KR101335081B1

KR101335081B1 - 강황과 캡사이신을 사과부산물과 함께 발효하여 항바이러스와 항균력이 있는 항생제 대체용 기능성 사료첨가제의 제조 방법

Info

Publication number: KR101335081B1
Application number: KR1020120088759A
Authority: KR
Inventors: 문기혁; 윤정원; 윤병필
Original assignee: 문기혁
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2013-12-03

Abstract

본 발명은 항바이러스력과 항균력이 높아 면역증강효과가 있으며, 특유의 강한 자극성 향이 있는 강황과 캡사이신 분말을 사과 가공부산물 효모발효액과 함께 그 자체를 혼합 발효하여, 강황과 캡사이신의 항균력과 항바이러스력 기능은 유지하면서 자극적인 향을 완화하였다. 또한 강황, 캡사이신, 사과 가공부산물 혼합발효물을 사료첨가제로 제조하여 가축에 급여한 결과, 자극적인 향에 의한 사료 거부감이 없어지도록 하여 기능성 사료의 사료섭취량이 줄지 않도록 하였으며, 대량생산 시 유익한 생균이 일정함량이상 제품에 존재하도록 하는 생산공정 개발 조건을 함께 제공한다.

Description

강황과 캡사이신을 사과부산물과 함께 발효하여 항바이러스와 항균력이 있는 항생제 대체용 기능성 사료첨가제의 제조 방법 {The Method of producing antibiotic substitute functional feed additive with fermented curcumin, capsacin and apple by-product composite having anti-viral and anti-microbial activity}

본 발명은 강황과 매운고추의 주성분인 캡사이신 혼합물을 효모인 Saccharomyces cerevisiae와 사과 가공부산물을 발효한 배양물에 첨가하여 함께 발효하여 사료 거부감의 원인인 특유의 강한 향을 완화한 발효물을 제조하는 기술과 이를 유산균 Lactobacillus plantarum과 고초균 Bacillus subtilis가 배양된 미강과 혼합하여 저온 숙성 건조하여 생균이 혼합된 사료첨가제를 개발하는 기술에 관한 것이다. 본 발명으로 제작된 사료첨가제를 양계 사양실험한 결과 폐사율이 실험구(2.2%)가, 대조구(9.7%)보다 7.5% point 낮게 나타나 효과가 매우 우수하였으며, 양돈 실험 결과에서는 기간 경과 할수록 시험구의 일당증체량, 사료섭취량, 사료요구율이 대조구보다 각각 1%에서 7%까지 증가하는 결과를 얻었다.

강황의 커큐민(curcumine)에 대한 연구는 매우 많이 진행되어 항바이러스, 항균, 염증제거, 혈행개선, 면역력 증가 등 효과가 다양하며, 강황을 분말 또는 추출물로 만들어서 식품이나 화장품으로 많이 사용한다.［문헌1］KR1020090126225 (김유학) 2009. 12. 8. ［문헌2］KR 1020100052904 (건국대학교산학협력단) 2010. 5. 20. 마찬가지로 고추의 캡사이신도 항산화효과, 지방세포의 대사, 식욕증진, 항비만 등 효과가 있음이 연구되었다.［문헌3］KR 1009457170000((주)에스.앤.디) 2010. 2. 26. 많은 연구의 결과에 나타났듯이 강황과 캡사이신은 그 효과가 확실함으로 국제적으로 점차 사용제한되고 있는 백신과 항생제의 대체제로 사용하면, 사육 가축들의 바이러스에 대한 면역력 향상［문헌4］KR 1020110004763 (한국생명공학연구원) 2011. 1. 14 에 매우 도움이 될 것이다.

종래의 기술에서 직접적인 사료첨가제로 개발되어 특허등록된 관련기술은 다음과 같다. 울금 등을 포함한 다양한 한약제를 열수 추출한 후, 효모와 유산균으로 단계별 발효한다. 여기에 각종 영양첨가제와 대두박 등의 부형제, 그리고 강한 향을 마스킹하기 위하여 스테비오사이드와 같은 향미제를 첨가하여 제조한 사료첨가제품이 있다.［문헌5］KR 1008809150000 (대한민국(농촌진흥청)) 2009. 1. 21.

그 외에는 강황을 멸균한 후, 유산균 배양액에 첨가하여 강황내부의 curcumine 성분을 증량시키는 발효방법.［문헌6］KR 1007176110000 (주식회사태영이앤티) 2007. 2. 27. 울금의 열수추출물을 멸균한 후, 바실러스 배양액에 첨가하여 발효해서, 울금의 기호성 향상과 낫토키나아제의 작용으로 울금의 흡수율을 증가시켜 체내의 이용률을 증가시킬 수 있는 발효울금 제조방법 ［문헌7］100990962000 (유상훈) 2010. 10. 25. 등이 있다. 그러나 처음의 사료첨가제 제조 방법을 제외하고는 대부분이 식품으로 이용되고 있다.

국외의 기술현황도 국내와 마찬가지로 강황과 고추(캡사이신)에 대한 항균, 항바이러스, 면역증강효과와 식욕증진, 비만억제 등에 대한 연구는 많이 이루어져 있지만, 사료첨가제로서는 그 개발이 식품에 비해 많지 않다.

외국의 개발품이 국내에 사료첨가제로서 국제특허로 출원된 기술은 닭의 바이러스성 질병인 뉴캐슬병의 치료 및 발병억제를 위하여 심황, 생강, 고추냉이의 추출물로 사료용 첨가제를 개발한 기술이 있다.［문헌8］WO 2008/074028 (더 퀴클리 코포레이션) 2008. 6. 19

국내 외 전체적으로 강황, 울금 등의 성분인 curcumine을 사료첨가용으로 개발한 제품은 많지 않으며, 사용빈도도 매우 낮은 것이 현 실정이다.

구제역, 조류독감 등 바이러스 원인질병은 국가적으로 큰 손실을 발생시키는 질병이다. 특히 2010년 하반기에 발생한 구제역은 초기대응 부족과 건조한 혹한의 날씨 때문에 강력히 전염되어 피해액이 3조원에 달하고, 가축을 살처분한 매립지는 침출수발생 등의 환경문제와 살처분 방법에 대한 비난으로 축산 농가에게 정신적 고통을 주는 등 구제역 발생으로 인한 직간접적인 피해는 예상을 초월하였다. 더욱 큰 문제는 사계절이 있는 우리나라는 가을에서 겨울로 넘어가는 환절기에 해마다 반복적으로 구제역이 발생할 가능성이 매우 높다는 것이다.

또 다른 바이러스 원인 질병인 조류독감도 전파력이 강한 고위험성 질병이다. 그리고 구제역 원인 바이러스는 다행히 사람에게 전파되지 않지만 조류독감 바이러스는 사람에게도 전염되는 변종바이러스가 발생하기 때문에 매우 위험하다. 그런데 이 조류독감도 해마다 환절기에 반복적으로 발생할 가능성이 매우 높게 예상되고있다.이외에도 가축에서 발생하는 다양한 바이러스성 질병은 돼지 소화기관에 이상을 유발해서 심한 설사를 유발하고, 이로 인한 폐사나 사료효율저하 때문에 축산농가에 큰 손실이 되고 있다. 양계산업에서도 살모넬라에 의해 감염되는 가금티푸스 때문에 역시 많은 손실을 보고 있는 실정이다.

가축은 평상시에는 살아있는 유산균, 효모, 고초균, 곰팡이 등 미생물로 만든 생균제를 사료에 첨가하여 먹임으로써 항상 건강한 상태를 유지할 수 있도록 하고 있다. 반면 각종 질병은 백신접종에 의한 예방과 항생제 투약 및 접종으로 치료할 수 있다. 하지만 항생제의 사용이 제한되는 요즘은 항생제를 대체할 수 있는 제품의 개발이 절실한 실정이다. 꾸준한 연구개발로 항균력이 우수한 생균제품은 다양하게 개발되어 출시되었으나, 구제역이나 조류독감을 극복하는 항바이러스력이 있는 제품은 아직까지 많이 개발되지 않았다.

항생제를 대체할 수 있는 제품을 개발하고자 천연물에 대한 관심이 매우 높다. 특히 천연물을 추출한 후 미생물을 이용하여 발효하면 천연물에 함유된 기능성물질의 효과가 높아지거나 거부감이 있는 향과 맛이 개선되는 등 긍정적인 효과가 나타나는데, 이러한 이유로 천연물발효에 대한 관심이 높아지는 추세이다. 또한 천연물을 발효하면 천연물에 함유된 기능성물질의 효과뿐만 아니라, 미생물도 함께 사용할 수 있는데, 어떠한 미생물을 사용하느냐에 따라서 그 시너지효과가 매우 높아지게 되며, 이러한 상승효과는 종래의 항생제를 대체 할 만큼 항바이러스와 항균효과가 높다.

항균, 항바이러스 능력이 있는 천연물질은 다양한데, 그 중에서 ① 강황, 울금 등은 그 효과가 높고 염증개선과 면역력증가 등 다양한 기능이 있는 반면 가축의 사료첨가제로서의 개발은 매우 낮았다. ② 고추의 캡사이신 성분도 항산화효과가 높고, 식욕개선, 항비만 효과가 높음에도 불구하고 사료첨가제로 개발이 더디었다.

그러므로 강황의 커큐민 성분과 고추의 캡사이신 성분을 이용하여, 구제역과 조류독감의 바이러스와 가축 소화기 내부의 병원성 유해세균 억제 및 가축의 면역력을 높여줌으로써 백신과 항생제 대체하는 안전한 천연물 발효제품을 개발이 필요하다. 그러나 강황 과 캡사이신은 그 맛이 매우 강하여 사람이나 가축에게 거부감을 주는데, 이러한 거부감을 감소시키면서 효능을 높이는 연구가 또한 함께 필요하다.

사과나 감, 복분자 등 폴리페놀 성분에 의한 항산화력과 유용성분이 있는 농산물들은 과실 그 자체를 즐기기도 하지만, 이를 가공하여 농축하거나 즙을 내어 먹기도 한다. 그리고 가공과정에서 많은 부산물들이 발생하는데 이를 가축의 사료로 활용하는 연구는 활발히 진행되고 있다. 몇몇의 연구는 높은 결과를 내어 그 성과가 나타나는 반면, 아직 대부분은 결과물의 산업화가 낮은 것이 현실이다.

사과는 매년 가을에 생산되는데, 사과즙 형태로 많이 즐기기도 한다. 역시 부산물이 많이 발생하지만 그 이용은 매우 저조하다. 사과부산물은 당이 풍부하여 발효 가공시 균이 성장하기에도 좋고, 발효 후 풍미가 우수하며, 초산발효 후에는 변질이 더디어지는 이점이 있다. 이러한 사과의 이점을 이용하면, 강황과 캡사이신 발효물의 강한 향과 맛을 저감시키고, 가축이 섭취하기 좋은 맛을 내며, 농가 부산물을 부가가치를 높여 효과적으로 사용함과 동시에 쓰레기 감소 등의 효과도 함께 볼 수 있을 것이다.

위와같은 점을 고려할 때, 현재 축산업에서는 강황과 캡사이신의 효과를 함유하면서 유산균, 효모, 고초균의 생균이 함께 공급되어 천연물과 생균의 상승효과를 기대하여 항생제를 대체할 수 있는 기능성 사료첨가용 생균제 개발이 반드시 필요한 시점이라 하겠으며, 환경문제도 함께 해결 할 수 있는 농가부산물의 가공처리 역시 사과 가공부산물뿐만 아니라, 여타의 농가부산물도 함께 해결되어야 하는 상황이다.

본 발명은 강황과 캡사이신을 종래의 비싼 가공비가 드는 방법이 아닌 경제성 있는 개발방법을 연구하여 사육농가가 사용하기에 부담 없으며, 사회적으로 큰 비용이 지출되는 질병을 억제하는 사료 첨가용 항생제 대체 기능성제품을 생산하고자 하였으며, 강황과 캡사이신 추출물을 멸균하여 발효하는 것이 아닌 강황과 캡사이신의 강한향을 저감하여 가축이 섭취하는데 거부감이 없도록 개발 항균력을 유지하면서 유용미생물은 함께 존재하는 조건을 확립하고, 대량 생산을 위한 스케일업 공정개발, 제품의 현장사양실험으로 효능을 입증하여 항생제와 백신을 대체할 수 있는 기능성 사료첨가제를 제조하는 기술을 개발하고자 하는 것이다.

본 발명으로 개발된 기술은 다음과 같은 효과가 있다. 기존의 선행기술과 특허, 연구개발 제품 등은 강황을 열수 추출한 다음, 별도의 가공과 멸균 등의 공정을 거치므로 에너지, 시간, 고형부산물 처리 등에 대한 비용이 발생하였으며, 이는 생산비용에 포함되어 값비싼 제품이 되고, 소비자의 외면을 받아왔다. 그러나 생산 공정을 줄여 에너지 소비를 줄이고, 제품의 생산시간을 단축하고, 부산물의 발생이 없는 환경친화적인 방법인 본 발명의 기술은 생산원가를 낮추어 생산자와 소비자가 모두 만족하는 좋은 제품을 탄생 시킬 수 있게 되었다.

즉, 멸균하지 않은 사과박을 분쇄하여 효모배양액으로 발효하는 방법, 강황과 캡사이신분말을 첨가하여 추가발효를 진행하는 것, 별도의 유산균과 바실러스 배양액을 첨가하는 방법, 쌀도정 부산물인 미강을 이용하여 혼합하고 저온건조하여 숙성하는 방법 등은 에너지의 소비를 줄이면서도, 사과가공부산물의 발효향미와 발효강황의 강한향 저감에 따른 사료섭취량 증가효과, 강황과 캡사이신에 의한 면역력 증가, 유익한 생균에 의한 소화효율 향상 등 다양한 복합효과를 한번에 이룰수 있는 현장과 환경 친화적인 개발 기술인 것이다.

더더욱 4계절의 변화가 있는 우리나라는 향후 가을에서 겨울이 되는 환절기에 바이러스성 질병이 확산 될 가능성이 아주 높으며, 2009년 이후 구제역과 조류독감이 매년 발생 중이다. 그러나 백신의 사용은 축산물의 수출을 막고, 항생제의 사용은 국제적으로 점차 제한되고 있다. 이러한 상황에서 사육 가축들은 바이러스와 병원성세균에 대한 면역력 향상이 매우 중요하다. 강황, 캡사이신, 사과가공부산물 혼합 발효물과 생균제를 함께 가축에게 공급할 수 있는 본 개발품은 구제역, 조류독감 및 바이러스 유발 장염 등에 대한 백신의 천연대체제와 소화기 유해병원성세균에 대한 항생제 천연대체제로 널리 사용될 수 있으며, 그 수요는 매우 높다고 하겠다. 그리고 구제역과 조류독감의 발생으로 인한 살처분 예방효과와 방역비용, 매립과 환경정화비용 등을 감안하면 경제적인 효과는 매우 높다고 하겠다.

도1은 강황과 캡사이신, 사과가공부산물을 발효하여 만든 생산제품 사진

재료 및 균주

실험에 사용한 강황(tumeric, Curcuma longa L.)은 주산지가 동남아이며, 인도네시아에서 생산되어 수입된 분말제품을 사용하였다. 카레의 노란색 색소 성분인 커큐민(curcumine)이 산지에 따라 조금씩 차이가 있지만, 평균적으로 0.3%가 뿌리부분에 함유되어 있다.

캡사이신(Capsaicin)은 파프리카 열매 분말을 사용하였으며, 인도네시아에서 생산된 제품을 사용하였다. 실험에 사용된 강황과 캡사이신은 향후 대량생산을 위한 원료 조달이 용이한 공급형태인 강황 40%(w/w), 캡사이신 20%(w/w), 부형제로 옥분20%(w/w)를 균일하게 혼합하여 사용하였다.

사과박부산물은 사과의 산지 경북 영주 단산면에서 10월에 수확하고, 사과즙을 만들고 남은 부산물을 수거하였다. 수거된 사과박은 600리터의 용기에 보관한 후 갈아서 사용하였다. 사과박은 상온상태에서 보관하였으며, 부패하지 않도록 유지하는 것이 중요하였다. 가능한 사과박을 압축하여 공기가 유입되지 않도록해서 부패균이 성장하지 않도록 하였으며, pH 3에서 4를 유지하였다.

본 발명에 사용한 균은 효모 Saccharomyces cerevisiae, 병원성 균주는 가금티푸스를 유발하는 Salmonella gallinarum, Escherichia coli 10250, Pseudomons aeruginosa, 그리고 Staphylococcus aureus를 사용하였다.

대량배양 발효조건 확립

대량 생산시 사과박을 멸균하려면 에너지소비량이 많고, 생산 공정이 개방된 구조이어서 무균적인 상태를 유지할 수 없으므로 사과박을 멸균하지 않은 상태에서 배양할 때 부패되지 않는 조건을 찾아야했다. 분쇄한 사과박을 멸균하지 않고 250ml 삼각플라스크에 100ml의 증류수를 넣고, 10%(v/v), 15%(v/v), 20%(v/v), 25%(v/v)를 첨가하여 30℃에서 배양한 다음, 향기를 맡아서 결정하였다. 상기와 같은 방법을 3반복하여 측정한 결과, 25% 사과박은 매우 농도가 높아서 혼합에 문제가 있었으며, 10%와 15%는 사과박 발효과정에서 변질된 향이 나타났고, 곰팡이 등 오염균이 매우 쉽게 나타났다. 20% 배양액은 사과박의 적절한 농도와 산도가 유지되어 곰팡이 오염균이 나타나지 않았으며, 배양중 단냄새와 신냄새를 나타내어 실험에 사용하는 사과박 사용량으로 결정하였다.

S. cerevisiae 산업용 배지조성

Yeast extract	3%, (w/v)
Dextrose	20
Iso separate protein	5
KH₂PO₄	2
ZnSO₄	0.5
MgSO₄	0.5
(NH₄)SO₄	1.5
CaCl₂	0.7
CH₃COONa	0.5

① 효모는 종균배양 후, 30리터 산업용 배지에 접종해서 48시간 배양하였다. 대수기(log phase)에 접어든 배양액에 분쇄한 사과박을 8리터 첨가하여 최종적으로 20%(v/v)가 되도록 첨가하고 5일간 배양하였다. 사과박은 멸균한 조건과 멸균하지 않은 조건을 비교하였다. 24시간마다 생균수를 측정하여 우점종 균주가 변하는가를 측정하였다. 5일 경과 후, 강황(커큐민) 40%(w/w), 캡사이신 20%(w/w), 옥분40%(w/w)로 구성된 강황 혼합물을 2kg을 첨가하여 5%(w/v)가 되도록 한 후, 7일간 더 배양하였다.

사과박을 첨가하여 5일간 배양결과, 멸균 사과박의 경우엔 오염균의 발생이 거의 없었으나 멸균하지 않은 사과박에서는 바실러스 오염균이 발생하였다. 커큐민과 캡사이신분말은 5%(w/v) 이상 첨가할 경우 점도가 너무 높아져서 혼합이 되지 않았으므로 이를 최대 첨가량으로 결정하였다.

항균력 측정

위 조건으로 배양된 강황과 캡사이신 발효물에서 균을 제거하고 배양액성분내의 항균능력을 측정하였다. 공시균주는 E.coli, S. gallinarum, P. aeruginosa, 그리고 S. aureus를 사용하였고, 각 공시균주를 E.coli는 LB medium, 나머지 균주는 Tryptic soy broth medium에서 24시간 액상배양 후, 540 nm에서 OD값 1.0 이 되도록 각 배양액을 멸균수로 희석한 다음, agar를 첨가한 각 공시균주용 배지 200ml에 0.6ml씩 넣고 흔들어서 골고루 섞은 후 배양접시에 분주하였다. 직경 80mm 종이디스크에 아래 과정으로 준비한 배양액 추출물이 모세관 현상으로 흡수되도록 적신 후, 냉각되어 굳은 배지 표면에 올려놓고, 24시간 배양 후 형성된 투명환의 크기를 측정하여 항균력을 비교 확인하였다. 3반복하여 평균값을 구하였다.

① 배양액 자체의 항균능력 측정을 위하여 각 배양액을 원심분리하여 고형분을 제거한 다음, 상층액을 0.4㎛ filter로 여과하여 균을 제거하였다. 대조구는 5% 강황과 캡사이신 혼합분말을 이용하였고, 충분히 수용액상에서 녹인 후 같은 방법으로 고형분을 제거하였다.

② 각 배양액을 2시간 동안 끓여서 강황과 캡사이신의 열수 추출에 따른 항균력 변화를 관찰하였다. 배양액을 열을 가하여 추출 후, 원심분리하여 고형분을 제거하고 여과 한 다음 항균력을 측정하였다. 대조구는 5%(w/v) 강황과 캡사이신 혼합분말을 이용하였고, 같은 방법으로 추출하였다.

③ 각 배양액의 양을 측정한 후, 동결건조하여 수분을 모두 제거하였다. 처음 측정한 배양액 양만큼 되도록 에탄올을 첨가하여 충분히 녹여준 후, 원심분리와 여과로 고형분을 제거하여 샘플을 준비하였다. 대조구는 강황혼합분말을 에탄올에 5%(w/v)가 되게 녹인 후, 고형분 제거해서 준비하였다.

④ 동일하게 조건으로 각 배양액을 동결건조 한 다음, 에탄올을 첨가한 배양용액을 80℃에서 2시간 동안 가열한 다음 원심분리와 여과로 샘플을 준비하였다. 대조구도 같은조건으로 가열하여 준비하였다.

샘플의 이름과 조건은 아래의 표에 나타내었으며, 각 샘플은 항균력과 항산화력, HPLC 분석에 동일하게 사용하였다.

수용추출물의 샘플 종류 및 조건표

Sample No .	종균 종류	사과박종류	추출조건 - 공통 : 고형분 제거
W-E	효모	멸균	배양액 자체 (가열하지 않은) 샘플 (①번 추출조건)
W-F	효모	멸균	배양액을 가열한 열수추출 조건 샘플(②번 추출조건)
W-G	효모	비멸균	배양액 자체 (가열하지 않은) 샘플 (①번 추출조건)
W-H	효모	비멸균	배양액을 가열한 열수추출 조건 샘플(②번 추출조건)
W- CO - NH	대조구	강황혼합분말 5%	배양액 자체 (가열하지 않은) 샘플 (①번 추출조건)
W- CO -H	대조구	강황혼합분말 5%	배양액을 가열한 열수추출 조건 샘플(②번 추출조건)

에탄올추출물의 샘플 종류 및 조건표

Sample No.	종균 종류	사과박종류	추출조건 - 공통 : 동결건조 후 에탄올첨가, 고형분 제거
E-E	효모	멸균	가열하지 않은 에탄올 샘플 (③번 추출조건)
E-F	효모	멸균	가열한 에탄올 추출 샘플 (④번 추출조건)
E-G	효모	비멸균	가열하지 않은 에탄올 샘플 (③번 추출조건)
E-H	효모	비멸균	가열한 에탄올 추출 샘플 (④번 추출조건)
E- CO - NH	대조구	강황혼합분말 5%	가열하지 않은 에탄올 샘플 (③번 추출조건)
E- CO -H	대조구	강황혼합분말 5%	가열한 에탄올 추출 샘플 (④번 추출조건)

항균력 측정결과, S. gallinarum과 P. aeruginosa 둘다 감수성이 비슷하였고, S. aureus가 가장 감수성이 높았다. 멸균한 것과 멸균하지 않은 사과박, 추출시 가열유무 등에 따른 유의적인 차이는 없었으나, 멸균한 사과박 그리고 가열 추출한 것이 좀 더 높은 항균력을 나타내었다. 그리고 에탄올추출물은 수용추출물보다 148~216% 더 높은 항균력을 나타내었다.

E. coli에 대한 항균력 시험은 주목할 결과가 나왔다. 수용추출물 실험에서는 대조구인 커큐민추출물에서 항균력이 나타나지 않았으나, 효모 발효한 커큐민에서는 항균력이 나타났기 때문이다. 알코올추출물 대조구 커큐민에서는 수용추출물에선 보이지않던 항균력이 나타났는데, 이는 항균성분이 알코올에 잘 추출되기 때문으로 추측되며, E. coli 항균실험에서 강황은 발효하는 것이 넓은 항균스펙트럼을 생산할 수 있게 하는 유용한 방법임을 알게 해주었다.

발효조건별 수용추출물의 병원성균주에 대한 항균력 측정결과 (단위:mm)

	S. *gallinarum*	P. *aeruginosa*	S. *aureus*	E. *coli*
W-E	16.5	11.0	14.7	12.7
W-F	11.0	10.7	10.3	13.7
W- CO - NH	11.3	13.7	16.0	0
W- CO -H	13.7	8.0	12.7	0
W-G	13.3	12.0	15.0	14.0
W-H	12.0	12.3	10.3	12.7

발효조건별 에탄올추출물의 병원성균주에 대한 항균력 측정결과 (단위:mm)

	S. *gallinarum*	P. *aeruginosa*	S. *aureus*	E. *coli*
E-E	23.0	19.5	23.0	11.7
E-F	19.5	19.3	21.0	12.3
E- CO - NH	22.5	19.0	23.3	11.0
E- CO -H	22.0	20.5	19.5	12.0
E-G	21.0	15.7	19.7	11.0
E-H	16.0	15.7	20.0	12.0

항산화력측정

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)을 이용하여 radical 제거능력을 확인하여 각 배양액에 항산화력을 측정하였다. DPPH (sigma, 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl, approx. 90%) 15.8mg을 에탄올 100ml에 넣고 30분간 교반하여 0.4 mM DPPH용액을 준비하고, 0.2M MES buffer pH6.0를 준비하여 두 용액을 각각 동일한 양을 혼합 후, 추가로 20% 에탄올 동량을 첨가하여 혼합 후 반응용액을 준비하여 실험에 사용하였다. 준비된 반응용액 0.9ml에 에탄올과 샘플의 혼합량 300㎕를 첨가하여 30분간 반응 후 517nm에서 파장을 측정하였다. 측정된 흡광도값을 아래의 식에 대입하여 DPPH의 산화저해력(DPPH radical scavening activity(%))을 구하여 비교하였다.

DPPH radical scavening activity(%)

대조구는 에탄올만 300㎕ 첨가한 값을 사용하였고, 실험구는 항균력 측정을 위해서 준비한 샘플 10가지를 사용하였다. 수용추출물보다 에탄올추출물의 항산화력이 더 높아서 에탄올 추출물은 수용추출물의 85.7%(v/v)를 사용하였다. 즉, 수용추출물은 210㎕, 에탄올추출물은 180㎕의 샘플량을 사용하였다.

수용추출물의 산화저해능(항산화)력 측정결과

	O.D	산화저해능 (%)
control	0.774	0
W- CO - NH	0.342	55.8
W- CO -H	0.375	51.6
W-E	0.314	59.4
W-F	0.378	51.2
W-G	0.313	59.6
W-H	0.337	59.5

에탄올추출물의 산화저해능(항산화)력 측정결과

	O.D	산화저해능(%) ¹ ⁾
control	0.774	0
E- CO - NH	0.344	64.5
E- CO -H	0.357	62.5
E-E	0.317	68.4
E-F	0.338	65.3
E-G	0.348	63.8
E-H	0.327	67.1

1)수용추출물의 첨가량 보정결과치임.(산화저해능×1.16 : 샘플양 보정수치)

HPLC를 이용한 배양조건별 추출물 내의 커큐민 함량 변화 측정

발효조건, 추출용매, 가열유무에 따른 커큐민의 함량 변화를 측정하였다. 표준물질은 sigma 사에서 판매하는 커큐민(Curcuma longa (Turmeric), powder, (E,E)-1,7-bis(4-Hydroxy-3methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione; Diferuloymethane; Diferulylmethane; Natural Yellow 3 C₂₁H₂₀O₆ FW 368.38)을 사용하였다. 컬럼은 Waters Sunfire C18 (4.6×150mm), 이동상은 100% 메탄올, 0.8ml/min의 flow rate로 UV 420 nm에서 detection 하였다. 용매는 메탄올을 사용하였다.

각각의 발효조건과 추출용매에 따른 분석결과는 상이하였으며, 수용성보다 에탄올에서 그리고 가열조건에서의 커큐민 추출을 더 용이하게 나타났으며, 효모를 종균으로 이용하였을 때 커큐민의 함량이 더 높게 분석되었다.

시험생산 (1)

본 발명에서 시제품 생산을 위한 조건은 멸균을 하지 않은 상황에서 유익한 균주가 일정 함량이상 존재하고, 강황과 캡사이신의 강한 향이 완화되어야 한다는 것이다. 개방형 발효구조에서 멸균은 큰 의미가 없을뿐더러 에너지의 소비가 높아 생산비가 높아지기 때문이다.

앞서 실시예 2에서 시행한 대량배양조건으로 효모를 종균으로 사용해서 만든 강황배양액을 준비하였고, 별도로 L. plantarum과 B. subtilis 배양하여 미강 100kg에 혼합하여 각 균주가 미강 g당 1×10¹⁰ CFU/g 함량으로 있게끔 준비하였다. 리본믹서기를 이용하여 강황발효액과 유익균이 있는 미강 100kg을 혼합하고, 건조기안에 넣고 45℃에서 저온숙성 건조하여 수분함량이 8%(w/w) 이하인 사료첨가용 시제품을 만들었다. 건조중에 90% 이상의 균이 사멸되지만 1×10⁷ CFU/g 이상의 균은 살아있으므로 제조성분등록된 기준에 적합한 제품을 생산할 수 있었다. 본 공정은 이미 알려진 선행기술과 중복되지 않으면서도 강황의 효과를 극대화 할 수 있는 제품을 생산할 수 있게 하는 것이다.

시험생산 (2)

실시예 6의 시험생산 1번 방법을 좀 더 보완하여 공정을 개선하였다. 멸균하지 않은 사과박 분쇄물 30리터를 미강 100kg에 넣고, 효모배양액 10리터를 추가로 첨가하고 수분함량이 40%(w/w) 정도 되게끔 물을 첨가한 다음 골고루 혼합하였다. 사과가공부산물이 효모에 의하여 발효되면 알코올발효를 거쳐 특유의 사과향미가 있는 초산발효를 하는데, 이 발효액은 가축에 기호성이 높아서 가축이 싫어하는 향이 있어도 사료를 섭취하게 하는 기능이 있다. 사과부산물과 미강을 함께 3일 이상 발효한 후, 강황과 캡사이신 혼합분말 2kg을 첨가한 다음, 5일이상 발효를 진행하여 강한 향을 줄여 주었다. 그리고 유산균, 바실러스 배양액을 첨가하여 혼합 후, 45℃에서 건조하여 또 다른 공정을 통한 시제품을 생산하였다.

이 시험생산 2 공정의 장점은 효모배양액을 많이 준비하지 않아도 되며, 강황 혼합 발효액을 준비하기 위한 기간이 작다는 것이다. 특히 에너지소비량이 월등히 적고 간편하여 유용한 생산방법이 될 것으로 판단되었고, 강황의 유용성분이 알코올발효에 의한 잘 추출되거나, 발효에 의해 더 증가되는 효과적인 생산방법이 되는 것이다.

사양시험 - 육계

충남 당진의 육계농장에서 실험을 진행하였다. 품종은 로스(ROSS)이었으며, 사료는 목우촌 청주사료를 사용하였다. 시험구 사육수는 14,420수 였으며, 사료톤당 2kg의 시제품을 혼합하여 급여하였다. 대조구는 20,600수 였고 사료외에 농장에서 자체 생산한 일반미생물 생균제제를 사료에 혼합하여 급여하였다. 총 사육일수는 34일이었다. 결론적으로 시험구가 폐사율이 대조구에 비해 7.5% ponit 낮은 2.2%가 나타났고, 사료요구율이 개선되고, 출하중량이 늘어나는 등 농가소득이 대조구에 비해 kg당 49원 더 증가하였다. 특히 사육 후반부 대조구는 호흡기 질환 발생으로 사육닭의 폐사가 증가하는 상황이었음에도 불구하고 바로 옆동의 시험구는 호흡기가 적고 폐사계도 거의 나타나지 않는 등 농가의 입장에서도 아주 소중한 실험이 되었었다.

육계 사양시험 결과표

	시험구	대조구	차이
입추수수	14,420	20,600	-6,180
출하수수	14,104	18,594	-4,490
사계수수	316	2,006
(폐사율)	2.2%	9.7%	-7.5
출하중량	21,430	26,020	-4,590
평균체중	1.519	1.399	0.120
육성율 (%)	100.7%	93.0%	7.8%
사료요구율	1.714	1.784	-0.07
사료성과급	42	14	28
육성율성과급	15	-6	21
합계	57	8	49

사양시험 - 양돈

양돈실험은 충남 당진 합덕의 한 농장에서 실시하였다. 6두의 시험구에 사료 톤당 1kg의 시제품을 급여하였다. 체중과 사료섭취량 (체중측정일에 pen 당 사료공급량에서 잔량을 빼서 측정함.), 사료요구율, 분변상태를 측정 하였다. 4주간 실험을 한 결과, 일당증체량과 사료섭취량, 사료요구율 등에서 통계적으로 유의적 차이을 나타내지는 않았지만, 증체량이 7%, 섭취량이 6%, 사료요구율이 1% 증가한 점을 고려할 때, 농가 사육능 개선가능성이 있음을 기대할 수 있었다. 분변도 정상적인 분변상태를 유지하였으며, 대조구와 큰 차이는 없었다.

양돈 사양시험기간 중 사육두의 평균 체충 측정표

기간	시험구(kg)	대조구(kg)
0	7.3	7.3
1	9.3	9.2
2	12.0	11.9
3	15.2	15.0
4	20.4	19.5

양돈 사양시험기간 중 사육두의 평균 분변 상태 측정표

기간	시험구(kg)	대조구(kg)
0	3.3	3.0
1	3.8	3.2
2	3.0	3.5
3	3.5	3.5
4	3.4	3.5

본 특허출원은 중소기업청에서 지원하는 2011년도 산학연공동기술개발사업(No.46506)의 연구수행으로 인한 결과물임을 밝힙니다.

Claims

효모 Saccharomyces cerevisiae 배양액에, 분쇄하였지만 멸균하지 않은 사과가공부산물이 20%(v/v)가 되도록 첨가하여 5일간 배양한 다음, 강황 40%(w/w)와 캡사이신 20%(w/w)가 함유된 혼합분말 5%(w/v)를 추가로 첨가하여 7일간 배양한 발효물을 미강 100kg에 혼합하고 건조하여 생산하는 것을 특징으로 하는 기능성 사료첨가제의 생산 방법.
미강 100kg에 분쇄하였지만 멸균하지 않은 사과가공부산물 30리터를 넣고, 효모 Saccharomyces cerevisiae 배양액 10리터를 추가로 첨가하여 3일간 발효한 후, 강황 40%(w/w)와 캡사이신 20%(w/w)가 함유된 혼합분말 2kg을 첨가하고 5일간 발효를 진행 다음, 건조하여 생산하는 것을 특징으로 하는 기능성 사료첨가제의 생산방법.