KR101363933B1 - 가자 추출물과 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 패혈증 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 가자 추출물 및/또는 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 비브리오 패혈증 개선용 조성물은 가자 추출물과 지유 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 패혈증을 유발하는 비브리오균에 대한 항균 활성을 가지며 비브리오균에 의한 숙주 세포의 괴사를 억제하는 효과를 나타내었다. 또한 본 발명의 조성물은 세포 독성이 없어 안전하게 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 적용 가능하다.

Description

가자 추출물과 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물{Compositions for improving vibrio vulnificus septicemia comprising Terminalia chebula extract and Sanguisorbae officinalis extract}

본 발명은 비브리오 패혈증 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 가자(Terminalia chebula ) 추출물과 지유(Sanguisorbae officinalis) 추출물을 유효성분으로 하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물에 관한 것이다.

패혈증이란 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반응 증상을 나타내는 것으로 대표적으로 비브리오 균의 감염에 의한 비브리오 패혈증(Vibrio vulnificus septicemia)이 있다. 비브리오 패혈증은 비브리오 불니피쿠스균(Vibrio vulnificus)의 감염에 의한 급성 패혈증으로서, 오염된 어패류를 섭취하거나, 오염된 바닷물이 상처 난 피부에 접촉할 때 감염되며 급성 발열, 오한, 혈압저하, 복통, 구토, 설사 등의 증상이 동반되고 피부 병변의 발생 등의 임상적 특성을 나타낸다. 특히, 간장 질환 등의 기저질환을 앓고 있는 감수성이 높은 환자들의 혈류로 들어간 비브리오 불니피쿠스는 활발하게 증식하는데 이런 간질환을 앓는 환자의 비브리오 패혈증으로 인한 사망률은 50%이상이므로 사망률 감소에 있어서 그에 대한 예방과 치료가 필요하다. 그래서 이를 위한 연구들이 많이 이루어지고 있지만, 이를 치료하는 방법으로 항생제 투여 외에 다른 확실한 치료제나 예방법이 미미한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 예로부터 식용 또는 약용으로 이용되어 오던 한약재 추출물을 이용함으로써 조금 더 안전적인 효과를 기대할 수 있는 방법을 구상하게 되었고 그 결과, 가자 및 지유의 추출물 또는 그 혼합물을 처리할 경우, 비브리오 패혈증감염을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 가자 추출물 및/또는 지유 추출물을 유효성분으로 포함하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 가자 추출물 및/또는 지유 추출물에 의한 비브리오 패혈증 개선용 조성물에 대한 것이다. 가자와 지유 추출물을 사용하여 비브리오균에 대한 최소억제농도(MIC) 실험과 페이퍼 디스크 한천 확산 실험을 수행하였으며 추출물을 각각 처리하였을 시에 항균효과가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 가자와 지유 추출물을 혼합하여 처리하였을 경우 항균 효과가 상승하였다. 패혈증 비브리오균에 감염되면 숙주세포의 괴사가 일어나게 되는데 가자와 지유 추출물을 처리할 경우 세포 괴사의 억제 효과가 나타났으며 각 추출물들은 세포 처리시에 독성을 나타내지 않아 안전성이 확인되었다.

본 발명의 유효성분으로서, 상기 가자(訶子)는 가자나무(Terminalia chebula)의 성숙한 열매에서 씨를 제거하고 말린 과육을 말하는 것으로, 알려진 주요성분 중 탄닌(tannin)이 비교적 많이 함유되어 있고(20~40%) 그 외 케불락산(chebulagic acid), 케불린산(chebulinic acid), 1,3,6-트리갈로일 포도당(trigalloyl glucose), 1,2,3,4,6-펜타갈로일 포도당(pentagalloyl glucose), 엘라그산(ellagic acid), 갈릭산(gallic acid), 루테오익산(luteoic acid) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 약리작용으로는 수렴(收斂), 지사(止瀉)작용, E. coli(대장균), Salmonella typhimurium(쥐티푸스균), Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Bacillus subtilis(고초균), Staphylococcus aureus(황색 포도상구균), Listeria monocytogenes(리스테리아균) 등에 대한 항균활성이 있다.

본 발명의 또 다른 유효성분으로서, 상기 지유(地楡, Sanguisorba officinalis)는 오이풀이라고도 불리며 우리나라 각처의 산지에서 자라는 장미과의 다년생 초본이다. 약용으로 사용하는 부위는 뿌리이며 주요성분으로 탄닌(tannin), 트리터페노이드(triterpenoid)계 사포닌(saponin)이 함유되어 있고 분리된 사포닌에는 지유글리코사이드Ⅰ(ziyu glycosideⅠ) 및 포몰릭산(pomplic acid), 지유 글리코사이드Ⅱ(ziyu glycosideⅡ),지유 글리코사이드 B(ziyu glycoside B)등이 함유되어 있다.(도해 향약대사전, 영림사, 신민교 외1, p654-656; 약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, p362-363).약리작용으로는 본초강목에서 뿌리의 유동엑스는 피부에 항염 작용과 혈관수축작용을 한다고 하며, 대장균에 대한 항균 작용도 있다고 기재되어있다.

상기 가자는 가자나무의 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 열매에서 종자를 제거한 부위가 사용가능하다.

상기 지유는 뿌리, 줄기, 잎, 종자 및/또는 열매가 모두 사용 가능하며, 바람직하게는 뿌리 부위가 사용가능하다.

본 명세서에서 "추출물"은 추출 방법을 불문하고 추출대상인 가자나 지유를 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), 아세톤, 에틸 아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 1,3-부틸렌클리콜, 헥산, 디에틸에테르 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻어진 그 추출물과 그 추출물에서 상기 열거된 영매로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 상기 추출물은 바람직하게는 추출 대상을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하고 얻어진 것으로서, 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미이다.

또 본 명세서에서, "유효성분"은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, "패혈증"은 여러 가지 방법으로 몸 안에 침입한 다양한 미생물에 의하여 나타나는 전신성 염증 반응 증후군으로 이해될 수 있으며 이는 패혈성 쇼크란 용어로도 혼용된다. "비브리오 패혈증"은 비브리오균의 감염으로 인한 패혈증으로 이해될 수 있으며, 보다 바람직하게는 비브리오 불니피쿠스 균의 감염으로 인한 패혈증으로 이해될 수 있다.

또한 "개선"이란 비브리오 패혈증의 제거, 완화, 예방을 포함하는 의미이다.

본 명세서의 조성물은 가자 추출물과 지유 추출물 각각을 유효성분으로 이용할 수도 있지만, 바람직하게는 가자 추출물과 지유 추출물의 혼합물을 유효성분으로 한다. 하기의 실험예에서 확인된 바와 같이, 가자 추출물과 지유 추출물의 혼합물은 단독의 추출물을 이용한 경우와 비교하여 비브리오 패혈증 개선 효능이 크게 나타난다.

본 발명의 비브리오 패혈증 개선용 조성물은 그 유효성분을 제형, 배합 목적 등에 따라 진통 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.999 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 진통 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 비브리오 패혈증 개선용 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 유효성분인 가자 및/또는 지유 추출물을 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 혼합하여 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다.

제약상 허용되는 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜, 기타 상용되는 것을 포함한다.

경구투여용 고체 조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체 조성물에서는 유효성분인 식물 추출물이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 고체 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 물질로 이루어진 필름으로 피복될 수 있고, 경우에 따라서는 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다.

경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염수가 포함된다. 비수성의 용액제·현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80® 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균 방법으로 무균화될 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 시에 용해시켜 사용할 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다.

바람직하기는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 물론 경구투여방법도 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분의 투여량은 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로는 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 비브리오 패혈증 개선용 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품, 영양 보조제 건강식품, 및 식품 첨가제 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등의 형태의 것들이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. "극미량"이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성(예컨대 면역력 증진)을 부가하여 가지도록 생약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 생약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물, 고삼 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 가자 추출물 및/또는 지유 추출물을 이용한 비브리오 패혈증 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 비브리오 패혈증 개선용 조성물은, 약제학적 조성물과 식품 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 가자 추출물과 지유 추출물을 농도별로 혼합하여 처리하였을 때 나타나는 비브리오 볼니피쿠스균에 대한 항균 효과를 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 가자 추출물 및 지유 추출물의 제조

전남 생약 협동조합을 통해 건조된 생약인 가자 및 지유를 구입하여 각각 600g을 사용하여 유기용매에 추출하였다.

<실시예 1> 가자 추출물의 제조

건조된 가자 600g을 90% 에탄올 2L로 150 수조(water bath)에서 2시간 동안 추출을 2회 반복추출 후 추출액을 여과하고 그 여과액을 회전감압농축기로 감압 농축하였다.

<실시예 2> 지유 추출물의 제조

건조된 지유 600g을 94% 에탄올 2L로 150 수조(water bath)에서 2시간 동안 추출을 2회 반복추출 후 추출액을 여과하고 그 여과액을 회전감압농축기로 감압 농축하였다.

< 실험예 > 가자 및 지유의 항균효과 및 세포괴사 억제효과

<실험예 1> 가자 및 지유의 항균효과

<실시예 1>과 <실시예 2>를 통하여 획득한 가자 추출물과 지유 추출물을 이용하여 병원성 세균에 대한 항균 활성을 확인하였다. 이 병원성 세균은 패혈증 비브리오 균인 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus ), 비브리오 콜레라( Vibrio cholera N16961 - Strain : 01 biovor EL Tor ), 독소생성대장균( enterotoxigenic E. coli, ETEC ), 메티실린 내성 황색포도구균(MRSA), 이질 세균(Shigella flexneri)이다.

<실험예 1-1> 액체배지 희석법을 이용한 MIC 측정

비브리오 불니피쿠스 균주를 액체배지 3ml에 한 콜로니씩 접종하고 37℃에 하룻밤 배양하였다. 상기 배양액을 새로운 액체배지에 1/1000으로 희석하고 80ul씩 96웰 플레이트에 떨어뜨렸다. 단일 추출물 효과를 볼 군에는 완충 용액과 각 가자 및 지유 단독 추출물을, 혼합 처리군에는 가자 및 지유 추출물을 각 농도별로 혼합하여 처리하였고 색보정을 위해 신선한 액체배지에 추출물 처리하여 파라필름으로 봉인한 뒤 37℃에 하룻밤 배양하여 마이크로 플레이트리더(microplate Reader)로 흡광도 600nm에서 측정하여 각 농도별 단일 추출물과 각 추출물의 농도별 혼합 시 항균효과를 확인하였다. 그 결과를 하기 [표 1], [표 2] 및 [도 1]에 나타내었다.

가자 추출물과 지유 추출물의 항균효과를 확인하기 위한 적정농도의 결정은 각 추출물 자체와 혼합 시 추출물에 대한 최소 저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)실험 및 분할 저해농도(fractional inhibitory concentration, FIC), 각 추출물 자체에서 50% 저해하는데 필요한 저해농도(the half maximal inhibitory concentration, IC 50) 결과에 기초하였다.

비브리오 콜레라균에 대한 각 추출물 단독 처리

IC50	Vibrio cholera
가자 추출물	260.20ug/ml
지유 추출물	257.43ug/ml

비브리오 불니피쿠스균에 대한 각 추출물 단독 처리 및 혼합 처리

Vibrio vulnificus	IC50	Alone(ug/ml)		Combination (ug/ml)		FIC index		Outcome
		MIC	Range	MIC	Range	FIC	Range
가자 추출물	42.32 ug/ml	320.83 51.0	125~ 400	140.63 35.1	62.5~ 200	0.875 0.07	0.75~1	Partially synergistic
지유 추출물	100.02 ug/ml	254.17 47.6	125~ 400	103.13 34.0	50~ 200

실험 결과, 비브리오 불니피쿠스에서 가자, 지유 추출물을 단독 처리 시 IC50는 42.323ug/ml, 100.02ug/ml으로 가자 추출물이 더 낮은 농도에서 50% 억제율을 보였다. 하지만, MIC 측정시 320.83ug/ml, 254.17ug/ml으로 최소 저해 농도는 지유 추출물이 더 낮은 농도에서 항균효과를 보였다. 그리고 혼합 처리시 MIC는 지유 추출물의 농도가 가자 추출물의 농도보다 더 낮은 농도에서 억제하여 항균효과가 있다. 이를 토대로 계산한 분할 저해 농도(FIC)가 0.875로 부분적으로 상승효과를 시킨다는 결과를 얻었다. 그러나 [도 1]에서와 같이 가자 100ug/ml, 지유 50ug/ml 또는 가자 50ug/ml, 지유100ug/ml 농도의 혼합시(2:1 또는 1:2) 최소 저해 농도가 가장 바람직하였다.

<실험예 1-2> 페이퍼 디스크를 이용한 한천 확산법

페이퍼 디스크를 이용한 한천 확산법(Paper disc diffusion assay)을 이용하여 가자 추출물 및 지유 추출물의 항균활성을 확인하였다.

비브리오 불니피쿠스균, 비브리오 콜레라를 액체배지 3ml에 한 개의 콜로니를 접종하고 37℃에 하룻밤 배양하였다. 상기 균주 배양액을 1/100으로 희석하여 50μl를 아가 플레이트에 접종(10⁶ CFU)하고 잘 도말 하여 건조하였다. 상기 건조된 플레이트에 멸균한 직경 8mm인 페이퍼 디스크를 올리고 그 위에 50% DMSO/EtOH에 녹여진 각 추출물을 떨어뜨린 후 16시간 동안 37℃에 배양하여 아가 플레이트 주위에 생성된 저지대(Clear zone)를 확인하고 이의 범위를 측정하여 항균 활성을 평가하였다. 이들의 항균활성 결과는 [표 3]에 나타내었다.

시료 종류	저지대 직경(mm)
	Vibrio vulnificus	Vibrio cholera
대조군	19.4 0.25	18 1.27
가자 추출물	20.2 0.37	22.8 0.8
지유 추출물	21.6 0.4	19.4 0.4
조성물(6:4)	23	24

상기 [표 3]에서, 가자 추출물과 지유 추출물은 비브리오 불니피쿠스균과 비브리오 콜레라에 대하여 항균활성을 지님을 확인하였다. 이 결과를 통하여 각 추출물 및 추출물을 혼합한 조성물이 대조군보다 높은 항균활성을 지님을 알 수 있었으며 특히 비브리오 불니피쿠스균에 대한 항균활성이 높게 나타난 것을 확인하였다.

<실험예 2> 가자 및 지유 추출물의 세포괴사 억제효과

비브리오 패혈증 균에 감염되면 균의 독성으로 인하여 세포가 괴사하는 현상이 일어난다. 가자 추출물과 지유 추출물이 비브리오 균에 의한 세포 괴사를 억제하는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

비브리오 불니피쿠스균을 HI 액체배지 3ml에 한 콜로니씩 접종하고 37℃에 하룻밤 배양하였다. 또한 인간 숙주세포(Host cell)를 48웰 마이크로 플레이트 (48 well micropate)에 웰(well)당 5×10⁴으로 접종하고 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 하룻밤 배양하였다. 상기 배양액을 새로운 액체 배지에 1/200으로 희석하여 log phase로 4시간 동안 37℃에 배양한다. 상기 세포 배양 후 무혈청 DMEM 배지로 2회 씻어주고 새로운 배지를 바꿔준 뒤 상기 단일 추출물을 최종 농도가 200ug/ml, 100ug/ml, 80ug/ml, 60ug/ml 가 되도록 처리하고 상기 희석하여 배양한 비브리오 불니피쿠스 배양액을 MOI(bacteria at a multiplicity of infection) 20으로 접종하여 2시간 동안 배양한다.

상기 인간 숙주세포인 HeLa cell에 비브리오 불니피쿠스균을 처리하여 배양한 상등액을 원심분리하여 얻고 그 상등액을 96 웰 마이크로 플레이트(96 well microplate)에 웰 당 30l씩 넣었다. 여기에 젖산 탈수소효소(LDH) 기질을 웰 당 30ul씩 넣고 30분 동안 반응시킨 후 정지 용액을 첨가하여 마이크로 플레이트리더(microplate Reader)로 흡광도 490nm에서 측정하여 독성여부를 확인하였다.

독성 억제 효과에 대한 실험 결과를 하기 계산식을 이용하여 결정되었으며, 그 결과는 [표 4]에 나타내었다. 대조군으로서 비브리오 불니피쿠스 접종군을 사용하였다.

세균 독성 억제 효과(%)=((대조군의 흡광도-추출물 처리시의 흡광도)

/대조군의 흡광도) × 100

농도	60(ug/ml)	80(ug/ml)	100(ug/ml)	200(ug/ml)
가자 추출물	17.97%±2.06 / *	62.74%±3.48 / **	73.80%±1.24 / ***	77.70%±0.59 / ***
지유 추출물	4.88%±5.14	1.89%±0.85	18.30%±5.42	76.70%±0.83 / ***

유의성 P<0.05 : *, P<0.01:**, P<0.001:***

상기 [표 4]에서, 가자 추출물과 지유 추출물이 살아있는 비브리오 불니피쿠스균으로 인한 세포 괴사를 억제시킴을 확인하였다. 가자와 지유 추출물 모두 200ug/ml에서 70%이상의 억제율을 보여 농도가 높을수록 억제율이 높았다. 특히, 가자 추출물의 경우 80ug/ml 까지 60%이상의 억제율이 나타나 지유 추출물에 비해 낮은 농도에서도 패혈증 비브리오균에 의한 세포 괴사로부터 억제하는 효과를 보임을 확인하였다.

<실험예 3> 가자 및 지유 추출물의 안전성 확인

상기 실험에 사용한 가자 추출물과 지유 추출물의 독성을 평가하여 안전성을 확인하기 위하여 인간 숙주세포인 HeLa cell와 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell)를 사용하여 세포증식 실험을 하였다.

인간 숙주세포 (HeLa cell)를 96웰 마이크로 플레이트(96 well microplate)에 웰(well)당 2×10⁴으로 접종하여 DMEM 배지에, 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell)는 96웰 마이크로 플레이트(96 well microplate)에 웰당 1×10⁵으로 접종하여 RPMI 배지에 각각 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 새로운 배지로 교체한 뒤 각 추출물의 최종 농도가 200ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml가 되도록 처리하고 24시간 뒤 MTS 를 가하여 측정하였다. MTS 용액(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5(3-카르복시메쏘니페놀)-2-(4-설포페닐)-2에이치-테트라졸리움)을 웰 당 20ul씩 가하고 4시간 뒤 마이크로 플레이트 리더(microplate Reader)로 흡광도 490nm에서 측정하여 독성여부를 확인하였다. 세포증식효과에 대한 실험 결과 하기 수학식을 이용하여 결정되었으며, 그 결과는 [표 5] 및 [표 6]에 나타내었다. 대조군으로서 완충용액을 사용하였다.

세포증식효과(%)=(추출물 처리시의 흡광도/대조군의 흡광도)×100

HeLa cell

농도	50(ug/ml)	100(ug/ml)	200(ug/ml)
가자 추출물	115.86%±7.46	111.64%±3.13	145.80%±3.73 /***
지유 추출물	108.29%±0.54	131.20%±8.64	122.45%±7.97

RAW254.7 cell

농도	50(ug/ml)	100(ug/ml)	200(ug/ml)
가자 추출물	124.53%±4.00 / *	112.62%±1.56 / *	115.59%±1.41 / *
지유 추출물	95.30%±0.60 / **	94.27%±0.50 / **	114.60%±.75 / *

유의성 P<0.05 : *, P<0.01:**, P<0.001:***

상기 결과에서, 인간 숙주세포 (HeLa cell)와 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell)에서 가자, 지유 추출물 모두 증식시키거나 세포 증식에 크게 영향을 미치지 않은 것으로 확인 되었다. 따라서 추출물 자체에서 독성을 지니는 성질이 없으므로 가자와 지유의 추출물은 독성으로 인한 부작용이 없다고 예상되고 그로 인한 안전성의 효과도 지녔음을 알 수 있다.

Claims (6)

1. 가자 추출물 및 지유 추출물 모두를 유효성분으로 포함하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 추출대상인 가자나 지유를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 비브리오균에 대한 항균 효과를 특징으로 하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물.
   
5. 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물.
   
6. 제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 비브리오 패혈증 개선용 조성물.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   

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