KR101357296B1 - 밀도에 기초한 액체 격리하기 위한 도구: 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

전체 혈액을 수집한 다음 이를 후속 사용 및 저장을 위해 성분들로 분리하기 위한 방법 및 장치. 자가-함유된 백 세트를 샘플 수집을 위해 사용하고, 이는 다시 성분 분리를 위해 원심분리기 내에 들어맞도록 적합하게 된 장치 내로 위치할 수 있다. 그리고나서, 각 성분은 밀도에 따라, 각 성분의 수집을 인도하는 밸브의 조작을 조절하기 위해 장치 내에 존재하는 센서를 가지고 순차적으로 추출된다. 센서는 다음과 같은 특징 중 하나 이상을 판독할 수 있다: 적외선, 광학 특성, 밀도, 중량, 방사능, 형광, 색깔, 자기, 초음파, 전기용량, 여기에서 특징들은 혈액 및 혈액 성분에 고유한 것이거나 부가물이다. 그리고나서 각 성분은 이의 저장 용기 내로 분리될 수 있다. 바람직한 센서는 광학 특성과 중량을 포함한다. 혈액 밀도 분리 이외에, 장치는 분리 이전에 친화성 매질 또는 항체와 혼합될 수 있는 세포, 단백질, 아세포 입자 또는 바이러스를 포함하는 용액을 함유할 수 있다.

혈액, 분리, 수집, 저장, 밀도, 격리, 원심분리

Description

밀도에 기초한 액체 격리하기 위한 도구: 방법 및 장치{INSTRUMENTALITY FOR SEQUESTERING LIQUIDS BASED ON DENSITY: METHOD AND APPARATUS}

다음 발명은 혈액 성분 분리에 있어서 수단과 방법론에 일반적으로 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액 샘플을 수집한 다음 수집된 샘플을 구성하는 혈액 성분으로 개별 저장 및 사용을 위해 분리하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

혈액 수집은 언제나 중요하며, 특히 응급 상황(즉각적인 사용)에서는 더 그러하나, 전체 혈액은 "시일경과(outdated)"가 되기 전에 약 30일간만 저장될 수 있을 뿐이다. 장기간 저장을 위해서 전체 혈액을 이의 주된 성분들(백혈구, 혈소판, 적혈구 및 혈장)로 분리하는 능력은 월등하게 중요한데, 이는 각 성분마다 장기간 저장이 온도 및 저장 매체 면에서 다르기 때문이다. 수집 후 일어나는 가장 중요한 성분 분리는 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 혈소판 및 혈장을 서로 분리하는 것이다. WBC 내에서 림프구세포와 단핵세포로부터 과립백혈구를 분리하는 것이 때로 중요하다. 특정 성분의 분리 및 추출 후, 혈액 분획을 환자에게 되돌려 줄 수 있다.

상이한 밀도에 기인하여 원심분리 하에서 또는 원심분리 후에 전체 혈액의 다양한 성분들을 분리하는 것이 가능하다. 미국특허 제4,120,448호와 같이 일부 선행 기술의 방법들은 원심분리에 연결된 챔버를 이용한다. 원심분리된 혈액은 챔버에서 분리되고, 복수 개의 수집 수단이 밀도 의존적으로 각 성분들이 집합하는 영역에 대응하는 챔버의 다양한 위치에 자리한다.

백혈구를 전체 혈액으로부터 격리하는 본(선행 기술) 기술은 숙련된 기술자를 필요로 하며, 1 시간이라는 기간에 걸쳐서 16 단계가 수행될 것을 요구한다는 점에서 노동 집약적이며, 그리고 기술의 행사에 있어 기술자에게 의존한 요구조건 때문에 일관적이지 못한 결과를 낳는다.

그러나, 더욱 의미심장하게도 16 단계의 본 기술은 "열려" 있다; 즉, 혈액 산물은 산물의 무균성을 유지하지 않는 방식으로 처리되는데, 이는 다양한 생산 단계에서 세포의 냉동보호제나 침전제를 가하거나 샘플을 얻을 필요가 내부로 바깥 환경의 접근을 허용하면서 달성될 수 없기 때문이며, 이는 산물의 잠재적 오염을 의미한다. 상기 16 단계는 다음과 같다:

1. 수집 백(bag)으로 태반 혈액 수집 (60-200 ml 범위).

2. 수집 백으로 HES 첨가(20% v/v).

3. 특별 원심분리 컵 지지물로 수집 백 선적.

4. 50G에서 13분간 원심분리하여 RBC로부터 WBC 올리기(한 번에 6 유닛까지).

5. 중량을 재기 위해 익스프레서(expressor) 및 가공 백 세트로 수집 백 고 정하거나 무균 연결하기.

6. 중량을 재기 위해 익스프레서 및 가공 백으로 수집 백 조심히 옮기기.

7. WBC 풍부 혈장과 RBC의 상층 10-15 ml를 가공 백으로 짜내기-과량 RBC 남기기.

8. 과량의 RBC를 지닌 수집 백 제거하기.

9. 특별 원심분리 컵 지지물에 가공 백 선적하기.

10. 400G에서 10분간 가공 백 원심분리하기(한 번에 6 유닛까지).

11. 가공 백을 익스프레서로 조심히 옮기기.

12. 20 ml WBC 성분을 남기면서 과량의 혈장 짜내기.

13. 가공세트로부터 과량의 혈장 백 제거하기.

14. 4℃에서 가공 백 내 WBC에 세포의 냉동보호제 5 ml 가하기.

15. 냉동보호된 WBC를 냉동 백으로 옮기기.

16. 가공 백으로부터 냉동 백 튜브밀봉하고 분리하기.

다음 선행기술은 본 출원인이 인식하고 있는 기술 상태를 반영하며 관련 선행 기술을 공개해야 하는 출원인에게 인정된 의무로부터 면하기 위해 여기에 포함한다. 그러나, 이들 참고문헌들 어느 것도 단독으로 또는 어느 가능한 조합으로도, 이하 상세히 밝혀지고 특히 청구된 바와 같은 본 발명의 결합을 교시하거나 자명하게 하지 않음이 규정된다.

특허 번호 발행일 발명자

4,120,448 1978년 10월 17일 Cullis

4,720,284 1988년 1월 19일 McCarty

Des. 314,824 1991년 2월 19일 Moon

5,674,173 1997년 10월 7일 Hlavinka 등

5,723,050 1998년 3월 3일 Unger 등

5,792,038 1998년 8월 11일 Hlavinka

5,921,950 1999년 7월 13일 Toavs 등

6,315,706 2001년 11월 13일 Unger 등

6,348,031 2002년 2월 19일 Unger 등

6,652,475 2003년 11월 25일 Sahines 등

WO95/01842 1995년 1월 15일 발행 Unger

상기에 열거되었으나 특별히 기술되지 않은 종래 기술 문헌들은 혈액 가공용 다른 기구들을 교시하며 더 나아가 출원인이 인지하고 있는 종래 기술을 목록에 수록한다. 이들 참고문헌들은 상기에서 특별히 구별된 문헌으로부터 심지어 더 뚜렷하게 다르다.

본 발명은 전체 혈액 샘플을 공급자로부터 수집하기 위해 사용될 수 있는 백 세트를 포함한다. 가장 중요하게, 백 세트는 일단 혈액이 도입되면 가공이 무균 후드로부터 떨어지거나 깨끗한 방 바깥에서 일어날 수 있는 폐쇄 시스템을 규정하는데, 이는 바깥 환경에서 임의 병균에 대한 접근이 방지되기 때문이다. 이어서, 백 세트는 성분 분리를 위해 원심분리 내로 놓인다. CPD, ACD 또는 CPD-A와 같은 항응고제를 함유할 수 있는 전체 혈액 가공 백은 복수 개의 성분 백에 연결된 적어도 하나의 입구 및 하나의 출구를 포함한다. 가공 백은 HES와 같은 침전 보조제를 임의로 포함할 수 있으나, 선행 기술과는 달리, 이러한 침전 보조제가 요구되는 것은 아니다. 각 성분 백은 전체 혈액 가공 백으로부터 안내하는 별개의 라인을 가지며, 각 라인은 일단 특정 성분 백이 채워지면 전체 혈액 백으로부터 꺽쇠 고정되고 튜브 밀봉되어 분리될 수 있다.

실제로, 혈액은 수집되어 전체 혈액 가공 백 상의 유입 포트로 인도되며, 입력 라인은 꺽쇠 고정되고 밀봉되며 전체 혈액 가공 백으로부터 분리된다. 비대칭 모양의 전체 혈액 가공 백은 바닥 말단에서 백과 밀접하게 접하는 상보적 모양의 개구를 갖는 백 세트 홀더에 걸리고, 백 세트 홀더의 외부는 통상적인 원심분리기 컵 또는 소켓에 들어맞도록 적합하게 된다. 원심분리기는 성분을 최적으로 분리하기 위해서 다양한 G-힘에서 가동된다. 일단 성분들이 전체 혈액 가공 백에서 밀도에 의해 분리되면, 서보 모터가 가공 백으로부터 가장 밀도가 큰 성분을 함유하게 될 백에 이르는 라인 상의 미터링 밸브를 열기 위해서 맞물린다. 이는 통상 원심분리 하에서 가장 밀도가 큰 성분이 이의 특정 저장 백을 채우는 것을 허용한다.

출원인의 공정은 25분이라는 기간에 걸쳐서 수행되는 다음의 7 또는 8 단계로 요약될 수 있으며, 이는 림프구세포와 단핵세포의 90%를 초과하는 반복가능한 수득량을 결과한다.

1. 수집 백으로 태반 혈액 수집하기(60-200 ml 범위).

2. 백 가공 세트로 수집 백 고정하거나 무균 연결하고 혈액을 가공 백으로 옮기기.

3. 가공 백으로 HES 첨가하기(20% v/v) (선택적).

4. 가공 백 세트를 자동 익스프레서로 선적하기.

5. 두 개의 상이한 속도로 방해받지 않은 운전에서 원심분리하기: 20분간 1,400G로 RBC/혈장 경계에서 WBC 격리하고 5분간 85G로 RBC를 RBC 백으로 그리고 WBC를 냉동 백으로 짜내기.

6. 가공 백 세트로부터 과량 RBC와 혈장 백을 튜브 밀봉하고 분리하기.

7. 4℃에서 냉동 백의 WBC에 세포 냉동보호제 5 ml 첨가하기.

8. 세포 냉동보호제 라인으로부터 냉동 백 튜브 밀봉하고 분리하기.

첫 번째 성분의 완전한 수집은 백 세트 홀더 기구에 존재하는 광학 센서에 의해 바람직하게 표시된다. 센서에 의해 인도되는 서보 모터(servo motor)는 라인상의 미터링 밸브(metering valve)를 자동으로 폐쇄하고 그 특정 성분의 수집을 종결시킨다. 이어서, 서보 모터는 미터링 밸브를 추가로 맞물려 미터링 밸브와 두 번째 저장 백을 연결하는 두 번째 출력 라인을 통해 다음 성분의 수집을 허용한다. 이 과정은 모든 바람직한 성분이 별개의 저장 백에 수집될 때까지 연속하여 계속할 수 있다: 적혈구, 백혈구(림프구세포 및 과립백혈구), 혈소판 및 혈장. 그렇게 하는 것이 바람직하다면, 백혈구 및 혈소판과 같은 다중 성분들은 동일 저장 백으로 인도될 수 있다. 센서는 광학 외의 것일 수 있다. 예컨대, 센서는 유체를 유전체로 보면서 상이한 밀도에 고유한 전기적 특성, 예컨대, 전기용량에 있어서의 변화를 모니터링할 수 있다. 상업적으로 구입가능한 마커들(예, 단일클론 항체, 극성화된 입자, 자기 밀도, 또는 형광 마커 등)이 혈액으로 도입되어 모니터링될 수 있다.

유체 성분을 수신하는 백은 또한 원심분리 동안 및 휴지시 모두 중량에 대해 지탱될 수도 있다. 정확한 분리가 일어난다.

일단 수집되면, 각각의 저장 백은 밀봉되어 전체 혈액 가공 백으로부터 분리된다. 임의 필요한 보존제 또는 첨가제가 가공 또는 저장 전에 수집 라인을 통해 도입될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일차적 목적은 전체 혈액 성분을 후속 저장 또는 사용을 위해 분리하기 위한 신규 도구 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 혈액 성분을 분리하기 위한 전통적인 수단으로 혈액 뱅크에서 전형적으로 실시된 다중 원심분리 운전들 사이의 상당한 조작 없이 단일의 방해받지 않은 원심분리 운전 동안 기계에 의해 전적으로 분리가 달성될 수 있는 상기와 같은 특징의 도구 및 방법을 제공하는 것이다.

더 나아가, 적혈구, 혈장, 혈소판, 및 백혈구를 정교하게 격리하고 심지어 백혈구 모집단 내에서 분리하는 것을 목적으로 한다.

더 나아가, 본 발명은 분리 장치가 조작을 단순히 하도록 자가-함유된 상기와 같은 특징의 도구 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

첫 번째 관점에서, 첫 번째 백과 복수의 다른 백들을 포함하는 백 세트; 백 세트 홀더, 그 위에서 첫 번째 백은 백 세트 홀더의 안쪽 부분 내에 함유되며 복수의 다른 백들 내의 액체는 상기 첫 번째 백 내의 액체보다 낮은 높이에 위치하는 백 세트 홀더; 그리고 직경면에서 마주하는 적어도 두 개의 수신 소켓을 갖는 원심분리기로서, 적어도 하나의 소켓은 백 세트 홀더를 수신하도록 치수가 맞추어진 원심분리기를 조합하여 포함하는, 전체 혈액으로부터 성분들을 격리하기 위한 도구를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

두 번째 관점에서, 혈액 가공 백을 수신하도록 치수가 맞추어진, 둘러싸지 않은 상부를 갖는 첫 번째 포켓; 첫 번째 포켓의 둘러싸지 않은 상부에 인접하게 위치하는, 첫 번째 포켓에서 혈액 가공 백을 지지하는 수단; 개방 위치와 폐쇄 위치를 갖는, 첫 번째 포켓 아래의 이동가능한 바닥 부분; 개구가 상기 이동가능한 바닥 부분이 개방 위치일 때 첫 번째 포켓으로 접근을 허용하는, 첫 번째 포켓의 장축을 따라 위치한 힌지 부분; 접근이 상기 이동가능한 바닥 부분이 개방 위치일 때 오로지 가능한 두 번째 포켓을 조합하여 포함하는, 전통적인 원심분리기 및 혈액 가공 백 세트와 사용하기 위한 장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

세 번째 관점에서, 가공 백, 적어도 하나의 보조 백, 가공 백에 인접한 샘플링 사이트 및 각각의 보조 백에 연통하는 샘플링 사이트를 갖는 혈액 가공 백 세트를 제조하는 단계; 전체 혈액을 가공 백으로 도입하는 단계; 전체 혈액을 후속 분석을 위해 샘플링하는 단계; 전체 혈액을 원심분리하는 단계, -여기서, 성분들은 가공 백에서 분리됨-; 각 성분을 혈액 가공 백 세트의 적어도 하나의 보조 백으로 인도하는 단계; 각 성분의 샘플을 후속 분석을 위해 옮기는 단계; 및 각 성분을 후속 사용을 위해 저장하는 것을 포함하는, 전체 혈액으로부터 성분들을 분리하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

네 번째 관점에서, 입구 및 출구를 갖는 첫 번째 백; 각각이 내용물을 인가하거나 추방하는 적어도 하나의 포트를 갖는 복수의 보조 백; 첫 번째 백으로부터 각각의 보조 백으로 안내하는 도관 수단; 첫 번째 백과 다수의 보조 백들 사이 선택적인 접근을 허용하도록 조절가능한, 상기 도관 수단 상의 밸브 수단을 조합하여 포함하는 백 세트를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

도 1은 개방 위치에서 본 발명의 백 세트 홀더를 나타낸다.

도 2는 폐쇄 위치에서 본 발명의 백 세트 홀더를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 백 세트를 나타낸다.

도 4는 개방 위치에서 백 홀더 내 위치에서 백 세트를 나타낸다.

도 5는 폐쇄 위치에서 백 홀더 내 위치에서 백 세트를 나타낸다.

도 6은 전통적인 원심분리기에서 두 개의 백 홀더의 위치를 나타낸다.

도 7은 성분 분리 전 백 세트 홀더 내 백 세트를 나타낸다.

도 8A, 8B, 8C는 가공 백으로부터 성분을 거두어들이는 단계들을 나타낸다.

도 9는 성분 분리 후 백 세트 홀더 내 백 세트를 나타낸다.

도 10은 성분들이 분리되기 전 혈액 샘플의 수집 후의 백 세트를 나타낸다.

도 10a는 도 10과 동일한 상태를 도시하나 중간의 연층(buffycoat) 백이 없다.

도 11은 적혈구 성분이 분리된 후의 백 세트를 나타낸다.

도 11a는 도 11과 동일한 상태를 도시하나 중간의 연층(buffycoat) 백이 없다.

도 12는 바람직한 공정의 플로우차트이다.

도 13은 그래픽 형태로 전체 혈액 성분의 분리를 예시한다.

도 14A, 14B, 14C는 미터링 밸브의 작동 위치를 나타낸다.

도 15는 백 세트의 대안적 양태를 나타낸다.

도 16은 수집 백의 백 세트로의 부착을 나타낸다.

도 17은 수집 백의 내용물을 백 세트의 가공 백으로 배수하는 작동을 나타낸다.

도 18은 백 세트로부터 연결 백과 응괴(clot) 필터의 연결분리를 나타낸다.

도 19는 가공 백으로부터 혈액으로 샘플링 필로우(pillow)를 채우는 과정을 도시한다.

도 20은 백 세트로부터 샘플링 필로우와 이와 연관된 샘플링 포트의 연결분리를 나타낸다.

도 21은 가공 백으로 선택적인 침전제의 첨가를 도시한다.

도 22는 백 세트의 백 세트 홀더로의 삽입을 예시한다.

도 23은 백 세트가 백 세트 홀더 내에 있는 동안 원심분리 하에 일어나는 혈액 성분의 이송을 도시한 것이다.

도 24는 백 세트로부터 적혈구의 연결분리를 나타낸다.

도 25는 냉동 백의 내용물이 혼합되는 방식을 예시한다.

도 26은 냉동 백의 내용물로 샘플링 피그테일(pigtail)을 채우는 과정을 도시한다.

도 27은 백 세트로부터 샘플링 피그테일과 이와 연관된 샘플링 포트의 연결분리를 나타낸다.

도 28은 냉동 백으로 DMSO의 첨가와 이의 후속 혼합을 도시한다.

도 29는 잔여 DMSO과 공기를 시스템으로부터 빼는 방식을 예시한다.

도 30은 백 세트로부터 냉동 백의 연결분리를 나타낸다.

도 31은 냉동 백 부분으로부터의 샘플을 보존을 위해 창출하는 방식을 예시한다.

도 32는 후속 분석을 위해 도 31로부터 튜빙에 남겨진 적은 분량의 냉동 백 물질과 가공 백 물질의 추출을 나타낸다.

도 33은 가공 백으로부터 DMSO 유입 라인과 이와 연관된 접속점의 연결분리를 나타낸다.

도 34는 후속 분석을 위해 샘플을 가공 백으로부터 취하는 방식을 예시한다.

도 35는 서보 모터와 밸브 시스템 연결의 도식도이다.

도 36은 원심분리 동안 시간의 함수로서, 질량 및 센서에 의해 모니터링된 액체 수준을 표시한 것이다. 또한 거두어들인 WBC 용액의 증가하는 중량 증가를 야기하여 전체 WBC 냉동 백을 결과시키는 일련의 온/오프 밸브 회전을 나타낸다.

도 37은 원심분리동안 냉동 백(백혈구) 칭량을 도시적으로 나타내는 백 세트의 추가 반복이다.

도 38은 대안적인 가공 장치(50)를 반영한다.

도 39는 도 38의 또 다른 도면이다.

이러한 목적 및 기타 다른 목적들은 뒤따르는 상세 설명을 첨부된 도면과 결합하여 고려할 때 명백해질 것이다.

도면을 참조하여, 유사 도면 번호는 다양한 도면들에 걸쳐서 유사 부분을 나타내며, 도 3에 도시된 바와 같은 도면 부호 10은 본 발명에 따른 백 세트에 관한 것이다.

본질적으로, 백 세트(10)는 전체 혈액 가공 백(2), 행거(hanger)(16)를 지닌 적혈구(RBC) 백(4), 및 백혈구의 수집 및 저장을 위한 냉동 백(6)을 포함한다. 가공 백(2)은 유입 라인(12)을 통해, 사혈 바늘(8)을 통하거나 (도 10) 또는 고정 또는 무균 연결됨으로써, 항응고 혈액을 함유하는 또 다른 백으로 공급된다. 가공 백(2)은 상부 모서리(11a), 짧은 측면 모서리(11b), 긴 측면 모서리(11c)와, 바닥 부분이 출구(26)로 인도되는 비대칭 포인트(14)로 테이퍼링되는 측면 모서리들 사이에 경사진 바닥 모서리(11d)를 포함하는 비대칭 모양을 갖는다.

비대칭 가공 백은 과립백혈구의 30-50%를 제외하는 시간 구성에서 백혈구 모집단의 단핵세포 분획의 집중을 허용한다. 과립백혈구는 조혈 재건에서 아무런 역할도 하지 않으므로, 이의 결실은 이식을 위해 보다 정제된 백혈구 선택을 가져온다.

또한, 비대칭 백 세트는 침전제의 필요없이 이러한 정제가 일어나도록 허용하는데, 침전제는 너무 점성이어서 필터를 통해 무균하기 어려워서 백 세트로 세포 냉동보호제 입구에서 0.2 μ필터를 통한 통로에 의해 DMSO가 무균될 수 있기 때문에 "폐쇄" 무균 백 세트에 MNC가 농축되도록 허용한다.

출구(26)는 가공 백(2)으로부터 세 가지 방식의 미터링 밸브(20)로 출력을 인도한다. 미터링 밸브(20)의 작동 위치는 도 14A-14C에 도시되어 있다. 두 개의 공급 라인(24a, 24b)이 미터링 밸브(20)로부터 RBC 백(4)과 냉동 백(6)으로 안내한다. 공급 라인(24a, 24b)과 유입 라인(12)은 각각 열로 밀봉될 수 있으며, 백 세트(10)로부터 분리될 수 있다. 모든 라인들은 요구시 유체 통로를 막도록 폐쇄될 수 있는 클램프(clamp)(22)가 장착된다. 다른 성분들이 분리되어야 한다면, 백 세트(10)는 수용하기 위해서 미터링 밸브에 상응하는 조정을 지닌 추가 백을 함유할 수 있다.

다양한 공급 라인이 백 세트(10)에 존재할 수도 있다. 예컨대, 냉동 백 공급 라인(24b)이 세포 냉동보호제를 시스템으로 도입하기 위한 입구(16)를 가질 수 있다. 이러한 입구는 필터(30) (도 10 참고), 바람직하게 0.2μ 필터가 무엇보다도 공기 바깥에 있는 병균으로부터 오염을 막고 냉동 백 및 튜빙으로부터 공기의 벤팅(venting)을 허용하기 위해 장치될 수 있다. 중간 연층 백(40)(도 10)이 냉동 백 공급 라인(24b) 상에 존재할 수 있다. 연층 백(40)은 분리된 백혈구 분획을 수집하는데, 이는 혈소판과 백혈구를 포함하며, 적은 체적의 혈장 또는 적혈구를 포함한다. 도 10a 및 11a는 중간 연층 백(40)을 갖지 않은 백 세트를 나타낸다.

처음, 가공 백(2)은 CPD(시트레이트, 포스페이트 및 덱스트로즈)와 같은 항응고제로 채워져 혈액이 사혈 주사를 통해 백으로 끌리거나, 또는 유입 라인이 항응고된 혈액을 함유하는 다른 백에 고정 또는 무균 연결한다. 미터링 밸브(20)는 폐쇄 위치에서 시작한다(도 8A). 모든 클램프(22)를 유입 라인(12) 상의 클램프(22)를 제외하고 폐쇄한다. 혈액, 바람직하게는 말초, 태반 탯줄 혈액, 또는 골수를 사혈 바늘(8) 또는 다른 적절한 입구를 통해 공급자로부터 얻고 이를 유입 라인(12)을 통해 가공 백(2)으로 공급한다. 그리고 나서, 유입 라인(12)을 꺽쇠 고정, 열 밀봉하여 백 세트(10)로부터 분리한다. 선택적으로, HES가 혈액 수집 전,후로 선택적 입구를 통해 RBC 백(4)에 도입될 수 있다.

이 시점에서, 백 세트(10)는 도 1,2에 도시된 바와 같이 백 홀더(50)에 위치한다. 백 홀더(50)는 실질적으로 직선 측면에 의해 연결된 두 개의 둥근 말단을 지닌 실질적으로 타원 모양을 갖는 다소 원통형이다. 주된 구획(70)은 가공 백(2)을 수신하기 위해 치수가 맞춰진 신장된 타원 모양을 갖는다. 주된 구획(70)은 백 홀더(50)(Z를 따라)의 바닥 부분(162) 아래로 미끄러진 다음 백 홀더(50)의 둥근 말단들 중 하나에 존재하는 힌지(71)(X를 따라)에 대해 덮개(72)를 열어 접근한다. 가공 백(2)은 힌지된 덮개(72)가 미터링 밸브(20)로 안내하는 포인트(14)와 일치하는 모서리(11c) 위에서 폐쇄하도록 백 홀더(50)에서 배향된다. 미터링 밸브(20)를 백 홀더(50)의 주된 부분 상에 위치한 구멍(74a)에서 수신한다. 힌지된 덮개(72) 상에 위치한 상보적 구멍(74b)은 미터링 밸브(20)의 돌출 말단을 수신한다. 힌지된 덮개(72)는 바닥 부분(162)이 폐쇄 위치일 때 오로지 닫힐 것이다. 바닥 부분이 닫 히면, 바닥 부분(162) 내 노치(164)는 백 홀더(50)의 주된 몸체상에 존재하는 보유 탭(166)과 들어맞는다.

도 1을 참고하여, 백 홀더(50)는 원심분리 과정 동안 자리에서 백을 유지하는, 가공 백(2) 상에 루프(loops)(28)와 맞물리는 후크(hooks)(60)를 갖는 백 행거(76)를 포함한다. 백 홀더(50)의 주된 분획(70)은 가공 백(2)의 비대칭 모양에 상보적인 측면벽(156)을 갖는 가공 백(2)을 수신하도록 만들어졌으며, 가공 백(2)은 가공 백(2)의 출구(26)와 비대칭 포인트(14)를 수신하도록 치수가 맞춰진 아웃포트(outport)(160)에서 끝난다. 측면벽(156)은 중간 둘레에서는 느슨하게 그리고 바닥(출구(26) 근처)에서는 보다 단단히 가공 백(2)을 포용한다. 백(2) 바닥 근처에서 더욱 밀접한 포용은 침전 후 백 내용물을 혼란시키는 것을 최소화하기 위해 바람직하다. 즉, 분획(70)의 상단은 외부 타원 모양과 흡사하나 지지하는 관계에서 백 모서리(11b, 11c, 11d)를 유지하면서 아웃포트(160)로 아래로 테이퍼링된다.

노치(78)는 백 홀더(50)의 실질적으로 직선의 측면들 중 하나를 따라 존재한다. 노치(78)는 RBC 백(4) 상에서 행거(16)를 수신한다. RBC 백(4)은 변위(81)를 통해 더 낮은 지지 선반(83)으로 이끄는 곡선 리세스(80)에서 백 홀더(50)의 바깥을 따라 매달린다. 냉동 백(6)은 화살 Z를 따라 열기 위해서 바닥 부분(162) 아래로 미끄러짐으로써 접근되는, 백 홀더(50)의 주된 분획(70)의 아래에 위치한 리셉터클(82) 내에 포용된다. 도 4 및 도 5는 성분 분리가 일어나기 전에 백 세트 홀더(50)에 실린 전체 백 세트(10)를 나타낸다. 도 37은 분리 과정 동안 냉동 백이 중량을 재는 것을 도식적으로 나타내는 백 세트의 추가 반복을 나타낸다. 도 38은 중량 하중 셀(505)을 통해 조절 칩 모듈(57)을 이의 상부면에서 그리고 쉘과 냉동 백을 이의 바닥면에서 지지하는 플랫폼(503)에 의존하는 쉘(501) 내에 냉동 백이 캡슐화되어 있음을 나타낸다. 쉘(501)은 "U" 형 선반받이(bracket)(509)에 의해 보호되는 공기 공간(508)에서 표류한다.

미터링 밸브(20)를 백 홀더(50)에서 모터 드라이버(56)에 연결한다. 서보 모터(56)를 재충전가능한 배터리(B)에 의해 동력화된 소프트웨어-조절되는 조절 칩 모듈(57)에 연결한다. 모듈(57)은 원심분리동안 열 생성에 기인하여 온도 상쇄를 요구할 수 있다. 포트(P)는 배터리 충전기(C)를 이용하도록 제공된다(도 35). 서보 모터(56)는 미터링 밸브(20)의 작동을 조절하는 한편, 백 세트(10)는 백 홀더(50)에 장착된다. 하나 또는 그 이상의 광학 센서(58)가 각 분획이 거두어진 후 서보 모터(56)가 미터링 밸브(20)를 닫기에 적절한 시간을 유발할 수 있다. 센서는 도 1에 도시된 봐와 같은 위치 또는 그보다 아래 가공 백(2)의 비대칭 포인트(14)에 인접한 아웃포트(160)(도 8C)에 밀접하게 위치할 수 있다. 예컨대, 센서(58)는 밸브(20) 둘레 모든 브랜치와 백(4 및 5)의 입구를 모니터링할 수 있다. 도시된 센서(58)는 광학적이나 밀도, 중량, 적외선, 방사능, 형광, 색깔, 자기, 초음파, 전기용량에 기초할 수 있으며, 여기에서 측정된 특징은 부가물일 수 있다.

닫혀 있을 때, 백 홀더(50)는 통상적인 원심분리기(100) 내에 주재하도록 치수가 맞춰진 원심분리 컵(66)에 들어맞도록 적합하게 된다. 바람직하게, 적어도 두 개의 백 세트 홀더(50)가 균형을 위해 도 6에 도시된 바와 같이 직경상으로 마주보는 원심분리 컵(66)에 위치한다. 원심분리 컵(66) 내의 백 세트(10)는 성분의 최적 성층화를 달성하기 위해 하나 이상의 G-힘에 놓여질 수 있다(도 8A-8C). 이어서, 서보 모터(56)는 최적 G-힘에서 적혈구를 거두어 들이기 위해 공급 라인(24a)을 열고 백(4)으로 접근을 허용하도록 미터링 밸브(20)를 작동한다. 서보 모터(56)는 광학 센서(58)가 적혈구가 거두어졌음을 나타낼 때 미터링 밸브(20)를 닫는다(도 8A, 8B). 광학 센서(58)는 백혈구 분획과 혈장 분획 사이 경계를 감지한다.

백혈구 및/또는 혈소판을 함유하는 다음 분획은 가공 백(2)으로부터 거두어지며; 서보 모터(56)는 미터링 밸브(20)를 열어 다음 수확을 위한 백(6)으로 안내하는 공급 라인(24b)(도 8C)에 대한 접근을 허용한다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 냉동 백(6)으로의 수확(WBC) 동안, 공급 라인 내 공기는 냉동 백(6)에 이미 존재하는 공기에 더해져서 WBC 및/또는 혈소판과 세포 냉동보호제의 적절한 혼합을 돕는데 유용한 공기 거품(70)을 생산한다. 이어서, 서보 모터(56)는 도 8A에 나타낸 바와 같이 미터링 밸브(20)를 닫고, 원심분리기(100)는 멈추도록 허용된다. 도 9는 성분 분리가 일어난 후 백 세트 홀더(50) 내 백 세트(10)를 나타낸다.

존재하는 경우, 연층 백(40)은 바람직하게 25 ml 용량을 갖는다. 20 ml의 연층을 연층 백(40)에 도입하고, 5 ml의 DMSO 용액을 이어서 도입한다. 연층 백은 두 개의 차가운 층 사이에 위치하며, 세포 냉동보호제와 WBC 용액을 혼합하기 위해 연층 백(40)의 회전 또는 니딩(kneading)이 일어난다.

백 홀더(50)는 원심분리 컵(66)으로부터 제거되고 열리며, 백 세트(10)는 서보 모터(56)가 미터링 밸브(20)로부터 연결분리될 때 제거한다. 각각의 공급 라인(24a, 24b)을 꺽쇠 고정하고, 열 밀봉하여 가공 백(2)으로부터 제거한다. 임의 추가 백들도 유사하게 제거할 수 있다.

냉동 백(6)에 연결된 공급 라인(24b)이 연결분리된 후, 세포 냉동보호제가 입구를 통해 냉동 백(6) 내 수집된 성분 내로 도입될 수 있다. 냉동 백(6) 내 공기 거품(70)은 세포 냉동보호제가 수집된 성분들과 완전히 혼합되도록 허용한다. 혼합 후, 공기 거품(70)을 아마도 필터-보호된 세포 냉동보호제 입구(16)(도 10)를 통해 추방한다. 그리고나서, 튜빙을 열 밀봉하고 세포 냉동보호제 입구(16)의 하부로 백(6)을 제거함으로써 성분을 저장을 위해 준비한다.

바람직하게, 각 라인(유입 라인(12)과 공급 라인(24a, 24b))을 수집 또는 저장 백 근처 샘플링 위치(예, 위치(18))로 접근을 허용하도록 배향한다. 즉, 라인 내 혈액 또는 유체 샘플은 수집된 성분의 용적을 방해하지 않으면서 취해질 수 있다.

도 13은 시간의 함수로써 전체 혈액 성분의 분리를 도시한다. 원심분리 하에서 각 분획은 이의 밀도의 함수로써 가공 백(2) 내에서 성층화한다. 겹치는 영역(175)(도 13)은 가공 백(2) 내 각각의 층 라인을 따른 분리에서 영역을 지시한다. 원심분리가 계속될수록, 각 분획의 경계는 보다 분명하게 한정되며, 즉, 영역(175)은 감소하고 각 분획은 보다 완전하게 수확된다. 즉, 원심분리 전략은 밀도에 의한 분리, 다양한 세포들의 밀도와 외부 표면 영역에서 다른 성층화를 위해 수반된 시간, 원심분리 힘, 및 경계 층 맑음을 결합한다. 수확에 대한 결정은 이러한 교환 조건에 기초하여 가장 큰 값 및 이의 바람직한 순도라는 구성요소의 함수로써 다양할 것이다.

바람직하게, 성층화 원심분리는 대략 20분 동안 1000 Gs, 바람직하게 1400 Gs를 초과하는 힘에서 일어난다. 이송 원심분리 단계는 100Gs, 바람직하게 78Gs 미만에서 일어나며, 광학 센서(58)로부터 출력에 의존하여 멈춘다. 도 36의 우측면은 WBC 모집단을 추출하기 위해서 밸브(20)를 ON/OFF 조절함으로써 증가하면서 마무리되는 백색 세포 백(냉동 백(6))을 나타낸다.

본 발명은 혈액 성분의 분리에 바람직하게 사용되는 반면, 분리 기술과 장치는 다른 유체의 분리를 위해서도 적합한 것으로 이해된다. 콘트롤 칩 모듈내로 프로그래밍된 소프트웨어는 서보 모터가 수회 밸브를 열고 닫도록 야기할 수 있으며, 이로써, 층 배달 동안 밸브를 조절할 수 있다. 또한, 수확 절차 동안 시간 증가를 변화시킴으로써, 가공 백(2)으로부터 혈액 성분의 제거 동안 "토로이드(toroidal)"(코리올리) 효과의 결과로써 일어날 수 있으며 다른 유체의 분리를 위해 변형될 수 있는 세포 유형들 사이 혼합을 감소시키기 위하거나 또는 다양한 하드웨어 조건, 예컨대, 평평치 못한 원심분리 적하를 보충하기 위해 세포 성분들 사이 정교한 컷오프가 달성될 수 있다.

백 세트(210)의 또 다른 양태가 도 15에 도시되어 있다. 본질적으로, 백 세트(210)는 전체 혈액 가공 백(202), 적혈구(RBC) 백(204), 및 냉동 백(206)을 포함한다.

가공 백(202)을 스파이크(208)에서 종결하는 유입 라인(212)을 통해 공급한다. 가공 백(202)은 상부 모서리(211a), 짧은 측면 모서리(211b), 긴 측면 모서리(211c)와, 바닥 부분이 출구(226)로 인도되는 비대칭 포인트(214)로 테이퍼링되 는 측면 모서리들 사이에 경사진 바닥 모서리(211d)를 포함하는 비대칭 모양을 갖는다. 출구(226)는 가공 백(202)으로부터의 출력을 마개 밸브(220)로 인도한다. 두 개의 공급 라인(224a, 224b)은 마개 밸브(220)로부터 RBC 백(204)과 냉동 백(206)으로 각각 안내한다. 공급 라인(224a, 224b)과 유입 라인(212)은 각각 열 밀봉되어 백 세트(210)로부터 분리될 수 있다. 모든 라인들은 바람직할 때 유체 통로를 막기 위해 폐쇄될 수 있는 라인 클램프(222)가 장치되어 있다. 다른 성분들이 분리되어야 한다면, 백 세트(210)는 다른 백들을 수용하기 위해 마개 밸브(220)에 상응하는 조절장치를 지닌 추가 백을 포함할 수 있다.

처음, 관심 있는 혈액을 수집 백(200) 또는 이와 유사한 용기로 수집한다. 스파이크(208)를 수집 백(200) 내로 삽입하고, 혈액은 수집 백(200)으로부터 가공 백(202)으로 유입 라인(212)을 통해 배수한다(도 16, 17). 유입 라인(212)은 바람직하게 응괴 필터(230)를 가지는데, 이를 통해 혈액은 가공 백(202)에 이르기 전에 통과한다. 혈액이 옮겨진 후, 유입 라인(212)을 열 밀봉하고 수집 백(200)과 응괴 필터(230)를 제거한다(도 18).

유입 라인(212)은 또한 바람직하게 샘플링 포트(232), 샘플링 필로우(234), 및 접근 포트(236)(도 19)를 갖는다. 수집 백(200)과 응괴 필터(230)를 유입 라인(212)으로부터 이동한 뒤, 샘플링 필로우(234)를 압착하고 풀어서 샘플링 필로우를 혈액으로 채운다. 그리고나서 유입 라인(212)을 열 밀봉하고 샘플링 필로우(234)를 샘플링 포트(232)(도 20)를 따라 제거한다. 샘플링 필로우(234) 내 혈액은 이어서 별개 분석을 위해 샘플링 포트(232)를 통해 접근할 수 있다.

침전제가 요구되었던 선행기술과는 달리, 하이드록시에틸 녹말(HES)과 같은 침전제가 주사기 수단(236a) 또는 유사 전달 수단을 사용하여 유입 라인(212) 상에 있는 접근 포트(236)를 통해 가공 백(202)에 선택적으로 가해질 수 있으며, 가공 백(202)은 침전제를 혈액과 완전히 혼합하도록 조작된다(도 21). 이어서 백 세트(210)는 백 홀더(50) 내로 위치하며 상기에서 상세히 설명한 바와 같이 원심분리기와 함께 사용한다(도 22). 분리된 적혈구는 RBC 백으로 옮겨지고 WBC 분획은 이 작동 동안에 냉동 백(206)으로 옮겨진다. 그리고나서 백 세트(210)를 백 홀더(50)로부터 제거한다(도 23). 그리고나서 공급 라인(224a)을 열 밀봉하고 RBC 백(204)을 제거한다(도 24). RBC 백의 내용물은 샘플 포트(238)를 통해 접근한다.

도 25를 참고하여, 공급 라인(224b)에는 보조 포트(242)에서 종결하는 보조 유입 라인(240)을 연결하는 첫 번째 접속점(260)이 장치되어 있다. 두 번째 접속점(262)은 벌브(246)에서 종결하는 브랜치 라인(244)을 연결하기 위해 보조 유입 라인(240) 자체에 존재한다. 브랜치 라인(244)은 또한 샘플링 피그테일(248)과 샘플링 포트(250)를 함유한다. RBC 백(204)의 제거 후, 브랜치 라인(244)상의 벌브(246)는 압착되어 공급 라인(224b)에 남아 있는 임의 잔여 혈장을 냉동 백(206)으로 인도한다. 이어서, 브랜치 라인(244) 상의 클램프(222)는 닫힌다. 이어서, 냉동 백(206)의 내용물은 바람직하게 냉동 백(206)을 45°로 유지하고 냉동 백(206)의 작은 구획(206a)을 초당 한 번 압착으로 총 10번 천천히 압착함으로써 혼합한다.

이어서, 브랜치 라인(244) 상의 클램프(222)가 열리고, 벌브(246)가 압착되 고 풀려서 샘플링 피그테일(248)을 냉동 백(206)의 내용물로 채운다(도 26). 브랜치 라인(244)을 열 밀봉하고 백 세트(210)로부터 제거한다(도 27). 샘플링 피그테일(248)의 내용물을 별도 분석을 위한 샘플링 포트(250)를 통해 접근한다.

냉동 백(206)은 이의 측면 상에 놓여 두 개의 얼음 팩(252) 사이에 끼인다(도 28). DMSO를 보조 유입 라인(240) 상에 무균 필터(242a)(즉, 0.2 마이클론 이하)를 갖는 보조 포트(242)를 통해 냉동 백(206) 내로 도입한다. 궤도 믹서(254)를 냉동 백(206)의 내용물을 완전히 혼합하기 위해 사이에 끼인 냉동 백(206)과 사용한다. 이어서, 사이에 끼인 냉동 백(206)은 정지상 홀더(256) 내에 놓인다(도 29). 주사기(258)를 보조 입구(242) 내로 삽입하고 공급 라인(224b)과 보조 유입 라인(240) 내에 걸린 임의 잔여 DMSO를 빼내기 위해 사용한다. 냉동 백(206)으로부터 연층/DMSO를 공급 라인(224b)으로부터 두 번째 접속점(262)에 도달할 때까지 주사기(258)에 의해 빼낸다. 이어서, 냉동 백(206)을 백 세트(210)로부터 공급 라인(224b)을 열 밀봉함으로써 제거한다(도 30).

첫 번째 접속점(260) 후 공급 라인(224b)의 일부는 냉동 백(206)에 부착된 채 남아있다. 공급 라인(224b)의 이 부분을 세 개의 분리된 샘플(275a, 275b, 275c)을 형성하기 위해서 열 밀봉하고(여전히 냉동 백(206)에 연결됨), 냉동 백(206)의 작은 구획(206a)을 분리하는 영역을 열 밀봉하여 이를 냉동 백(206)의 나머지로부터 분리시킨다(도 31). 그리고나서, 최종 산물을 저장을 위해 냉동한다.

마개 밸브(220)를 가공 백 내 혈장을 첫 번째 및 두 번째 접속점(260, 262) 근처 공급 라인(224b) 내 연층과 접촉하는 것을 허용하도록 돌린다(도 32). 혈장 희석된 연층 샘플을 박테리아 샘플링을 위해 주사기(258) 내로 빼내고, 주사기(258)를 보조 포트(242)로부터 제거한다. 보조 라인(240)을 함유하는 공급 라인(224b)과 첫 번째 및 두 번째 접속점(260, 262)은 그리고나서 가공 백(202)으로부터 연결분리하여 폐기한다(도 33). 가공 백(202) 내 혈장 샘플은 접근 포트(236)를 사용함으로써 제거될 수 있다(도 34).

더 나아가, 이렇게 기술된 본 발명으로, 상기에 개시되고 하기 청구의 범위에 기술된 본 발명의 범위 및 의미를 벗어나지 않으면서 수많은 구조적 변형과 개작이 가능함이 자명할 것이다.

Claims (10)

1. 상부 모서리, 짧은 측면 모서리, 긴 측면 모서리와 경사진 바닥 모서리를 포함하는 비대칭 모양을 갖는 첫 번째 백과 복수의 다른 백들을 포함하는 백 세트;

   백 세트 홀더, - 그 위에서 첫 번째 백은 백 세트 홀더의 안쪽 부분 내에 함유되며 복수의 다른 백들은 상기 다른 백들 중 어느 하나로 들어가는 액체가 상기 첫 번째 백 내의 액체보다 낮도록 위치됨.-; 및

   직경에 있어 마주보는 적어도 두 개의 수신 소켓을 갖는 원심분리기, - 적어도 하나의 소켓은 백 세트 홀더를 수신하도록 치수가 맞추어짐.-를 조합하여 포함하는,

   전혈로부터 성분들을 격리하기 위한 장치.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 상부 모서리, 짧은 측면 모서리, 긴 측면 모서리와 경사진 바닥 모서리를 포함하는 비대칭 모양의 가공 백, 적어도 하나의 보조 백, 가공 백에 인접한 샘플링 사이트 및 각각의 보조 백과 연통하는 샘플링 사이트를 갖는 혈액 가공 백 세트를 제조하는 단계;

   채취된 전혈을 가공 백으로 도입하는 단계;

   상기 전혈을 후속 분석을 위해 샘플링하는 단계;

   상기 전혈을 원심분리하는 단계, -여기서, 성분들은 가공 백에서 분리됨.-;

   각 성분을 혈액 가공 백 세트의 적어도 하나의 보조 백으로 인도하는 단계; 및

   각 성분의 샘플을 후속 분석을 위해 옮기는 단계를 포함하는,

   폐쇄 무균 환경에서 전혈로부터 성분들을 분리하는 방법.
6. 상부 모서리, 짧은 측면 모서리, 긴 측면 모서리와 경사진 바닥 모서리를 포함하는 비대칭 모양을 갖고 입구 및 출구를 갖는 첫 번째 백;

   복수의 보조 백들, - 각각의 상기 보조 백은 내용물을 넣거나 배출하는 적어도 하나의 포트를 갖는다.-;

   첫 번째 백으로부터 각각의 보조 백으로 안내하는 도관 수단;

   첫 번째 백과 상기 복수의 보조 백들 사이의 선택적인 접근을 허용하도록 조절가능한, 상기 도관 수단 상의 밸브 수단을 조합하여 포함하는 백 세트.
7. 제6항에 있어서, 상기 밸브 수단이 상기 복수의 보조 백들 사이의 선택적인 접근을 서로 허용하는 백 세트.
8. 원심분리기의 내형과 상보적인 외부 형상을 갖는, 백 세트 지지 수단을 지닌 하우징;

   밸브의 조절 하에 액체 수신 입구 및 출구를 갖고 상부 모서리, 짧은 측면 모서리, 긴 측면 모서리와 경사진 바닥 모서리를 포함하는 비대칭 모양을 갖는 가공 백을 포함하고, 폐쇄된 무균 시스템인 백 세트, - 상기 밸브는 백 세트에서 복수의 다른 백으로 선택적으로 안내함.-; 및

   상기 복수 백으로 액체를 인도하는, 상기 하우징 상의 밸브 조절 수단을 조합하여 포함하는,

   밀도의 함수로써 액체를 성분들로 분리하기 위해 원심분리기와 함께 사용하기 위한 장치.
9. 제8항에 있어서, 상기 밸브 조절 수단은

   상기 복수의 백 중 하나에 작동가능하게 연결되어 하나의 백의 중량을 증가시키는 액체를 계량하도록 구성된 계량 수단을 포함하며, 상기 계량 및 상기 밸브 조절 수단은 상기 하나의 백을 정밀하게 채우도록 제휴하여 작동하는 장치.
10. 제8항에 있어서, 상기 밸브 조절 수단은

    상기 밸브의 방향을 변경하기 위한 상기 밸브에 대한 명령에 의해 유발되는 액체 특성의 천이를 구별하기 위해 상기 백 세트와 상기 하우징에 대하여 배치된 센서를 포함하는 장치.

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