TW200812602A - Anti-angiogenic composition - Google Patents

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200812602 九、發明說明： 【發明所屬之^技彳奸領域】 發明領域 本發明係關於一包含人摹皂苷Rg3之抗血管生成組成 5物。特定地，本發明係關於一包含濃度為40至6〇%(w/v)之 20(S)-人蔘皂苷Rg3之抗血管生成組成物，其中該2〇〇人 蔘皂普Rg3之濃度藉由抑制血管内皮生長因子受體 -l(VEGFR-l)之活性及降 >(氏活體内血管内皮生長因子 (VEGF)之位準而具有針對血管生成（angi〇genesis)及腫瘤生 10 長優異的抑制活性。

【冬好;J 發明背景 由於高齡人口、抽煙人口的比例的增加，飲食習慣的 15改變，缺乏運動等因素使得癌症的發生率有成長的情形， 且因此已有各種企圖於發展一用於治療癌症的抗癌藥劑。 然而，大部份目前已發展出之抗癌藥劑具有如對正常細胞 之毒性、藥物抗性及復發的風險等缺點，且因此，仍有發 展一和先前已存在之抗癌藥物具有不同之機制之創新抗癌 2〇藥劑的需求。因此，已執行大規模的研究而發現癌症發病 的原因及病程，且建議更多對於癌症治療之根本的解決之 道。在此方面，J· Folkman在1971年建議一抗血管生成藥劑 作為用於預防腫瘤生長及轉移之一新式替代之解決方案 [Folkman等人，N· Engi· Λ MM·，285, pi 182, 1971]。 5 200812602 血管生成係一涉及由已經存在之管體生成新血管 的生理過程，且其亦被相信為許多種疾病之原因，如：腫 瘤生長及轉移、糖尿病性視網膜病變、牛皮癣、慢性發炎 及潰瘍[Carmeliet等人，加re，407, p249, 2000]。特定地， 5被報導出來的是，對於像是癌症這樣發生過度血管生成的 1*月形’其可能只藉由抑制這樣的血管生成而預防腫瘤的生 長及轉移[Garcea等人，五狀叩⑽j⑽厂似/冰40， pl302, 2004] 〇 用於經由抑制企管生成而發展一抗癌藥劑之標的的代 10表性實例包括血管内皮生長因子(VEGF)、血管内皮生長因 子受體(VEGFR)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、轉化 生長因子-α及-点（TGF-α及-β)、表皮細胞生長因子(EGF)、 血小板衍生生長因子（PDGF)等等[presta等人，c卿h•狀 Growi/l Fflcior 及⑼ 16, pl59, 2005 ; Hoeben等人，Phamacol 15 Rev 56, p549, 2004 , Shannon^ A, Clin Colorector Cancer 4, S74, 2004]。 基於抑制血管生成之抗癌藥劑的領先者係Avastin®，其 係一對KVEGF之單株抗體。Avastin®已被使用為一用於合 併化學療法藥劑以治療轉移性結腸癌病人的第一線藥物 20 (該化學療法藥劑包括5-Fluorouracil (5-FU))且係在2004年 二月首次被美國食品及藥物管理局（FDA)認可為一抗血管 生成抑制劑[HUrwitz 等人，c/i>l c〇brecii?r

Cancer 4, S62, 2004]。此外’為了增列非小細胞肺癌及乳癌於的有效表單 内’臨床測試及核准程序係積極地進行中[Miller等人，C/h 6 200812602

Breast Cancer 3, 421, 2003; Lynch et al.9 Lung Cancer 50, S25，2005]。另外，由Bayer及Onyx合力研發之一口服致標 性抗癌藥劑Nexavai:⑧已於2005年接獲FDA核准為用於進行 性腎癌及胃腸道基質瘤（gastrointestinal stromal tumor ； 5 GIST)之第一線藥物·，而且Pfizer的SU11248經FDA核准為用 於進行性腎癌之第一線藥物並於2006年一月以Sutent@之名 稱上市販售。除此之外，許多抗血管生成抑制劑，包括：

Novartis的PTK787/ZK222584，係在進行臨床測試中[Kim,

Mo/.所0/· ㈣，12, p263, 2〇〇5 ; Thomas等人， 10 30, p32, 2003]。 已有報導指出人蓁及紅人蔘表現出各種藥理活性，包 括··抗癌活性；而且一顯示出抗癌活性之代表性主要成份 係人蔘皂皆。特別地，人蔘皂苷Rg3(C42H72〇i3: 785 〇3)係 紅人蔘之特有的皂苷。相信的是，人蔘皂苷Rg3係藉由被包 15 έ在新鮮人蔘中之原人蔘二醇$1*〇1:〇卩&1^\&(11〇1)皂普在製 備紅人蔘期間之熱分解而產生。紅人蔘一般係包含一少量 的人蔘皂苷Rg3，即：〇 〇〇6%之2〇(s)人蔘皂苷Rg3以及 0.014%之20(R)-人篆皂普Rg3 [Kitagawa等人，了心g如哪

Vol 1，p21，1983]。 2〇 由於Kaku等人於1980首次由紅人蔘分離出 20(R)-人蓁皂苷Rg3以及其後之結構描述等人， ΑΓΖ尸〇/"也仏叹心义30, 936_943, 1980]，其已知可表 現^對腫瘤生長及轉移之抑制作用，血管放鬆以及針對抗 癌藥物抗1±之抑制作用[Back等人，心5，18, 200812602 pl64，1995 ; Hasegawa等人，尸/⑽加 MM·，61，p409，1995 ; Mochizuki等人，5k/. P/mr/n· 5m"·，18，pll97，1995 ; Ginseng Res·，25, pl07, 2001 ; Shinkai等人，/pn. /· Cancer /?a·，87，p357，1996 ; Tao等人，CTn/i. /· 40，p606, 5 • 2002 ; Tao等人，CTnVz· /· 5Wg·，40, p606, 2002]。 此外，也被發現的是，人蔘皂苷Rg3可藉由壓制癌細胞 黏附、侵入及血管生成而抑制轉移[Mochizuki等人，5k/· P/iarm·如//·，18, pll97, 1995]，而且20(R)-人蔘皂苷Rg3針 對血管生成的抑制作用係來自於對VEGF的抑制作用 10 [Zhang等人，342，p824, 2006 ; Chen等人，37, p60, 2006 ; Chen等人，Ζα Z/h·，30, p357, 2QQ5 ·，hn專 Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，yi，ρ22Ί， 2002]。 - 15 如上所述，已有很多關於人蔘皂苷Rg3針對血管生成及 • VEGF活性之抑制活性的報告。然而，其係皆關於20(R)_人 蔘皂苷Rg3，20(S)-人蔘皂苷Rg3之同質異構物，或是其並 未提供足夠之訊息以依據該人蔘皂苷Rg3之第20個碳位置 之光學活性而將其歸類為”S-型，，或”R-型，，。了解到屬於人蔘 20 皂苷Rg3之立體異構物的2〇(S)-人蔘皂苷Rg3及20(R)-人蔘 皂苷Rg3之間對於轉移抑制活性之差異[Korearl Patent Application No· 2005-53631，SK Chemicals]，本發明之發明 人結論出其係值得去細察20(S)-人蔘皂苷Rg3以及包含其之 組成物對於對抗血管生成的抑制活性及抗癌活性。基於此 8 200812602 類之§fl息’本發明已進行以下所述之貝驗’且結論是他們 已確定20(S)-人蔘皂苷Rg3表現出比20(R)-人蔘皂苷Rg3 (其 對於VEGF之拮抗作用為已知的）為強的VEGF抑制活性。特 定地，本發明已發現一包含2〇(S)-人蔘皂苷Rg3濃度為4〇至 5 60%(w/w)之組成物比2〇(S)-人蔘皂苷1^3或2〇(R)-人蔘皂苷 R g 3單一投藥之組成物表現出更佳之對抗血管生成的抑制 活性。 H 明内】 10 發明概要 因此，在本發明之一實施態樣中，提供了一包含濃度 為40至60%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成物，其係表現 出對抗血管生成的優異抑制效果，且因此可藉由連續投予 該藥物而用於預防或治療癌症。 15 圖式簡單說明 本發明之實施態樣之上述及其它目的、特徵及其它優 點將由以下詳細之敘述配合所附之圖式而清楚地了解，其 中： 一 弟1圖係一包含濃度為50%(w/w)之20(S)-人篆專苦 Rg3之組成物的高壓液體色層分析。 第2圖係一顯示該包含20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物 在血管内皮生長因子(VEGF)活體内活性方面之抑制效果 的圖表。 9 200812602 第3圖係一顯示該包含濃度為50%(w/w)之20(S)-人蔘 4苦Rg3之組成物在非小細胞肺癌活體内血管生成方面之 抑制效果的圖表。 第4圖係一呈現包含濃度為50%(w/w)之20(S)-人蔘皂 5 ^Rg3之組成物對於非小細胞肺癌在活體内腫瘤生長抑制 實驗之照片。 C 方反 ]j 較佳實施例之詳細說明 ° 依據本發明之一方面，其係提供一用以預防及治療癌 症之組成物’其包含濃度為4〇至6〇%(w/w)之由化學式I所表 不之2〇(S)-人蔘皂苦Rg3。， [化學式I]

本發明中使用為用於萃取之原始材料的人蔘可包括人 蔘科植物例如·亞，州人蔘（p⑽似以·^^叹）、田七人蔘加尤 notoginseng)、美洲尺篆（Ραηαχ quinquef〇Uum^反 a ‘尺篆 (〜似巧却細⑶小或其等之組織培養產物。 10 200812602 包含20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物，更特定地是，濃 度為40至60%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3為一有效成份， 可有效地使用於經由其針對血管生成優異的抑制效果而預 防及治療癌症。 5 本發明之組成物的典型每日劑量可在1至i〇〇〇mg/體 重kg的範圍内。然而，該被了解的是，實際投藥之有效成 份的量必須按照各種相關因素，包括：該有效成份的吸收、 去活化及分泌速率’選擇之投藥途徑，各別病患的年齡、 性別及體重，以及該病患症狀的嚴重程度而決定。因此， 10上述之劑量不應在任何方面被解讀為本發明之範圍的限 本發明之組成物可被製備為健康食品或藥物，且依據 上述之劑量可以單一劑或以各別分離劑的形式投藥。 本發明之組成物可依據該領域中習用之程序被製備為 15飲品、錠劑、丸劑或膠囊，且可為口服的。可擇地，本發 明之組成物可以注射的形式投藥。 藥物製備品可依據該領域中習用之程序使用本發明之 組成物而被製造。在如此做的時候，將本發明之組成物和 一合適之載劑、賦形劑及稀釋劑混合、稀釋或包封為膠囊、 20袋囊或其它形式容器的外型係較佳的。因此，該製備品可 被做為疑劑、丸劑、粉末、袋囊、藥酒、懸浮液、乳劑、 糖漿、霧劑、軟凝膠膠囊及硬凝膠膠囊、無菌注射溶液、 無菌幫裝粉末等等之形式。特定地，使得該組成物被製備 為一用於口服投藥的藥劑係更佳的。此外，為了預防該藥 11 200812602 物製備品在口服投藥時因為胃酸而被分解，可參考將其和 一制酸劑一起投藥。此外，一用於口服投藥之固體形式的 製備品，例如··一錠劑，可利用一腸衣塗覆而被保護。 同時，本發明之組成物的用途並不限定於被認可為藥 5物之產品，且應被了解為一廣泛的概念，其係包括習用之 功能性食品或健康支持食品。 當依此製備之包含有濃度為4〇至60%(w/w)之 20(S)-人蔘皂苷Rg3作為有效成份的組成物被投藥時，其顯 示針對腫瘤生長及血管生成的優異效果而不具有任何已知 10之副作用，且因此被期望能安全地使用於預防及治療癌症。 現在將參照下列範例詳細敘述本發明之實施例。然 而，该等範例係用於說明之目的而並非被解讀為限制本發 明之範圍。 範例1 ·分離人蔘二醇及人蔘三醇皂苷部份 15 約1公斤量的人蔘根鬚係以7L的70%甲醇在80°C、5 J 萃取一_人且經’辰縮，且該萃出物係懸浮在水中以調整 其固體成份為25%。該懸浮液係經過添加5Gg的氫氧化納 以及接著以1.2L水飽和丁醇萃取四次的處理，由此得到 39.6g的人蔘三醇皂苷。萃取後所得的水相部份係於攪動中 20以添加18〇111乙的18%鹽酸而中和，且以以1.4L水飽和丁 醇萃取三次，由此而得46.3g的人篆二醇皂苷。 範例2:形成一酸分解產物之人蓁二醇皂苷部份的製傷 由範例1所得之包含有人蔘皂苷Ra、Rb卜Rb2、Re、 Rd等之人蔘二醇皂普完全溶於道的水之後，係添加入 12 200812602 3g的乳酸，在7〇 C下攪拌且反應％小時。該反應混合物 係藉由添加20g的氫氧化鈉而中和， 以1.4L水飽和丁醇萃 取二次且在減壓下進行濃縮，由此可得奶的人蔘二醇皂 苷之酸水解產物。 5 範例3 : 20(R>人蔘皂苷Rg3的製備 2〇g之由範例2所得之酸水解產物的人蔘二醇皂普係 和380mL之甲醇或乙醇混和且在8(rc迴流下反應2小時， 由此可得4g的如白色粉末之不可溶材料的 2〇(R)-人蔘皂苷Rg3。由此所得之2〇(R)·人蔘皂苷Rg3表現 10出和先前文獻所報導之13C-NMR光譜和質量光譜資料相同 的結果Vol· 35(5)，p432, 1991]。 範例4 : 20(S)-人蔘皂苷Rg3以及含有不同量之 20(S)-人蔘皂苷Rg3之部份的製備 在範例3回收20(R)-人蔘皂苷Rg3之後所剩的濾出物 15 係在減壓下濃縮以得到15g的人蔘二醇皂苦之酸水解產 物。該酸水解產物係使用一氣仿/甲醇/水（14:2:0.1〜12:3:0.3) 之混合物為具有不同濃度梯度之沖提液而通過石夕膠凝體之 柱狀色層分析，由此可得一具有所欲之比例的 20(S)-人蔘皂苷Rg3部份。對於各組成物之代表圖式，包含 20 50%之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物係表示在第1圖中。 包含濃度為多於或等於80%(w/w)之 20(S)-人蔘皂苷Rg3的部份係使用半分餾柱體（25〇χ2〇 mm，YMC-ODS Η80，s-4 μπχ/ 沖提液=43% 氯化甲基) 之高壓液態色層分析而純化，而得到500mg的純 13 200812602 20(S)-人蔘皂苷Rg3。如此所得之2〇(s)_人蔘皂苷r幻表現 出和先前文獻所報導之YNMR光譜和質量光譜資§湘同 的結果V〇1· 35(5)，p432, 1991]，類似於在範 例3中所得之20(R)-人蔘皂苦Rg3。 、巳 5 實驗範例1包含不同濃度之20(s)-人蔘皂苷Rg3之組 成物對於活體外VEGFR-1活性的抑制作用 〆 為了選擇出-針對血管生成表現出優異抑制活性之包

含20(S)-人蔘皂苦Rg3的組成物，不同濃度之包含 20(S)-人蔘皂：^Rg3之組成物係如範例4中所述般利用柱狀 10 色層分析而製備。 為比較如上製備之不同濃度之包含 20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物對於VEGFR_丨(在血管生成中 扮演重要的角色）的抑制活性，遂執行以下的實驗。在此實 驗中’使用的是構設為表現人類重組VEGFIM的昆蟲細胞 I5 sf21。各該組成物，分別包含〇、2〇、4〇、5〇、⑹、⑽及 ioo%(w/w)之20(s)_人蔘皂皆Rg3，係溶於濃度為5叩/mL 之二甲基亞颯及預溫育在ρΗ 7·4之HEPES緩衝液，連同 0.2 pg/mL之酶在3rc的溫育箱中15分鐘。添加〇 2 之聚（Glu:Tyr)、1〇 μΜ 之 Ατρ 以及 〇 25 μα[γ32ρ]Ατρ 至該 2〇培養溶液中且反應30分鐘。3〇分鐘之後，藉由添加挪之 Η3Ρ〇4至違反應混合物而中止該反應。在移除該反應產物 之後，各組成物對於VEGFR-1活性之抑制率係利用測量在 該反應期間形成之[γ32 P]聚(Glu:Tyr)的量而決定。 14 200812602 該組成物對於VEGFR—；!活性之抑制率（％)係以在各組 成物中形成之[32P]pGly(Glu:Tyr)的量&上作為負控制組之 1%二甲基亞砜的比例表示【參考第i表】（各值係由二槽 井之值平均而得）。 【第1表】 5 pg/mL 之 VEGFR-1 活性的抑制率（％) 蔘1苷 0% Rg3 之濃（w/w) 度(％) 20 % (w/w) 40 % (w/w) 50% (w/w) 60 % (w/w) 80 % (w/w) 100% (w/w) 5 18 22 19.8 8 9 νΏ果疋其確遺、该包含濃度為40至60%(w/w)之20(S)_ 人蔘皂苷Rg3之組成物呈現出對於VEGFR_丨活性之優異的 抑制效果’且特定地，該包含5〇%(w/w)之2〇(s)_人蔘皂苦 之組成物表現出最強的抑制效果(22%)。 馨 實驗範例2包含20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物對於活 體内VEGF活性的抑制作用 15 在實驗範例1中係讀認包含20(S)-人蔘皂苷Rg3之組 成物可抑制VEGFR-1之活性。進一步地，本發明人執行以 下之實驗以比較包含不同濃度20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成 物和包含20(R)-人蔘皂苷Rg3(其為20(S)-人蓁皂苷Rg3的 立體異構物）之組成物對於VEGF之活體内的抑制效果。在 20 此實驗中係應用小鼠高移轉性皮膚癌細胞(B16F10黑色素 瘤）以及特定之無病原（SPF)雕性C57BL/6小鼠。作為一實 15 200812602 驗組，藥物樣品係藉由使用〇·5%之羧基曱基纖維素為賦形 劑而配製各組成物為10 mg/kg。 B16F10黑色素瘤細胞係培養在補充有之10%胎牛血清 (FBS)之DMEM中且藉由使用胰蛋白酶-EDTA而分離。該 5 培養液係接著以PBS稀釋，且各稀釋液之〇.2mL係以5xl〇5 細胞/小鼠的濃度皮下注射至SPF雌性C57BL/6小鼠的肩月甲 區域。在細胞移植至每組10隻小鼠之後，該藥物樣品係以 10 mL/kg的劑量經7天口服投藥至該等小鼠，且該等藥物 樣品的毒性係藉由監測體重的改變而決定。在投藥完成之

10 後’即割下該腫瘤使其為具有20-30mg的重量，並溶在PBS 中。為了檢測對於VEGF的抑制活性，遂執行elisa(酵素 写外結免疫吸附測疋，Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay)。首先，100 pL之各腫瘤樣品係被添加至一 EUsa 套組之96-槽井盤的各槽井中且在室溫下反應2·5小時。該 15盤係經清洗且和10〇1^的經生物素標識之抗體反應j小 曰守。該盤再經清洗之後，1〇〇μ[的HRP-抗生蛋白鏈菌素 (HRP-Streptavidin)係添加至各槽井且反應45分鐘。該盤係 接著經清洗且和反應液反應10分鐘。在該反應藉由添加一 終止液而停止之後，各槽井之吸光度係在45〇11111之下測量 20 活體内VEGF的水平。 里 各藥物樣品對於V E G F活性的抑制率(％)係以各樣σ 中所量測之VEGF活性對於負控制組中所量測之vEGp^ 性的比例表示，該負控制組係以0 5%之甲基纖維素投 16 200812602 藥。（參考第2表及第2圖）(各數值係藉由平均ι〇隻小鼠的 數值而得） 第2表

濃度為10mg/kg對於B16F10黑色素瘤細胞之VEGF 活性的抑制率（％) 2〇(s)-人蔘皂苷 一^!之濃度(％) 0 % (w/w) 50 % (w/w) 100 % (w/w) 20(R)-Rg3 ___B16F10 -3.4 41 26 10 -100 %(w/w): 20(S)-人蔘皂苷 Rg3 _20(R)-Rg3 : 20(R)-人蔘皂苷Rg3 如第2表中所述，發現到2〇(S)-人蔘皂苷Rg3比其立 體異構物20(R)-人蔘皂苷Rg3表現出多於20倍的強大抑制 10活性’且該包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物 表現出最強的抑制效果(41%)。 貫驗範例3包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂皆Rg3之組 成物對於活體内黑色素瘤細胞株血管生成的抑制作用 15 為了比對包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成 物以及其主要成份20(S)-人蔘皂苷Rg3單獨對於活體内血 管生成的抑制活性(其在實驗範例i及實驗範例2中顯示對 於VEGFR-1及VEGF最強的抑制活性），遂進行以下實驗。 在此實驗中係應用B16F10黑色素瘤細胞以及特定之無病 20原（SPF)雌性C57BL/6小鼠。作為一實驗組，藥物樣品係藉 由使用0.5%之羧基甲基纖維素為賦形劑而配製2〇⑻-人寨 17 200812602 皂苷Rg3及包含其之組成物分別為50%(w/w)的濃度及ι〇 mg/kg的劑量，而一負控制組係以該賦形劑單獨投藥。 B16F10黑色素瘤細胞係培養在補充有之10%胎牛血清 (FBS)之DMEM中且藉由使用胰蛋白酶-EDTA而分離。該 5培養液係接著以PBS稀釋，且各稀釋液之ojmL係以5xl05 細胞/小鼠的濃度皮下注射至SPF雌性C57BL/6小鼠的肩胛 區域。各組係由8隻小鼠組成。在細胞移植之後，該藥物 _ 樣品係以10 mL/kg的劑量經每日一次口服投藥至該等小鼠 6天。在實驗期間，每天測量體重，且該等藥物樣品的毒性 10係藉由監測體重的改變而決定。在投藥完成之後，自該等 小乳分離出皮膚組織且以數位相機照相。其後，以肉眼計 异在該硬質瘤週邊形成的血管數目。利用學生氏t_測試 (Student’s t-TEST)計算統計顯著性。 當該實驗依照上述之方法執行時，藥物樣品對於血管 -15生成之抑制率（％)係以在各實驗組所觀察到的金管數目對 Φ 於負控制組中所觀察到的血管數目之比例表示，該負控制 組係以0.5%之羧基甲基纖維素投藥，且該結果係如第2表 所不(各數值鋪由平均在8隻小鼠巾所觀察到的血管數目 而得）。 20 弟3表 濃度為10 mg/kg對於B16F1〇黑色素瘤細胞之血管生 成的抑制率(％) ---—Γ_______ 20(s)-又包含 ~L^——^ 苷Rg3的組成物少 18 200812602 B16Fl〇r 23.6w ~~- -'---—_11!* p<0.001) 結果，2〇(S)-人蔘皂苷Rg3以及包含濃度為5〇 %(w/w) 之20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成物皆顯示優異的抑制效果。 特別是，包含50 %(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成物比 5單獨20(s)-人蔘皂苷R0表現出針對血管生成更優異的抑 制活性。這些結果證明對於VEGF的拮抗係該包含2〇(3)_ 人蔘皂苦Rg3的組成物對於血管生成抑制活性的主要機 制’如同實驗範例1及2所確定的。 10 實驗範例4包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組 成物對於活體内非小細胞肺癌血管生成的抑制作用 為了比對20(S)-人蔘皂普Rg3及包含50%(w/w)之 2〇(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物對於人類衍生細胞株之活體 内血管生成的抑制活性(其針對B16F10黑色素瘤細胞血管 15生成的抑制活性在實驗範例3中已證實），遂進行以下實 驗。在此實驗中係應用人類衍生之非小細胞肺癌細胞株 NCI-H460以及特定之無病原（spF)雌性bALB/c裸鼠。作為 一貫驗組’藥物樣品係藉由以0.5%之羧基曱基纖維素作為 賦形劑配製20(S)·人蔘皂苷Rg3而製備為lOmg/kg之最大 20劑里’且以一為2之通比稀釋該最大劑量至5 mg/kg，藉此 得到較低劑量之樣品。該包含5〇%(w/w) 2〇(s)-人蔘皂苷 Rg3之組成物係經製備為其最大劑量40 mg/kg，且該較低 19 200812602 劑量係藉由以一為2之通比稀釋該最大劑量樣品至5 mg/kg。一負控制組係以該職形劑單獨投率。 Να_Η460細胞係培養在補充有之10%胎牛血清(FBS) 之DMEM中且藉由使用胰蛋白酶-EDTA而分離。該培養液 5係接著以PBS稀釋，且各稀釋液之〇.3mL·係以9xl06細胞 /小鼠的濃度皮下注射至SPF雌性BALB/c裸鼠的肩胛區域 中。各組係由6隻小鼠組成。在細胞移植之後，該藥物樣 • 品係以10 mL/kg的劑量經每日一次口服投藥至該等小鼠 14天。且該等藥物樣品的毒性係藉由監測體重的改變而決 10疋。，在投藥完成之後，分離出該腫瘤且以1〇%中性福馬林 固疋，以製備一組織塊。藉此製備之組織塊係以一超微切 片機切片為5# m的厚度，藉此得到一組織切片。該組織切 #係對CD31進行免疫染色，以製備-經染色之組織切片。 在以-光學顯微鏡選定在該經染色之組織切片上的5個點 15之後，由該光學顯微鏡所觀察之血管數目係經計算且取為 • —平均值。利用學生氏卜賴計算料上之顯著性。 藥物樣品對於血管生成之抑制率(％)係以在以撕⑻_ 人蓁皂普Rg3單獨投藥或是以包含不同濃度之5叫詞 的20傅人蔘阜苦Rg3之組成物投藥的各實驗組所觀察到 2〇的血管數目對於負控制組中所觀察到的血管數目之比例表 示，該負控制組係以〇·5%讀基甲基纖維素投藥，且雜 果係如第4表及第3圖所示(各數值係藉由平均在6隻= 中所觀察到的灰管數目而得）。 第4表 20 200812602 不同濃度對於NCI-H460非小細胞肺癌細胞株之血管 生成的抑制率(％) 20(S)-人蔘皂普 Rg3 包含 50 %(w/w)之 20(S)^X^ 皂苷Rg3的組成物 少 5 mg/kg 10 mg/kg 23.8"" 18.4 24.8" 30.3 山 20 mg/kg - 35.9“‘ — 40 mg/kg - 38.9^ —' ----- (*** ρ<〇.〇〇1) 結果，發現到包含濃度為50 %(w/w)之20(S)-人蔘皂苦 5 Rg3的組成物在劑量為10 mg/kg下顯示在人類衍生之非小 細胞肺癌細胞株NCI-H460對於血管生成比20(S)-人蔘皂苷 Rg3早一投樂有相等或更好的抑制活性。 貫驗範例5 :包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之 10 組成物對於活體内非小細胞肺癌腫瘤生長的抑制作用 為了測試包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成 物在濃度分別為5及10 mg/kg下對於活體内腫瘤生長的抑 制效果(其在實驗範例4中顯示依賴濃度的抑制效果），遂進 行以下實驗。 15 在此實驗中係應用人類衍生之非小細胞肺癌細胞株 NCI-H460以及特定之無病原（SPF)雌性B ALB/c裸鼠，且脫 氧氟尿苦（doxifluridine) (40 mg/kg)係用為正控制組。作為 一實驗組，藥物樣品係藉由以0.5%之羧基甲基纖維素作為 賦形劑配製20(S)-人蔘皂苷Rg3為5 mg/kg而製備。進一 20步地，該包含50%(w/w) 20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物係經 21 200812602 製備為其最大劑量10 mg/kg，且以一為2之通比稀釋該最 大劑量樣品至5 mg/kg而製備較低劑量之樣品。負控制組 之小鼠係以該賦形劑單獨投藥。 NCI-H460細胞係培養在補充有之10%胎牛血清(FBS) 5之DMEM中且藉由使用胰蛋白酶-EDTA而分離。該培養液 係接著以PBS稀釋，且各稀釋液之〇 3niL係以9xl06細胞 /小鼠的濃度皮下注射至SPF雌性BALB/c裸鼠的肩胛區域 中。各組係由6隻小鼠組成。在細胞移植之後，該藥物樣 品係以10 mL/kg的劑量經每日一次口服投藥至該等小鼠2 10 週。 腫瘤體積(tumor v〇lume，Tv)係利用測徑器每週3次以 下列公式計算而得： TV=最大軸（mm)x最小軸 15 在投藥完成之後，該等小鼠係以放血而犧牲，分離出 腫瘤且測量。體重係在實驗期間每天測量，且該等藥物樣 。口的t性係藉由監測體重的改變而決定。利用學生氏^測 試計算統計上之顯著性。 藥物樣品對於腫瘤生長之抑制率（％)係以在各實驗組 2〇所测量到的腫瘤體積對於負控制組中所測量到的腫瘤體積 之比例表示，該負控制組係以〇·5%之羧基甲基纖維素投 市，且该結果係如第5表及第5圖所示（各數值係藉由平均 在6隻小鼠中所觀察到的血管數目而得）。 二 第5表 22 200812602 對於NCI-H460非小細胞肺癌細胞株之腫瘤生長的抑 制率（％) ------- S τη〇/ΐ^Λ --4 包含50 %(w/w)之20(S)-人謇息 __ 苷Rg3的組成物 ~ ~~: Λ 乐 —_ -—一· ____ 脫氧氟尿苷 ^ 1A1K/K? 21.0 - mg/kg yj f\ TVl rv /1 39.2^ mg/kiT L ~ ~~~ 18.3 ~——--- —----Hjp<0.05, ** p<0.01) 、’、。果，發現到包含濃度為5〇 %(w/w)之如⑸-人茱皂苦 ⑩ 5 Rg3的組成物祕出躲人類触之非小細胞肺癌細胞株 NCI-H460之腫瘤生長相較於正控制組脫氧氟尿苷有相等 或更好的抑制活性，且特定地，在濃度為1〇 mg/kg時對於 腫瘤生長其表現出2倍或更高的抑制活性。其並未觀察到 相關於該藥物樣品投藥的毒性。 1〇 基於以上實驗範例所得之結果，其確認20(S)-人蔘皂

普Rg3及包含20⑸人蔘皂苷Rg3之組成物經由和VEGF 相關之拮抗機制對於血管生成及腫瘤生長呈現出優異的抑 制效果。 15 實驗範例6 :包含50 %(w/w)之2〇(S)-人蔘皂苷Rg3的 組成物在SD大鼠的毒性測試 為了測試包含50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成 物的毒性，遂進行以下實驗。在此實驗中係應用 SD(Sprague-Dawley)型之特定無病原（SPF)大鼠，且各組係 20由5隻雌性及雄性大鼠所組成。包含50%(w/w) 20(S)·人蔘 皂苷Rg3之組成物係藉由利用〇.5%之羧基甲基纖維素作為 23 200812602 賦形劑而製備且其最大劑量係基於先前實驗之結果而決定 為2000 mg/kg。藉由以一為2之通比稀釋該最大劑量樣品 至1000 mg/kg而製備較低劑量之樣品，以及由此所製備之 樂物樣品係以每隻大鼠為2〇 mg/kg之劑量經每日一次口服 5投藥至該等大鼠。所有的動物係被監測緊接在注射之後是 否有觀察到任何不正常的狀況，以及每小時之後的狀況， 直到在該投藥日的6小時之後。從隨後之日開始，每隔一 天則觀察一或多次不正常狀況的出現直到14天。體重係在 才又藥别及投藥後之第1天、第3天、第7天及第14天測量。 1〇投藥14天後，所有的動物皆以乙醚麻醉，將其腹腔割開， 依據動脈切開術進行放血而犧牲，且以肉眼觀察所有臟器 不正常的狀況。若該動物在投藥的隔天死亡，由該先見之 明認為可能不正常的器官所得之組織係以1〇%的中性福馬 林固定且萬一臨時需要時可進行組織病理學測試。藉由使 15用SPSS ι〇·ι之變異性單向分析計算該實驗統計上之顯著 性。 結果’所有經包含有5〇%(w/w)22〇⑸人蔘皂苷Rg3 之組成物投藥之實驗組雌性及雄性SD大鼠皆存活，且並未 觀察到有顯著臨床上的不正常狀況、體重的改變或是其它 20毒性效果。由這些結果已發現到包含有50%(w/w)之20(s)-人蔘皂苷Rg3之組成物的最小致死劑量(MLD)為2000 mg/kg或更高。 製備例1 :製備粉末及膠囊 24 200812602 lOOmg之含有50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成 物和14.8mg的乳糖、3mg的結晶纖維素及〇 2mg的硬脂酸 鎭此合在一起。該混合物係藉由一適當之裝置填充至n〇 5 凝膠膠囊中。 5 製備例2:製備軟膏 藉由使用含有50%(w/w)之20(S)-人蓁皂苷Rg3的組成 物依據以下成份的配方製備一軟膏。 0 【成份配方】 ~ 有效成份5g、棕招酸十六烧酯20g、十六烧醇4〇g、硬 10脂醇4〇g、莖蔻酸異丙酯8〇 g、單硬脂酸山梨酸酯2〇g、聚 山梨酸ί旨60g、對氧苯曱酸丙醋1 g、對氧笨甲酸甲酉旨1 g、 足夠量之磷酸及蒸餾水。 製備例3:製備注射劑 藉由使用含有50%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3的組成 15 物依據以下成份的配方製備一注射劑。 肇 【成份配方】 有效成份lOOmg、甘露醇180mg、二驗磷酸鈉25mg 以及注射用蒸餾水2974mg。 製備例4:製備健康食品 20 以每日劑量為基礎，〇.3g之含有50%(w/w)之20(S)-人 篆皂苷Rg3的組成物、粉末狀維生素E、乳酸鐵、氧化鋅、 於驗酿胺、維生素A、維生素B1及維生素B2係混合在一 起。 25 200812602 該健康食品的成份配方係如下所列（以成人之每曰劑 量為基礎）： 有效成份 300 mg 人蔘萃取物 100 mg 5 綠茶萃取物 100 mg 維生素C 100 mg 粉末狀維生素E 120 mg 乳酸鐵 2 mg 氧化鋅 2 mg 10 菸鹼醯胺 20 mg 維生素A 5 mg 維生素B1 2 mg 維生素B2 2 mg 玉米澱粉 200 mg 15 硬脂酸鎂 20 mg

產業利用性 如前所述，本發明之組成物表現出比單獨人蔘皂苷Rg3 為高之針對血管生成及腫瘤生長的抑制效果，且也已知為 20 不具有副作用，因此，係期待可用於癌症的預防及治療。 L圖式簡單說明1 本發明之實施態樣之上述及其它目的、特徵及其它優 點將由以下詳細之敘述配合所附之圖式而清楚地了解，其 26 200812602 ' 中： 弟1圖係一包含濃度為50%(w/w)之20(S)-人蓑息普 Rg3之組成物的高壓液體色層分析。 • 第2圖係一顯示該包含20(S)-人蔘皂苷Rg3之組成物 5在血管内皮生長因子(VEGF)活體内活性方面之抑制效果 的圖表。 第3圖係一顯示該包含濃度為5〇%(w/w)之20(S)-人蓑 m 皂苷RS3之組成物在非小細胞肺癌活體内血管生成方面之 _ 抑制效果的圖表。 10 第4圖係一呈現包含濃度為50%(w/w)之20(S)-人萋皂 苷Rg3之組成物對於非小細胞肺癌在活體内腫瘤生長抑制 實驗之照片。 【主要元件符號說明】 - 益 27

Claims (1)

1. 200812602 十、申請專利範圍： 1 · 一種藉由抑制血管生成而用於預防及治療癌症的組成 物，其包含濃度為40至60%(w/w)之20(S)-人蔘皂苷Rg3。 2 .如申請專利範圍第1項之組成物，該癌症係皮膚癌或肺癌。 5 3·如申請專利範圍第1項之組成物，該組成物係經配製為 一注射劑製品或一用於口服投藥之製品。 4.如申請專利範圍第1項之組成物，用於一成人之每曰劑 _ 量係在總量為1至l〇〇〇mg的範圍内。

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