項1に記載の検出方法。
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