KR101328620B1 - 신생혈관생성 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진세노사이드 Rg3가 함유된 신생혈관생성 억제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1 : vascular endothelial growth factor receptor-1)의 활성 저해 및 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 in vivo 레벨(level)을 낮추어줌으로써 우수한 신생혈관생성(angiogenesis) 억제활성과 이에 따른 종양 성장 억제활성을 갖는 20(S)-진세노사이드 Rg3가 40 내지 60 %(w/w) 함유된 조성물에 관한 것이다.
혈관 내피세포 성장인자, 신생혈관생성 억제, 20(S)-진세노사이드 Rg3
Description
도 1은 20(S)-진세노사이드 Rg3가 50%(w/w) 함유된 조성물의 고압 액체 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 20(S)-진세노사이드 Rg3를 함유한 조성물의 in vivo 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 억제 작용을 나타낸 것이다.
도 3은 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 50 %(w/w)인 조성물의 비소세포폐암에 대한 in vivo 혈관생성 억제 작용을 나타낸 것이다.
도 4는 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물의 비소세포폐암에 대한 in vivo 종양 성장 억제 실험 최종일의 종양 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 진세노사이드 Rg3가 함유된 신생혈관생성 억제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1 : vascular endothelial growth factor receptor-1)의 활성 저해 및 혈관 내피세포 성장인 자(VEGF)의 in vivo 레벨(level)을 낮추어줌으로써 우수한 신생혈관생성(angiogenesis) 억제활성과 이에 따른 종양 성장 억제활성을 갖는 20(S)-진세노사이드 Rg3가 40 내지 60 %(w/w) 함유된 조성물에 관한 것이다.
최근 인구의 노령화, 흡연율 증가, 식생활의 변화, 운동 부족 등으로 암의 발병이 증가하고 있고, 이를 치료하기 위한 항암제의 개발이 활발히 진행되고 있다. 지금까지 개발된 항암제들은 대부분 그 효과와 함께 정상 세포 파괴에 따른 독성, 항암제에 대한 내성 발생 및 재발 등의 문제점을 갖고 있어 새로운 기전을 바탕으로 한 항암제가 요구되어지고 있다. 따라서, 암의 발병원인과 진행과정의 원인을 밝혀 보다 근본적인 해결책을 제시하려는 노력이 진행되고 왔고, 1971년 J. Folkman에 의해 종양의 성장 및 전이를 막기 위하여 신생혈관생성 억제제(anti-angiogenic agent)가 새로운 대안으로 제시 되었다[Folkman 등, N. Engl. J. Med., 285, p1182, 1971].
신생혈관생성(Angiogenesis)이란 기존의 혈관에서부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 의미하며, 종양의 성장과 전이(metastasis), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 건선(psoriasis), 만성 염증(chronic inflammation), 궤양(ulcer)과 같은 다양한 질환의 원인이 되고 있다[Carmeliet 등, Nature, 407, p249, 2000]. 특히, 암과 같은 과도한 신생혈관생성이 일어나는 경우는, 이러한 신생혈관생성을 억제하는 것만으로도 종양의 성장과 전이를 효과적으로 억제할 수 있다[Garcea 등, European Journal of Cancer 40, p1302, 2004].
신생혈관생성 억제를 통하여 항암제를 개발하기 위한 타깃으로 혈관 내피세 포 성장인자(VEGF), 혈관 내피세포 성장인자 수용체(VEGFR : vascular endothelial growth factor receptor), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF : basic fibroblast growth factor), 전환 성장인자 알파 및 베타(TGF-α, -β), 표피 성장인자(EGF : epidermal growth factor), 혈소판 유래 성장인자(PDGF : platelet-derived growth factor)등을 들 수 있다[Presta 등, Cytokine Growth Factor Rev 16, p159, 2005; Hoeben 등, Phamacol Rev 56, p549, 2004; Shannon 등, Clin Colorector Cancer 4, S74, 2004].
신생혈관생성 억제를 기전으로 하는 항암제의 선두주자로는 아바스틴이 있으며, 이는 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody)로서 전이성 대장직장암 환자에 5-플루오로우라실(5-FU: 5-Fluorouracil)을 포함한 화학요법제와 병용 투여하여 쓰이는 1차약으로 2004년 2월 혈관 생성 억제제로서는 첫 번째로 미국 식품의약청(FDA : Food and Drug Administration)에서 승인[Hurwitz 등, Clin Colorector Cancer 4, S62, 2004] 받았고, 비소세포 폐암 및 유방암에 대한 적응증 추가를 위하여 임상 시험 및 승인을 받기위한 과정이 진행 중에 있다[Miller 등, Clin Breast Cancer 3, 421, 2003; Lynch 등, Lung Cancer 50, S25, 2005]. 뒤를 이어 바이엘(bayer)과 오닉스(onyx)가 공동 개발한 경구용 표적 항암제 넥사바(Nexavar) 역시 2005년 신장암에 대하여 승인을 받았고, 화이자(Pfizer)의 SU11248은 진행성 신장암과 위장관기저암 (GIST)에 대해 1차약으로 2006년 1월 승인 받아 수텐트(sutent) 라는 제품명으로 팔리고 있으며, 이외에도 노바티스(Novartis)의 PTK787/ZK222584 등 많은 신생혈관생성 억제제들이 임상 중에 있다[Kim, Biochem. Mol. Biol. News, 12, p263, 2005; Thomas 등, Semin Oncol 30, p32, 2003].
인삼 및 홍삼은 여러 가지 약리작용이 알려져 왔으며, 그 중 항암활성을 나타내는 주요 성분으로는 진세노사이드(ginsenoside)가 대표적이다. 특히, 진세노사이드 Rg3(C42H72O13 : 785.03)는 홍삼의 특징적인 사포닌 중 하나로서, 진세노사이드 Rg3가 홍삼 중에 극미량[20(S)-진세노사이드 Rg3(0.006%), 20(R)-진세노사이드 Rg3(0.014%)]이 함유된 것은 홍삼을 제조하는 과정에 수삼에 함유된 프록토파낙사다이올(Protopanaxadiol)계 사포닌들이 열분해되여 생성되는 것으로 추정된다[Kitagawa 등, The Ginseng Review, Vol 1, p21, 1983].
1980년 Kaku 등이 홍삼으로부터 20(R)-진세노사이드 Rg3을 분리하여 구조를 확립 한 이래[Kaku 등, Arzneim. Forsch. Drug Res. 30, 936-943, 1980], 항암 및 암 전이 억제, 혈관 이완 작용 및 항암제의 내성 억제 작용 등에 대한 활성이 보고 되었다[Back 등, Arch. Pharm. Res., 18, p164, 1995; Hasegawa 등, Planta Med., 61, p409, 1995; Mochizuki 등, Biol. Pharm. Bull., 18, p1197 , 1995; Ginseng Res., 25, p107, 2001; Shinkai 등, Jpn. J. Cancer Res., 87, p357, 1996; Tao 등, Chin. J. Surg., 40, p606, 2002; Tao 등, Chin. J. Surg., 40, p606, 2002].
Mochizuki 등은 진세노사이드 Rg3가 암세포의 부착(adhesion), 침투(invasion) 및 신생혈관생성(angiogenesis)을 저해함으로써 암전이를 억제한다고 보고 하였고[Mochizuki 등, Biol. Pharm. Bull., 18, p1197, 1995], 20(R)-진세노사이드 Rg3 의 신생혈관생성 억제작용은 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 억제에 기인한다는 보고가 있다[Zhang 등, Biochem Biophys. Res. Commun., 342, p824, 2006; Chen 등, Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 37, p60, 2006; Chen 등, Zhongguo zhong Yao Za Zhi, 30, p357, 2005; Pan 등, Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi, 37, p227, 2002].
상기 언급한 바와 같이, 진세노사이드 Rg3의 신생혈관생성 억제 및 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 관련한 억제활성이 여러 문헌에서 보고된 바 있으나 모두 20(S)-진세노사이드 Rg3의 이성질체인 20(R)-진세노사이드 Rg3에 관한 것이거나, 진세노사이드 Rg3의 탄소 20번 위치의 광학활성에 대한 구분["S"형와 "R" 형]이 불분명하였다. 또한, 본 연구자들은 진세노사이드 Rg3의 입체이성질체 관계인 20(S)-진세노사이드 Rg3와 20(R)-진세노사이드 Rg3가 암 전이 억제 활성에 있어 차이를 보임을 확인[특허출원번호 2005-53631, 에스케이케미칼 주식회사]하였기에, 20(S)-진세노사이드 Rg3 및 이를 함유하는 조성물의 신생혈관생성 억제활성과 이를 통한 항암활성을 규명하는 것이 의미가 있다고 판단되어 본 실험을 진행하였다.
이에, 본 발명자들은 본 실험을 통하여, 혈관내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 길항작용이 있다고 보고된 20(R)-진세노사이드 Rg3 보다 20(S)-진세노사이드 Rg3가 우수한 억제 활성을 갖는다는 점을 확인하였고, 더욱 자세하게는 20(S)-진세노사이드 Rg3를 40 내지 60 %(w/w) 함유한 조성물이 20(S)-진세노사이드 Rg3 또는 20(R)-진세노사이드 Rg3을 단독으로 투여하였을 때 보다 우수한 신생혈관생성 억제 효과를 나타낸다는 사실을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 지속적으로 복용함으로써 암을 예방하거나 치료할 수 있는, 상기 우수한 신생혈관생성 억제 효과를 나타내는 20(S)-진세노사이드 Rg3를 40 내지 60 %(w/w) 함유한 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 20(S)-진세노사이드 Rg3을 40 내지 60 %(w/w) 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명에서 추출 대상이 되는 인삼은 파낙스 속 식물, 예를 들면, 파낙스 진생(Panax ginseng), 파낙스 노토진생(Panax notoginseng), 파낙스 퀸크폴리움(Panax quinquefolium), 파낙스 야포니쿠스(Panax japonicus) 등이나 또는 이들 식물의 조직 배양물을 의미한다.
본 발명에 따르는 활성 조성물로서 20(S)-진세노사이드 Rg3를 함유하는, 더욱 상세하게는 20(S)-진세노사이드 Rg3으로서 40 내지 60 %(w/w)를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물은 우수한 신생혈관생성 억제효과를 통하여 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 대한 인체 내로의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 암의 진행상태 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로는 성인에게 합계량으로, 1일 1 내지 1000 mg 투여토록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 식품 또는 의약품으로 제조하여 상기 1일 복용량에 맞추어 1일 1회 내지 2회 정도로 분할하여 복용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법으로 드링크제, 정제, 환제 또는 캡슐제의 형태로 제조하여 경구 복용할 수 있으며 또는 주사제로 제조하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물을 함유하는 의약 조성물의 제형을 제조함에 있어서, 조성물을 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하거나 이들로 희석하여 제조된 조성물을 캅셀 및 기타 용기의 형태의 담체 등에 봉입시키는 것이 바람직하다. 이러한 제형들은, 예를 들어, 정제, 환제, 과립제, 분말, 엘릭실제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 특히, 경구투여용 제제로 제형화된 형태가 바람직하다. 또한, 경구 투여 시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구 투여용 고형 제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도 있 다.
한편, 본 발명의 조성물을 포함하는 것으로써 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하지는 않으며, 통상적인 기능성 식품 또는 건강 보조식품까지도 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
본 발명에 따르는 조성물의 활성성분인 20(S)-진세노사이드 Rg3가 40 내지 60 %(w/w)로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물을 조제하여 복용할 경우 그 효과가 우수할 뿐 만 아니라, 부작용이 없이 안전하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 파낙사다이올계와 트리올계의 사포닌 분획 분리
미삼 1 kg을 80 ℃로 5시간동안 70% 메탄올 7 L로 2회 추출하여 농축한 추출물을 고형분 함량 25%가 되도록 물에 현탁시켰다. 수산화나트륨 50 g을 가하여 알칼리화시킨 후 수포화 부탄올 1.2L로 4회 추출함으로 인해 파낙사트리올계의 사포닌을 39.6 g 수득하였다. 추출 후 남은 수층에 18% 염산을 180 ml 교반 투입하여 중화 후 수포화 부탄올 1.4 L로 3회 추출함으로 인해 파낙사다이올계의 사포닌을 46.3 g 수득하였다.
실시예 2: 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 분획 제조
상기 실시예 1에서 얻어지는 진세노사이드 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 파낙사다이올계의 사포닌을 2.4L의 물에 완전 용해 후 70 ℃에서 36시간 동안 젖산 23 g을 첨가하여 교반 반응시켰다. 수산화나트륨 20 g을 가하여 중화시킨 후 수포화 부탄올 1.4 L로 2회 추출하여 감압 하에 농축함으로써 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌을 27 g 수득하였다.
실시예 3: 20(R)-진세노사이드 Rg3 제조
상기 실시예 2에서 얻어지는 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 20 g을 메탄올 또는 에탄올 380 ml을 가한 후 2시간 동안 80 ℃에서 환류 반응 시 흰색 분말의 난용성 물질인 20(R)-진세노사이드 Rg3 4 g을 수득하였다. 수득한 20(R)-진세노사이드 Rg3은 문헌[약학회지 제 35권 5호, p432, 1991]에 공지된 것과 일치하는 13C-NMR 스펙트럼 및 질량 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 4: 20(S)-진세노사이드 Rg3 제조 및 다양한 비율의 20(S)-진세노사이드 Rg3을 함유한 분획물의 제조
상기 실시예 3에서 20(R)-진세노사이드를 수득하고 남은 여과물의 용매를 감압 농축하여 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 15 g을 얻었다. 이 산 분해 가공물을 클로로포름/메탄올/물(14:2:0.1 ~ 12:3:0.3)의 농도 구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용하여 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토크래피를 수행하여 목적하는 비율의 20(S)-진세노사이드 Rg3 분획물을 수득하였다. 각 조성물의 대표도면으로써 20(S)-진세노사이드 Rg3가 50% 존재하는 첨부도면을 도 1에 명기하였다.
함유 비율 중 얻어진 20(S)-진세노사이드 Rg3 함량이 80 %(w/w) 이상인 분획물을 세미분취용 칼럼(250*20 mm, YMC-ODS H80, s-4 um/ 용출액 = 43% 시안화메틸)을 이용한 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여 순수한 20(S)-진세노사이드 Rg3 500 mg을 얻었다. 수득한 20(S)-진세노사이드 Rg3은 실시예 3에서 얻어지는 20(R)-진세노사이드 Rg3과 함께 문헌[약학회지 제 35권 5호, p432, 1991]에 공지된 것과 일치하는 13C-NMR 스펙트럼 및 질량 스펙트럼을 나타내었다.
실험예 1: 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량비를 달리한 조성물의
in vitro
혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1) 활성 억제 작용
신생혈관 생성에 대한 우수한 억제활성을 갖는 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함유 조성물을 선별하고자, 상기 실시예 4에서 명기한 바와 같이 컬럼 크로마토그래피를 통하여 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량별 조성물을 제조하였다.
제조된 20(S)-진세노사이드 Rg3 함량별 조성물에 대하여 신생혈관 생성에 중요한 역할을 하는 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1)에 대한 억제 활성을 비교하기위해 다음 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 사람의 재조합형 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1)을 발현시킨 곤충 세포 sf21을 사용하였다. 20(S)-진세노사이드 Rg3가 각각 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 %(w/w) 함유된 조성물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 5 ㎍/ml의 농도로 녹인 후 0.2 ㎍/ml의 효소와 함께 pH 7.4의 HEPES 완충액에서 15분 동안 37˚C 인큐베이터를 사용하여 전배양(preincubation)하였다. 그 후 0.2 mg/ml의 poly(Glu:Tyr), 10 μM의 ATP 그리고 0.25 μCi [γ32 P]ATP를 첨가하여 반응을 시작하여 30분간 배양하였고, 30분 후 3%의 H3PO4를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응물을 제거한 후 [γ32 P]poly(Glu:Tyr)가 형성된 양을 측정하여 각 조성물의 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1)에 대한 활성 억제 정도를 판단하였다.
혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1)에 대한 활성 억제 정도(Inhibition rate, %)는 음성대조군인 1% 디메틸설폭사이드에 대한 각 시료별 [32 P]poly(Glu:Tyr)가 형성된 양의 비로 나타내었다[표 1 참조]. (각 값은 2 웰의 평균임).
20(S)-진세노사이드 Rg3 함량(%) | 0 % (w/w) |
20 % (w/w) |
40 % (w/w) |
50% (w/w) |
60 % (w/w) |
80 % (w/w) |
100% (w/w) |
VEGFR-1 | 7 | 5 | 18 | 22 | 19.8 | 8 | 9 |
상기 실험 결과, 20(S)-진세노사이드 Rg3를 40 내지 60%(w/w) 함유한 조성물들이 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1에 대한 우수한 억제 활성을 나타냄을 확인하였고, 그 중 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물이 가장 강력한 억제활성(22%)을 나타내었다.
실험예 2: 20(S)-진세노사이드 Rg3를 함유한 조성물의
in vivo
혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 억제 작용
상기 실험예 1에서 20(S)-진세노사이드 Rg3를 함유한 조성물이 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1)의 활성을 억제함을 확인하였다. 이와 함께, 본 연구자들은 20(S)-진세노사이드 Rg3 함량별 조성물과 20(S)-진세노사이드 Rg3의 이성질체인 20(R)-진세노사이드 Rg3의 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 in vivo 억제 활성을 비교하기 위해 다음 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 세포는 마우스 고 전이성 피부암세포인 B16F10 메라노마이며 동물은 특정병원균 부재 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험군은 0.5 % 카르복시메틸셀룰로오즈를 부형제로 하여 각 시료의 용량이 10 mg/kg가 되도록 약물을 제조하였다.
B16F10 메라노마 세포를 10 % 우태아혈청(FBS : Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM 세포배지에서 배양한 후 트립신-EDTA를 이용하여 분리하였다. 그 후 PBS로 희석하여 5 X 105 cells/mouse의 농도가 되도록 특정병원균 부재 암컷 C57BL/6 마우스의 견갑부에 피하주사로 0.2 ml씩 주사하였다. 약물 투여는 마우스 군당 10마리씩 세포 이식 다음날부터 시작하여 총 7일간 마우스 몸무게 1 kg 당 10 ml가 되도록 매일 경구 투여하였으며 약물의 독성 정도는 몸무게 변화를 통하여 판단하였다. 투여 종료 후 종양을 20~30 mg 정도로 잘라서 용해시킨 후 보정하여 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 억제활성을 보기위하여 ELISA 키트의 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2.5 시간동안 반응시켰다. 플레이트를 세척 후 바이오틴이 부착된 항체(biotinylated antibody)를 100 ㎕씩 넣고 1 시간동안 반응시켰다. 다시 플레이트를 씻어준 후 HRP-Streptavidin을 100 ㎕씩 넣고 45분간 반응시킨 다음 플레이트를 씻어준 후 기질 반응액을 넣고 10분간 반응시켰다. 정지액으로 반응을 멈춘 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 내피세포 성장인자(VEGF)의 in vivo 레벨을 관찰하였다.
혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 억제 활성정도(inhibition rate, %)는 음성 대조군인 0.5 % 카르복시메틸셀룰로오즈를 투여하였을 때의 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 활성에 대한 각 시료 별 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 활성비로 표시하였다[표 2, 도 2 참조]. (각 값은 마우스 10마리의 평균임)
20(S)-진세노사이드 Rg3 함량 (%) | 0 %(w/w) | 50 %(w/w) | 100 %(w/w) | 20(R)-Rg3 |
B16F10 | -3.4 | 41 | 26 | 10 |
- 100 %(w/w): 20(S)-진세노사이드 Rg3 - 20(R)-Rg3 : 20(R)-진세노사이드 Rg3 |
상기 표 2에서 보는바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rg3가 이성질체 관계인 20(R)-진세노사이드 Rg3 보다 약 2.6배가량 강력한 저해활성을 나타내었고, 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물이 41%로서 가장 강력한 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3: 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 50 %(w/w)인 조성물의 메라노마 세포주에 대한
in vivo
혈관생성 억제 작용
상기 실험예 1 및 2에서 혈관 내피세포 성장인자 수용체-1(VEGFR-1) 활성 억제 및 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 억제 효과가 가장 우수했던 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물과 이의 주성분인 20(S)-진세노사이드 Rg3의 신생혈관 생성 억제 활성을 in vivo 상에서 비교하기 위해 다음 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 세포는 B16F10 메라노마이며 동물은 특정병원균 부재 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험군은 0.5 % 카르복시메틸셀룰로오즈를 부형제로 하여 20(S)-진세노사이드 Rg3 단독 및 이를 50 %(w/w) 함유한 조성물의 용량이 10 mg/kg가 되도록 약물을 제조하였고 음성 대조군으로는 부형제를 단독으로 투여하였다.
B16F10 메라노마 세포를 10 % 우태아혈청(FBS : Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM 세포배지에서 배양한 후 트립신-EDTA를 이용하여 분리하였다. 그 후 PBS로 희석하여 5 X 105 cells/mouse의 농도가 되도록 특정병원균 부재 암컷 C57BL/6 마우스의 견갑부에 피하주사로 0.2 ml씩 주사하였다. 마우스는 군당 8마리씩 배치하였다. 약물 투여는 세포 이식 다음날부터 시작하였으며 총 6일간 마우스 몸무게 1 kg 당 10 ml이 되도록 매일 경구 투여하였다. 몸무게 측정은 매일 하였으며 이를 통해 약물의 독성 정도를 판단하였다. 투여 종료 후 마우스 피부를 분리하여 디지털 카메라로 사진 촬영을 한 후 암괴 주위에 형성된 혈관의 수를 육안으로 계수하였다. 실험의 통계학적 유의성은 Student's t-TEST로 검정하였다.
상기의 실험방법으로 실험하였을 때 음성 대조군인 0.5 % 카르복시메틸셀룰로오즈를 투여하였을 때의 혈관의 개수에 대한 각 시료군의 혈관의 개수의 비를 혈관 생성 억제 정도(inhibition rate, %)로 표시하였으며, 이를 다음 표 3에 나타내었다. (각 값은 마우스 8마리의 혈관 개수의 평균임)
구 분 | 20(S)-진세노사이드 Rg3 | 20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물 |
B16F10 | 23.6*** | 37.1*** |
(*** p<0.001) |
상기 실험 결과, 20(S)-진세노사이드 Rg3 단독 및 이를 50 %(w/w) 함유한 조성물 모두 높은 억제활성을 나타내었다. 특히, 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50%(w/w) 함유한 조성물이 보다 우수한 신생혈관억제 활성을 나타낸 바, 실험예 1과 2에서의 결과와 같이 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)에 대한 길항작용이 본 억제활성의 주요 기전임을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 50 %(w/w)인 조성물의 비소세포폐암에 대한
in vivo
혈관 생성 억제 작용
실험예 3에서 B16F10 메라노마에 대하여 우수한 억제 활성을 보였던 20(S)-진세노사이드 Rg3와 이를 50 %(w/w) 함유한 조성물의 혈관 생성 억제 활성을 인체유래 세포주상에서 비교하기 위해 다음 실험을 실시하였다. 인체유래 비소세포폐암 세포주인 NCI-H460을 사용하였으며 동물은 특정 병원균 부재 암컷 BALB/c 누드마우스를 사용하였다. 실험군은 0.5 % 카르복시메틸셀룰로오즈를 부형제로 하여 20(S)-진세노사이드 Rg3의 최고 용량을 10 mg/kg로 하여 제조하였으며, 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 5 mg/kg까지 최고 용량을 희석하여 사용하였다. 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물은 최고 용량을 40 mg/kg로 하여 제조하였으며, 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 5 mg/kg까지 최고 용량을 희석하여 사용하였다. 음성 대조군으로는 부형제를 단독으로 투여하였다.
NCI-H460 세포를 10 % 우태아혈청(FBS : Fetal Bovine Serum)을 포함하는 RPMI1640 세포배지에 배양한 후 트립신-EDTA를 이용하여 분리하였다. 그 후 PBS로 희석하여 9 X 106 cells/mouse의 농도가 되도록 특정병원균 부재 암컷 BALB/c 누드마우스의 견갑부에 피하주사로 0.3 ml씩 주사하였다. 마우스는 군당 6마리씩 배치하였다. 약물 투여는 세포 이식 다음날부터 시작하여 마우스 몸무게 1 kg 당 10 ml이 되도록 총 14일간 매일 경구 투여하였으며, 매일 몸무게 측정을 통해 약물의 독성 정도를 판단하였다. 약물 투여가 끝난 후 종양을 분리하여 10% 중성 포르말린에 고정시켜 조직 블록을 제작하였다. 제작된 조직을 초박절편기를 이용하여 5 ㎛로 박절하여 조직표본을 제작한 후 CD31에 대한 면역 염색방법을 실시하여 조직염색 표본을 제작하였다. 광학현미경을 사용하여 면역 염색을 실시한 조직염색 표본의 5곳을 선정하여 현미경에 보이는 혈관의 개수를 계수한 후 평균을 산출하였다. 실험의 통계학적 유의성은 Student's t-TEST로 검정하였다.
신생혈관생성 억제 정도(inhibition rate, %)는 음성 대조군인 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈를 투여하였을 때의 혈관의 개수에 비해 20(S)-진세노사이드 Rg3 단독 및 이를 50%(w/w) 함유한 조성물을 농도별로 투여하였을 때의 혈관의 개수의 비를 측정하였으며, 그 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었다. (각 값은 마우스 6마리의 혈관 개수의 평균임)
구 분 | 20(S)-진세노사이드 Rg3 | 20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물 |
5 mg/kg | 23.8*** | 18.4*** |
10 mg/kg | 24.8*** | 30.3*** |
20 mg/kg | - | 35.9*** |
40 mg/kg | - | 38.9*** |
(*** p<0.001) |
상기 실험 결과, 인체유래 비소세포폐암 세포주인 NCI-H460에 대하여 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50%(w/w) 함유한 조성물은 10 mg/kg 투여용량에서 20(S)-진세노사이드 Rg3 단독 대비 동등 이상의 활성을 나타내었다.
실험예 5: 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 50 %(w/w)인 조성물의 비소세포폐암에 대한
in vivo
종양 성장 억제 작용
실험예 4에서 농도의존성을 보였던 20(S)-진세노사이드 Rg3 50%(w/w) 함유 조성물의 5와 10 mg/kg 농도에서의 in vivo 종양성장 억제 효과를 측정하고자 다음과 같은 실험을 실시하였다.
실험에 사용한 세포는 인체유래 비소세포폐암 세포주인 NCI-H460이며 동물은 특정병원균 부재 암컷 BALB/c 누드마우스를 사용하였고 양성 대조군으로는 독시플루리딘(Doxifluridine, 40 mg/kg)을 사용하였다. 실험군은 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈를 부형제로 하여 20(S)-진세노사이드 Rg3의 농도를 5 mg/kg로 하여 제조하였다. 또한, 20(S)-진세노사이드 Rg3를 50 %(w/w) 함유한 조성물은 최고 용량을 10 mg/kg로 하여 제조하였으며, 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 5 mg/kg까지 최고 용량을 희석하여 사용하였다. 음성 대조군으로는 부형제를 단독으로 투여하였다.
NCI-H460 세포를 10 % 우태아혈청(FBS : Fetal Bovine Serum)을 포함하는 RPMI1640 세포배지에 배양한 후 트립신-EDTA를 이용하여 분리하였다. 그 후 PBS로 희석하여 9 X 106 cells/mouse의 농도가 되도록 특정병원균 부재 암컷 BALB/c 누드마우스의 견갑부에 피하주사로 0.3 ml씩 주사하였다. 마우스는 군당 6마리씩 배치하였다. 약물 투여는 세포 이식 다음날부터 시작하여 총 2주간 마우스 몸무게 1 kg 당 10 ml이 되도록 매일 경구 투여하였다.
종양의 부피(TV : Tumor Volume)는 주 3회 캘리퍼스를 이용하여 장축(mm) × 단축(mm)2 × 0.5의 식을 사용하여 평가하였으며, 투여 종료 후 마우스를 방혈치사하여 종양을 분리한 후 측정하였다. 몸무게 측정은 매일 하였으며 이를 통해 약물의 독성 정도를 판단하였고, 실험의 통계학적 유의성은 Student's t-TEST로 검정하였다.
종양 성장 억제 정도(inhibition rate, %)는 음성 대조군인 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈를 투여하였을 때의 종양의 부피에 대한 각 시료군별 종양 부피의 비로 표시하였으며, 이를 다음 표 5와 도 5에 나타내었다. (각 값은 마우스 6마리의 평균임)
구 분 | 20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유된 조성물 |
독시플루리딘 |
5 mg/kg | 21.0* | - |
10 mg/kg | 39.2** | - |
40 mg/kg | - | 18.3 |
(* p<0.05, ** p<0.01) |
상기 실험 결과, 인체 유래 비소세포폐암 세포주인 NCI-H460에 대해 20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물은 양성 대조군인 독시플루리딘(Doxifluridine) 대비 동등 이상의 억제활성을 보였고, 특히 10mg/kg 의 농도에서는 2배 이상의 종양 성장억제 활성을 나타내었다. 실험물질의 투여와 관련된 독성은 관찰되지 않았다.
상기 실험예들을 통하여, 본 발명자들은 20(S)-진세노사이드 Rg3 및 이를 함유하고 있는 조성물들이 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 관련 길항작용을 통한 신생혈관생성 억제 작용 및 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하였다.
실험예
6: 20(S)-
진세노사이드
Rg3
50 %(w/w) 함유 조성물의 SD
랫드에서의
독성 실험
20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물의 독성 정도를 평가하기 위하여 다음 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 동물은 SD (Sprague-Dawley) 계통의 특정병원균 부재 랫드이며 군당 암수 5 마리씩 배치하였다. SK304G는 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스를 부형제로 하여 약물을 제조하였으며 최고 용량은 예비 실험 결과를 본 후 2000 mg/kg 로 제조하였으며 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 1000 mg/kg 까지 최고 용량을 희석하여 사용하였고 랫드 한 마리당 20 mg/kg 용량으로 1회 경구 투여하였다. 그 후 모든 동물에 대하여 투여 당일에는 투여 직후 및 이후 6 시간까지는 매시간, 그 이후는 매일 1회 이상 투여 후 14일까지 이상 증상관찰을 실시하였다. 몸무게 측정은 투여 전, 투여 후 1, 3, 7 및 14 일에 하였으며 투여 14일 후 모든 생존동물을 에테르를 이용하여 마취시킨 후 개복하여 후대동맥을 절단하는 방법으로 방혈 치사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 만약 투여 후 1일 이후에 사망 동물이 발생 시 육안적 이상 장기의 조직은 10 % 중성 포르말린액에 고정하고 필요한 경우에 병리 조직검사를 실시하기로 하였다. 실험의 통계학적 유의성은 SPSS 10.1을 이용한 일원배치 분산분석으로 검정하였다.
상기 실험 결과 암수 SD 랫드에 SK304G를 투여한 모든 실험군에서 사망동물 및 아무런 이상 증상이 관찰되지 않아 SK304G의 최소치사량 (MLD : Minimal Lethal Dose, 죽음을 초래하는 한계 최소량)은 2000 mg/kg 이상인 것으로 판단하였다.
제제예 1: 분말 및 캅셀제의 제조
20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물 100 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 결정성 셀룰로오스 3 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 No.5 젤라틴 캅셀에 채웠다.
제제예 2: 연고제의 제조
20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물를 이용하여 다음과 같은 조성으로 연고제를 제조하였다.
[조성]
유효성분 5 g, 세틸팔미테이트 20 g, 세탄올 40 g, 스테아릴알코올 40 g, 미리스탄이소프로필 80 g, 모노스테아린산 소르비탄 20 g, 폴리솔베이트 60 g, 파라옥시안식향산 프로필 1 g, 파라옥시안식향산 메틸 1 g, 인산 및 정제수 적량
제제예 3: 주사제의 제조
20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물을 이용하여 다음과 같은 조성으로 주사제를 제조하였다.
[조성]
유효성분 100 mg, 만니톨 180 mg, 인산일수소나트륨 25 mg, 주사용 정제수 2974 mg
제제예 4: 건강식품의 제조
1일 복용 기준으로 20(S)-진세노사이드 Rg3 50 %(w/w) 함유 조성물 0.3 g, 분말비타민 E, 젖산철, 산화아연, 니코틴산 아미드, 비타민 A, 비타민 B1 및 비타민 B2를 혼합하여 제조하였다.
상기 건강식품의 구성성분은 다음과 같다(사람 1일복용량 기준).
유효성분 300 mg
인삼 추출물 100 mg
녹차 추출물 100 mg
비타민 C 100 mg
분말비타민 E 120 mg
젖산철 2 mg
산화아연 2 mg
니코틴산아미드 20 mg
비타민 A 5 mg
비타민 B1 2 mg
비타민 B2 2 mg
옥수수전분 200 mg
스테아린산 마그네슘 20 mg
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따르는 조성물은 진세노사이드 Rg3 단독에 비해 우수한 신생혈관생성 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 부작용도 없어 암 예방 및 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
Claims (4)
- 인삼 추출물로서의 20-(S)-진세노사이드 Rg3을 함유하는 혼합물 중에, 20-(S)-진세노사이드 Rg3가 40 내지 60 %(w/w)로 함유된 것을 특징으로 하는 신생혈관생성 억제에 의한 암 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 암은 피부암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 및 경구투여용 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물의 1일 투여량이 성인에게 합계량으로 1000 mg이하로서 10-40mg/kg임을 특징으로 하는 조성물.
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