KR101320333B1

KR101320333B1 - Ｅｇｌｎ2 변이체 및 혈전색전 장애 및 관상동맥 심장질환의 예방 또는 치료에서의 이의 용도

Info

Publication number: KR101320333B1
Application number: KR1020087008806A
Authority: KR
Inventors: 데틀레프 코치안; 마티아스 헤르만
Original assignee: 사노피
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2006-09-30
Publication date: 2013-10-22
Also published as: BRPI0617304A2; JP5210166B2; TW200738746A; IL220636A0; AR055442A1; US8114398B2; JP2009511027A; US20110123515A1; TWI404725B; IL190586A0; EP1937714B1; AU2006301579A1; CN101282988A; KR20080052663A; WO2007042166A2; US8211427B2; CN101282988B; DE102005048898A1; HK1124869A1; US8329167B2

Abstract

본 발명은 아미노산 서열의 58번 위치에 세린 또는 류신을 갖는 사람 EGLN2 변이체, 및 혈전색전 장애 또는 관상동맥 심장 질환, 특히 뇌졸중, 지연된 가역적 허혈성 신경 결손(PRIND), 일과성 허혈 발작(TIA), 심근경색 및/또는 조기 심근경색의 예방 또는 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.

EGLN2, 혈전색전 질환, 관상동맥 심장 질환, 심근경색, 단일 뉴클레오타이드 다형성

Description

ＥＧＬＮ2 변이체 및 혈전색전 장애 및 관상동맥 심장 질환의 예방 또는 치료에서의 이의 용도{EGLN2 variants and use thereof in preventing or treating thromboembolic disorders and coronary heart diseases}

본 발명은 아미노산 서열의 58번 위치에 세린 또는 류신을 갖는 사람 EGLN2 변이체, 및 혈전색전 또는 관상동맥 심장 질환, 특히 졸중, 지연된 가역적 허혈성 신경 결손(PRIND), 일과성 허혈 발작(TIA), 심근경색 및/또는 조기 심근경색의 예방 또는 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

EGLN2는, 이의 HIF 프롤릴 하이드록실라제 활성으로 인해 프롤릴 하이드록실라제 도메인-함유 단백질 1 (PHD1; prolyl hydroxylase domain-containing protein 1)로도 공지되어 있고, 5개의 암호화 엑손으로 이루어진 보존된 게놈 구조를 갖는 Egl-Nine 유전자 계열의 밀접하게 관련된 단백질의 그룹에 속한다. 저산소증 유도 인자(HIF; Hypoxia-Inducible Factor)는 산소 항상성의 많은 양상에서 중요한 역할을 하는 전사 조절인자이지만, EGLN 동종형(isoform) EGLN1 (PHD1), EGLN2 (PHD2) 및 EGLN3 (PHD3)이 HIF의 생리학적 조절에 관여하는지는 아직 불확실하다[참조: Appelhoff, R. J. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 38458-38465, No. 37]. 모든 EGLN 동종형은 상이한 세포 특이적 및 유도성 작용을 보이고, 이것이 저산소상태에 대한 HIF 반응의 조절에서 유연성을 가능하게 할 것이라고 보고되어 있다. 이는 특정한 EGLN 동종효소의 특이적인 약리학적 억제가, 치료학적 용도에서 유용한 HIF 반응의 선택적 조절에 대한 가능성을 가질 수 있다는 것을 의미할 것이다[참조: Appelhoff, R. J. et al. (2004), supra]. EGLN2 억제는, 예를 들면, 휴지 상태 하에서 다양한 세포 종류에 걸쳐 광범위하게 HIF 반응을 활성화시킬 것이다. 대조적으로, EGLN3의 특이적인 억제는 고 수준의 효소를 발현하는 특정한 조직에서 저산소상태에 대한 반응을 선택적으로 증가시킬 것이다[참조: Appelhoff, R. J. et al. (2004), supra]. 이는 허혈/저산소 질환을 치료하는데 대한 가능성을 열어줄 수 있다. EGLN2 및 EGLN3과 대조적으로, EGLN1의 생리학적 역할에 관해서는 많이 알려져 있지 않다.

관상동맥 심장 질환의 발생 및 진행에서 EGLN2의 잠재적인 관여를 보다 충분히 이해하기 위하여, 유전자형-표현형 연관 분석을 익히 특성규명된 환자 그룹에서, 본 발명에 따라 참조 번호 NM_053046.2 하에 공개된 EGLN2 참조 서열의 470번 위치에서 EGLN2 유전자의 변이에 관하여 수행하였다. EGLN2 유전자의 상이한 유전자 변이체는 이미 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성)로서 공지되어 있고 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=112398 하에 공개되어 있다.

놀랍게도, 사람 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산의 470번 위치의 뉴클레오타이드의 변이, 특히 시토신에서 티미딘으로의 변이, 또는 사람 EGLN2 단백질의 58번 위치의 아미노산의 변이, 특히 세린에서 류신으로의 변이는 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 발생과 관련이 있다는 것이 밝혀졌다.

그러므로, 본 발명의 대상은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질, 및 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산, 특히 서열번호 4에 따른 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA, 특히 이본쇄 DNA이다. 핵산의 서열은 또한 하나 이상의 인트론 및/또는 하나의 폴리A 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 핵산은 벡터의 제조에, 바람직하게는 셔틀(shuttle) 벡터, 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 발현 벡터 또는 유전자 치료 활성을 갖는 벡터 형태의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 넉아웃(knock-out) 유전자 작제물 또는 발현 카세트(cassette)를 상기한 핵산을 사용하여 제조할 수 있다. 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 발현 벡터일 수 있다. 원핵생물 발현 벡터의 예로는, 이.콜라이(E. coli)에서의 발현의 경우, 예를 들면, 벡터 pGEM 또는 pUC 유도체가 있다. 진핵생물 발현 벡터의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현의 경우, 예를 들면, 벡터 p426Met25 또는 p426GAL1 [참조: Mumberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768]이 있고, 곤충 세포에서의 발현의 경우, 예를 들면, EP-B1-0 127 839 또는 EP-B1-0 549 721에 공개된 것과 같은 배큘로바이러스(Baculovirus) 벡터가 있으며, 포유동물 세포에서의 발현의 경우, 예를 들면, 벡터 Rc/CMV 및 Rc/RSV 또는 SV40 벡터가 있고, 이들은 모두 일반적으로 입수가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 또한, 예를 들면, 이.콜라이에서의 발현을 위한 trp 프로모터 [참조: EP-B1-0 154 133], 효모에서의 발현을 위한 Met　25, GAL　1 또는 ADH2 프로모터 [참조: Russel et al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674-2682; Mumberg, supra], 곤충 세포에서의 발현을 위한 배큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터 [참조: EP-B1-0 127 839]와 같이 각각의 숙주 세포에 적당한 프로모터를 함유한다. 포유동물 세포에서의 발현의 경우, 예를 들면, 적당한 프로모터로는 진핵생물 세포에서 구성적, 조절성, 조직-특이적 또는 대사적으로 특이적인 발현을 가능하게 하는 것이 있다. 본 발명에 따른 조절 요소로는 프로모터, 활성인자 서열, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer) 및/또는 리프레서(repressor) 서열이 있다. 진핵생물에서 구성적 발현을 가능하게 하는 적당한 조절 요소의 예로는 RNA 폴리머라제 III에 의해 인식되는 프로모터 또는 바이러스 프로모터, CMV 인핸서, CMV 프로모터 (실시예 13 참조), SV40 프로모터 또는 LTR 프로모터, 예를 들면 MMTV [마우스 유방 종양 바이러스 (참조: Lee et al. (1981) Nature 214, 228-232)] 기원의 프로모터, 및 예를 들면 HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV 또는 HIV로부터 유래된 추가적인 바이러스 프로모터 및 활성인자 서열이 있다. 진핵생물에서 유도성 발현을 가능하게 하는 조절 요소의 예로는 테트라사이클린 오퍼레이터(operator) 및 이에 상응하는 리프레서가 있다[참조: Gossen M. et al. (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5, 516-20]. 진핵생물에서 대사적으로 특이적인 발현을 가능하게 하는 조절 요소의 예로는, 바람직하게는 저산소상태에 의해 조절되는 프로모터가 있다.

본 발명에 따라 사용되는 핵산의 도입, 및 이에 따른 형질감염, 형질전환 또는 감염에 의한 진핵생물 또는 원핵생물 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하기 위하여, 핵산은 플라스미드로서, 또는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 일부분으로서 존재할 수 있다. 본 발명에서 적당한 바이러스 벡터로는 특히 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 헤르페스바이러스가 있다. 본 발명에서 적당한 비-바이러스 벡터로는 특히 비로좀(virosome), 리포좀, 양이온성 지질 또는 폴리-리신-접합된 DNA가 있다.

유전자 치료 활성을 갖는 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 예를 들면 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터가 있다[참조: Lindemann et al., 1997, Mol. Med. 3: 466-76; Springer et al., 1998, Mol. Cell. 2: 549-58]. 나출형(naked) DNA는 국소적 적용에서 피부 세포 속으로 침투할 수 있으므로, 진핵생물 발현 벡터는 분리된 형태가 유전자 치료용으로 적당하다[참조: Hengge et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 112: 370-5]. 유전자 치료 활성을 갖는 벡터는, 본 발명에 따라 사용되는 핵산을 리포좀과 복합체를 형성시켜 수득할 수도 있는데, 이는 특히 피부 세포의 매우 높은 형질감염 효율이 달성될 수 있기 때문이다[참조: Alexander and Akhurst, 1995, Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85]. 리포펙션(lipofection)의 경우에, 작은 단층 소포를 리포좀 현탁액의 초음파 처리에 의해 양이온성 지질로부터 제조한다. DNA를 리포좀의 표면에 이온 결합시켜, 즉 순 양전하가 남게 되는 비로 결합시켜, 플라스미드 DNA를 리포좀 100%와 복합체를 형성시킨다. 문헌[참조: Felgner et al. (1987, supra)]에서 사용된 지질 혼합물 DOTMA (1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸암모늄 브로마이드) 및 DPOE (디올레오일포스파티딜에탄올아민) 외에도, 그동안 많은 신규 지질 제형이 합성되었고 다양한 세포주의 형질감염에서의 효율에 대해 검사되었다[참조: Behr, J.P. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986; Felgner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Gao, X. & Huang, L. (1991), Biochim. Biophys. Acta 1189, 195-203]. 지질 제형의 예로는 DOTAP N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸-암모늄 에틸-설페이트 또는 DOGS (트랜스펙탐(TRANSFECTAM); 디옥타-데실아미도글리실-스페르민)가 있다. 세포 속으로의 핵산의 전달을 증가시키는 보조물질은, 예를 들면, DNA에 결합된 단백질 또는 펩타이드, 또는 세포 핵 속으로의 핵산의 이동을 가능하게 하는 합성 펩타이드-DNA 분자일 수 있다[참조: Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6, 282; Branden et al. (1999) Nature Biotech. 17, 784]. 보조물질에는 또한 세포의 세포질 속으로[참조: Planck et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem. 8, 213], 또는 예를 들면, 리포좀 속으로[참조: Uhlmann and Peymann (1990) supra] 핵산의 방출을 가능하게 하는 분자가 포함된다. 다른 특히 적당한 형태의 유전자 치료 벡터는, 본 발명에 따라 사용되는 핵산을 금 입자에 가해서, 이를 소위 유전자 총(gene gun)을 사용하여 조직 (바람직하게는 피부) 또는 세포 속으로 발사하는 방법으로 수득될 수 있다[참조: 실시예 13; Wang et al., 1999, J. Invest. Dermatol., 112: 775-81, Tuting et al., 1998, J. Invest. Dermatol. 111: 183-8].

상기 핵산의 유전자 치료 용도를 위하여, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 일부가, 하나 이상의 비-암호화 서열, 예를 들어 인트론 서열, 바람직하게는 프로모터와 폴리펩타이드의 개시 코돈 사이의 인트론 서열 및/또는, 특히 유전자의 3' 말단에 폴리A 서열, 특히 천연 폴리A 서열 또는 SV40 바이러스 폴리A 서열을 함유하는 경우가 또한 유리한데, 이에 의해 mRNA의 안정화가 달성될 수 있기 때문이다[참조: Jackson, R.J. (1993) Cell 74, 9-14 and Palmiter, R.D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 478-482].

넉아웃(knock-out) 유전자 작제물은, 예를 들면, 미국특허 제5,625,122호; 제5,698,765호; 제5,583,278호 및 제5,750,825호로부터 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터 또는 넉아웃 유전자 작제물을 사용하여 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있으며, 원핵생물 숙주 세포의 예로는 이.콜라이가 있고, 진핵생물 세포의 예로는 사카로마이세스 세레비지애 또는 곤충 세포가 있다. 특히 바람직한 형질전환된 숙주 세포는 유전자전이된(transgenic) 배아 비-사람 줄기 세포이고, 이는 본 발명에 따른 넉아웃 유전자 작제물 또는 본 발명에 따른 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 한다. 숙주 세포 및/또는 줄기 세포의 형질전환을 위한 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 전기천공(electroporation) 또는 미세주입(microinjection)이 포함된다.

본 발명의 또다른 대상은 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 함유하는 유전자전이된 동물에 관한 것이다.

유전자전이된 동물, 특히 마우스의 제조 방법은, 독일특허 제196 25 049호 및 미국특허 제4,736,866호; 제5,625,122호; 제5,698,765호; 제5,583,278호 및 제5,750,825호로부터 마찬가지로 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 배아 또는 정모세포 속으로의 발현 벡터(상기 참조)의 직접 주입에 의해, 또는 배아 줄기 세포 속으로의 발현 벡터의 형질감염에 의해 생산될 수 있는 유전자전이된 동물을 포함한다[참조: Polites and Pinkert: DNA Microinjection and Transgenic Animal Production, page 15 to 68 in Pinkert, 1994: Transgenic animal technology: a laboratory handbook, Academic Press, London, UK; Houdebine, 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, page 115 to 146 in Pinkert, 1994, supra; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, page 147 to 176 in Pinkert, 1994, supra; Monastersky: Gene Transfer Technology; Alternative Techniques and Applications, page 177 to 220 in Pinkert, 1994, supra]. 본 발명에 따라 사용되는 핵산을 소위 표적화 벡터 속으로 통합시키는 경우[참조: Pinkert, 1994, supra], 배아 줄기 세포의 형질감염 및 상동 재조합 후, 예를 들면, 일반적으로 이형접합성 마우스로서 감소된 핵산 발현을 보이는 넉아웃 마우스를 발생시키는 것이 가능하지만, 동형접합성 마우스는 핵산의 발현을 더 이상 나타내지 않는다. 이러한 방식으로 생산된 유전자전이된 및 넉아웃 세포 또는 동물은, 유전자 치료 활성을 갖는 약리학적 활성 물질 벡터의 스크리닝 및 확인에 사용될 수도 있다.

본 발명의 또다른 대상은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "특이적으로"라는 용어는 항체가 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질에는 결합하지만, 본질적으로 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질에는 결합하지 않는다는 것, 즉 항체가 58번 위치에 세린을 갖는 EGLN2 단백질과 58번 위치에 류신을 갖는 EGLN2 단백질을 구별하는데 적당한 것을 의미한다.

상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이고, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체라는 용어는 본 발명에 있어서, 유전자 조작에 의해 제조되고, 임의로 변형된 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 예를 들면, 키메릭(chimeric) 항체, 사람화된 항체, 다기능 항체, 2-특이적 또는 올리고특이적 항체, 일본쇄 항체, F(ab) 또는 F(ab)₂ 단편을 의미하는 것으로도 이해된다[참조: 유럽특허 제EP-B1-0 368 684호, 미국특허 제4,816,567호, 제4,816,397호, 국제공개공보 제WO　88/01649호, 제WO　93/06213호, 제WO　98/24884호].

항체를 생산하는 방법은 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 따라, 예를 들면, 경우에 따라, 예를 들어 프로인트(Freund's) 애주번트 및/또는 수산화알루미늄 겔의 존재 하에서, 상기 폴리펩타이드 또는 이의 언급된 일부분으로 포유동물(예: 래빗)을 면역화시키는 방법으로 수행한다[참조: Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344-1349]. 이어서, 면역학적 반응의 결과로서 동물에서 형성된 폴리클로날 항체를, 일반적으로 공지된 방법에 따라 혈액으로부터 쉽게 분리하여, 예를 들면, 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 모노클로날 항체는, 예를 들면, 윈터(Winter)와 밀슈타인(Milstein)의 공지된 방법에 따라 생산할 수 있다[참조: Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299]. 재조합 항체는 앞서 명시한 특허 공보에 공개된 바와 같이 생산할 수 있다.

본 발명의 또다른 대상은 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이때 앞서 명시한 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하고, 임의로 EGLN2 단백질을 세포 또는 배양 배지로부터 분리한다.

EGLN2 단백질은, 예를 들면, 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 따라, 앞서 이미 설명한 바와 같이, 적당한 발현 시스템에서 상기한 핵산의 발현에 의해 제조한다. 적당한 숙주 세포로는, 예를 들면, 이.콜라이 균주 DHS, HB101 또는 BL21, 효모 균주 사카로마이세스 세레비지애, 곤충 세포주 레피도프테라(Lepidoptera) (예: 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 기원), 또는 동물 세포 COS, Vero, 293, HaCaT 및 HeLa가 있고, 이들은 모두 일반적으로 입수가능하다. EGLN2 단백질은 융합 단백질의 일부분일 수도 있다. 상기한 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질은 앞서 설명한 바와 같이 본 발명에서 제조되며, 이때 융합 단백질은 상기한 폴리펩타이드의 기능 또는 융합 부분의 절단 후에만 기능적으로 활성인 특정 기능을 자체에 이미 갖고 있다. 특히, 약 1 내지 300, 바람직하게는 약 1 내지 200, 특히 약 1 내지 100, 특히 약 1 내지 50개의 외래 아미노산의 비율을 갖는 융합 단백질이 본 발명에 포함된다. 이러한 펩타이드 서열의 예로는 원핵생물 펩타이드 서열이 있고, 이는 예를 들면 이.콜라이의 갈락토시다제로부터 유래할 수 있다. 또한, 바이러스 (예: 박테리오파지 M13)의 펩타이드 서열을 사용하여, 당업자에게 공지된 파지 디스플레이(phage display) 방법을 위한 융합 단백질을 생산할 수도 있다. 융합 단백질을 위한 펩타이드 서열의 보다 바람직한 예로는 융합 단백질의 검출을 보다 용이하게 하는 펩타이드, 예를 들면, "녹색 형광 단백질" 또는 이의 변이체가 있다.

상기한 단백질의 분리 및/또는 정제를 위하여, 추가적인 폴리펩타이드(들) (태그)를 부착시킬 수 있다. 적당한 단백질 태그를 사용하면, 예를 들면, 매트릭스에 대해 고 친화도로 흡수시킬 수 있고, 현저한 정도로 복합체를 용출시키지 않으면서 적당한 완충액을 사용하여 엄중하게 세척할 수 있으며, 이후에 흡수된 복합체의 표적화된 용출이 가능하다. 당업자에게 공지된 단백질 태그의 예로는 (His)₆ 태그, Myc 태그, FLAG 태그, 헤마글루티딘 태그, 글루타티온 트랜스퍼라제(GST) 태그, 친화도 키틴-결합 태그 또는 말토스-결합 단백질(MBP) 태그를 갖는 인테인(intein)이 있다. 이러한 단백질 태그는 N- 또는 C-말단에 및/또는 내부에 위치할 수 있다.

본 발명의 추가적인 대상은 EGLN2 단백질의 조절인자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이고, 이때 상기 방법은,

(a) EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계,

(b) 검사 화합물을 제공하는 단계, 및

(c) 검사 화합물이 EGLN2 단백질 또는 EGLN2 유전자에 미치는 영향을 측정하거나 검출하는 단계

를 포함한다.

일반적으로, EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산은, 예를 들면, 검정 시스템에서 제공되고, 예를 들면 화학 화합물 라이브러리의 형태로, 직접적 또는 간접적으로 검사 화합물, 특히 생화학 또는 화학 검사 화합물과 접촉시킨다. 이어서, 검사 화합물이 EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산에 미치는 영향을 측정하거나 검출한다. 이후, 적당한 조절인자 (예: 활성화제 또는 억제제)를 분석하고/하거나 분리할 수 있다. 화학 화합물 라이브러리의 스크리닝을 위하여, 당업자에게 공지되어 있거나 시판되는 고효율 검정(high-throughput assay)을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "화학 화합물 라이브러리"라는 용어는, 임의의 다수의 공급원 (예: 화학적으로 합성된 분자 및 천연 산물)으로부터 어셈블리되었거나 조합 화학 기술에 의해 생성된 다수의 화학 화합물을 말한다.

일반적으로, 검사 화합물이 EGLN2 또는 EGLN2 유전자에 미치는 영향은 이질적 또는 균질적 검정에서 측정하거나 검출한다. 본원에서 사용되는 이질적 검정은 하나 이상의 세척 단계를 포함하는 검정인 반면에, 균질적 검정에서는 이러한 세척 단계가 필요하지 않다. 시약과 화합물을 단지 혼합하여 측정한다.

적당한 기능적 검정은 EGLN2의 유전자 발현, EGLN2의 직접적인 활성화 또는 억제를 토대로 할 수 있다. EGLN2 유전자 발현의 조절인자로서 검사될 생화학 또는 화학 화합물의 존재 하에서, 직접적인 활성화 또는 억제, 또는 다른 단백질 (예: 세포 단백질)과의 복합체 형성을, 일반적으로 당업자에게 공지된 수단에 의해 또는 문헌[참조: Appelhoff, R. J. et al. (2004), supra 및/또는 Jaakkola, P. et al. (2001) Science, 292, 468-472, No. 5516]에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.

예를 들면, 프롤릴 하이드록실라제 활성은 Pro (예: 프롤릴 하이드록실라제 또는 HIF-1α 서브유닛의 Pro⁵⁶⁴)의 산화를 검출할 수 있는 질량 분광 분석에 의해, 또는 당업자에게 공지된 효소적 검정에 의해, 예를 들면, 사람 세포, 동물 세포, 세균 세포 또는 효모 세포를 사용한 시험관내 전체 세포 검사 검정 및/또는 시험관내 검사 검정에서 측정할 수 있다.

고체상-결합된 폴리펩타이드도 어레이(array)의 일부분일 수 있다. 고체상 화학 및 광-불안정성(photolabile) 보호 그룹을 사용하여 이러한 어레이를 제조하는 방법은, 예를 들면 미국특허 제5,744,305호에 공개되어 있다. 이러한 어레이를 검사 화합물 또는 화합물 라이브러리와 접촉시켜 상호작용 (예: 결합 또는 입체구조 변화)에 대해 검사할 수도 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 상기 방법은 전체 세포를 사용하여 수행한다. 일반적으로 멀티웰(multiwell) 플레이트의 바닥에서 성장하는 세포를 고정시켜, 투과화하고, 차단시켜, 예를 들면 관심대상의 기질에 대한 1차 (P)-특이적 항체와 함께 항온처리한다. 이어서, 예를 들면, 유로피움 표지되거나 HRP 접합된 2차 항체를, 예를 들면 상기한 바와 같은 특정 화학발광 또는 비색 물질과 함께 사용하여 시그날을 발생시킨다. 현미경을 병용하여, (P)-특이적 항체의 양을 단일 세포 수준에서 정량할 수 있을 뿐만 아니라, 인산화-유도된 기질의 전위(translocation) 또는 세포의 형태학적 변화도 정량할 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 방법은, 예를 들면, 미세유체공학(microfluidics), 즉 채널(channel) 구조화를 사용하여, 예를 들어 로봇 플레이팅 및 로봇 액체 이동 시스템을 포함하는 로봇 시스템에서 수행한다.

본 발명의 다른 양태에서, 상기 방법은 고효율 스크리닝(high-throughput screening) 시스템의 형태로 수행한다. 이러한 시스템에서는, 유리하게 스크리닝 방법이 자동화되고 소형화되며, 특히 소형화된 웰 및 로봇에 의해 제어되는 미세유체공학이 사용된다.

본 발명의 또다른 대상은 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 생산을 위한 서열번호 2 또는 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다. 특히 혈전색전 질환은 졸중, 지연된 가역적 허혈성 신경 결손(PRIND) 및/또는 일과성 허혈 발작(TIA)이다. 또한, 관상동맥 심장 질환은 특히 심근경색이다. 구체적으로는, 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산은 졸중, PRIND 및/또는 TIA의 예방 또는 치료를 위한 약제를 생산하는데 사용되고, 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 함유하는 EGLN2 단백질 또는 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산은 심근경색, 특히 조기 심근경색의 예방 또는 치료를 위한 약제를 생산하는데 사용된다.

구체적으로는, 470번 위치의 뉴클레오타이드가 염색체 DNA에서 티미딘 또는 mRNA에서 우라실이거나, 58번 위치의 아미노산이 류신인 경우, 졸중, PRIND 및/또는 TIA의 더 위험성이 높다. 하지만, 470번 위치의 뉴클레오타이드가 시티딘이거나 58번 위치의 아미노산이 세린인 경우에는, 심근경색, 특히 조기 심근경색의 위험성이 더 높다.

본 발명에 있어서, "EGLN2-C470C"라는 용어는 EGLN2를 암호화하는 유전자의 두 대립유전자(allele) 상에서 참조 서열 NM_053046.2의 470번 위치에 시티딘 (이는 상응하는 단백질의 58번 위치의 아미노산이 세린이 되게 한다)을 갖는 사람의 그룹을 말한다. 이러한 사람들은 상기 EGLN2 변이체에 대하여 동형접합성이다. 따라서, "EGLN2-C470T"라는 용어는 EGLN2를 암호화하는 유전자의 하나의 대립유전자 상에는 시티딘 (이는 상응하는 단백질의 58번 위치가 세린이 되게 한다)을 갖고, EGLN2를 암호화하는 유전자의 다른 대립유전자 상에는 티미딘 (이는 상응하는 단백질의 58번 위치가 류신이 되게 한다)을 갖는 사람의 그룹을 말한다. 이러한 사람들은 상기 EGLN2 변이체에 대하여 이형접합성이다.

사람 EGLN2 단백질을 암호화하는 참조 서열의 핵산 서열은 바람직하게는 서열번호 1의 핵산 서열을 갖고, 사람 EGLN2 단백질의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 하지만, 상기 참조 서열의 470번 위치에 상응하는 위치에서 시티딘으로부터 티미딘으로의 뉴클레오타이드 교환 및/또는 상기 참조 서열의 58번 위치에 상응하는 위치에서 세린으로부터 류신으로의 아미노산 교환이 존재하고, 또한 상응하는 단백질이 프롤릴 하이드록실라제 활성, 특히 HIF 프롤릴 하이드록실라제 활성을 갖는 경우, 본 발명은 사람 EGLN2의 다른 변이체 및 이의 비-사람 동족체, 예를 들면 다른 포유동물 EGLN2 동족체 또는 캐노하디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 마우스 또는 래트로부터의 EGLN2 동족체도 포함한다. 상기 효소 활성은, 예를 들면 이미 앞서 설명한 바와 같이 질량 분광 분석으로 측정할 수 있다.

일반적으로, 470번 위치의 특정 뉴클레오타이드는 핵산 서열결정(sequencing) 방법, 핵산의 질량 분광 분석, 하이브리드화 방법 및/또는 증폭 방법으로 판정할 수 있다. 핵산 서열결정 방법의 예로는 방사성 및/또는 형광 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 파이로시컨싱(pyrosequencing) 및/또는 서열결정(sequencing)이 있다. 하이브리드화 방법의 예로는 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석 및/또는 DNA-마이크로어레이 상에서의 하이브리드화 방법이 있다. 증폭 방법의 예로는 TaqMan 분석, 차등 RNA 디스플레이 분석(differential RNA display analysis) 및/또는 발현 차이 분석(RDA; Representational Difference Analysis)이 있다[참조: Shi M. M. (2002) Am J Pharmacogenomics., 2(3), 197-205; Kozian & Kirschbaum (1999) Trends Biotechnol., 17(2), 73-8].

또한, 58번 위치의 아미노산 서열은 특정 단백질의 양을 측정하는 방법 및/또는 특정 단백질의 활성을 측정하는 방법에 의해 판정할 수 있다. 특정 단백질의 양을 측정하는 방법의 예로는 웨스턴 블롯 분석 및/또는 ELISA가 있다. 특정 단백질의 활성을 측정하는 방법의 예로는 사람 세포, 동물 세포, 세균 세포 또는 효모 세포를 사용한 시험관내 전체 세포 검사 검정 및/또는 시험관내 검사 검정이 있고, 이들은 모두 당업자에게 공지되어 있다.

각각의 변이체의 검출을 위한 샘플의 예로는 세포, 조직 또는 체액, 특히 혈액, 내피 세포 또는 평활근 세포의 세포 성분이 있다. 바람직하게는, 샘플을 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 예비처리하여, 추가적인 분석을 위한 샘플의 핵산 또는 염색체 DNA, 또는 단백질을 분리하고/하거나 정제한다.

본 발명에 따른 변이체의 확인을 위한 바람직한 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 예를 들면, 조사해야 할 사람 또는 환자로부터의 샘플로부터, 특히 세포, 조직, 체액, 또는 혈액, 내피 세포 또는 평활근 세포의 세포 성분으로부터 핵산 프로브, 특히 DNA 프로브를 분리하는 단계;

(b) 프라이머, 특히 실시예에 명시된 프라이머를 사용하여 EGLN2 유전자의 470번 위치를 포함하는 특정 영역을 증폭시키는 단계;

(c) 증폭된 영역을 서열결정(sequencing)하는 단계; 및

(d) 서열결정된 영역을 분석하는 단계.

본 발명에 따른 변이체의 결정을 위한 대안적인 방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 예를 들면, 조사해야 할 사람 또는 환자로부터의 샘플로부터, 특히 세포, 조직, 체액, 또는 혈액, 내피 세포 또는 평활근 세포의 세포 성분으로부터 EGLN2 단백질을 분리하는 단계; 및

(b) EGLN2 단백질의 58번 위치의 아미노산을 판정하는 단계.

보다 바람직한 단계는 실시예에 개별적으로 또는 총체적으로 명시되어 있고, 각각의 단계에 대해 본원에 참조로서 인용된다.

마지막으로, 본 발명의 대상은 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 치료를 위한 약제를 생산하는 방법에 관한 것이고, 이때 상기 방법은,

(a) 상기한 스크리닝 방법을 수행하는 단계,

(b) 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 치료에 적당한 측정되거나 검출된 검사 화합물을 분리하는 단계, 및

(c) 측정되거나 검출된 검사 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조 물질과 함께 제형화하는 단계

를 포함한다.

상기 방법의 (c) 단계에 있어서, 검출된 검사 화합물은 일반적으로, 투여의 종류에 따라, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 보조 물질, 예를 들면 생리학적 완충 용액, 예를 들면, 염화나트륨 용액, 탈염수(demineralized water), 안정화제, ε-아미노카프로산 또는 펩스타틴 A, 또는 격리제(sequestering agent), 예를 들면 EDTA, 겔 제형, 예를 들면, 백색 바셀린, 저점도 파라핀 및/또는 황랍 등과 함께 제형화한다.

적당한 추가적인 첨가제로는, 예를 들면, 세제 (예: Triton X-100 또는 데옥시콜산나트륨) 뿐만 아니라, 폴리올 (예: 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤), 당 (예: 수크로스 또는 글루코스), 양쪽성이온(zwitterion) 화합물, 예를 들면, 아미노산 (예: 글리신 또는, 특히 타우린 또는 베타인) 및/또는 단백질 (예: 소 또는 사람 혈청 알부민)이 있다. 세제, 폴리올 및/또는 양쪽성이온 화합물이 바람직하다.

생리학적 완충 용액은 바람직하게는 대략 6.0 내지 8.0의 pH, 특히 대략 6.8 내지 7.8의 pH, 특히 대략 7.4의 pH를 갖고/갖거나 대략 200 내지 400 밀리오스몰/리터, 바람직하게는 대략 290 내지 310 밀리오스몰/리터의 삼투몰농도를 갖는다. 약제의 pH는 일반적으로 적당한 유기 또는 무기 완충액을 사용하여, 예를 들면, 바람직하게는 인산염 완충액, 트리스 완충액 (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충액 ([4-(2-하이드록시에틸)피페라지노]-에탄설폰산) 또는 MOPS 완충액 (3-모폴리노-1-프로판설폰산)을 사용하여 조절한다. 각각의 완충액의 선택은 일반적으로 목적하는 완충액 몰농도에 따라 달라진다. 인산염 완충액은, 예를 들면, 주사 및 주입 용액에 적당하다.

상기 약제는 통상적인 방식으로, 예를 들면, 본 발명에 따른 약제를 함유하는, 경구 투여 제형, 예를 들면 정제 또는 캡슐제로; 점막, 예를 들면 비강 또는 구강으로; 피부 밑에 이식되는 저장소(depository)의 형태로; 주사, 주입 또는 겔로 투여될 수 있다. 상기 약제를, 경우에 따라, 리포좀 복합체의 형태로, 국소적으로 및 국부적으로 투여하여, 상기한 특정 관절 질환을 치료하는 것이 또한 가능하다. 또한, 치료는 경피 치료 시스템(TTS)으로 수행할 수 있고, 이는 약제의 일시적 제어 방출을 가능하게 한다. TTS는, 예를 들면, 유럽특허 제EP　0 944 398 A1호, 제EP 0 916 336 A1호, 제EP　0　889　723　A1호 또는 제EP 0 852 493 A1호로부터 공지되어 있다.

주사 용액은 일반적으로, 상대적으로 소량 (예: 약 1 내지 약 20ml)의 용액 또는 현탁액만을 신체에 투여하는 경우에 사용된다. 주입 용액은 일반적으로, 다량 (예: 1 리터 이상)의 용액 또는 현탁액을 투여하는 경우에 사용된다. 주입 용액과 대조적으로, 주사 용액의 경우에는 수 밀리리터만이 투여되므로, 주사에서 혈액 또는 조직액의 pH 및 삼투압의 약간의 차이는 중요하지 않거나, 통각과 관련하여 무의미한 정도로만 중요하다. 그러므로, 사용 전에 본 발명에 따른 제형을 희석하는 것은 일반적으로 필요하지 않다. 하지만, 상대적으로 다량으로 투여하는 경우에는, 본 발명에 따른 제형을 적어도 대략 등장 용액이 되는 정도까지 투여 전에 잠시 동안 희석시켜야 한다. 등장 용액의 예로는 0.9% 농도의 염화나트륨 용액이 있다. 주입의 경우, 희석은, 예를 들면 멸균수를 사용하여 수행할 수 있고, 투여는, 예를 들면 소위 우회(bypass)를 통해 수행할 수 있다.

다음의 도면, 표, 서열 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명을 설명할 것이다.

도 1은 NCBI 번호 NM_053046의 사람 EGLN2 유전자의 핵산 서열을 보여준다. 470번 위치(굵은 글씨)에서 C→T의 유전자 변이를 갖는 유전자 단편의 증폭을 위하여 사용된 프라이머에 밑줄을 그었다.

도 2는 NCBI 번호 NM_053046의 핵산 서열로부터 유래된 사람 EGLN2의 아미노 산 서열을 보여준다. EGLN2 단백질의 58번 아미노산 위치를 굵게 표시하였다.

도 3은 58번 위치에서 류신을 함유하는 사람 EGLN2 변이체의 아미노산 서열을 보여준다. EGLN2 단백질의 58번 아미노산 위치를 굵게 표시하였다.

도 4는 470번 위치에서 티미딘을 함유하는 사람 EGLN2 변이 유전자의 핵산 서열을 보여준다.

도 5는 환자 그룹에서 관상동맥 심장 질환의 발병 연령에 미치는 참조 서열 NM_053042.2의 470번 위치에서의 EGLN2의 유전자형 (EGLN2 단백질의 58번 위치에서 아미노산 교환을 일으킴)의 영향을 보여준다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의적이다.

서열의 설명

서열번호 1은 NCBI 번호 NM_053046의 사람 EGLN2 단백질의 핵산 서열을 보여준다.

서열번호 2는 NCBI 번호 NM_053046의 핵산 서열로부터 유래된 사람 EGLN2의 아미노산 서열을 보여준다.

서열번호 3은 58번 위치에 류신을 함유하는 사람 EGLN2 변이체의 아미노산 서열을 보여준다.

서열번호 4는 470번 위치에 티미딘을 함유하는 사람 EGLN2 변이체 유전자의 핵산 서열을 보여준다.

서열번호 5는 참조 서열 NM_053046.2의 뉴클레오타이드 444번 내지 463번의 제1 프라이머 서열을 보여준다.

서열번호 6은 참조 서열 NM_053046.2의 염기 504번 내지 521번의 상보적인 서열의 제2 프라이머 서열을 보여준다.

서열결정 및 분석에 의한 SNP 검출

증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 ( 프라이머 ):

다음의 프라이머를 사용하여 참조 번호 NM_053046.2의 EGLN2 서열의 470번 위치에서의 C에서 T로의 뉴클레오타이드 교환을 검출하였다:

프라이머 1: 5'- CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG -3' (참조 서열 NM_053046.2의 뉴클레오타이드 444번 내지 463번; 서열번호 5);

프라이머 2: 5'- GGGCTGGCAGTGGTAGAG -3' (참조 서열 NM_053046.2의 염기 504번 내지 521번의 상보적인 서열; 서열번호 6).

증폭을 위한 PCR 프로토콜:

사용된 시약은 Applied Biosystems(Foster City, USA)로부터 구입하였다: 20ng의 게놈 DNA; 1 단위의 TaqGold DNA 폴리머라제; 1x Taq 폴리머라제 완충액; 500μM dNTP; 2.5mM MgCl₂; 200nM의 위에 제시된 각각의 증폭 프라이머쌍; H₂O ad 5 ㎕.

유전자형분석(genotyping)을 위한 PCR의 증폭 프로그램:

10분 동안 95℃ x 1 사이클

30초 동안 95℃

30초 동안 70℃ x 2 사이클;

30초 동안 95℃

30초 동안 65℃ x 2 사이클;

30초 동안 95℃

30초 동안 60℃ x 2 사이클;

30초 동안 95℃

30초 동안 56℃

30초 동안 72℃ x 40 사이클;

10분 동안 72℃

30초 동안 4℃ x 1 사이클;

미니시컨싱(minisequencing)을 위한 프로토콜 및 SNP 의 검출

사용된 시약은 Applied Biosystems(Foster City, USA)로부터 구입하였다. 2㎕의 정제된 PCR 산물; 1.5㎕의 BigDye-Terminator-키트; 200nM의 상기한 서열결정 프라이머; H₂O ad 10㎕.

서열결정을 위한 증폭 프로그램:

2분 동안 96℃ x 1 사이클;

10초 동안 96℃

10초 동안 55℃

4분 동안 65℃ x 30 사이클;

7분 동안 72℃

30초 동안 4℃ x 1 사이클;

서열결정 산물의 분석:

서열을, 먼저 Sequenz Analyse 소프트웨어[판매원: Applied Biosystems, Foster City, USA]로 분석하여 예비 데이터를 얻고 나서, Phred, Phrap, Polyphred und Consed 소프트웨어로 처리하였다. Phred, Phrap, Polyphred und Consed는 워싱턴 대학교의 필 그린(Phil Green)에 의해 작성되었다 (http://www.genome.washington.edu).

결과

사람들의 그룹의 특징

표 1은 연구된 사람들의 그룹의 특징을 보여준다.

EGLN2 유전자의 변이체의 빈도 및 분포

표 2는 연구된 환자 그룹에서 참조 서열 NM_053046.2의 470번 위치에서의 EGLN2 유전자의 유전자 변이체의 빈도 및 분포를 보여준다.

아래에서는 EGLN2-C470C (EGLN2 Ser58Ser) 및 EGLN2-C470T (EGLN2 Ser58Leu)를 갖는 개체만을 고려한다.

조기 심근경색의 발병에 미치는 EGLN2 의 변이체의 영향

표 3은 연구된 환자 그룹에서 조기 심근경색 (남성의 경우 55세 미만, 그리고 여성의 경우 60세 미만) 및 졸중/지연된 가역적 허혈성 신경 결손(PRIND; prolonged reversible ischemic neurological deficit)/일과성 허혈 발작(TIA; transitoric ischemic attack)의 발병에 미치는 참조 서열 NM_053046.2의 470번 위치에서의 EGLN2의 유전자형의 영향을 보여준다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의적이다.

결과:

1. EGLN2-C470C를 갖는 환자는 EGLN2-C470T를 갖는 환자와 비교하여 조기 심근경색에 대해 통계적으로 높은 발병률을 보였다.

2. EGLN2-C470T를 갖는 환자는 EGLN2-C470C를 갖는 환자와 비교하여 졸중, PRIND 및/또는 TIA가 발생할 위험성의 유의적인 증가를 보였다.

관상동맥 심장 질환이 있는 환자의 연령에 미치는 EGLN2 의 변이체의 영향

도 5는 환자 그룹에서 관상동맥 심장 질환의 발생 연령에 미치는 참조 서열 NM_053042.2의 470번 위치에서의 EGLN2의 유전자형의 영향을 보여준다.

결과:

관상동맥 심장 질환의 조기 발생에 대한 EGLN2-C470C (EGLN2 Ser58Ser)을 갖는 환자의 연령의 유의적인 의존도가 EGLN2-C470T (EGLN2 Ser58Leu)를 갖는 환자의 연령과 비교하여 관찰되었다.

결론:

앞서 제시된 EGLN2를 암호화하는 유전자 및/또는 단백질 EGLN2의 유전자 변이체들 간의 통계적으로 유의적인 관련성은, 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 발생에 상기 유전자 변이체들이 관련되어 있다는 것을 명확하게 보여준다. 따라서, 상기 유전자 변이체는 혈전색전 및/또는 관상동맥 심장 질환의 진단을 위한, 특히 조기 심근경색 및/또는 졸중, PRIND 및/또는 TIA의 진단을 위한 생물학적 마커이다.

서열번호 1

서열번호 2

서열번호 3

서열번호 4

서열번호 5

서열번호 6

<110> Sanofi-Aventis <120> EGLN2 variants and use thereof in preventing or treating thromboembolic disorders and coronary heart diseases <130> DE2005/050 <150> DE 10 2005 048 898.6 <151> 2005-10-12 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc 61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag 121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca 181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg 241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg 301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg 361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc 421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctc ggcagggagt 481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc 541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc 601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg 661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac 721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc 781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat 841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca 901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac 961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc 1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac 1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag 1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc 1201 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag 1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag 1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag 1381 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca 1441 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca 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Cys Pro Leu Leu Pro Ser Tyr 35 40 45 His Cys Pro Gly Val Pro Ser Glu Ala Ser Ala Gly Ser Gly Thr Pro 50 55 60 Arg Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ala Ser Pro Leu Arg Asp Gly Phe 65 70 75 80 Gly Gly Gln Asp Gly Gly Glu Leu Arg Pro Leu Gln Ser Glu Gly Ala 85 90 95 Ala Ala Leu Val Thr Lys Gly Cys Gln Arg Leu Ala Ala Gln Gly Ala 100 105 110 Arg Pro Glu Ala Pro Lys Arg Lys Trp Ala Glu Asp Gly Gly Asp Ala 115 120 125 Pro Ser Pro Ser Lys Arg Pro Trp Ala Arg Gln Glu Asn Gln Glu Ala 130 135 140 Glu Arg Glu Gly Gly Met Ser Cys Ser Cys Ser Ser Gly Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ala Ser Ala Gly Leu Met Glu Glu Ala Leu Pro Ser Ala Pro Glu Arg 165 170 175 Leu Ala Leu Asp Tyr Ile Val Pro Cys Met Arg Tyr Tyr Gly Ile Cys 180 185 190 Val Lys Asp Ser Phe Leu Gly Ala Ala Leu Gly Gly Arg Val Leu Ala 195 200 205 Glu Val Glu Ala Leu Lys Arg Gly Gly Arg Leu Arg Asp Gly Gln Leu 210 215 220 Val Ser Gln Arg Ala Ile Pro Pro Arg Ser Ile Arg Gly Asp Gln Ile 225 230 235 240 Ala Trp Val Glu Gly His Glu Pro Gly Cys Arg Ser Ile Gly Ala Leu 245 250 255 Met Ala His Val Asp Ala Val Ile Arg His Cys Ala Gly Arg Leu Gly 260 265 270 Ser Tyr Val Ile Asn Gly Arg Thr Lys Ala Met Val Ala Cys Tyr Pro 275 280 285 Gly Asn Gly Leu Gly Tyr Val Arg His Val Asp Asn Pro His Gly Asp 290 295 300 Gly Arg Cys Ile Thr Cys Ile Tyr Tyr Leu Asn Gln Asn Trp Asp Val 305 310 315 320 Lys Val His Gly Gly Leu Leu Gln Ile Phe Pro Glu Gly Arg Pro Val 325 330 335 Val Ala Asn Ile Glu Pro Leu Phe Asp Arg Leu Leu Ile Phe Trp Ser 340 345 350 Asp Arg Arg Asn Pro His Glu Val Lys Pro Ala Tyr Ala Thr Arg Tyr 355 360 365 Ala Ile Thr Val Trp Tyr Phe Asp Ala Lys Glu Arg Ala Ala Ala Lys 370 375 380 Asp Lys Tyr Gln Leu Ala Ser Gly Gln Lys Gly Val Gln Val Pro Val 385 390 395 400 Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr 405 <210> 3 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asp Ser Pro Cys Gln Pro Gln Pro Leu Ser Gln Ala Leu Pro Gln 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ser Ser Ser Glu Pro Leu Glu Pro Glu Pro Gly Arg Ala 20 25 30 Arg Met Gly Val Glu Ser Tyr Leu Pro Cys Pro Leu Leu Pro Ser Tyr 35 40 45 His Cys Pro Gly Val Pro Ser Glu Ala Leu Ala Gly Ser Gly Thr Pro 50 55 60 Arg Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ala Ser Pro Leu Arg Asp Gly Phe 65 70 75 80 Gly Gly Gln Asp Gly Gly Glu Leu Arg Pro Leu Gln Ser Glu Gly Ala 85 90 95 Ala Ala Leu Val Thr Lys Gly Cys Gln Arg Leu Ala Ala Gln Gly Ala 100 105 110 Arg Pro Glu Ala Pro Lys Arg Lys Trp Ala Glu Asp Gly Gly Asp Ala 115 120 125 Pro Ser Pro Ser Lys Arg Pro Trp Ala Arg Gln Glu Asn Gln Glu Ala 130 135 140 Glu Arg Glu Gly Gly Met Ser Cys Ser Cys Ser Ser Gly Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ala Ser Ala Gly Leu Met Glu Glu Ala Leu Pro Ser Ala Pro Glu Arg 165 170 175 Leu Ala Leu Asp Tyr Ile Val Pro Cys Met Arg Tyr Tyr Gly Ile Cys 180 185 190 Val Lys Asp Ser Phe Leu Gly Ala Ala Leu Gly Gly Arg Val Leu Ala 195 200 205 Glu Val Glu Ala Leu Lys Arg Gly Gly Arg Leu Arg Asp Gly Gln Leu 210 215 220 Val Ser Gln Arg Ala Ile Pro Pro Arg Ser Ile Arg Gly Asp Gln Ile 225 230 235 240 Ala Trp Val Glu Gly His Glu Pro Gly Cys Arg Ser Ile Gly Ala Leu 245 250 255 Met Ala His Val Asp Ala Val Ile Arg His Cys Ala Gly Arg Leu Gly 260 265 270 Ser Tyr Val Ile Asn Gly Arg Thr Lys Ala Met Val Ala Cys Tyr Pro 275 280 285 Gly Asn Gly Leu Gly Tyr Val Arg His Val Asp Asn Pro His Gly Asp 290 295 300 Gly Arg Cys Ile Thr Cys Ile Tyr Tyr Leu Asn Gln Asn Trp Asp Val 305 310 315 320 Lys Val His Gly Gly Leu Leu Gln Ile Phe Pro Glu Gly Arg Pro Val 325 330 335 Val Ala Asn Ile Glu Pro Leu Phe Asp Arg Leu Leu Ile Phe Trp Ser 340 345 350 Asp Arg Arg Asn Pro His Glu Val Lys Pro Ala Tyr Ala Thr Arg Tyr 355 360 365 Ala Ile Thr Val Trp Tyr Phe Asp Ala Lys Glu Arg Ala Ala Ala Lys 370 375 380 Asp Lys Tyr Gln Leu Ala Ser Gly Gln Lys Gly Val Gln Val Pro Val 385 390 395 400 Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr 405 <210> 4 <211> 2111 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc cttttttttt ttcctttctc 60 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggact tggggaccag 120 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctg ccctgcctca ccctgcccca 180 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcg gaggaggagg cggaggaggg 240 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccggggg atgaagacac tgctgccatg 300 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctcc ctcagttacc agggtcttcg 360 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgg gagtggagag ttacctgccc 420 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgccta gtgaggcctt ggcagggagt 480 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagcc ctcttcggga cggttttggc 540 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaag gcgctgcagc gctggtcacc 600 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctg aggcccccaa acggaaatgg 660 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggc cctgggccag gcaagagaac 720 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgca gcagtggcag tggtgaggcc 780 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccg agcgcctggc cctggactat 840 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaagg acagcttcct gggggcagca 900 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaac ggggtgggcg cctgcgagac 960 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagca tccgtgggga ccagattgcc 1020 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtg ccctcatggc ccatgtggac 1080 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatg tcatcaacgg gcgcaccaag 1140 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacg taaggcacgt tgacaatccc 1200 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctga atcagaactg ggacgttaag 1260 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggc ccgtggtagc caacatcgag 1320 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggc ggaaccccca cgaggtgaag 1380 ccagcctatg ccaccaggta cgccatcact gtctggtatt ttgatgccaa ggagcgggca 1440 gcagccaaag acaagtatca gctagcatca ggacagaaag gtgtccaagt acctgtatca 1500 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgc atggcagaca gcttaaatga 1560 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccc tgccaccgct gctgcttctg 1620 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctg ttgctgagga ccaaggagga 1680 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgt cacctggaca gggggcagcc 1740 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggt cctaccctgt ctggtcatga 1800 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcact tcccaccagg atgcaggact 1860 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatgggg tgggaggagt acccccaagt 1920 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactcccca acccctttgg ccatggcagg 1980 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaa aggtgccagg aggagcatgg 2040 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctc agagctgcaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa a 2111 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 5 ctgtccagga gtgcctagtg 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 6 gggctggcag tggtagag 18

Claims

서열번호 3에 따른 아미노산 서열로 이루어진 EGLN2 단백질.
제1항에 따른 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산.
제2항에 있어서, 서열번호 4에 따른 핵산 서열로 이루어진 핵산.
제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하는 벡터.
제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하거나, 제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하는 벡터를 함유하는 숙주 세포.
제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하거나, 제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하는 벡터를 함유하는, 유전자전이된(transgenic) 사람이 아닌 동물.
제1항에 따른 EGLN2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하는 숙주 세포 또는 제2항 또는 제3항에 따른 핵산을 함유하는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 적당한 배양 배지에서 배양하는, 제1항에 따른 EGLN2 단백질의 생산 방법.
(a) 서열번호 2 또는 3의 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계,

(b) 검사 화합물을 제공하는 단계, 및

(c) 상기 검사 화합물이 상기 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 유전자에 미치는 영향을 측정하거나 검출하는 단계

를 포함하여, 서열번호 2 또는 3의 EGLN2 단백질의 조절인자를 스크리닝하는 방법.
제9항에 있어서, 검사 화합물이 화학 화합물 라이브러리의 형태로 제공되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 검사 화합물이 상기 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 유전자에 미치는 영향을 이질적 또는 균질적 검정에서 측정하거나 검출하는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 어레이(array) 상에서 수행되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 전체 세포를 사용하여 수행되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 로봇 시스템에서 수행되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 미세유체공학(microfluidics)을 사용하여 수행되는 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 고효율 스크리닝(high-throughput screening) 방법인 방법.
서열번호 2 또는 3의 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 조기 심근경색, 졸중, 지연된 가역적 허혈성 신경 결손(PRIND) 및 일과성 허혈 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 진단하기 위한 약제학적 조성물.
삭제
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제17항에 있어서, 서열번호 3의 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산이 졸중, PRIND 및 TIA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 진단하기 위한 것인 약제학적 조성물.
제17항에 있어서, 서열번호 2의 EGLN2 단백질 또는 상기 EGLN2 단백질을 암호화하는 핵산이 조기 심근경색의 진단을 위한 것인 약제학적 조성물.
(a) 제9항 또는 제10항에 따른 방법을 수행하는 단계,

(b) 조기 심근경색, 졸중, PRIND 및 TIA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환의 진단에 적당한 측정되거나 검출된 검사 화합물을 분리하는 단계, 및

(c) 상기 측정되거나 검출된 검사 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조 물질과 함께 제형화하는 단계

를 포함하여, 조기 심근경색, 졸중, PRIND 및 TIA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환의 진단을 위한 약제를 제조하는 방법.