KR101282356B1 - 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 오가피 부탄올 분획물은 헬리코박터 파이롤리 균의 생육을 유의적으로 억제하여 헬리코박터 파이롤리 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호하고 항균활성을 우수하게 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising Acanthopanacis Cortex butanol fraction for preventing or treating gastrointestinal disease}
본 발명은 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
위는 식도를 통하여 들어온 음식물을 저장하고 소화되기 쉽게 잘게 부수며, 십이지장으로 음식물을 보내는 것을 조절하여 췌장효소의 분비와 조화를 이루어 효율적인 소화와 흡수가 되도록 하는 장기이다. 위는 음식물이 들어오면 이를 소화시키기 위해 강한 산인 위산을 분비하는데, 이때 위점막 보호층이 위산에 의해 위점막이 손상받지 않도록 작용한다. 위를 보호하는 위점막 보호층은 여러 종류의 인자로부터 공격을 받아 손상 받기 쉽다. 대표적인 공격 인자로는 위산, 알콜, 아스피린 등의 비스테로이드성 소염제(NSAID), 헬리코박터 파이롤리(helicobacter pylori) 등의 세균, 스트레스에 의해 유도된 위점막의 미세순환장애와 저혈압 등이 있다. 이러한 요인으로 인해 위점막층이 손상되었을 때 미란, 발적, 출혈, 부종을 동반한 염증이 발생하게 되며, 손상이 심하여 위점막을 뚫고 점막 하단 및 근육층까지 손상되었을 때 위궤양이 발생하게 된다. 또한, 상기 요인에 의해 십이지장 점막이 손상되어 가장 표면에 있는 점막층보다 깊이 패이면서 점막근층 이상으로 손상이 진행되면 십이지장 궤양이 발생하게 된다.
따라서, 상기와 같은 공격인자에 의해 유발된 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환을 치료하기 위해서는 위산 분비 억제, 헬리코박터 파이롤리 균의 증식 억제, 점액 분비 촉진, 상피세포 재생 촉진, 항염증 등의 효능을 가진 약물이 필요하다.
현재 가장 대표적인 위장질환 치료제로는 과다한 위 분비액을 중화시키는 제산제(antacid), 위산 분비를 억제하는 히스타민 H2 수용체 길항제와 프로톤 펌프 저해제(proton pump inhibitor), 소화액에 대한 위 내막의 내성을 증가시키고 산 분비를 억제할 수 있는 프로스타글란딘(prostaglandin), 또는 위점막 보호제 등이 있다.
상기 약물 중 제산제는 근본적인 치료가 아닌 일시적인 속효성을 위한 것으로, 위 내의 pH를 상승시켜 펩신의 활성을 저하시킴으로써 약효를 나타낸다. 그러나, 제산제를 사용할 시 무기물질 투여에 의해 변비, 설사, 대사성 알칼로시스 (alkalosis), 요로결석증 등과 같은 부작용이 보고되어 있으며, 최근에는 제산제에 의한 산반동(acid rebound) 현상 등이 문제시되고 있다.
또한, 상기 약물 중 가장 널리 사용되고 있는 히스타민 H2 수용체 길항제인 시메티딘(cimetidine)은, 위점막 내의 히스타민 수용체를 차단하여 히스타민 분자를 위세포가 차단함으로써 히스타민 분자가 위세포로 하여금 산의 분비 신호를 하지 못하도록 작용한다. 위궤양의 본격적 치료는 시메티딘이 1977년 발매되면서부터 시작되었으며, 여러 종류의 유도체가 개발되었다. 그 중 라니티딘(ranitidine), 파모티딘(famotidine), 록사티딘(roxatidine), 니자티딘(nizatidine) 등은 치료기간의 단축으로 임상에서 우수한 항궤양 효과를 나타내고 있으나, 약물투여 중지 후 재발율이 높은 단점이 있다. 또한, 시메티딘은 남성의 성욕감퇴, 남성의 여성형 유방, 호중구 감소증 등의 부작용을 비롯하여 약물상호작용까지 나타내므로 사용을 기피하는 현상을 보이고 있으며, 가장 최근의 약인 라니티딘이나 파모티딘은 장기간 사용 시 약효가 크게 감소되는 현상이 목격되고 있다.
또한, 프로톤 펌프 저해제로는 오메프라졸(omeprazole)과 란소프라졸 (lansoprazol) 등이 있으며, 위벽세포에서의 산 분비를 최종단계에서 저해하여 강력한 산 분비억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 약제에 의한 궤양치유 환자에서도 재발율은 감소되지 않고 있으며, 연변, 설사, 발열, 두통, 피로감 등의 부작용이 보고되고 있다.
상기와 같이, 히스타민 H2 수용체 길항제와 프로톤 펌프 저해제와 같은 항분비제의 개발로 지금까지 수술을 필요로 하는 위장질환을 약물 요법으로 치유할 수 있었다. 그러나, 치유된 위장질환의 대부분은 재발하거나, 재현되어 완전히 치유된 후에도 장기간에 걸친 유지 요법이 필요하며, 또한 유지 요법 중에도 재발 또는 재현하는 현상이 빈번히 관찰되고 있다. 따라서, 위산 분비를 억제할 목적으로 히스타민 H2 수용체 길항제와 프로톤 펌프 저해제만을 사용할 경우 위장질환의 치료에 있어 가장 중요한 재발율 억제효과를 기대할 수 없다.
또한, 위점막 보호제의 경우 일반적으로 속효성이 적고 복용량이 많으며, 비교적 장기간 복용해야 하는 단점이 있으나, 재생점막이 정상과 유사하게 회복되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근에는 제산제, 히스타민 H2 수용체 길항제 또는 프로톤 펌프 저해제와 같은 위산 억제제와 함께, 점막을 보호하고 조직수복을 촉진하며 점막혈류를 증가시키는 수크랄패트(sucralfat), 비스무스 킬레이트(bismuth chelate)와 같은 위점막 보호제를 동시에 사용하고 있다.
또한, 최근에는 헬리코박터 파이롤리 균을 제거할 목적으로 항생제가 사용되고 있다.
위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 주요 증상으로는 복통, 속쓰림, 더부룩함, 소화불량, 트림, 오심, 구토, 출혈 등이 있다. 상기 증상들을 완화시키기 위하여 속효성으로 제산제를 복용하거나 식사를 하는 경우가 있으나 이는 일시적일 뿐이고, 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염진통제들은 부작용으로 인하여 사용이 제한되고 있다. 특히 아스피린, 이부프로펜 등의 비스테로이드성 소염진통제들은 오히려 위궤양 또는 십이지장궤양을 심화시켜 궤양이 있는 환자에게는 사용을 극도로 자제하거나 제산제와 함께 복용시키는 등 사용에 많은 제한을 받고 있다. 따라서, 위장질환에서 나타나는 증상들을 완화시키고, 오랜 시간 복용시에도 부작용이 적으면서 위를 보호할 수 있는 약물 개발의 필요성이 요구되고 있다.
따라서, 화학적 약물보다는 부작용이 적으면서 안정성이 확보된 생약재를 이용한 위장질환의 치료제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 생약재를 이용한 위장질환의 치료제로 쑥, 목별자, 강황, 감초, 소엽 등 많은 생약재들이 연구되어 오고 있다.
한편, 오가피(五加皮, Acanthopanacis Cortex)는 두릅나무과에 속하는 관목식물로, 잎이 다섯 개로 갈라져 있다. 오가피의 종류로는 가시오가피(Acanthopanax senticosus(RUPR. et MAX.) HARMS), 오가피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM.), 왕가시오가피(Acanthopanax senticosus var. subinermis KITAGAWA) 등 15종이 한국에 존재하며, 오래 전부터 한방에서는 독성과 부작용이 없다는 상약(上藥)으로 분류하여 뿌리와 목질부(가지)를 약재로 사용하여 왔고, 잎, 열매 및 꽃도 약용 부위로 사용할 수 있다. 오가피의 잎에는 지사노사이드 (chiisanoside)가 함유되어 있으며, 뿌리에는 오가피 배당체인 아칸토사이드 B, D (Acanthoside B, D) 뿐만 아니라 지링긴(sylrgin), 쿠마린 배당체 등이 함유되어 있다. 또한, 오가피에는 면역성을 높여주는 수용성 다당체가 함유되어 있다. 오가피는 맛이 맵고 쓰며 따뜻한 성질을 가지고 있고, 간경(肝經), 신경(神經)에 작용하여 풍습을 없애고 기를 돋우며 정수를 불러준다고 알려져 있다. 또한 오로(오장이 허약하여 생기는 허로병)와 칠상(남자가 허약해서 생기는 일곱 가지 증상)을 보해 주며, 다리를 잘 쓰지 못하는 데에 사용되고, 신체의 기(氣)를 높여주고, 정력을 좋게 해주며, 정신을 맑게 하고, 의지력을 높게 하며, 몸이 가벼워지고 늙는 것을 방지하고, 몸 안의 나쁜 피를 맑고 깨끗이 다스려 준다고 알려져 있으며, 허리 척추가 쑤시는 통증, 남자 음위증, 낭습, 여자음양증 등의 여러 가지 증상을 치료해준다고 알려져 있다.
상기한 바와 같이, 오가피에 대하여 다양한 약리학적 효과가 알려져 있지만, 위점막 보호 및 치료에 대한 연구는 아직까지 미미한 수준이다.
본 발명자들은 부작용이 적은 위장질환 치료제를 개발하기 위하여 생약재 중에서 탐색하던 중, 오가피 부탄올 분획물이 헬리코박터 파이롤리 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호하고 항균활성을 우수하게 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 오가피 부탄올 분획물의 추출 및 분리과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스에 처리한 후 마우스의 위 무게 변화를 측정한 도이다.
도 3은 본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스에 처리한 후 마우스의 위에 존재하는 헬리코박터 파이롤리 균의 콜로니 수를 측정한 도이다.
도 4는 본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스에 처리한 후 마우스의 위 조직의 변화를 관찰한 도이다.
도 5는 본 발명의 오가피 부탄올 분획물의 헬리코박터 파이롤리 균의 생육저지환 크기를 관찰한 도이다.
본 발명은 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이롤리 균에 의해 유발된 위염, 위궤양 및 십이지장궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 오가피 부탄올 분획물은 하기와 같은 방법으로 제조된다. 먼저, 오가피를 물과 C1~C4 알콜의 혼합용매로 추출한다(3회 반복). 상기 추출액을 여과한 후 감압농축하고 동결건조시켜 분말 형태의 오가피 알콜 조추출물을 얻는다. 상기 C1~C4 알콜은 1 내지 100% 메탄올, 1 내지 100% 에탄올(주정) 중에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 100% 에탄올(주정), 더욱 바람직하게는 60 내지 95% 에탄올(주정)이다. 상기 분말 형태의 오가피 알콜 조추출물을 증류수에 현탁시키고, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 추출 및 분리한 후, 감압농축하고 동결건조시켜 분말 형태의 오가피 부탄올 분획물을 얻는다.
상기 오가피는 잎, 목질부(줄기 및 가지), 뿌리, 열매, 꽃 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 가시오가피나무(Acanthopanax senticosus (RUPR. et MAX.) HARMS), 왕가시오가피나무(Acanthopanax senticosus var. subinermis KITAGAWA), 오가피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM.), 지리산오가피나무(Acanthopanax chiisanense NAKAI), 섬오가피나무(Acanthopanax koreanum NAKAI), 털오가피나무(Acanthopanax rufinerve NAKAI), 서울오가피나무 (Acanthopanax seoulense NAKAI), 당오가피(Acanthopanax sieboloians) 및 오가나무(Acanthopanax sieboldianum MAKINO)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스에 투여한 경우, 농도 의존적으로 마우스의 위 무게를 감소시켜 정상 마우스의 위 무게로 회복시키며, H. pylori 균에 감염된 마우스의 위에 존재하는 콜로니 수를 80~90% 정도 감소시키고, 위점막 부위의 손상이 감소하면서 비후해진 위 조직이 원상태로 복귀하여 H. pylori 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호한다. 또한, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물은 우수한 항균활성을 나타낸다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물은 헬리코박터 파이롤리 균의 생육을 유의적으로 억제하여 헬리코박터 파이롤리 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호하고 항균활성을 우수하게 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 오가피 부탄올 분획물과 함께 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 오가피 부탄올 분획물의 일일 투여량은 약 15~4,000㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 오가피 부탄올 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 오가피 부탄올 분획물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 가시오가피 목질부 부탄올 분획물의 제조
1. 가시오가피 목질부 알콜 조추출물의 제조
가시오가피나무(Acanthopanax senticosus(RUPR. et MAX.) HARMS) 목질부(줄기 및 가지)를 음건하고 세절하였다. 세절된 가시오가피 목질부 500g을 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 70% 에탄올(주정) 5.0ℓ를 가한 후 65~80℃에서 4시간씩 3회 추출하였다. 추출액을 모은 후 여과하고 10 brix 정도로 감압 농축하였다. 농축액을 진공동결건조기로 건조시켜 분말 형태의 가시오가피 목질부 70% 에탄올(주정) 조추출물 21.8g을 얻었다.
2. 가시오가피 목질부 부탄올 분획물의 제조
상기 1에서 얻은 분말 형태의 가시오가피 목질부 70% 에탄올(주정) 조추출물에 물과 n-헥산을 1:1(v/v) 비율로 혼합한 용액을 가하여 150회 이상 강하게 흔들고 2번 반복하여 포화시킨 후 정치하여 헥산층과 수층으로 분리하였다. 분리된 수층에 에틸아세테이트를 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 에틸아세테이트층과 수층으로 분리하였다. 분리된 수층에 n-부탄올을 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 부탄올층과 수층으로 분리하였다. 각 분획물들은 회전진공농축기에서 농축하고, 동결건조하여 분말 형태의 분획물로 얻었다. 각 분획물의 양은 헥산층이 0.35g, 에틸아세테이트 (EtOAc)층이 1.94g, 부탄올(BuOH)층이 9.52g, 수(H2O)층이 9.79g으로 총 21.6g을 얻었다. 상기에서 얻은 4개의 가시오가피 목질부 분획물 중 가시오가피 목질부 부탄올 분획물(BuOH)을 동물실험의 시료로 사용하였다.
본 발명의 오가피 부탄올 분획물의 추출 및 분리과정은 도 1에 나타내었다.
실험예 1 : 본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물의 헬리코박터 파이롤리 균에 대한 효능 실험
본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물의 헬리코박터 파이롤리 균에 대한 효능을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 실험동물
실험동물은 5주령의 SPF(specific pathogen free) BALB/c 마우스를 (주)대한바이오링크로부터 분양받아 동물사의 일정한 조건(온도: 20±2℃, 상대습도: 40~60%, 명암: 12시간 명암주기) 하에서 6일 정도 충분하게 적응시켜 사육하였다. 사료는 실험동물용 고형사료인 멸균소독된 퓨리나 사료를 자유 섭취시켰으며, 물은 상수도를 자외선 살균기로 소독시킨 후 자유 섭취시켰다. 실험 시작 전 24시간 동안 물만 주고 절식시켰다. 건강 상태가 양호하다고 판단되는 마우스만 선택하여 실험에 사용하였다. 실험군은 8개군으로 나누었으며, 실험군 당 10마리씩 할당하였다.
오가피 부탄올 분획물은 오가피 분획물 전체 양의 약 44% 비율이므로, 오가피 알콜 조추출물과 상대적으로 효능을 평가하기 위하여 용량 설정의 기준을 오가피 알콜 조추출물 양의 50%로 설정하였다. 하기 표 1에 실험군과 투여용량을 나타내었다.
실험군 H. pylori (KCTC 12083) 실험동물수
정상군 접종 안함 10
대조군 접종 10
가시오가피 목질부
70% 에탄올(주정) 조추출물		 50㎎/㎏ 접종 10
150㎎/㎏ 10
300㎎/㎏ 10
가시오가피 목질부
부탄올 분획물		 25㎎/㎏ 접종 10
75㎎/㎏ 10
150㎎/㎏ 10
2. 헬리코박터 파이롤리 균( H. pylori , KCTC 12083)의 배양 및 감염
H. pylori는 10%(v/v) 면양혈액(sheep blood), 반코마이신 10㎍/㎖, 날리딕스산(nalidixic acid) 25㎍/㎖, 암포테리신 B 5㎍/㎖가 첨가된 브루셀라 아가 배지 (Brucella Broth agar(BD, France))에 접종한 후, 37℃, 10% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 생성된 콜로니는 우레아제(urease) 및 카탈라제(catalase) 시험, 그램 염색(gram staining)으로 H. pylori 임을 확인하였다. 항생제는 모두 Sigma-aldrich 사의 제품을 사용하였다.
마우스용 존데를 이용하여 마우스에 1×109 CFU/㎖의 H. pylori를 한마리 당 0.1㎖씩 접종한 후 같은 방법으로 이틀 간격으로 2회(총 3회) 추가 접종하여 마우스에 H. pylori 균을 감염시켰다.
3. 헬리코박터 파이롤리 균이 감염된 마우스의 일반증상 및 사망동물의 관찰
H. pylori 균 접종 후 2주가 지나면 상기 실시예 1에서 제조한 시료(가시오가피 목질부 70% 에탄올(주정) 조추출물, 가시오가피 목질부 부탄올 분획물)를 투여하고, 투여 후 1시간에서 6시간까지 매시간마다 일반증상 및 사망동물의 유무를 관찰하였다. 또한, 모든 생존 동물을 에테르로 마취시킨 후 개복하여 방혈치사시킨 다음 육안으로 모든 내부장기를 관찰하였다.
관찰 결과, 8개의 실험군에서 사망동물은 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물의 LD50 값은 300㎎/㎏을 상회할 것으로 판단하였다. 또한, 생존 동물의 내부장기에 손상이 없음을 확인하였다.
4. 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스의 위 무게 변화 측정
H. pylori 균 접종 후 2주가 지나면 상기 실시예 1에서 제조한 시료(가시오가피 목질부 70% 에탄올(주정) 조추출물, 가시오가피 목질부 부탄올 분획물)를 2주간 공급하고, 균 접종 후 4주가 지나면 실험동물을 희생시켜 위를 적출하고 무게를 측정하였다.
결과는 표 2 및 도 2에 나타내었다.
실험군 마우스의 위 무게(g)
정상군 0.30±0.03
대조군 0.35±0.04
가시오가피 목질부
70% 에탄올(주정) 조추출물		 50㎎/㎏ 0.32±0.05
150㎎/㎏ 0.30±0.03
300㎎/㎏ 0.28±0.02
가시오가피 목질부
부탄올 분획물		 25㎎/㎏ 0.33±0.04
75㎎/㎏ 0.30±0.03
150㎎/㎏ 0.28±0.04
표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 정상군에 비해 마우스의 위 무게가 약 17% 정도 증가하였으나, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물 처리군은 농도 의존적으로 마우스의 위 무게를 감소시켜 정상군의 마우스의 위 무게로 회복되는 것을 확인하였다.
5. 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스의 위에 존재하는 헬리코박터 파이롤리 균의 콜로니 수 측정
H. pylori 균에 감염된 마우스의 위를 절제하고, 적출된 위의 절반은 호모게나이저(Tokken Inc. Japan)를 이용하여 16,000rpm에서 1분 동안 균질화시킨 후 1/10으로 희석시켜 5일 동안 배양하였다. 배양 후 콜로니 수를 계수한 후 log 값으로 변환하였다.
결과는 표 3 및 도 3에 나타내었다.
실험군 콜로니 수 log 값(CFU)
정상군 - 0.00
대조군 2,916,667 6.46
가시오가피 목질부
70% 에탄올(주정) 조추출물		 50㎎/㎏ 2,447,429 6.39
150㎎/㎏ 2,328,500 6.37
300㎎/㎏ 1,610,800 6.21
가시오가피 목질부
부탄올 분획물		 25㎎/㎏ 412,750 5.62
75㎎/㎏ 404,571 5.61
150㎎/㎏ 398,222 5.60
표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 가시오가피 목질부 70% 에탄올(주정) 조추출물 투여군은 H. pylori 균에 감염된 마우스의 위에 존재하는 콜로니 수를 16~45% 감소시켰으나, 가시오가피 목질부 부탄올 분획물 투여군은 H. pylori 균에 감염된 마우스의 위에 존재하는 콜로니 수를 86% 정도 감소시켰다.
6. 헬리코박터 파이롤리 균에 감염된 마우스의 위 조직의 변화 관찰 : 파라핀 절편 방법 (paraffin section method)
H. pylori 균에 감염된 마우스의 위를 절제하고 적출된 위 조직을 10% 포르말린 용액에 넣어 하룻 동안 흔들어 준 후 보관하였다. 포르말린에 담긴 위 조직을 꺼내어 리간드 등 불필요한 부분을 제거하고 0.5㎝ 정도로 잘라서 카세트에 넣은 후 흐르는 물에 6시간 이상 수세하였다. 수세한 카세트를 꺼내어 조직표본가공기 (Enclosed Tissue Processor. Sakura Finetechnical Co. Japan)에 넣고 기계를 작동시켰다. 기계 작동이 끝난 후에 카세트를 꺼내어 65℃로 셋팅되어 있는 조직포매기(Leica Microsystems Inc., Germany)에 놓았다. 카세트 속에 있는 위 조직을 꺼낸 후 카세트 덮개는 버리고 금속 틀에 파라핀을 붓고 그 틀의 정중앙에 위 조직이 위치할 수 있게 고정시킨 후 카세트 본체 부분을 올려놓고 이를 굳혔다. 굳혀진 것에서 금속 틀을 분리한 후 카세트 본체 부분의 불필요한 파라핀 부분을 제거한 후 -20℃ 이하로 하루 이상 보관하였다. 그 다음, 블록을 조직 박절기에 넣고 4㎛로 자른 후 60℃의 물에 띄운 후 자른 조각들이 팽팽하게 펴지면 슬라이드로 자른 조각이 중앙에 오도록 하여 조각을 떠내었다. H&E 염색 전에 염색할 슬라이드를 55~65℃의 건조기에 최소 2시간 이상 넣어 슬라이드와 파라핀 조각이 확실히 밀착되도록 하고 염색하였다. H&E 염색 후 H. pylori 균에 감염된 마우스의 위를 절제하여, 파라핀 절편 방법(paraffin section method)을 이용하여 마우스의 위 조직의 변화를 현미경(Olympus JP/BX51, 100배)으로 관찰하였다. 관찰 프로그램은 Image partner 3.5.231(Image partnership co. Ltd)을 사용하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, H. pylori 균에 감염된 마우스의 위 내부 조직은 비후해지며 조직 내 공간이 증대되었으나, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물 투여군의 경우 위점막 부위의 손상이 감소하면서 비후해진 위 조직이 원상태로 복귀하는 현상을 관찰할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 오가피 부탄올 분획물이 H. pylori 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호한다는 것을 알 수 있다.
실험예 2 : 본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물의 헬리코박터 파이롤리 균 억제 효과 : 페이퍼 디스크(paper disk, agar diffusion method) 방법
본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물의 헬리코박터 파이롤리 균 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
10㎜ 페이퍼 디스크를 121℃, 15분 조건으로 멸균을 실시하여 90℃ 건조기에서 건조시켰다. 건조된 페이퍼 디스크에 준비된 시료(오가피 에틸아세테이트 분획물, 오가피 부탄올 분획물, 오가피 물 분획물)를 흡수시키고 무균 작업대에서 건조시켰다. 이때, 시료의 농도는 1개의 페이퍼 디스크 당 280㎍부터 1/2배로 연속 희석하여 항균활성을 검색하였다. 오가피 헥산 분획물의 경우 극미량으로 조절하기가 어려워 본 실험에서 제외하였다. 브루셀라 한천 배지에서 미호기성 상태(10% CO2, 5% O2, 100% 습도)에서 37℃에서 3일 동안 배양된 2 플레이트의 전체 콜로니를 수확하여 1㎖의 멸균수에 현탁(1×108 CFU)하여 균주액으로 사용하였다. 활성 검색에 사용될 새로운 브루셀라 한천 배지에 각각 100㎕씩 균주액을 도말하고, 무균적으로 시료를 흡수시켜 건조한 페이퍼 디스크를 배열시켜 옮겼다. 미호기성 상태에서 72시간 동안 배양하고 H. pylori가 자라면서 형성된 생육저지환(clear zone) 형성 유무를 확인하고 크기를 측정하였다. 생육저지환 크기는 각각의 시료에 대하여 3회 이상 반복하여 얻은 결과를 평균한 값이다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 오가피 에틸아세테이트 분획물과 오가피 물 분획물에서는 항균활성이 미미하게 나타났으나, 오가피 부탄올 분획물에서는 생육저지환 크기가 280㎍ 농도에서 22±2㎜, 140㎍ 농도에서 18±2㎜, 70㎍ 농도에서 15±2㎜를 나타내어 뚜렸한 항균활성을 나타내었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
오가피 부탄올 분획물 2g
유당 1g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
오가피 부탄올 분획물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아르산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
오가피 부탄올 분획물 100㎎
옥수수전분 100㎎
유 당 100㎎
스테아르산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 2 : 식품의 제조
본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
오가피 부탄올 분획물 20~95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
오가피 부탄올 분획물 0.2~1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
오가피 부탄올 분획물 0.5~5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
오가피 부탄올 분획물 0.1~5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
오가피 부탄올 분획물 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품(dairy products)의 제조
오가피 부탄올 분획물 5~10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 3 : 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
오가피 부탄올 분획물 10~15%, 설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 75~80%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들었다. 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82%를 주입하여 본 발명의 오가피 부탄올 분획물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
2. 건강음료의 제조
오가피 부탄올 분획물(고형분 2.5%, 97.16%), 대추 엑기스(65 brix, 2.67%), 과체복합 추출물(고형분 70%, 0.12%), 비타민 C(0.02%), 판톤텐산칼슘(0.02%), 감초 추출물(고형분 65%, 0.01%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
3. 야채쥬스의 제조
오가피 부탄올 분획물 5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
4. 과일쥬스의 제조
오가피 부탄올 분획물 1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
본 발명의 오가피 부탄올 분획물은 헬리코박터 파이롤리 균의 생육을 유의적으로 억제하여 헬리코박터 파이롤리 균에 의한 위 점막부위 조직의 손상을 보호하고 항균활성을 우수하게 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 오가피 부탄올 분획물은 위염, 위궤양 및 십이지장궤양 등의 위장질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 오가피 알콜 조추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올로 순차적으로 추출 및 분리하여 얻은 오가피 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터 파이롤리 균에 의해 유발된 위염, 위궤양 및 십이지장궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 오가피는 잎, 목질부(줄기 및 가지), 뿌리, 열매 및 꽃으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 혼합한 것을 특징으로 하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 오가피는 가시오가피나무(Acanthopanax senticosus(RUPR. et MAX.) HARMS), 왕가시오가피나무(Acanthopanax senticosus var. subinermis KITAGAWA), 오가피나무(Acanthopanax sessiliflorus(RUPR. et MAX.) SEEM.), 지리산오가피나무(Acanthopanax chiisanense NAKAI), 섬오가피나무 (Acanthopanax koreanum NAKAI), 털오가피나무(Acanthopanax rufinerve NAKAI), 서울오가피나무(Acanthopanax seoulense NAKAI), 당오가피(Acanthopanax sieboloians) 및 오가나무(Acanthopanax sieboldianum MAKINO)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 위장질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 삭제
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