KR101338941B1

KR101338941B1 - 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101338941B1
Application number: KR1020110073400A
Authority: KR
Inventors: 김종부; 최상원; 이은주; 정현진; 이성규; 박우동; 임현희; 김준한; 최지영; 박진홍
Original assignee: (주) 엔유씨생활과건강; 주식회사 엔유씨전자
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2013-12-10
Also published as: KR20130012298A

Abstract

본 발명은 골관절염(Osteoarthritis) 또는 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 건조 중량 100g 당, 20-히드록시엑디손(20-Hydroxyecdysone)을 50 내지 150mg 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물과 이의 제조 방법에 관한 것이고, 나아가 상기 발효 우슬 추출물을 함유하는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

Description

골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법{Fermented achyranthes extract for the prevention and treatment of osteoarthritis or rheumatoid arthritis and a method for preparation thereof}

본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

골관절염이란, 뼈와 뼈가 직접 부딪히는 충격과 마찰을 완화하기 위해 우리 몸의 관절 안에 발달한 연골층이 손상되어 뼈와 뼈가 직접 마찰하면서 통증이 발생하고 이에 따라 움직이기 어려워지는 질환을 말한다. 이러한 골관절염은 주로 무릎, 고관절, 손, 발, 척추 등 하나의 관절에서부터 발생할 수 있고, 여러 관절에서 동시에 발생할 수도 있는 질환이다.

류마티스 관절염이란, 면역체계의 이상에 의해 자신의 관절이나 몸의 일부를 공격하여 염증을 일으키는 자가 면역 질환으로써, 손가락, 손, 발, 손목, 발목, 무릎 등 여러 관절이 아프고 붓는 증세를 나타내며, 근육, 피부, 폐, 눈 등 여러 다른 장기에도 이상을 초래할 수 있는 전신적인 만성 염증성 질환을 말한다.

이러한 관절염이 발생하게 되는 직접적인 원인은 아직까지 명확하지 않기 때문에 이에 대한 연구가 계속적으로 진행되고 있으며, 현재까지도 류마티스 관절염 등의 관절염에 대한 효과적인 치료 방법이나 예방 방법 등이 제대로 알려진 바가 없어, 이에 대해 해결해야 할 점들이 많이 남아 있는 실정이다.

관절염 치료를 위한 여러 치료제 및 치료 방법들이 제안되어 왔으나, 이러한 치료제 및 치료 방법들은 근원적인 치료법이라고 보기 어려우며, 관절염 치료제로써 스테로이드 호르몬제와 같은 호르몬제가 많이 알려지고 사용되어 왔으나, 그에 따른 부작용들이 보고가 됨에 따라 그 사용이 어렵게 되었다.

관절염, 특히 만성 류마티스 관절염은 환자에게 심한 통증을 유발하므로 반드시 항염증제 등을 복용하여야만 하는데, 이러한 통증을 완화시키기 위하여 오랫동안 널리 사용되어 온 것이 아스피린이다. 그러나 이러한 아스피린은 사람의 위에 치명적인 영향을 주므로 관절염을 치료하는 데에 필요한 양을 계속적으로 복용하는 것은 어려운 것으로 여겨지고 있다.

기존의 이러한 화학 요법적 약제는 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용, 항염증 효과의 결핍 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 가지고 있어 이러한 문제에 대한 해결책으로서 효과적인 관절염 치료제의 개발에 대한 요구가 끊임없이 지속되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 관절염 치료제는 정도의 차이나 개인적인 차이가 있기는 하지만 모두 어느 정도의 부작용을 가지고 있고, 특히 류마티스 관절염의 치료를 위해서는 약제를 장기간 복용할 필요가 있기 때문에, 부작용이 적은 약재를 개발하는 것이 매우 중요하고 시급한 문제가 되고 있다.

우슬(Achyranthes)은 비름과에 속하는 여러해살이 초본 식물, 또는 그의 뿌리를 일컫는 것으로서, 쇠무릎(우슬) 풀은 마디가 소의 무릎과 같이 퉁퉁하게 부풀어 올라 있다고 하여 붙여진 이름이다.

우슬의 일반적인 효능은 혈액 순환을 원활하게 하고 어혈을 제거하는 작용을 하여 생리불순, 산후복통의 치료에 쓰이며, 간과 신장 등의 장기에도 좋은 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

KR 제10-0540033호 B1 (2005.12.29.공고) KR 제10-0654904호 B1 (2006.12.06.공고) KR 제10-2003-27208호 A (2003.04.07.공개)

본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 추출물 및 이의 제조 방법을 제공한다.

보다 상세하게는 본 발명의 일 양태에 따르면, 건조 중량 100g 당, 20-히드록시엑디손(20-Hydroxyecdysone)을 50 내지 150mg 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 발효균이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 인 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase) 저해율이 71.5% 이상 및 사이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2) 저해율이 63% 이상인 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 연골분해효소의 발현 억제 효능, 항산화 효능, 염증 유발인자의 발현 억제 효능, 항염증성 인자의 생성 증가 효능 및 류마티스 인자 발현 억제 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기의 발효 우슬 함유 추출물을 함유하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기의 건강기능식품 조성물에 오가피, 해동피, 홍화씨 및 어성초 추출물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 발효균이 바실러스 서브틸리스인 발효 우슬 추출물의 제조 방법으로서,

우슬을 증자하는 단계;

상기 증자된 우슬에 바실러스 서브틸리스를 접종하여 발효시키는 단계; 및

상기 발효된 우슬을 추출 및 농축시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기의 제조 방법에 있어서, 상기 발효 단계는 상기 증자된 우슬 100 중량부에 대하여, 5 내지 20 중량부의 바실러스 서브틸리스를 접종하여 발효시키는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기의 제조 방법에 있어서, 상기 발효 단계는 30 내지 55℃의 온도 범위에서 1 내지 7일의 기간 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 20-히드록시엑디손은 우슬 내 생합성으로 만들어지는 주요성분으로서 세포막 내에서 염증을 일으키는 카텝신 B(Cathepsin B)의 과다 분비를 막아주는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 20-히드록시엑디손의 함량은 상기 발효 우슬 추출물의 건조 중량 100g 당 50 내지 150mg인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 함량이 70 내지 150mg일 수 있으며, 가장 바람직하게는 함량이 100 내지 130mg일 수 있다. 상기 건조 중량이란, 상기 발효 우슬 추출물을 수분 함량이 5 중량% 미만이 되도록 동결 건조 시킨 건조물의 중량을 의미하는 것으로, 상기 동결 건조는 그 수행 방법에 있어서 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행할 수 있다.

상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 청국장, 메주 등 전통 발효 음식에 사용되는 대표적인 균주를 의미하는 것으로, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1을 사용할 수 있다. 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1은 한국미생물보존협회(KCCM)에 특허 기탁된 공지의 균주이다(기탁번호 KCCM-10839, 2007. 1. 24).

상기 5-리폭시게나제는 아라키돈산을, 염증 매개인자로 잘 알려진 류코트리엔으로 전환시키는 물질로써, 염증을 악화시키는 매개체의 하나로 알려져 있다.

본 발명의 일 양태인 발효 우슬 함유 추출물에 의한 상기 5-리폭시게나제의 저해율은 바람직하게는 71.5% 이상 100% 미만 일 수 있다.

상기 사이클로옥시게나제-2는 염증 유발인자로 알려져 있다.

본 발명의 일 양태인 발효 우슬 함유 추출물에 의한 상기 사이클로옥시게나제-2의 저해율은 바람직하게는 63% 이상 100% 미만 일 수 있다.

상기 우슬을 발효시키는 방법은 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 발효 우슬 또는 발효 우슬을 함유하는 혼합물을 추출하는 방법은 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 발효 우슬 추출물을 제조하는 방법은 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.

우슬을 증자하는 단계;

상기 발효된 우슬을 농축시키는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물의 제조 방법은 그 구체적인 단계의 수행 방법에 있어서 특별히 한정되지 아니하며, 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 알려진 방법에 의하여 수행할 수 있다.

다만, 상기 발효 단계에 있어서, 보다 바람직하게는 상기 증자된 우슬 100 중량부에 대하여, 5 내지 20 중량부의 바실러스 서브틸리스를 접종하는 방식으로 수행할 수 있고, 가장 바람직하게는 10 내지 15 중량부의 바실러스 서브틸리스를 접종하는 방식으로 수행할 수 있다. 또한 상기 발효 단계에 있어서, 보다 바람직하게는 30 내지 55℃의 온도 범위에서 1 내지 7일의 기간 동안 발효시키는 방식으로 수행할 수 있고, 가장 바람직하게는 40 내지 45℃의 온도 범위에서 3 내지 6일의 기간 동안 발효시키는 방식으로 수행할 수 있다.

상기 우슬은 비름과에 속하는 여러해살이 초본 식물 또는 그 뿌리를 말한다.

상기 오가피는 두릅나무과에 속하는 오가(갈)피나무의 뿌리, 줄기 또는 나무껍질을 말한다.

상기 해동피는 두릅나무과에 속하는 엄나무의 뿌리 또는 나무껍질을 말한다.

상기 홍화씨는 국화과에 속하는 홍화의 씨앗을 말한다.

상기 어성초는 삼백초과에 속하는 여러해살이풀로, 약모밀이라고도 불리는 식물을 말한다.

상기 발효 우슬 함유 복합 조성물에 있어서, 발효 우슬, 오가피, 해동피, 홍화씨 및 어성초의 함량은 특별히 한정되지 아니하나, 바람직하게는 발효 우슬 100 중량부에 대하여, 오가피 15 내지 35 중량부, 해동피 15 내지 35 중량부, 홍화씨 15 내지 35 중량부 및 어성초 15 내지 35 중량부를 함유할 수 있고, 보다 바람직하게는 발효 우슬 100 중량부에 대하여, 오가피 20 내지 30 중량부, 해동피 20 내지 30 중량부, 홍화씨 20 내지 30 중량부 및 어성초 20 내지 30 중량부를 함유할 수 있다.

본 발명의 발효 우슬 추출물은 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료적 효능을 갖는다. 보다 상세하게는, 본 발명의 발효 우슬 추출물 및 발효 우슬 복합 추출물은 연골분해효소의 발현 또는 활성을 억제시키고, 항산화 활성이 우수하며, 염증 유발인자의 발현을 억제하고 항염증성 인자의 생성을 증가시키는 등 소염 효과가 뛰어나며, 류마티스 인자를 감소시키는 등 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료적 효능이 뛰어난 추출물 및 건강기능식품 조성물을 제공하는 이점을 갖는다.

도 1은 각 샘플군의 PGE₂ 생성량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 PGE₂ 생성이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
도 2는 각 샘플군의 MMP-1, -3 및 -13 단백질 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 MMP-1, -3 및 -13 단백질 발현이 감소됨을 보여주는 도면이다.
도 3은 각 샘플군의 MMP-1, -3 및 -13의 mRNA 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 MMP-1, -3 및 -13의 mRNA 발현이 감소됨을 보여주는 도면이다.
도 4는 각 샘플군의 TNF-α의 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 TNF-α의 발현이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
도 5는 각 샘플군의 IL-4의 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 IL-4의 발현이 증가됨을 보여주는 그래프이다.
도 6은 각 샘플군의 MMP-3의 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 MMP-3의 발현이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
도 7은 골관절염이 유도된 각 샘플군의 조직병리학적 관찰 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 각 샘플군의 IL-1β의 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 IL-1β의 발현이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
도 9는 각 샘플군의 RF의 발현량에 관한 것으로, 발효 우슬 추출물에 의해 RF의 발현이 감소됨을 보여주는 그래프이다.
도 10은 류마티스 관절염이 유도된 각 샘플군의 조직병리학적 점수를 보여주는 그래프이다.

이하, 실시예 및 실험예를 기술함으로써 본원 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본원 발명의 일 예시에 불과하며, 본원 발명의 내용이 이에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

실시예 1

발효 우슬 추출물의 제조

시중의 우슬 건조물 100g을 세척하여 분쇄기로 분쇄한 후, 상기 분쇄물에 150g의 이온수를 첨가하여 혼합한 후 120℃에서 15분간 증자하였다. 그 다음, 상기 증자된 우슬에 미리 배양된 바실러스 서브틸리스 BN-NUC1(한국미생물보존협회(KCCM), 기탁번호 KCCM-10839, 2007. 1. 24) 5%를 접종하고, 40~45℃ 온도 범위에서 5일간 발효하여 발효 우슬을 얻었다. 상기 발효 우슬에 10배가량의 물을 넣고 40℃에서 3시간 동안 추출하는 과정을 2회 반복하였다. 상기 추출물을 여과한 후, 감압 농축한 다음, 100ml 물에 용해시킨 후 냉침시켰다. 그 다음, 연속식 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 난 상등액을 회전진공농축기(Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후 동결 건조하여 본 발명의 발효 우슬 추출물을 얻었다.

실험예 1

발효 우슬 추출물의 20-히드록시엑디손(20-Hydroxyecdysone) 함량 분석

상기 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물과, 상기 실시예 1과 동일한 방법에 의하되, 발효 단계를 거치지 않고 제조된 비발효 우슬 추출물을, 0.45μm membrane filter(Gelman, Ann Arbor, MI, USA)로 통과시킨 후, 하기 표 1의 조건하에서 HPLC(High performance liquid chromatography)를 사용하여, 우슬의 지표성분인 20-히드록시엑디손의 함량을 분석하였다. 20-히드록시엑디손은 우슬의 생합성으로 만들어지는 주요성분으로서 세포막 내에서 염증을 일으키는 카텝신 B(Cathepsin B)의 과다 분비를 막아주는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

20-히드록시엑디손의 함량을 분석한 결과는 하기 표 2에 나타낸다.

항목	작동 조건
HPLC 시스템	Waters 600 controller HPLC system (New York, USA)
칼럼( Column )	YMC-Pack Pro C₁₈ column
용매	C; 0.05% H₃PO₄ in H₂O D; 100% MeOH C 부터 D 까지 60분 동안 선형 구배 용리(a Linear gradient elution)
검출기	UV₂₄₉ _&310 _nm
유속( Flow rate )	0.8 mL/min

발효 기간	20-히드록시엑디손 (mg/100 g, 건조 중량)
비발효	15.13±0.91
3일	54.80±1.74
5일	123.93±8.20
7일	122.95±3.04

상기 표 2에서와 같이, 비발효 우슬 추출물의 20-히드록시엑디손의 함량은 우슬 추출물의 건조 중량 100g당 15.13mg이었고 발효 3일째에는 54.80mg, 발효 5일째에는 123.93mg(비발효 샘플에 비해 약 8배가량 높은 수치)이었으며 발효 7일째에는 122.95mg이었다. 우슬을 발효함에 따라 발효 5일째까지는 20-히드록시엑디손의 함량이 증가하였으나 발효 7일째에는 오히려 함량이 감소하는 것으로 보아, 발효기간은 7일을 넘지 않는 것이 보다 바람직할 것으로 판단되었다.

실험예 2

발효 우슬 추출물의 항염증 활성: 5-LO 및 COX-2 저해 활성 측정

5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase, 이하 5-LO)는 아라키돈산을, 염증 매개인자로 잘 알려진 류코트리엔으로 전환시키는 물질로써, 염증을 악화시키는 매개체의 하나이다.

발효 우슬 추출물의 5-LO 저해 효능 측정은 분석키트(lipoxygenase inhibitor screening assay kit)를 이용하여 실험하였다. 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물 10μL에 5-LO(220 units/mL) 90μL와 1mM의 아라키돈산 10μL를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체(chromogen) 100μL를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 오토리더기를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 노르디히드로구아이아레틱산(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)을 사용하였으며, 하기의 식에 따라 저해율을 산출하였다.

5- LO 저해율(%)=[(대조군의 흡광도- 실험군의 흡광도)/ 대조군의 흡광도] X100

사이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2, 이하 COX-2)는 염증 유발인자로 알려져 있다. 발효 우슬 추출물의 COX-2 저해 효능은 COX 저해 스크리닝 분석 키트(COX inhibitor screening assay kit)를 이용하여 실험하였다. 상기 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물 20μL에 hemo 10μL, 효소 5μL, 버퍼 950uL를 넣고 37℃에서 반응시킨 후, 10μL의 아라키돈산을 첨가하여 37℃에서 2분간 반응시켜 COX-1과 COX-2를 활성화시켰다. 그 다음, 이 중 50μL를 취하여 200μL의 색원체를 넣은 후 25℃에서 90분간 반응시킨 다음, ELISA 오토리더기 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 비스테로이드성 소염 진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 중의 하나인 인도메타신(indomethacin)을 사용하였으며, 다음 식에 따라 저해율을 산출하였다.

COX -2 저해율(%)=[(대조군의 흡광도- 실험군의 흡광도)/대조군의 흡광도] X100

비발효 우슬 추출물 및 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물의 5-LO 및 COX-2 저해 효능을 25μg/mL 농도에서 측정한 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

시료	5- LO 저해율(%)	COX -2 저해율(%)
비발효 우슬 추출물	66.51±4.94	59.65±2.93
발효 우슬 추출물	72.89±0.80	74.11±2.04

상기 표 3과 같이, 5-LO 및 COX-2 저해 효능 모두, 비발효 우슬 추출물보다 발효 우슬 추출물에서 현저히 높은 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3

발효 우슬 추출물의 항염증 활성: PGE ₂ 생성량 측정

프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, 이하 PGE₂)는 COX-2의 작용에 의하여 분비되어 연조직의 염증을 악화시키는 인자로 알려져 있다. 발효 우슬 추출물의 PGE₂생성 억제 효능을 측정하기 위하여 하기와 같이 배양한 세포를 효소 면역 분석법 키트(Enzyme immunoassay kit)를 이용하여 실험하였다.

(1) 세포 배양

Korean Cell Line Bank(KLCB)로부터 Murine macrophage cell line RAW 264.7 세포를 분양받아, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% 항생제가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) low glucose 배지를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2~3일에 한번 씩 계대 배양을 시행하였다.

(2) PGE₂생성량 측정

상기 RAW 264.7 세포 배양액 내의 PGE₂함량을 효소 면역 분석법 키트를 이용하여 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM low glucose 배지를 이용하여 1 X 10⁵cells/mL 농도로 96 웰 플레이트에 분주하여 5개의 샘플을 준비한 후, 그 중 4개의 샘플에 각각 세균성 염증유발물질인 지질다당류(Lipopolysaccharide, 이하 LPS) 100 ng/mL를 처리하여 염증을 유발시키고, 이 4개의 샘플에 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물(FWS)을 각각 농도를 달리하여(각각 0, 62.5, 125, 250μg/mL) 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포 배양 상등액을 취하여 PGE₂의 생성량을 측정하였다.

실험 결과, LPS를 처리한 후의 세포 배양액 내에서의 PGE₂ 생성량은, LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 약 8배가량 증가된 것으로 확인되었으며, 이에 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물(FWS)을 처리한 경우, PGE₂의 생성이 유의적으로 감소되는 것이 확인되었다. 더 나아가, 발효 우슬 추출물을 약 125μg/mL 이상의 농도로 처리한 경우, LPS를 처리하지 않은 대조군 이하의 수준으로 PGE₂ 생성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

실험예 4

발효 우슬 추출물의 연골 보호 효능: MMPs 의 발현 감소 여부 측정

기질성 금속단백분해효소(Matrix metalloproteinases, 이하 MMPs)는 연골 및 관절의 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)의 파괴를 유도하고, 관절염 등의 질환을 진행시켜 서서히 악화시키는 인자로 알려져 있다. 발효 우슬 추출물이 MMPs 발현을 감소시키는지 여부를 측정하기 위하여 하기와 같이 배양한 세포를 이용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행하였다.

(1) 세포 배양

American Type Culture Collection(ATC)으로부터 SW1353 세포주(사람 연골 육종 세포주, human chondrosarcoma cell line)를 분양받아, 37℃의 5% CO₂ 배양기에서, DMEM high glucose에 10% FBS과 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 첨가된 배지에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.

(2) 세포 배양액에 TNF-α 및 발효 우슬 추출물 처리

① MMPs 단백질 발현 감소 정도의 측정을 위한 샘플군 준비

SW1353 세포를 DMEM high glucose 배지를 이용하여 1 X 10⁵cells/mL 농도로 96 웰 플레이트에 분주하여 7개의 샘플을 준비한 후, 그 중 6개의 샘플에 각각 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-α, 이하 TNF-α) 50ng/mL를 처리하고, 이 6개의 각 샘플에 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물(FWS)을 농도를 달리하여(0, 62.5, 125, 250, 500 및 1000μg/mL) 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

TNF-α는 혈관 내피 세포의 활성을 유도하여 여러 가지 화학 물질의 분비를 촉진함으로써 염증 관련 세포들의 이동을 촉진하는 등, 염증 발생을 반영하는 물질로 알려져 있다.

② MMPs의 mRNA 발현 감소 정도의 측정을 위한 샘플군 준비

상기 ①과 같은 방법으로 준비하되, TNF-α 50ng/mL를 처리한 6개의 각 샘플에 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물을 농도를 달리하여(0, 25, 50, 75, 100 및 125μg/mL) 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.

(3) 단백질 및 mRNA 수준에서 MMPs 발현 감소 정도의 측정

MMPs 단백질 발현 감소 정도를 측정하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였고, MMPs의 mRNA 발현 감소 정도를 측정하기 위해 역전사-중합효소 연쇄 반응법(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, 이하 RT-PCR)을 이용하였다.

총 RNA는 24시간 동안 배양한 SW1353 세포주에서 TRI 시약(Molecular Research Center, Inc.)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 하기와 같이 분리하였다. 우선, 배양된 세포에서 배지를 제거하고 pH 7.4 인산염 완충 식염수(Phosphate buffered saline, PBS) 10mL로 두 번 세척한 후, TRI 시약을 처리하였다. 이것을 1.5mL 튜브에 1mL씩 나누어 담고 1-브로모-3-클로로프로판(1-bromo-3-chloropropane) 200μL를 첨가한 후, 30초간 볼텍싱(vortex)하고 원심분리(3,000 rpm, 15분, 4℃)한 다음, 이의 상등액을 취하여 새로운 튜브에 옮겼다. 여기에 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 -20℃에서 2시간 이상 방치하고 난 다음, 원심분리(13,000 rpm, 15분, 4℃)한 후 이의 상등액을 제거하였다. 상기 상등액을 제거하고 난 침전물에 75% 에탄올을 첨가하고, 65℃ 수조에서 10분간 반응시켜 침전물을 녹였다. 분리된 RNA는 분광 광도계(spectrophotometer)와 1% 포름알데히드 아가로오스 젤(formaldehyde agarose gel) 전기영동을 이용하여 정량하고 확인하였다.

분리된 총 RNA 2μg에, Superscript Ⅱ RT 200 U, 0.5μg Oligo dT, 0.5mM dNTP를 첨가하여 42℃에서 90분간 반응시킨 후 70℃에서 10분간 반응을 종결시켰다.

총 RNA는 역전사되고 결과물인 cDNA는 하기 표 4의 프라이머(primer)들을 이용한 PCR 방법으로 증폭되었다. PCR의 반응에서 2.5U Takara Ex. Taq polymerase, 2mM MgCl₂, 0.2mM dNTP를 첨가하여 각각의 프라이머에 맞는 조건으로 실시하였다.

유전자	프래그먼트 사이즈( bp )	올리고뉴클레오티드 ( Oligonucleotides )	증폭 조건
MMP -1	408	5'-CTG AAG GTG ATG AAG CAG CC-3' 5'-AGT CCA AGA GAA TGG CCG AG-3'	94℃에서 1분 간, 56℃에서 1분 간, 72℃에서 1분 간 30 사이클
MMP -3	439	5'-CCT CTG ATG GCC CAG AAT TGA-3' 5'-GAA ATT GGC CAC TCC CTG GGT-3'	94℃에서 1분 간, 58℃에서 1분 간, 72℃에서 1분 간 30 사이클
MMP -13	489	5'-GAC TTC ACG ATG GCA TTG CTG-3' 5'-GCA TCA ACC TGC TGA GGA TGC-3'	94℃에서 1분 간, 60℃에서 2분 간, 72℃에서 3분 간 30 사이클

실험 결과, TNF-α를 처리한 후의 세포 배양액 내에서의 MMP-1, -3 및 -13 단백질 발현 및 mRNA 발현은, TNF-α를 처리하지 않은 대조군에 비해 현저히 증가된 것으로 확인되었으며, 이에 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물(FWS)을 처리한 경우, MMP-1, -3 및 -13 단백질 발현 및 mRNA 발현이 유의적으로 감소되는 것이 확인되었다(도 2, 도 3).

실험예 5

동물 모델을 이용한 발효 우슬 추출물의 관절염 개선 효능 검증

(1) 동물 모델 및 실험 디자인

2.5~3kg의 뉴질랜드산 흰 토끼를 입수하여 우리에 한 마리씩 각각 넣고 약 23±3℃의 온도와 약 50±5% 습도에서 12시간 간격으로 밤-낮 주기(light-dark cycle)를 주면서 사육하였다. 1주간 실험동물용 고형사료를 먹여 사육한 후, 체중을 측정하여 무작위로 3개의 군으로 나누었다. 제2군(관절염 대조군, OA) 및 제3군(시험군, FWS)은 오른쪽 무릎 관절의 관절낭에 콜라게나제 용액(collagenase solution)을 관절 내 주사요법(Intra-Articular Injection)으로 주입하여 골관절염을 유발시켰고, 제1군(정상 대조군, NC)에는 콜라게나제 용액 대신 식염수를 동량 주입하였다. 콜라게나제 용액 또는 식염수를 주입한 후 6일째부터 제1군 및 제2군에는 물을, 제3군에는 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물을 1일 1회, 4주 동안 매일 경구 투여하였다. 발효 우슬 추출물의 효능을 확인하기 위해 투여 4주 후에 부검을 실시하였다. 또한 채혈로 얻은 혈액으로 생화학적 검사를 실시하였고, 슬관절 연골의 조직병리학적 검사를 통해 발효 우슬 추출물의 골관절염에 대한 효능을 검증하였다. 실험 디자인을 하기 표 5에서 재정리한다.

군	군 이름		골관절염 유발 여부	시험물질 투여
1	NC (Normal Control)	정상 대조군	-	물
2	OA (Osteoarthritis)	관절염 대조군	오른쪽 무릎	물
3	FWS	시험군	오른쪽 무릎	발효 우슬 추출물

(2) TNF-α의 발현량 감소

혈장 내 염증 관련 인자들의 변화를 알아보기 위해 ELISA법을 이용하여 대표적인 친염증성 사이토카인인 종양괴사인자 TNF-α의 발현량을 측정하였다. 측정 결과, 혈액 내 TNF-α의 발현량은 정상 대조군(NC)에서 48.50±6.12pg/㎖로 나타난 반면, 관절염 유발군(OA)에서는 94.50±13.41pg/㎖로 나타나 관절염 유발에 따른 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 발효 우슬 추출물을 투여한 시험군(FWS)에서는 TNF-α의 발현량이 56.88±17.73pg/㎖로 나타나 유의적으로 감소하여 발효 우슬 추출물 투여가 염증 회복에 긍정적인 영향을 미침을 확인할 수 있었다(도 4).

(3) IL-4의 발현량 증가

인터루킨-4(Interleukin-4, 이하 IL-4)는 항염증성 사이토카인으로써, TNF-α와 IL-1β를 억제하여 연골 세포를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 혈액 내 IL-4의 발현량은 정상 대조군(NC)에서 57.50±10.83pg/㎖로 나타난 반면, 관절염 유발군(OA)에서는 160.57±10.83pg/㎖로 나타나 관절염 유발에 따른 IL-4의 생성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 시험군(FWS)에서는 IL-4의 발현량이 189.44±23.94pg/㎖로 나타나 관절염 유발군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 5). 상기의 결과는, 발효 우슬 추출물 자체가 IL-4의 발현을 촉진하여 골관절염을 치료하거나 예방하는 기전을 가지는 것으로 판단되었다.

(4) MMP-3의 발현량 감소

혈액 내 MMP-3의 발현량은 정상 대조군(NC)에서는 20.12±10.12pg/㎖인 것에 비해 관절염 유발군(OA)에서는 77.50±20.46pg/㎖로 나타나 관절염 유발에 따른 MMP-3의 혈액 내 생성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 시험군(FWS)에서는 MMP-3의 발현량이 34.63±14.09pg/㎖로 나타나 관절염 유발군에 비해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

(5) 조직병리학적 관찰

골관절염이 유도된 동물 모델에서 발효 우슬 추출물의 투여에 따른 관절 회복 정도를 평가하기 위해 조직병리학적 관찰을 시도하였다. 먼저 연골 세포의 배열 및 연골 기질의 양을 확인하기 위해, 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)을 이용한 H&E 염색 기법 및 관절 연골의 프로테오글리칸(Proteoglycan)을 염색하는 톨루이딘 블루(Toluidine blue, 이하 TB) 염색 기법 두 가지를 사용하였다.

관찰 결과, 정상 대조군(NC)의 경우 관절 표면이 매끄럽고 연골 세포와 기질의 배열이 모두 균형적이며, 프로테오글리칸 및 콜라겐 등의 연골 기질양이 풍부한 것으로 나타났다. 또한 콘드론(Chondron, 세포 주위 기질을 포함하고 있는 연골 세포)의 비대나 연골 세포의 증식성 변화 등도 관찰되지 않았다. 한편, 관절염 유도군(OA)의 경우에는 연골성 경골(Endochondral bone)의 두께가 두꺼운 것으로 관찰되었으며, 또한 육주형(trabecular type)이 아니라 하나의 기질 형태로 형성되어 있고 일부(점선 ①)에서는 호염성을 띄는 연골 기질을 포함하고 있는 것으로 관찰되었다. 이러한 병소의 특징으로 판단할 때 연골 표면(점선 ②)은 다소 고르지 못하게 거치상을 띠고 있기는 하지만, 손상 후 수복된 연골로 연골성 경골과 경계가 불명확한 것으로 판단되었다.

관절염 유도군의 또 다른 특징은 연골면의 손상(화살표 ①)으로 대부분의 연골층이 정상적인 연골 세포의 배열을 소실한 채 연골성 경골과 가까운 곳(화살표 ②)에서는 증식성 연골 세포들이 관찰되었고, 표층에 가까운 곳(화살표 ③)에서는 상처 치료 과정 중에 출현하는 섬유아세포(Fibroblast)와 연골 세포가 혼재해 있는 것으로 관찰되어 관절 내 콜라게나제의 침착에 따라 관절염이 유발되었음을 보여주었다.

한편, 시험군(FWS)의 경우 아직 수복되지 않는 병소(점선)가 관찰되었지만, 대부분의 연골층은 정상 관절면에 비해서 높은 세포 충실성(Cellularity)를 나타내면서 두껍게 증식한 것으로 관찰되었으며, 몇몇 개체에서 손상 연골 표면의 불규칙성은 관찰되었으나 TB 염색성은 정상적으로 관찰되었다(도 7).

실험예 6

동물 모델을 이용한 발효 우슬 추출물의 류마티스 관절염 개선 효능 검증

(1) 동물 모델 및 실험 디자인

DBA/1J 마우스 6주령의 수컷(Orient, Korea) 40마리를 입수하여, 1주간 실험 동물 사육실에서 순화시키고 7주령부터 실험을 시작하였다.

실험동물은 체중 측정 후, 각각 10마리씩 무작위로 4개 군으로 나누었다. 제1군은 아무런 처치를 하지 않은 정상 대조군(Normal), 제2군은 콜라겐 접종으로 관절염을 유발시킨 후(collagen-induced arthritis) 아무런 처치를 하지 않은 음성 대조군(CIA)으로, 상기 두 군은 일반 고형사료를 급여하였다. 제3군은 CIA를 유발시킨 후 항염증 약물인 Celecoxib(한국화이자제약사 제품) 0.03%를 포함하는 사료를 급여한 양성 대조군(Celecoxib)이고, 제4군은 CIA 유발 후 실시예 1에 의하여 제조된 발효 우슬 추출물 0.3%를 포함하는 사료를 급여한 시험군(FWS)으로 구성하였다. 발효 우슬 추출물의 효능을 확인하기 위하여 사료 급여 5주 후에 부검을 실시하였다.

상기 콜라겐 유도 관절염을 유발시키기 위하여, 기존의 알려진 방법에 따라 분리 정량된 우형 제2형 콜라겐(Bovine type Ⅱ collagen, Chondrex, USA)을, 동량의 complete Freund's adjuvant (Sigma, USA)와 전기 균질기(electirc homogenizer)를 이용하여 4℃를 유지하면서 고르게 섞어 에멀젼으로 만들었다. 이를 마우스 꼬리의 기시부에서 2~3cm 떨어진 부위에 50uL 피내 주사 하였고 처음 주사 한지 3주 후 동일한 방법으로 추가 접종 하였다. 추가 접종 시에는 incomplete Freund's adjuvant (Sigma, USA)를 사용하였다.

(2) IL-1β의 발현량 감소

인터루킨-1β(Interleukin-1β, 이하 IL-1β)는 염증을 촉진시키는 사이토카인으로 알려져 있다.

실험 결과에서 IL-1β는 음성 대조군(CIA)에서 가장 높은 발현을 보였고, 양성 대조군(Celecoxib)에서는 음성 대조군(CIA)보다 IL-1β 발현량이 유의적으로 감소된 것으로 나타났으며, 시험군(FWS)에서는 음성 대조군(CIA)보다 감소하는 경향을 보이는 것으로 나타났다(도 8).

(3) 류마티스 인자(Rheumatoid factor, 이하 RF)의 발현량 감소

상기 (1)에서 디자인된 실험을 8주째에 종료하였고, 각 군의 후대정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 측정 시까지 검체는 -70℃에 보관하였으며, 실험직전에 해동하여 RF인 면역 글로불린 G(Immunoglobulin G, 이하 IgG)와 IgM을 ELISA 키트 (SHIBAYAGI, Japan)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

류마티스 인자는 IgG의 Fc(Fragment, crystallizable) 영역에 결합하는 자가항체로, 류마티스 관절염의 진단과 예후 예측에 중요한 인자로 알려져 있다. 일반적으로 IgM 류마티스 인자 또는 IgG 류마티스 인자 등이 측정 대상이 되고, 이 중 IgM 류마티스 인자의 진단적 가치가 가장 높은 것으로 평가되고 있다.

실험 결과, 음성 대조군(CIA)에서 IgM 및 IgG 모두 가장 높게 나타났다. 반면 양성 대조군(Celecoxib)과 시험군(FWS)은 IgM이 음성 대조군(CIA)에 비해 유의적으로 감소한 것으로 관찰되었다. IgG 또한 양성 대조군(Celecoxib)과 시험군(FWS)에서 음성 대조군(CIA)에 비해 유의적으로 감소하였다(도 9).

(4) 조직병리학적 관찰

상기 디자인된 실험 종료 후, 각 군의 네 발을 채취하여 10% 중성포르말린 용액에 2일 동안 고정시킨 다음, 다시 10% EDTA(에틸렌디아민 테트라-아세트산, Ethylenediamine tetra-acetic acid) 용액에 담가 2주 동안 탈회하였다. 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매한 다음, 4㎛의 조직 절편을 제작하였다. 상기 조직절편에 H&E 염색법을 실시하여 조직변화를 관찰하고, TB 염색을 통해 무릎연골 내 프로테오글리칸의 소실 정도를 광학현미경으로 검사하였다. 관절의 조직병리학적 변화 관찰 시 그 병변 평가에 대한 기준은 플래터-자이버크(Plater-Zyberk) 등의 방법을 따랐으며, 이는 하기 표 6에 나타내었다. 최종점수는 하기의 두 가지 점수를 합산하여 각 군의 평균으로 표시하였다.

점수	미란 점수 척도
0	연골 또는 골의 파괴 없음
1-2	국소적인 연골 미란
3	미란 확대
4	전반적인 연골 미란 및 골 미란이 나타남
점수	활막염
0	염증 없음
1-2	막층 및/또는 막 내층의 침윤 세포가 다소 비대해짐
3	막층의 비대 및/또는 막 내층 세포의 보다 현저한 유입
4	활막 공간에 세포가 나타남, 막층의 비대 및 다수의 염증 세포에서 활막의 심한 침윤 관찰

실험 결과, 정상 대조군(Normal)은 정상적인 관절의 구조와 연골 내 풍부한 프로테오글리칸 함량을 보인 반면, 음성 대조군(CIA)에서는 뚜렷한 관절 연골의 소실 및 골미란을 보였으며, 관절낭 내 과도한 염증 세포의 침윤으로 인한 주위조직의 과도한 증생이 관찰되었다. 양성 대조군(Celecoxib)에서는 미약한 관절연골의 소실과 염증 세포 침윤이 관찰되었다. 시험군(FWS)에서는 앞, 뒷 발목 모두에서 염증 세포의 침윤, 관절연골 내 프로테오글리칸의 소실 및 주위 조직의 증생이 중간 정도로 관찰되었으며, 음성 대조군(CIA)과 비교하여 볼 때 전체 관절염 지수가 유의적으로 낮게 관찰되었다(도 10).

따라서 앞, 뒷 발목의 조직병리학적 관찰 결과 음성 대조군(CIA)이 가장 높은 관절염 지수를 보였고, 양성 대조군(Celecoxib), 시험군(FWS)은 음성 대조군(CIA)에 비해 관절염 지수가 유의적으로 감소하였다.

실시예 2

발효 우슬을 포함하는 발효 우슬 함유 복합 조성물의 제조

시중의 오가피, 해동피, 홍화씨 및 어성초를 입수하여 분쇄한 후, 각각 25g 씩을 취하여 실시예 1의 방법으로 제조한 발효 우슬 100g에 혼합한 후, 실시예 1에서와 같은 방법에 의해 상기 혼합물을 추출하여 발효 우슬 함유 복합 조성물을 얻었다.

Claims

발효 우슬 함유 추출물의 건조 중량 100g 당, 20-히드록시엑디손(20-Hydroxyecdysone)을 50 내지 150mg 함유하고, 상기 발효 우슬 함유 추출물에 함유된 우슬의 발효균이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것을 특징으로 하는, 골관절염(Osteoarthritis) 또는 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 발효 우슬 함유 추출물은 5-리폭시게나제(5-Lipoxygenase) 저해율이 71.5% 이상 및 사이클로옥시게나제-2(Cyclooxygenase-2) 저해율이 63% 이상인 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물.
제1항 또는 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 상기 발효 우슬 함유 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 오가피, 해동피, 홍화씨 및 어성초 추출물을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 발효 우슬 100 중량부에 대하여, 오가피 15 내지 35 중량부, 해동피 15 내지 35 중량부, 홍화씨 15 내지 35 중량부 및 어성초 15 내지 35 중량부를 함유하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
우슬을 증자하는 단계;
상기 증자된 우슬에 바실러스 서브틸리스를 직접 접종하여 30 내지 55 ℃에서 1 내지 7일 동안 발효시키는 단계; 및
상기 발효된 우슬을 추출 및 농축시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 골관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 발효 우슬 함유 추출물을 제조하는 방법.