KR20030027209A - 생약 추출물을 포함하는 관절염 치료 및 예방용 조성물의제조방법 및 그의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생약추출물을 포함하는 관절염 치료 및 예방용 조성물의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 조성물에 관한 발명으로,Achyranthis뿌리 및Atractylodes japonica뿌리의 약제학적 추출 조성물인 본 발명의 조성물은 관절염 치료 효과가 있으며, 특히 이의 발효 등의 산물이 관절염 치료에 더욱 우수한 효과가 있어서, 기존의 화학요법적 치료제에 대체하여 사용할 수 있는 탁월한 효능의 관절염 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

Description

생약 추출물을 포함하는 관절염 치료 및 예방용 조성물의 제조방법 및 그의 조성물{Process for preparing composition comprising medicinal herb extract for preventing and curing arthritis and composition thereof}

본 발명은 관절염 예방 및 치료에 탁월한 효과를 보이는 우슬 및 창출 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법 및 그 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관절염 치료를 위하여 종양괴사인자(Tumor necrosis Factor α, TNF-α), 인터페론-γ 및 인터루킨-12(IL-12)의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 형질전환성장인자(Transforming growth Factor β, TGF-β), 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10)의 생성을 현격하게 촉진시켜 항 염증 및 콜라겐 합성 촉진 등 골아세포, 연골조직의 재생에 뛰어난 효과를 보이는 우슬 추출물, 창출 추출물, 또는 이들의 혼합물을 함유한 조성물 및 발효 등의 제조방법을 통해 얻은 산물을 함유한 관절염 치료용 약제 조성물 과 그의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로, 관절염, 즉 관절의 염증질환은 류마티스 관절염 및 관절 염증 관련 질환과 같은 다양한 형태로 발생한다.

관절염은 특히 관절낭 내층의 활액막에 염증성 변화로 특징지어지는 만성 다 관절염으로써 전신의 관절에서 부종과 통증이 유발되고, 심한 경우에는 신체 장애자가 될 수 있는 만성적으로 진행되는 질환이다. 또한 류마티스 관절염과 같은 관절염 질환은 진행성이고 변형 및 관절 불굴과 같은 관절 장애를 발생시켜, 종종 효과적인 치료의 결핍과 계속된 악화로 인한 심각한 육체적 장애를 일으킨다.

관절염이 유발되는 직접적 원인은 아직까지 명확하지 않고 이에 대해 계속적으로 연구가 진행되고 있으며, 현재까지 류마티스 관절염 등의 관절염에 대한 효과적인 예방방법은 알려진 바가 없고, 일단 발병이 되는 경우에도 그의 치료를 위해 해결해야 할 점들이 많이 남아 있다.

전통적으로 이러한 관절염의 치료에는 코르티손 및 다른 부신피질 호르몬과 같은 스테로이드계, 아스피린, 피록시캄 및 인도메타신과 같은 비스테로이드계 항염증제, 오로타이오능금산과 같은 금작용제, 클로로퀴논제제 및 D-페니실아민과 같은 항류마티스제, 콜치신과 같은 통풍억제제, 및 시클로포스프아미드, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 레바미솔과 같은 면역 억제제를 포함하여 다양한 작용제로 화학요법으로 치료되어 왔다.

위에서 언급한 치료제들은 근원적인 치료법이 아니며, 스테로이드 호르몬제가 관절염 치료제로 알려지면서 많이 사용되기도 했으나, 그의 부작용이 명백해짐에 따라 그 사용은 어렵게 되었다.

또, 관절염, 특히 만성 류마티스 관절염은 환자에게 심한 통증을 유발하므로 반드시 항염증제 등을 복용하여야만 하며, 지금까지 이러한 통증을 완화시키거나 관절의 종창을 제거하는 약제로서 아스피린제 및 브타졸린제 등이 오랫동안 널리 사용되어 왔다. 그러나 아스피린 등은 사람의 위에 치명적인 영향을 주므로 관절염을 치료하는데 필요한 양을 계속적으로 복용하는 것은 어렵다.

기존의 이러한 화학요법적 약제는 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용,항염증 효과의 결핍, 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 가지고 있으며, 현재는 관절염 치료에 진통작용이 우수한 인도메타신 및 푸르페낭산과 비스테로이드성의 각종 소염제 정도가 조제하여 사용되고 있는 실정이다.

따라서, 이러한 문제에 대한 해결책과 급성 염증성 증상과 고통에 대해 증상적인 효과를 보여주는 관절염 치료제의 개발이 요망되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 관절염 치료제는 정도의 차이나 개인적인 차이가 있기는 하지만, 모두 어느 정도의 부작용을 가지고 있고, 특히 류마티스 관절염의 치료를 위해서는 약제를 장기간 복용할 필요가 있기 때문에, 부작용이 적은 약재를 개발하는 것이 매우 중요하다.

또한 상기 약제 중 일부는 정맥주사나 복강 주사로 투여하는 경우가 있는데, 이 경우에는 번거로울 뿐 아니라, 반복된 정맥주사 등은 앨러지, 쇼크 뿐 아니라, 위생상의 문제도 생길 수 있다. 따라서 먹기에 간편하면서, 안전한 치료제가 필요하게 되었다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기한 필요성에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 결핵균 주사 후 시간에 따른 발효한 약제(4B) 처리군과 대조군의 발의 부피변화를 나타낸 그림.

도 2는 결핵균 주사 후 시간에 따른 미발효 약제(1B) 처리군과 대조군의 발의 부피변화를 나타낸 그림.

도 3은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 쥐의 시간에 따른 발효 약제 처리군과 대조군의 Clinical Arthritic Index 평가결과를 나타낸 그림.

도 4는 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 쥐의 시간에 따른 발효 약제 처리군과 대조군의 관절염 Incidence 평가결과를 나타낸 그림.

도 5는 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 쥐의 시간에 따른 발효 약제처리군 및 미발효 약제 처리군 과 대조군의 Clinical Arthritic Index 평가결과를 나타낸 그림.

도 6은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 과 대조군 쥐의 안구에서 체취 한 혈장에서 측정한 면역글로블린 (Immunoglobulin) 농도를 비교한 그림.

도 7은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 과 대조군 쥐의 각 부위 적출 세포 내 TGF-β농도를 ELISA 로 분석 비교한 그림.

도 8은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 과 대조군 쥐의 각 부위 적출 세포 내 IL-10 농도를 ELISA 로 분석 비교한 그림.

도 9는 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 과 대조군 쥐의 Peyer's patches 적출 세포 내 IL-12 농도를 ELISA 로 분석 비교한 그림.

도 10은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군 및 대조군 쥐의 각 부위 적출 세포 내 INF-γ 농도를 ELISA 로 분석 비교한 그림.

도 11은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군과 대조군 쥐의 각 부위 조직에서 체취 한 세포의 RT-PCR 후 TGF-β의 전기영동 그림.

도 12는 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군과 대조군 쥐의 각 부위 조직에서 체취 한 세포의 RT-PCR 후 IL-4 의 전기영동 그림.

도 13은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 발효 약제 처리군과 대조군 쥐의 각 부위 조직에서 체취한 세포의 RT-PCR 후 TNF-α의 전기영동 그림.

도 14는 LPS 자극을 받은 mouse의 macrophage에 실시예 22에서 제조한 각각의 약재를 처리하여 대조군과 하이드로 코티존 비교 약물군과의 TNF-α농도를 비교한 그림.

도 15는 실시예 22에서 제조한 각각의 약재의 Collagenase Type IV 활성 저해 효과를 비교한 그림.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 우슬 및 창출을 추출하는 단계 및 상기 추출물을 발효하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 발효단계 후 농축하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하고, 본 발명의 추출에 사용하는 용매는 정제수, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올 및 이들의 혼합용매인 것이 바람직하며, 정제수, 에탄올 또는 메탄올이 더욱 바람직하다.

또, 본 발명의 우슬과 창출은 건조 또는 생약제인 것이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 우슬과 창출의 비율은 0:5∼5:0이 바람직하며, 1:10∼10:1인 것이 더욱 바람직하고, 특히 1:2인 것이 가장 바람직하다. 이때, 건조하지 않은 생우슬을 사용할 경우 포함된 수분 함량을 고려하여 환산한 중량 비율로 한다.

본 발명의 조성물 중 우슬, 창출추출물 모두 관절염 치료에 중요한 약재로 작용하나, 특히 우슬의 포함 여부 및 이의 발효산물이 TNF-α생성억제 및 Collagenase 활성저해 등 파골세포 활성억제와 골아세포 생성촉진으로 보다 관절염 치료에 중요한 역할을 담당한다.

또, 본 발명에 있어서 우슬 및 창출의 미발효 추출조성물에 대해 이의 발효산물이 보다 강한 TGF-β 생성 촉진 및 항 염증성 cytokine으로서 대식세포와 림프구에 강력한 억제효과를 보이는 IL-12의 농도를 현격하게 생성 촉진하여 항염증 치료 효과 및 골세포 증식에 기여하였고, mouse를 대상으로 한 체내 Immunoglobulin 적정에서도 inflamation에 관여하는 IgG2의 농도가 10배이상 적은 농도를 유지함으로써 총 면역단백의 량을 크게 감소시켜 관절염 치료에 보다 탁월한 효능을 가지고 있음을 확인하였다.

본 발명의 발효조건은 20℃ 이하와 50℃ 이상에서는 발효 효율이 적어지므로, 20∼50℃에서 4∼36시간인 것이 바람직하나, 공정 시간 단축을 위해 당화과정 중 30∼75℃까지 서서히 승온시키며 52℃ 단백질 휴지기 및 65℃ 당화 휴지기를 각각 30분간 둔 침출법(Infusion method)을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법에 의해서 제조된 관절염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 우슬추출물, 창출추출물 및 그의 혼합물을 포함하고, 각각을 따로따로 추출할 수도 있으며, 함께 추출하여 상기의 제조방법에 의해서 제조한 발효산물을 함유한 약제조성물이다.

본 발명의 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 의해 정제, 캡슐제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구투여용 제제와 같은 단위투여용 또는 수회 투여용 약제학적 제제로 제형화 될 수 있다. 본 발명의 실시예 에서는 젤 또는 연조 엑기스 형태로 제형화 하였다.

본 발명의 조성물의 특정환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명에서 관절염이란 모든 종류의 관절염을 의미하고, 그 중 특히 타박성관절염, 류마토이드 관절염, 퇴행성 관절염, 통풍성 관절염, 세균에 의해서 고름이 드는 화농성 관절염과 결핵성 관절염을 의미한다.

기타 본 발명의 조성물은 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)와 아밀로이드증(amyloidosis) 등의 자가면역질환에도 효과가 있다.

이하, 본 발명을 설명한다.

쇠무릎(Achyranthes fauriei LEVEILLE et VANIOT 또는 Achyranthes bidentata Blume)은 비름과(Amaranthaceae) 식물로 높이 약 90cm의 여러해살이 풀이다. 뿌리(우슬,Achyranthis Bidentatae Radix)에는 물분해 하면 올레아놀산(Oleanolic acid)과 글루쿠론산으로 갈라지는 사포닌이 있고, 물에 풀리는 알카로이드인 아키란틴(C₆H₁₁O₂N·H₂O)와 기타 알카로이드, 많은량의 점액이 있다. 물 추출액의 회분은 약 8% 이고 그 가운데서 칼륨염은 24.5%이다. 이밖에 시토스테롤, 스티그마스테롤, 아스파라긴산을 비롯한 아미노산과 호박산 등을 비롯한 다가 염기산이 있다. 약리작용으로는 진통효과, 진경효과(antispasmodic effect), 이뇨효과, 항알레르기 효과 등이 있다.(육창수 등, 현대 생약학, 서울, 학창사, 24-128, 1993)

쇠무릎뿌리(우슬)달임약은 동의치료에서 쟁혈약, 오줌내기약, 통경약 등으로 사용해왔으며, 신농본초경에 상품으로 수재되어 있고 동양의학에서 조혈약으로 구분하여 사용된다.

본 발명에 사용한 우슬은 국내의 자연산(Achyranthes japonica(MIQ.)NAKAI) 및 중국산 회우슬(Achyranthes bidentata Blume)을 구입 사용하였고, 그 뿌리는 문헌자료에 의하면 산후자궁무력증, 여러가지 원인의 자궁출혈, 월경과다 등 각종의 부인병 치료에 사용되어 왔다.

창출(Atractylodis Rhizoma)은 높이 80cm에 이르는 여러해살이 풀인 삽주(Atractylodes japonica KOIDZ.)의 뿌리줄기로써 봄 또는 가을에 캐서 물에 씻어 잔뿌리를 다듬고 햇볕에 말린 것으로, 국화과(Compositae)에 속한 삽주속의 다년생 초본으로 각지의 산에 자란다.

삽주의 뿌리(창출)에는 약 1.5%의 정유와 카로틴, 이눌린, 고무질, 알카로이드 반응이 있고, 또한 전초는 사포닌, 쿠마린 반응이 있다. 정유의 주성분은 Sesquiterpene인 아트락틸론(C₁₅H₂₀O, 녹는점 38℃, 약 20%)이며 이밖에 푸르푸랄, β-오이데스몰(β-Eudesmol), 히네솔이 있다. 다른 자료에 보면 아트락틸롤, 이소발레리안산에스테르, 아트락틸라트칼륨 등이 있다고 한다. 또한 조선삽주(Atractylodes Koreana Kitam)의 뿌리(창출) 정유 주성분은 아트락틸로딘이고 아세틸아트락틸로디놀, 아트락틸로디놀, 엘레몰이 소량 들어 있다. 삽주 정유 주성분인 아트락틸론은 매우 적거나 없다.

옛 동의문헌의 서술자료와 그림을 보면 조선 삽주의 뿌리가 창출에 보다 해당된다 할 수 있으며, 창출은 달고 맵고 따뜻하여 진정작용, 조혈작용, 오줌내기작용이 있으며, 동의치료에서는 실증에 의한 콩팥기능장애로 오줌이 적을 때, 위장염, 붓기, 어지러움증과 온몸이 아플 때 오줌내기, 땀내기약 등으로 동의처방에 배합하는 매우 중요한 동약이다. 민간에서는 설사와 토하는 것을 멈추게 하는 데와 소화불량증, 당뇨병, 기침 및 통풍치료에 종종 사용하여 오래 먹으면 장수한다는 말이 전해져오고 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 약효를 갖는 우슬과 창출 혼합물의 추출물이 독과 부작용이 없고 관절염에 우수한 치료효과를 가지는 한방 조성물임을 확인하였으며, 또한 이렇게 제조한 조성물의 발효 산물이 더욱 약효의 현저한 증가를 보임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 우슬과 창출을 각각 혹은 함께 물 또는 알코올로써 추출하고, 이를 발효 등의 제조공정을 통해 얻은 산물은 관절염의 예방 및 치료에 부작용이 없고 효능이 탁월한 생약성분의 약제학적 조성물 치료제를 제공하며 기존 화학요법적 치료제를 대체하여 유용하게 이용될 것이다.

본 발명자들은 관절염 치료에 현재 사용되고 있는 대부분의 관절염 치료제가 화학요법제로써 정도의 차이나 개인적인 차이가 있기는 하지만, 모두 어느 정도의 부작용을 가지고 있으므로 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용, 항염증 효과의 결핍, 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 극복하고자 상대적으로 부작용의 발현이 적다고 생각되는 천연물 유래 생약성분의 관절염 치료용 한방 조성물을 오랫동안 연구하여 왔다. 그 결과Achyranthis Radix로서 우슬과Atractylodes japonica의 뿌리로서 창출의 약제학적 한방조성물의 추출물이 동물실험 등의 결과 관절염 치료에 효과를 보임을 확인하였으며, 또한 그 추출 조성물의 발효산물이 보다 우수한 약효를 보임을 증명하였다. 이때 건조 우슬 혹은 자연상태의 생우슬을 사용하여 창출과 배합조건 및 추출 조건과 발효공정을 확립하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 우슬과 창출의 약제학적 한방조성물 추출물 및 그의 발효 산물, 또한 그 제조방법에 관한 것으로 바람직하게는 발효공정에 쌀밥, 전분 등을 사용할 수 있으며 맥아, 누룩 등으로써 발효하여 용매를 증발 농축시킨 농축 엑기스 또는 환제, 산제, 캅셀제 등의 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 우슬 및 창출을 탄소수 1∼4의 저급 알코올로 추출하여 잔류용매를 제거한 농축 추출물을 포함하며, 역시 이렇게 제조한 추출물에 발효공정을 적용할 수 있다.

본 발명은 우슬과 창출의 약제학적 한방 조성 추출물 및 이의 발효산물의 관절염 예방 및 치료효과를 랫트에 투여하여 조사한다. 또한 약제 투여군 및 대조군 쥐의 조직 세포를 체취 하여 임상평가와 함께 관절염 및 Inflammation 관련 싸이토카인 들의 농도를 분석하며, LPS로 자극한 마우스 마크로파지(macrophage) 에서 각 약재의 in-vitro 실험을 시행하였다.

본 발명에 따르면 쇠무릎(Achyranthis)의 뿌리로서 우슬은 중국산Achyranthis bidentata BL. 의 건조 우슬 또는 자연상태의Achyranthis japonica (MIQ.) NAKAI의 국산 미건조 생우슬을 사용하고, 삽주(Atractylodes japonica)의 뿌리로서 창출을 합하여 약제학적 한방조성물을 만든 뒤 이를 용매로 추출하고, 다시 여기에 맥아 또는 누룩 등을 넣어 발효한 산물이 관절염 예방 및 치료에 탁월한효능을 가지는 동물실험 결과 및 세포 조직학적 분석 결과를 얻었다.

본 발명의 우슬 및 창출 추출물은 다음과 같은 생약추출 방법에 따라 추출될 수 있다.

우슬과 창출을 추출용매에 넣고 50∼120℃에서 5∼24시간 동안 가온한다. 이 추출액을 40∼60℃로 냉각시키고 여과하여 상등액을 취하거나, 여과과정 없이 본 발명에서 사용하는 발효공정을 적용할 수 있다. 이와 같은 추출 및 여과조작을 1회 이상 반복하여 상등액을 합하고 용매를 증발시켜 농축한다. 우슬과 창출을 각기 추출하여 합하여 사용할 수도 있지만 함께 추출하는 것이 공정이 간단하며, 가온을 할 때 120℃ Oil-bath에서 온탕 하거나 Steam Distilation 방법을 이용하기도 하지만 바람직하게는 수욕조에서 80∼100℃로 온탕하는 방법을 이용한다. 또한 용매로써 정제수를 사용하는 경우 건창출 사용량의 6∼16배 조건에서 실험결과, 12배에서 추출량이 최적이었다.

또는 우슬 및 창출을 추출용매에 넣고 상온 또는 4℃에서 5∼7일간 냉침하고 여과하여 상등액을 취한다. 이와 같은 추출 및 여과조작을 1회이상 반복하여 상등액을 합하고 용매를 증발시켜 농축한다.

위와 같은 두 가지 추출방법에서 바람직하게는 우슬과 창출을 작은크기로 분쇄하여 사용할 수 있으며 추출 용매의 바람직한 예로써 순수한 물 또는 20∼50% 에탄올, 50∼100% 메탄올 등 알코올 수용액을 사용할 수 있으나 본 발명의 발효공정 적용을 위해 유기용매는 완전히 제거한다.

본 발명에서 사용하는 발효공정은 다음과 같은 생약 발효 방법에 따라 시행할 수 있다.

생약추출물에 20∼60℃에서 맥아, 누룩 등을 넣고 동일 온도범위에서 4∼36시간 동안 발효한다. 이때 생약추출물은 상기에서 기재한 추출법에 의해 얻어진 것을 사용하며 여과한 상등액을 사용하거나 또는 여과과정 없이 제조한 추출물을 발효 후에 여과할 수 있으며, 생약 추출액을 여과과정 없이 발효하여 여과한 경우 추출액을 여과한 상등액을 발효하여 여과한 때보다 발효산물이 약 5% 더 얻어졌다.

또는 생약추출물을 30℃에서 서서히 승온시키며 52℃에서 단백질 휴지기 및 65℃에서 당화 휴지기를 각각 30분간 둔 침출법에 의한 빠른 발효방법을 사용할 수도 있다. 이 경우 발효 최종온도인 75℃까지 2시간45분의 시간이 걸렸으며 고온 여과에 의해 여과시간을 상당히 단축할 수 있었다.

본 발명은 자연발효나 맥아, 누룩, 포도 및 포도주 발효효소원 또는 효모와 같은 발효미생물을 처리하여 발효를 진행할 수 있다. 특히 본 발명의 조성물을 발효시키면 약효 및 맛, 최종 제형의 형태유지(젤 상태)에 긍정적 효과를 가져와 약 효능 및 보관상의 이점을 갖는다. 또한 쌀밥을 맥아 또는 누룩 등에 의해 발효한 후 여과하여 상등액을 취한 뒤 상기의 생약추출물에 넣어 발효할 수도 있다.

맥아를 사용할 경우 맥아 효소에 의해 이미 포함되어 있는 다량의 전분은 당화(saccharification)시켜서 발효에 적합한 추출물을 얻을 수 있으며, 맥아전분을 보충해 주는 부원료는 많게는 맥아의 50%까지 사용한다. 이때 값싼 부원료를 사용함으로써 발효시간 단축 및 발효 추출량 증가 등의 경제적인 발효효율 증진과 함께 향미 증진, 혼탁도 감소 등의 부수적인 효과도 기대할 수 있다. 많이 사용되는 부원료로는 옥수수, 쌀, 밀, 파파인(Carica papaya의 유액으로부터 얻음), 키위 또는 배 등의 전분을 정제한 것(refined starch)이 있으며, 또한 이들 전분을 산이나 효소로 당화시킨 콘 시럽(corn syrup)과 같은 포도당 시럽(glucose syrup)도 있다.

누룩(곡자, koji)원료의 종류는 밀, 쌀에 밀가루를 입힌 것을 보통원료로 하는데 녹두, 찹쌀, 보리 등이 쓰이기도 한다. 효모원은 공기, 도꼬마리, 보릿짚, 벗짚, 뽕나무, 쑥, 상주, 연꽃, 솔대의 잎 여뀌의 어린잎, 솔잎 등이 있다. 원료 외 증자여부는 볶은 것, 낀 것, 살짝찐 것, 날밀이 있으며 원료의 입도는 12할부터 미분까지 한다. 부원료의 종류에는 뽕나무잎, 쑥, 수유를 달인즙, 복숭아씨 분말, 살구씨 분말, 참외분말 등이 있고, 여기에 조효소제를 처리하여 제조한다. 조효소제는 재래 누룩의 주균인 Rhyzopus와 Usami 및 0ryzae 등의 균을 배양하여 당화력을 높인 것으로 자연누룩의 복잡한 맛과 당화력을 동시에 추구한 것이다.

다음의 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 설명하나 이들 실시예 에만 한정하는 것은 아니다. 본 명세서 및 실시예에 기재된 %는 용량%를 의미한다.

실시예 1

생우슬(수분함량 50%) 85g을 잘 씻어 음건(陰乾)한 것과 건창출 85g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 500mL를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃에서 10시간 동안 Steam Extraction 하였다. 이 추출액을 약 75℃정도로 냉각하여 고온 여과하고 그 상등액을 취해 용매를 증발 농축하고 동결건조하여 55g의 환제를 얻었다(1B 샘플의 제조).

실시예 2

생우슬(수분함량 50%) 85g을 잘 씻어 음건한 것과 건창출 85g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 500mL를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃에서 10시간 동안 스팀 추출하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각한 뒤 맥아 60g 및 쌀밥 85g을 넣고 45℃에서 12시간 발효하였다. 이 추출액을 여과하고 용매를 증발 농축하여 유동성 엑기스를 얻었다.

동결건조 하여 64g의 환제를 얻었다(4B 샘플의 제조).

실시예 3

생우슬(수분함량 50%) 40g을 잘 씻어 음건한 것과 건창출 40g을 세절하여 5L 둥근 플라스크에 넣고 정제수 1280ml 를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 80∼100℃ 수욕조에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각한 뒤 맥아 12g 및 쌀밥 32g을 넣고 상온(약 30℃정도의 따뜻한 곳)에서 36시간 발효하였다. 이때 쌀밥이 액상에 동동 떠오를 때를 발효과정의 종결점으로 하고 이 추출액을 75℃ 까지 승온하여 고온여과하고 용매를 증발 농축하여 85ml의 유동성 엑기스를 얻었다(실험예 2의 발효약제 샘플).

실시예 4

건조우슬(수분함량 1%) 12g 과 건창출 24g을 세절하여 1L 둥근 플라스크에 넣고 정제수 288ml 를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 80∼100℃ 수욕조에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 75℃ 고온여과하고 용매를 증발 농축하여 70ml의 유동성 엑기스를 얻었다(실험예 3의 미발효약제 샘플).

실시예 5

건조우슬(수분함량 1%) 12g 과 건창출 24g을 세절하여 1L 둥근 플라스크에 넣고 정제수 288ml 를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 80∼100℃ 수욕조에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각한 뒤 맥아 7g을 넣고 40℃정도의 따뜻한 곳에서 18시간 발효하였다. 이 추출액을 75℃ 까지 승온하여 고온여과하고 용매를 증발 농축하여 70ml의 유동성 엑기스를 얻었다(실험예 3의 발효약제 샘플).

실시예 6

건조우슬(수분함량 0.7%) 20g과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 480mL를 넣어 환류냉각기를 장치한뒤 120℃ Oil-bath 에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 75℃정도로 냉각하여 고온 여과하고 그 상등액을 취해 용매를 증발 농축하여 31.5g의 고형분을 얻었다. 실시예 1의 결과와 비교하여 약 20%정도의 조 추출물을 더 얻을 수 있었다.

실시예 7∼실시예 9

생우슬(수분함량 50%) 40g을 잘 씻어 음건한 것과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 정제수를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃ Oil-bath 에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각한 뒤 맥아 7g 을 넣고 45℃에서 12시간 발효하였다. 이 추출액을 여과하고 용매를 증발 농축하여 고형분을 얻었다.

	실시예 7	실시예 8	실시예 9
정제수 사용량	240ml	320ml	640ml
발효추출량	27g	32.9g	34.9g

실시예 10

건조우슬(수분함량 0.7%) 20g과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 480mL를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃ Oil-bath 에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 50℃정도로 냉각한 뒤 맥아 7g, starch 3g 을 넣고 45℃에서 6시간 발효하였다. 이 추출액을 여과하고 용매를 증발 농축하여 36.8g의 고형분을 얻었다.

실시예 11

건조우슬(수분함량 0.7%) 20g과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 480mL를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃ Oil-bath 에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 75℃정도로 냉각한 뒤 여과하여 상등액을 모으고 맥아 7g, starch 3g 을 넣어 45℃에서 6시간 발효하였다. 이 추출액을 여과하고 용매를 증발 농축하여 34.6g의 고형분을 얻었다.

실시예 12

건조우슬(수분함량 0.7%) 20g과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 물 480mL를 넣어 환류냉각기를 장치한 뒤 120℃ Oil-bath 에서 10시간 동안 추출하였다. 이 추출액을 약 75℃정도로 냉각한 뒤 여과하여 상등액을 모았다. 맥아 7g, starch 3g 을 넣어 30∼75℃ 까지 온도를 서서히 올리면서 52℃ 에서 30분간, 65℃ 에서 30분간 휴지기를 주었다. 2시간 30분 뒤 용액의 온도가 75℃에 이르러 15분간 방치한 뒤 6시간 여과하고 위에서 모은 생약추출물과 합하여 6시간 발효하였다. 용매를 증발 농축하여 34.1g 의 고형분을 얻었다.

실시예 13∼실시예 16

건조우슬 20g 과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 100% 메탄올 용매를 480ml 넣어 80℃ 수욕조에서 10시간 추출하였다. 이 추출액을 여과하여 그 상등액을 취하고 용매를 증발 농축 제거하여 고형분을 얻었다.

정제수 80ml를 넣고 발효액을 넣어 6시간 발효하였다.

	추출용매	추출량	발효추출량	차이
실시예 13	Methanol 480ml	11.63g		3.1g
실시예 14	˝		14.7g
실시예 15	30% Ethanol 480ml(Ethanol:물=3:7 v/v)	28.21g		3.1g
실시예 16	˝		31.33g

실시예 17

건조우슬 20g 과 건창출 40g을 세절하여 2L 둥근 플라스크에 넣고 80% 메탄올(메탄올:물=4:1 v/v)용매를 480ml 넣어 4℃에서 7일간 냉침 하였다. 이 추출액을 여과하여 그 상등액을 취하고 용매를 증발 농축하여 잔류 메탄올을 완전 제거한 뒤 고형분 15.5g을 얻었다.

실시예 18

실시예 10에서 같은 방법으로 제조하여 부형제를 첨가하고 과립제, 산제를 얻고 이를 하드캅셀(Hard capsule)로 제조하였다.

실시예 19

실시예 10에서 같은 방법으로 제조하여 소량의 주정용 에탄올 및 정제수를 섞고 연질 캅셀을 제조하였다.

실시예 20

정제수 400mL 에 맥아(엿기름) 100g과 쌀밥 혹은 밀, 옥수수, 파파인 등의 발효 부원료 전분(starch) 100g을 넣어 30∼75℃까지 승온 침출법에 의해 발효액을 제조하였다. 용액을 75℃ 고온 여과하여 맑은 상등액을 사용한다.

실시예 21

원료 밀을 선별하여 세척하고 충분히 건조시킨 뒤 분쇄하여 20∼25% 정도로 살수하면서 혼합 반죽하였다. 일정량을 누룩틀에 넣고 압착하여 성형하고 종국[녹색이 더 짙은 장모성의 황국균(Aspergillus oryzae)을 쓰며 백국균(Asp. nigar mut.Kawachii) 등을 쓰기도 한다.]을 섞은 밀가루를 발라서 표면접종을 하였다. 이것을 곡자실의 살균한 짚방석을 깐 시렁에 얹고 또 살균한 짚방석으로 덮어 입곡 한다. 이후 통풍을 하면서 품온을 35℃ 이하로 조절하면서 매일 또는 격일로 뒤집기를 하면 입곡 4∼5일 후 황녹색 포자가 보이며 품온이 40℃ 이상으로 상승하여 곡자의 표면이 건조하기 시작하였다. 이후 품온이 점차 내려가며 방치하였다가 입곡 후 8∼10일 에 출곡하여 7일내외 숙성시키고 건조한 저장실에서 보관 사용하였다.

실시예 22

건조우슬과 창출을 정확하게 칭량하여 창출사용량의 8배수(v/wt) 메탄올로 12시간 환류 추출하고, 이 추출물을 여과하여 용매를 감압 농축 제거한다. 발효과정은 각 추출액에 실시예 20과 실시예 21에서 제조한 발효액을 함께 섞고 45℃에서 12시간 발효하였다.

샘플 코드	샘플 내용	약재 사용량	동결건조량
			추출물	발효추출물
an/h	생우슬(수분함량 55%)	220g	9.2g
ap/m	건조우슬(수분함량 1%)	100g	8.9g
b/m	건조창출	100g	12.2g
an b/m	생우슬/창출	(220g/100g)	20.6
ap b/m	건조우슬/창출	(100g/100g)	21.8
an pro	생우슬 발효	220g		23.1
ap pro	건조우슬 발효	100g		18.1
b pro	창출 발효	100g		22.9
an b pro	(생우슬/창출) 발효	(220g/100g)		37
ap b pro	(건조우슬/창출) 발효	(100g/100g)		31.8
pro	발효액	200g		19.7
hydrocortison	대조약	-	25mg/60Kg 용법

실험예 1 ; Paw Volumn Change 평가

옆처리된Mycobacterium Butyricum은 Difco, Detroit, MI에서 구입하였으며, 웅성 위스타 루이스 쥐(Wistar Lewis Rat)는 Charles River Japan Inc.사에서 구입하였고, 쥐는 구입 후(약 180g) 약 250g으로 체중을 맞추었다. 인컴플리트 프론드 애저번트(Freund adjuvant)등 다른 시약들은 Sigma에서 구입하였다.

AA(acute arthritis)는 Mycobacterium Butyricum(MB)을 프론드 에저번트에 현탁액을 만들어(5mg/ml) Wistar Lewis Rat 1마리당 100㎕씩 오른쪽 발바닥의 피하층에 1회 주입하여 대조군으로 하였고 기준군은 MB가 없이 프론드 에저번트만 동량 피하로 투입하였다. 양쪽 발의 부피는 water displacement 방법에 의해 매 3내지 4일에 측정되었으며 약 28일 동안 측정되었다. 약은 고형량을 기준으로 2g/kg의 용량으로 투여하였으며 약 6-7씩 각 군을 형성하였다(Turull and Queralt, 2000; Immuno. Pharmacol. 46 (2000) 71-77.).

그림에서의 각군의 명칭과 사용된 동물의 수는 다음과 같다.

Control Group : 대조군 (6마리)

1B Group ; 미발효 약제 사용 실험군 (7마리)

4B Group ; 발효 약제 사용 실험군 (7마리)

기준군(6마리)

발의 부피 변화(Paw Volume Change)는 대조군과 실험군에서 각각 기준군의 부피를 삭감하는 값으로 정의하였으며 실험군의 투여약의 AA 저해효과는 다음의 식으로 정의하였다(Badger et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 291(1999) 1380-1386).

본 실험에서 1B는 발효 안한 약재 추출물(실시예 1)을 나타내고, 4B는 약재추출물을 발효한 것(실시예 2)을 의미한다.

저해효과(%) = {1 - [실험군-기준군]/[대조군-기준군]} × 100

통계분석은 실험군의 발의 부피값을 대조군의 발의 부피값에 대하여 Student's t test를 통해 p 값을 구하여 비교하였으며, 0.05 이하인 경우 유의한 것으로 하였다.

그 결과는 다음과 같다.

도 1은 MB주사 후 시간에 따른 발의 부피변화를 요약한 것이다. 그림에서 보이는 바와 같이 대조군에 있어서 3일째 최초의 변화가 나타나며 기준일보다 2.6배 증가되었다. 16일째까지 증가된 현상을 유지하다가 20일째에 1회 추가증가가 관측되며 초기부피의 3.7배로 증가하였다. 이 후 감소추세로 변화하여 31일째 경, 초기의 2.9배 정도로 되었다. 4B의 투여시 대체적인 경향은 대조군과 유사하였으나, 4B군이 3일째의 부피를 이후 실험종결시까지 유지 내지 감소추세를 나타낸다는 점에서 대조군과 다른 양상을 보였다. 부피에 있어서도 4B의 경우 20일째 대조군의 55%로 감소되어(p〈 0.001) 모든 시간대에서 대조군보다 감소된 경향을 보였다. 반면 기준군의 경우, 초기 3일에 발의 부피는 최대였으며(최초일보다 1,8배 증가) 이후 점차적으로 감소되어 초기 값보다 약간 증가된 수준으로 회복되었다.

실험군과 대조군 그리고 기준군의 평균체중은 270g 정도로 거의 일치된 값이었으나 AA 유발 후 약 20일째의 체중은 4B, 1B군과 대조군은 약 25g 가량씩 감소된 값을 보여주었다. 반면, 기준군은 약 60g 가량 증가된 값을 보여주었다. 왼쪽발의 부피는 2군 모두 초기값과 차이를 보여주지 않았다.

도 2에서 보이는 바와 같이 1B의 투여 시, 대조군의 경우 유사하게 초기에 부피가 증가하였다가 일정시간이(이 경우 2주 후) 경과된 후 다시 증가하는 경향을 뚜렷이 보여주었다. 이러한 경향은 도1의 4B 투여 시에 보인 경향성과 뚜렷한 차이를 보이고 있다. 또한 1B는 대조군과 비교하여 볼 때 부종을 감소시키는데 효과를 가지고 있는 것으로 판명되었다. 한편 4B는 대조군과 비교하여 볼 때 부종을 감소시키는데 1B에 비해 우월한 효과를 가지고 있는 것으로 판명되었다.

[표 1] 4B와 1B의 대조군에 비교하여 감소된 오른발의 부피와 유의성(p)

날짜(4B)	0	3	6	9	13	16	20	23	25	28	31
차이(ml)p value	0.08(0.36)	0.20(0.063)	0.65 (0.025)	0.46(0.097)	0.68 (0.010)	0.69(0.149)	1.31 (0.001)	1.14 (0.004)	0.71 (0.027)	0.51(0.129)	0.62(0.059)
날짜(1B)	0	3	5	8	14	17	19	23	25	28
차이(ml)p value	0.01(0.82)	0.38 (0.03)	0.6(0.03)	0.6(0.07)	0.55(0.28)	0.55(0.2)	0.73 (0.05)	0.89 (0.02)	0.77(0.06)	0.72(0.09)

(굵은 글자는 p value 0.05 이하의 통계적인 유의성을 가지는 수치임을 표시)

표 1은 4B, 1B의 투여시 오른쪽 발의 부종을 측정하여 기준군 값과의 차를 정리한 것이다. 도 1에서 보인 바와 같이 4B는 대조군에 비하여 2주에서 4주 사이에 뚜렷한 부종호전효과를 보이고 있으나 1B 투여결과는 여전히 평균적으로 효과가 있음에도 불구하고 유효성이 약한 결과를 보이고 있다.

[표 2] 4B, 1B의 부종저해효과

날짜(4B)	0	3	6	9	13	16	20	23	25	28	31
저해효과(%)		20.4	30.1	22.9	26.6	28.2	44.1	40.6	28.4	23.8	29.0
날짜(1B)	0	3	5	8	14	17	19	23	25	28
저해효과(%)		58.5	34.1	24.5	18.2	5.75	22.0	27.7	28.0	29.0

(굵은 글자는 p value 0.05 이하의 통계적인 유의성을 가지는 수치임을 표시)

표 2는 상기의 결과를 저해효과로 환산한 결과이며, 다시 4B 약제투여가 가장 우수한 것임을 보여주고 있다. 4B투여는 3주째에 MB에 의한 부종을 약 40내지 45%의 감소를 유발시켰으며 1B약제는 이러한 효과가 25%의 결과를 보여주어 우슬, 창출의 추출 발효산물(4B)이 발효하지 않은 약재추출물(1B)보다 높은 치료효과를 보였다.

실험예 2 ; Clinical Arthritic Index 평가

미국의 Jackson Lab. 기원의, 1988년 한국과학기술원(KIST)에서 분양 받은 DBA/1 실험용 마우스 48마리를 평균체중 21.5g 으로 맞추어 2주간 안정화하고 기준군 및 실험군과 비교군으로 나눈 후 타입 2 콜라젠(Type II Collagen)으로 관절염을 유발시키기 위하여(Type II Collagen-induced mouse arthritis test) 꼬리에 1차 면역화(Immunization)시켰다. 다시 2주 후 왼쪽 뒷발바닥에 동일한 방법으로 부스트시키고, 실험군 20마리는 이후 2주간 7번에 걸쳐 1회/2일 간격으로 실시예 3의 약재 추출물을 발효한 약물을 고형분 기준 0.6g/kg 용량(122.5㎕/1마리)으로 경구 투여하였다. 비교군(CIA 군)에 대하여 실험군(약제 처리군, Tolerance 군)의 시간 경과에 따른 관절염 인시던스(Incidence)와 관절염 유발 정도를 임상 관절염 지수(Clinical Arthritic Index, 이하, "AI"라 함)로서 관찰하였으며, 실험예 4에서는 부스터 후 2일 뒤 기준군 쥐 4마리를 희생하여, 약제의 관절염 치료효과를 세포 조직학적 분석을 통해 평가하고자, 표준 검량선을 확보하고, 다시 실험 시작 5주차 약제처리가 완료된 시점에서 실험군 및 비교군의 쥐 각각 4마리를 2차 희생하여 적출한 세포조직의 세포 배양을 통해 ELISA 및 RT-PCR 방법 등으로 본 약제의 항 염증 및 관절염 치료 효과를 분석하였다.

면역화시에 사용한 CFA(Complete Freund's adjuvant)시약은 Chondrex 사의 Arthrogon-CIA (5ml/vial Lot.112700)을 사용하였으며, Collagen Type II 는 Sigma 사의 Bovine native C II를 사용하여 CFA와 1:1로 혼합하고 1마리당 100㎕를 쥐의 꼬리에 주입하였다. 부스터시에는 Difco 사에서 구입한 IFA(Incomplete Freund's adjuvant)를 Bovine native C II와 1:1로 혼합하여, 역시 1마리당 100㎕를 쥐의 왼쪽 뒷발 Foot fad에 주입하였다. 실험에서 관절염 유발의 정도는 임상 관절염 지수로서 왼쪽 뒷발을 제외한 나머지 세 발에서의 관절염 유발 정도를 관찰하여 정도에 따라 0∼4점을 부여함으로써(0점:이상 상황 미발견, 1점:발적(빨갖게 부어오름), 2점:발적 및 부종발현, 3점:관절염 발생으로 봄, 왼쪽 뒷발만큼 부종에 의해 부어오름, 4점:극심한 염증, 갈라짐, 발을 딛고있기 어려움) 합산 측정하였고, 인시던스는 세 발 중 하나라도 확연한 부종발현(AI 평가 3점이상)을 관찰할 수 있는 마우스의 수를 %로 나타내었다.

표 3과 표 4는 실험군에 약제를 먹이기 시작한 3주차부터 임상 평가를 시행하여 AI 및 인시던스를 평가 정리한 것이며, 이를 도 3과 도 4에 그림으로 나타내었다. 이후 4주차까지 약제를 처리한 뒤 8주차에서 대조군(CIA 군)의 관절염 유도정도가 57.1%로 최고점을 보이며 AI 평가 역시 평균 3점 이상의 확실한 관절염 유도가 이루어 진 뒤 이후 감소 추세를 보였다. 약제 처리군 에서도 약물투여가 끝난 6주차 이후 인시던스가 증가하는 경향을 보여주나, 약물 처리기간 내에서는 관절염 유발 및 정도가 거의 보이지 않아, 본 약제의 관절염 치료 및 예방 효과를 분명히 하였다. 또한 AI 평가분석에 있어서도 5주차에서 AI 평가치가 1차 증가한 뒤 7주차에서 2차 증가하는, 실험예 1의 결과와 동일한 경향을 뚜렷이 보여주고 있다. 이후 경과에서도 AI 평가의 최고점에서 약제 처리군이 평균 1점대를 넘지않는, CIA 군에 대해 66.4%의 현격한 관절염 치료 효과를 기록하였다.

[표 3] Clinical Evaluation Chart CIA유도군

날짜	관절염 지수(Arthritic index)	평균
	Ⅰ군		Ⅱ군	Ⅲ군	Ⅳ군
	1		2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
3주차	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
4-1	0	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	1	1	2	0.43
4-2	0	2	1	3	1	2	1	0	0	2	0	2	4	2	1.43
5	0	2	1	3	1	1	1	2	3	3	0	6	5	2	2.14
6	0	2	0	2	0	1	1	6	3	2	1	4	5	3	2.14
7	3	2	1	1	3	3	5	7	1	4	3	4	5	3	3.21
8	3	1	2	1	3	2	5	6	1	4	2	3	5	3	2.93
9	2	1	1	2	2	2	4	5	1	3	2	2	4	3	2.43

날짜	인시던스	평균
	Ⅰ군		Ⅱ군	Ⅲ군	Ⅳ군
	1		2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
3주차	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0
4-1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0
4-2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	-	14.3
5	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	+	+	-	21.4
6	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+	+	+	+	-	35.7
7	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	+	+	+	-	42.9
8	-	-	+	-	-	-	+	+	-	+	+	+	+	+	57.1
9	-	-	-	-	-	-	+	+	-	+	+	+	+	+	50

[표 4] Clinical Evaluation Chart 약제처리군

날짜	관절염 지수	평균
	Ⅰ군		Ⅱ군	Ⅲ군	Ⅳ군
	1		2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
3주차	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/16 = 0
4-1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	(2)	0/15 = 0
4-2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/16 = 0
5	0	0	1	0	0	0	1	1	0	0	1	1	1	(1)	0	1	7/15 = 0.47
6	1	0		1	0	0	0	0	0		0	4	0	0	0	2	8/14 = 0.57
7	0	0			0		1	1	2		4	0	2	0	1	2	13/12 = 1.08
8	0	0			0		1	1	2		3	0	2	0	0	2	11/12 = 0.92
9	0	2			0		1	0	2		3	0	2	0	0	0	10/12 = 0.83

날짜	인시던스	평균
	Ⅰ군		Ⅱ군	Ⅲ군	Ⅳ군
	1		2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
3주차	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0/16 = 0
4-1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	(-)	0/15 = 0
4-2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0/16 = 0
5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	(-)	-	-	0/15 = 0
6	-	-	-	-	-	-	-	-	-		-	+	-	-	-	+	2/15 = 13.3
7	-	-		-	-	-	-	-	+		+	-	-	-	-	+	3/14 = 21.4
8	-	-			-		-	-	+		+	-	-	-	-	+	3/12 = 25.0
9	-	+			-		-	-	+		+	-	-	-	-	-	3/12 = 25.0

실험예 3 ; 발효 약제 및 미발효 추출조성물의 관절염 치료효과 비교

DBA/1 실험용 마우스 30마리를 실험예 2와 동일한 방법으로 관절염을 유발시키고, 실험군을 실시예 4에서 제조한 미발효 약재 추출물 처리군과 실시예 5에서 제조한 발효 약제 처리군 각각 10마리씩으로 나누어 이후 3주간 10번에 걸쳐 1회/2일 간격으로 약물을 고형분 기준 0.36g/kg 용량(100㎕/1마리)으로 경구 투여하였다. 비교군(CIA 군)에 대하여 실험군(약제 처리군, Tolerance 군)의 시간 경과에 따른 관절염 유발 정도를 임상 관절염 지수(Clinical Arthritic Index, 이하, "AI"라 함)로서 관찰하였으며, 역시 실험예 4에서 두 약제의 관절염 치료효과를 세포 조직학적 분석을 통해 비교 분석하였다.

표 5는 실험군에 약제를 먹이기 시작한 3주차부터 임상 평가를 시행하여 AI를 평가 정리한 것이며, 이를 도 5에 그림으로 나타내었다.

대조군(CIA 군)의 관절염 유도정도는 실험 기간 중 내내 50∼75%를 유지하며 AI 평가에서 평균 4점 이상의 지속적인 증가를 보이고 2회에 걸친 확실한 증가를 관찰할 수 있는데 반해, 발효약제 처리군 에서는 약물투여 기간 중 지속적인 AI 평가치 감소를 보여주어 8주차에서 기준군에 대해 약 80.8%의 관절염 치료효과를 기록하였다. 또, 미발효 약재추출물 처리군에서도 약물투여 기간 중에는 AI 값이 감소 또는 유지되어 관절염 예방 및 치료효과가 있음을 알 수 있으나 8주차에서 관절염 치료효과가 기준군에 대해 49.5%로써 발효약제 처리군에 비해 관절염 치료효과가 56.8%에 불과했다.

[표 5] Clinical Arthritic Index 평가

시간(주)	CIA유도군	발효 약제처리군	미발효약재추출물 처리군
	AI			Incidence(%)
3-1	4	57	5.29	2.75
3-2	4.29	43	3.71	1.63
4	7.83	50	3.14	1.75
5	5.67	67	3.14	2.13
6	4.75	50	2.83	2.33
7	5.5	75	3	2
8	5.25	50	2.67	1.8

실험예 4 관절염 유발 마우스 적출세포 조직학적 분석

실험예2및 실험예3의 동물실험에서 2주차 후 부스터 한 뒤 약제 투입 전 기준군 마우스 4마리를 1차 희생하고, 다시 2주 후 약제 투입이 완료된 뒤 비교군(CIA 군) 및 약제 처리군 쥐 각각 4마리를 2차 희생하여 각 부위 조직세포를 적출하고, 세포 배양하여 ELISA 및 RT-PCR 법으로 세포 내 염증(inflammation) 및 면역 관련 싸이토카인 농도 변화를 측정, 항 염증 및 관절염 치료 효과를 분석하였다. 더불어 안구에서 체취한 혈장 중 면역글로브린 양을 항체 적정(Antibody titration) 하여 총 면역 단백 및 IgG1, IgG2 의 량을 측정하고 T 세포에 대한 약제 작용 정도를 측정하였다.

실험쥐의 조직세포 적출은 dLN(drainic lymph node), mLN(mensenteric lymph node), Spleen 및 P.P(Peyer's Patches)의 4부위에서 하였으며, RPMI 1640배지/10% 용액에서 세포 수프(Cell soup)을 만들어 원심분리(3000rpm, 5min)하고 5×10⁵세포 농도/웰 농도로 시딩하였다. ELISA(Enzyme Linked Immunosorbant assay) 법은 SPECTA MAX 250 기종을 사용하여 TGF-β(Transforming growth factor-β), INF-γ(Interferon-γ), IL-10 및 IL-12의 분석에 이용하였고, RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase chain reaction) 분석은 Perkin ELMER 9600을 사용하여 CIA 군 및 토러렌스(Tolerance) 군의 조직세포 내 TNF-α (Tumor necrosis factor-α), IL-4 (Interleukin-4) 및 TGF-β농도 차이를 측정하여 항 염증 및 관절염 치료 효과를 비교 분석하였다.

표 6와 표 7은 TGF-β 및 INF-γ의 ELISA 분석 과정을 나타낸 것으로, 이때 Blocking solution은 GIBCOBRL의 PBS 시약을 사용하여, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline 9.6g을 정제수 적량으로 1L를 맞추고 1% BSA(TM-USB. Lot.106268) 10g 과 0.1% 초산 나트륨을 첨가한 용액으로 하였다. TGF-β측정의 항체로 미국 R&D system사의 #244(Catalog No. MAB1835) 및 #19(Lot No. WS04)를 사용하였으며, PEPRO TECH EC LTD(U.S.A)사의 #17(Cat. No. 100-21) 및 Genzyme/Techne사의 #18(Cat. No. 80-1835)을 표준으로 이용하고 카타로그 매뉴얼을 참조하였다.

IL-10 및 IL-12의 ELISA 분석에서도 동일한 방법으로 Perkin ELMER 9600을 사용하여 카타로그 매뉴얼을 참조하고 측정하였다.

[표 6] ELISA 과정 / TGF-β

1. # 244로 코팅된 플레이트를 4℃ 오버 나잇(1/150으로 희석 -> (6㎕+894㎕ ccPBS) 3ml -> 50㎕/웰

2. 세척 조건 : PBST 1x

3. 블럿킹 용액으로 플레이트를 블럿킹하고 상온에서 1시간 배양

4. 세척 조건 : PBST 1x

5. 스탠다드 또는 샘플 :스탠다드 #17을 상온에서 2시간 배양(희석: (2㎍/ml)-> 2000pg 에 해당하도록 2㎕+238㎕(블럿킹 용액) -> 1/2

6. 세척 조건 : PBST 1x

7. 항체 #19를 검출, 상온에서 1시간 30분 배양(희석: 1/250 1.8㎕+898.2㎕(블럿킹 용액)-> 50㎕/웰

8. 세척 조건: PBST 1x

9. 2차 효소: Streptavidin-HRP R&D System 사 효소. (희석: 1/200)배양: 암소에 30분

10. 세척 조건 :PBST 1x

11. 기질: 기질 A:B=1:1 로 혼합 -> 50㎕/웰 (희석)배양 : 발색 정도에 따라 30분~ 1시간

12. 정지 용액 : 1N HCl

13. 리딩 : 450nm Elisa 분석기

[표 7] ELISA Procedure / INF-r

1. # 352로 코팅된 플레이트를 4℃ 오버 나잇(1/500으로 희석 -> (3㎕+2997㎕ ccPBS -> 50㎕/웰 ccPBS

2. 세척 조건 : PBST 1x

3. 블럿킹 용액으로 플레이트를 블럿킹하고(희석;50㎕/웰) 상온에서 1시간 배양

4. 세척 조건 : PBST 1x

5. 스탠다드 또는 샘플 :스탠다드 #344를 상온에서 2시간 배양(희석:1/100 2.4㎕+240㎕(블럿킹 용액) -> 1/2

6. 세척 조건 : PBST 1x

7. 항체 #353을 검출, 상온에서 1시간 30분 배양(희석: 1/250 3.6㎕+900㎕(블럿킹 용액)

8. 세척 조건 : PBST 1x

9. 2차 효소: Streptavidin-HRP R&D System 사 효소. (희석: 1/200 ->15㎕+2985㎕ (블럿킹 용액) 배양: 암소에 30분

10. 세척 조건 : PBST 1x

11. 기질: 기질 A:B=1:1 로 혼합 -> 50㎕/웰 (희석)배양 : 발색 정도에 따라 30분~ 1시간

12. 정지 용액 : 1N HCl

13. 리딩 : 450nm Elisa 분석기

INF-γ의 ELISA 분석은 역시 R&D system 사의 #352(Cat. No. MAB785), #353(Cat. No. MAF485) 및 #344(Cat. No. 485-MI)를 항체 표준 시약으로 사용하고카타로그 매뉴얼을 참조하였다.

도 6은 II형 콜라겐으로 관절염 유발된 CIA 군과 발효 약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 쥐의 안구에서 체취 한 혈장에서 측정한 면역글로브린 농도를 나타낸 그림이다. 20㎍/ml 농도의 Native bovine CII를 50㎕/Well coating 하고, Pharmingen 사에서 구입한 #250 및 182, 183의 검출 시약을 사용하여 혈장 중 총 면역글로브린 농도 및 IgG1, IgG2의 농도를 정량 하였다.

DBA/1 실험용 마우스는 체내 면역글로브린 중 IgG1이 T-헬프 2 세포(Th2)에서 유도된 면역 단백으로 항염증에 관계하며 실험결과 발효약제 처리군 및 미발효 약제 처리군 모두에서 2.5배 이상 증가하였고, Th1⇒IgG2으로 항원을 프레젠팅하여 염증을 유도하는 IgG2는 미발효 약제 처리군에서도 30%정도 감소하나 발효 약제 처리군에서 10배이상의 현격한 감소를 보여 총 면역글로브린의 농도 IgG 에서도 발효약제 처리군에서 두 배 이상의 현격한 감소를 보였다. 즉, 발효 약제 처리군이 T 세포 중 특이하게 Th2⇒IgG1 에 작용하고 inflamation을 유발하는 IgG2를 현격하게 감소시켜 항 염증을 유도 작용하였다. (57.8% Total IgG 농도 감소)

2차 희생 한 쥐의 적출세포에 대해 TGF-β, IL-10, IL-12 및 INF-γ의 ELISA 분석을 시행하고 도 7, 도 8, 도 9 및 도 10에 각각 나타내었다. 부스터 2주 후 측정 결과로, 장간막 림프절에서 CIA 군에 비해 발효 약제군이 현저한 TGF-β의 증가(약 2.5배)를 보이고 있으며, 관절염 유발 부위 및 Peyer's Patches 에서도 미발효 약제군에 비해 탁월한 TGF-β의 증가를 보여주었다. NK 세포와 T림프구로 하여금 IFN-γ를 생산하도록 유도하는 IL-12의 농도는 P.P에서 발효 약제군 및 미발효약제 처리군 모두 감소하였고(약 75% 이상), 항 염증성 cytokine으로서 대식세포와 림프구에 강력한 억제효과를 보이는 IL-10의 농도는 mLN 및 dLN에서 발효 약제 처리군이 현격한 증가(10∼30배)를 보이며 미발효 약재추출조성물 처리군에 비해 약 2.5배 이상 증가 결과를 보여 주었다. 염증에 관여하는 INF-γ의 측정치 역시 mLN 및 dLN에서 발효 약제 처리군이 감소(20∼40%) 결과를 얻었다.

골아세포 중 존재하는 TGF-β는 골기질에서 불활성으로 축적되어 있는데 골흡수 때에 파골세포가 방출하는 산에 의해 활성화되어 골아세포의 증식 및 콜라겐 합성을 촉진하고 파골세포에 대하여 억제적 작용을 한다. 또한 TGF-β는 모노카인(마크로파지에 의한 생산) 이라는 일설도 있는데, 아직까지는 뼈나 골수의 세포에서 생성하여 상피, 간엽세포의 활성화에 작용하는 것이 일반적인 내용이며, 따라서 T 세포에서 MHC 2 (일종의 마커)에 대한 억제작용으로 항 염증 작용이 있다.

본 실험에서는 또한 대조군(CIA 유도군)에 대한 발효 약제 처리군의 mLN, dLN, P.P 및 지라 조직의 세포를 10㎍ 사용하여 TGF-β, TNF-α 및 IL-4의 농도를 RT-PCR 법으로 분석하고 전기영동하여 IOD 값을 측정하였다.(양 단위: ng) RT-PCR 법은 세포 내에 발현된 RNA를 검출하고, 분석하는 센시티브 한 방법으로 적출세포 중 측정하고자 하는 특정 RNA를 분리하여, 역전사 반응으로 c-DNA를 합성하고 PCR로 증폭하여 대조군 및 검량선과 비교 분석한다.

도 11, 도 12, 도 13은 PCR법으로 분석한 TGF-β, IL-4 및 TNF-α의 전기영동 사진이며, 450nm 형광 검출기에서 IOD 값을 측정하여 표 8, 표 9 및 표 10에 나타내었다.

[표 8] 조직세포 내 TGF-β의 RT-PCR 결과

	mLN	dLN	Spleen	P.P
	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과
CIA 군	20435	14852	0.73	14302	21081	1.47	6323	12230	1.93	8169	19263	2.36
약제 처리군	7622.1	19310	2.53	4002.5	19668	4.91	5340.5	17939	3.36	3509.4	13957	3.98
차이	247% 증가	234% 증가	74% 증가	69% 증가

[표 9] 조직세포 내 IL-4 의 RT-PCR 결과

	mLN	dLN	Spleen	P.P
	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과
CIA 군	20435	9653	0.47	14302	4161	0.29	6323	2364	0.37	8169	8697	1.06
약제 처리군	7622.1	7404	0.97	4002.5	3469	0.87	5340.5	1237	0.23	3509.4	5447	1.55
차이	106%증가	200% 증가	38% 감소	46% 증가

[표 10] 조직세포 내 TNF-α의 RT-PCR 결과

	mLN	dLN	Spleen	P.P
	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과	β2M	결과
CIA 군	4953	15743	3.18	3537	9841.1	2.78	1737	10057	5.79	2496	7484.5	3.00
약재 처리군	3379	6791.5	2.01	3329	8364.3	2.51	1908	10180	5.34	2680	5000.8	1.87
차이	37% 감소	10% 감소	8% 감소	38% 감소

위 결과 c-DNA 초기 β2M IOD 값에 대해 PCR 증폭 후 IOD 값의 변화량을 환산하였을 때 TGF-β의 양은 부스터 위치 및 장간막 림프 절에서 2.5배의 증가를 기록하여, ELISA 분석 결과를 뒷받침 하여주고 있으며, 비장 및 Peyer's Patch에서도 상당히 증가하여 항염증 및 골아세포 증식에 관여하였음을 알 수 있다.(표 8)

B세포(Bone marrow cell) 자극인자로써 휴지기 B세포의 활성화에 관여하는 IL-4 역시, 부스터 위치 및 장간막 림프절에서 100∼200% 의 IL-4 농도 증가를 보여 활발한 B 세포 활성화에 관여하고 있음을 알 수 있으며, 비장 및 P.P 등과 같이 골수세포와 관계없는 기관에서의 농도는 큰 차이가 없었다.(표 9)

세포 내 TNF-α는 종양 괴사인자로써 염증 유발에 관계한다.

본 실험 결과 비장 및 Drainic LN 에서는 TNF-α의 농도가 별 차이를 보이지 않으나 장간막 및 P.P에서 크게 감소하는 것으로 보아 관절염의 이행 및 분화 억제에 상당한 영향을 미치고 있음을 알 수 있다. 즉, 약제 처리군에서 부스트 후 인시던스 측정결과 CIA 유도군과 달리 AI 및 관절염 유발정도가 현격하게 적음을 알 수 있다.(표 10)

실험예 5 마우스 마크로파지의 in-vitro 실험

실시예 22에서 제조한 본 약재의 11개 샘플 및 비교약물로써 Hydrocortison 과의 마우스 마크로파지를 LPS로 자극한 세포의 TNF-α 및 collagenase 저해효과를 측정하였다. 실험결과 TNF-α의 ELISA 결과는 LPS 군과 음성군이 유의하게 차이가 나며, 본 약재의 발효공정 중 발효액의 효과는 없는 것으로 나타났으며, 약제의 두 성분인 우슬 및 창출의 각각의 추출물에서 모두 TNF-α저해효과를 기록하였다. 더불어 각각의 추출물에 발효공정을 더한 샘플군에서도 TNF-α저해효과를 기록하였으며, 이때 발효액으로 인한 중량 편차(우슬9.2g⇒23.1g, 창출12.2g⇒22.9g)를 뺄 경우 현격한 저해효과를 환산할 수 있어 위 실험예 4의 결과를 뒷받침 해주고 있다.

도 14에서 그림으로 나타내었다.

콜라제네이즈 활성저해 실험은 역시 위 실시예 22에서 제조한 우슬, 창출의 각 추출 및 추출발효산물의 10개 샘플 및 발효액 자체를 음성 대조군과 비교하여 측정하였다. 우선 Azo dye-impregnated collagen(sigma사) 2%, CaCl₂1nM, Tris-HCl 50mM, Collagenase Type II(125ng/0.5ml)가 함유된 0.5 ml 용액에 각각의 약물을 첨가하고 37℃에서 15시간 효소 반응하였다. 540nm에서 UV/vis. 분광기로 반응에 의해 분리된 azo 염료의 량을 측정 비교하였다. 본 실험결과 약재의 각 성분 추출물 및 추출 발효물에서 모두 콜라제네이즈 활성 저해에 우수한 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

표 11 및 도 15에서 그림으로 나타내었다.

[표 11] 콜라제네이즈 활성저해 실험 - in-vitro 실험

약재명	효소 + 약재(두 실험의 평균)	약재	저해제가 있는 상태의 활성
AN/B in MeOH	0.329	0.256	0.073
AP/MeOH	0.32	0.258	0.062
AP/B in MeOH	0.2745	0.243	0.0315
B MeOH	0.2425	0.228	0.0145
B pro in water	0.516	0.278	0.238
AP/B pro in water	0.489	0.259	0.2
AN pro in water	0.515	0.285	0.23
AN/B in water	0.492	0.268	0.22
AP pro in water	0.5365	0.283	0.2535
Pro	0.6075	0.304	0.3035
AN in water	0.3265	0.237	0.0895
음성 대조군	0.319

상기한 구성의 본 발명에 따르면, 우슬과 창출의 추출물도 부분적으로 관절염 증상의 완화에 활성을 가지지만, 그 추출물의 발효산물인 본 발명의 경우, 발효하지 않은 것에 비해 약 2배 정도의 관절염 완화에 대한 효과를 보였다.

또한 본 발명에서 상기 구성의 발효산물은 관절염 예방 및 치료효과에서 약제투여 중 관절염 이행율이 전혀 없이 예방효과를 확실히 하였으며, 치료효과 역시 67%의 관절염 유도 감소 결과를 얻었다. 또한 체내 부종 및 관절염에 관계하는 싸이토카인의 농도를 현격하게 조절하여, 관절염 치료 뿐만 아니라 부종의 치료에도 탁월한 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

Claims (21)

1. a) 우슬 및 창출을 추출하는 단계; 및

   b) 상기 추출물을 발효하는 단계를 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 발효단계 후 농축하는 단계를 더욱 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
3. 제 1 항의 a) 단계에 있어서, 상기 추출에 사용하는 용매는 정제수, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
4. 제 1 항의 a) 단계에 있어서, 상기 추출에 사용되는 우슬과 창출의 비율은 0:5∼5:0인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 우슬 및 창출은 건조약재 혹은 생약재인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 우슬은Achyranthis japonica(MIQ.) NAKAI이거나Achyranthis bidentata BLUME인 것을 사용하고, 창출은Atractylodes japonica KOIDZ.또는Atractylodes Koreana Kitam임을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
7. 제 1 항의 b)단계에 있어서, 상기의 발효는 맥아, 누룩, 포도 및 포도주 발효효소원 및 효모로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 발효원을 사용하고, 발효 부원료로써 쌀밥 또는 쌀, 옥수수 전분, 밀, 파파인, 키위 또는 배를 직접 사용하거나 이들의 전분을 정제한 것 또는 이들의 포도당 시럽 중 하나 또는 둘 이상을 0∼50% 사용함을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
8. 제 1 항의 b)단계에 있어서, 상기 발효는 발효원 및 발효 부원료와 조효소제를 약재 추출액에 직접 투입하여 하거나 또는 발효액을 제조하고, 또한 약재 추출액을 각각 제조하여 함께 합하여 발효하는 방법을 포함하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
9. 제 1 항의 b)단계에 있어서, 상기 발효조건은 20∼75℃에서 2∼36시간인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물의 제조방법.
10. 제 1 항 에서 제 9 항 까지 중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 관절염 예방 및 치료용 조성물.
11. 제 1 항의 a)단계에 의해서 제조된 우슬 추출물, 창출 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 관절염 예방 및 치료용 조성물.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

    상기 발효 농축물을 주요 약효 성분으로 하고 부형제를 적량 사용하여 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 엑스제, 환제, 과립제, 산제 및 이들의 하드 캅셀제 또는 연질 캅셀제의 경구용 관절염 예방 및 치료용 약제조성물.
13. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 티지에프-베타 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
14. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 인터페론-감마의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
15. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 티엔에프-알파의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
16. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 인터루킨-4의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
17. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 인터루킨-10의 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
18. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 체내 인터루킨-12의 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
19. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 마우스의 면역글로브린 G1 생성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
20. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물은 마우스의 면역글로브린 G2 생성을 저해하는 것을 특징으로 하는 약제조성물.
21. 제 10 항에 있어서,

    상기 조성물이 염증 치료 및 예방을 목적으로 하는 조성물.